Articolo metodologico

Modello di roditore della perdita muscolare volumetrica del massetere per lo studio dei materiali di bioingegneria

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DOI:

10.3791/66450

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31 maggio 2024

 ,  , 
1Division of Plastic and Reconstructive Surgery, University of California San Francisco (UCSF)

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo un protocollo per la creazione chirurgica di una lesione da perdita muscolare volumetrica (VML) nel massetere di ratto, fornendo un modello riproducibile e accessibile per lo studio delle lesioni muscolari craniofacciali e il loro trattamento utilizzando biomateriali come il nuovo idrogel.

Abstract

Le lesioni da perdita muscolare volumetrica craniofacciale (VML) possono verificarsi a seguito di gravi traumi, escissione chirurgica, infiammazione e condizioni congenite o altre condizioni acquisite. Il trattamento della VML craniofacciale comporta il trasferimento muscolare chirurgico e funzionale. Tuttavia, queste procedure non sono in grado di ripristinare la normale funzione, sensazione o espressione e, più comunemente, queste condizioni non vengono trattate. Pochissime ricerche sono state condotte sulla rigenerazione del muscolo scheletrico in modelli animali di VML craniofacciale. Questo manoscritto descrive un modello di ratto per lo studio della lesione VML craniofacciale e un protocollo per la valutazione istologica dei biomateriali nel trattamento di queste lesioni. L'idrogel liquido e gli scaffold liofilizzati vengono applicati al momento della creazione chirurgica del VML e i masseteri vengono asportati in punti temporali terminali fino a 12 settimane con alti tassi di ritenzione e complicanze trascurabili. L'ematossilina e l'eosina (HE), il tricromo di Masson e l'analisi immunoistochimica vengono utilizzate per valutare i parametri di rigenerazione del muscolo scheletrico, nonché la biocompatibilità e l'immunomodulazione. Mentre dimostriamo lo studio di un idrogel a base di acido ialuronico, questo modello fornisce un mezzo per valutare le successive iterazioni dei materiali nelle lesioni VML.

Introduzione

Traumi gravi, escissione chirurgica, infiammazione e altre condizioni acquisite possono provocare un grado di perdita di tessuto che travolge i meccanismi di riparazione del muscolo scheletrico endogeno. La perdita di cellule e strutture residenti che promuovono il processo rigenerativo primario può provocare rimodellamento patologico e fibrosi tissutale, con conseguenti deficit a lungo termine di funzione e sensibilità e viene definita perdita muscolare volumetrica (VML)1,2,3. La risposta infiammatoria alle lesioni da VML coinvolge un meccanismo complesso e ben documentato che coinvolge macrofagi, citochine e cellule miogeniche che presenta molti bersagli teorici nella medicina rigenerativa4. Mentre molti studi in vitro hanno utilizzato questi bersagli in modelli animali di trattamento VML alle estremità, c'è una mancanza di ricerca sulla rigenerazione del muscolo scheletrico in modelli animali di VML craniofacciale 5,6,7.

La perdita di tessuto craniofacciale può derivare da condizioni come descritto in precedenza e un deficit di tessuto craniofacciale può verificarsi anche in condizioni congenite come la schisi, che in alcuni casi comporta una vera e propria carenza volumetrica di tessuto muscolare 8,9. Poiché i muscoli della regione craniofacciale sono importanti per la funzione e l'aspetto estetico, gli effetti a lungo termine della VML possono avere un'afflizione psicologica significativa. Diversi aspetti del muscolo scheletrico craniofacciale sono diversi dal muscolo scheletrico derivato dal somite che si trova nelle estremità, comprese le variazioni nell'espressione genica, l'origine embrionale, il fenotipo delle cellule satelliti, la quantità di cellule satelliti, la composizione delle fibre e l'architettura 10,11,12,13. Queste variazioni possono causare lesioni VML che colpiscono il muscolo craniofacciale in modo diverso rispetto al muscolo derivato da somite14,15. Ad oggi, gli approcci di ingegneria tissutale che hanno dimostrato di aumentare la rigenerazione nei modelli animali di VML degli arti non si sono tradotti in modo equivalente ai modelli animali di VML craniofacciale16. Ciò sottolinea la necessità di ottimizzare gli approcci in vivo ai modelli di VML craniofacciale animale.

Sebbene siano stati condotti diversi studi in vivo sulla VML craniofacciale, gli studi sono piccoli e la creazione di un robusto difetto del muscolo craniofacciale in modelli animali è impegnativa 8,13. Kim et al. hanno riportato lo sviluppo di un modello VML di massetere di topo. Tuttavia, questo studio ha valutato l'istologia solo fino a 28 giorni dopo l'infortunio e ha avuto un potere poco chiaro per rilevare le differenze negli esiti istologici tra i punti temporali17. Rodriguez et al. hanno riportato lo sviluppo di un modello VML craniofacciale di pecora. Tuttavia, hanno riportato un'elevata variabilità all'interno dei gruppi sperimentali, suggerendo un'eterogeneità nella gravità della lesione chirurgica iniziale16. Qui, riportiamo il protocollo del nostro modello VML di massetere di ratto e dimostriamo la sua utilità nella valutazione di approcci di ingegneria tissutale.

Protocollo

Questo studio è stato condotto in conformità con tutte le normative applicabili, inclusa l'aderenza alle raccomandazioni delineate nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Il programma istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'UCSF ha approvato tutte le procedure per animali e le cure postoperatorie (protocollo IACUC #AN195944-01).

1. Chirurgia VML

  1. Anestetizzare ratti maschi di Sprague-Dawley a 12 settimane di età del peso di 276-300 g in un contenitore sigillato utilizzando l'anestesia generale isofluorane a una velocità dell'1%-5% prima di essere trasferiti in un campo chirurgico sterile.
    1. Posizionare i roditori sul lato sinistro in modo che il collo sia esteso in posizione neutra e il naso inserito nell'ogiva anestetica, consentendo l'esposizione al lato destro del viso.
    2. Portata di isofluorano conica dall'induzione alla portata di mantenimento (circa il 2%).
  2. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi dei roditori.
  3. Svuotare la sede operatoria, delimitata da una linea tra l'angolo destro della bocca, la base dell'orecchio destro superiormente e l'angolo della mandibola inferiormente, dal pelo utilizzando la crema depilatoria.
    1. Disinfettare più volte il sito operatorio con movimenti circolari utilizzando sia lo scrub all'etanolo che quello alla betadina.
      NOTA: In questo protocollo non viene utilizzato un drappeggio sterile, date le dimensioni e la posizione di accesso. La procedura viene condotta utilizzando una tecnica asettica in conformità con le linee guida per la cura degli animali.
  4. Creare un'incisione longitudinale di 3-4 cm di lunghezza che si estende dal cuscinetto inferiore destro dei baffi all'orecchio destro.
    1. Sollevare un lembo cutaneo, consentendo la visualizzazione del massetere destro e dei rami buccale e mandibolare del nervo facciale (Figura 1A).
    2. Liberare la pelle dalla fascia sottostante utilizzando una separazione smussata e mantenere i bordi della pelle in una posizione retratta utilizzando pinze chirurgiche per una visualizzazione ottimale del muscolo sottostante.
  5. Praticare un'incisione trasversale di 1-2 cm di lunghezza nella fascia sovrastante la porzione anteriore del massetere. Utilizzare una separazione smussata per espandere lo spazio tra la fascia e il massetere con cura per mantenere l'integrità complessiva della fascia rimanente.
  6. Utilizzando l'incisione fasciale come finestra sul massetere superficiale, creare una lesione circolare nel muscolo di 5 mm di diametro e 5 mm di profondità utilizzando una biopsia sterilizzata monouso. Assicurarsi che il difetto sia centrato tra i rami vestibolare e mandibolare del nervo facciale, con cura per evitare traumi ai nervi (Figura 1B).
  7. Aggiungere il biomateriale alla lesione circolare del massetere (Figura 1C).
  8. Una volta che l'agente è adeguatamente posizionato, suturare la finestra fasciale che investe i muscoli utilizzando una singola sutura monofilamento 5-0 per evitare la migrazione.
    NOTA: Gli agenti in forma solida vengono inseriti direttamente nella ferita e il tessuto può essere perturbato per favorire la saturazione con il sangue, mentre gli agenti liquidi vengono aggiunti e lasciati gelificare se necessario o immediatamente chiusi in posizione utilizzando la fascia per evitare movimenti indesiderati. Nell'esperimento qui dimostrato, viene somministrato un criogel a base di acido ialuronico acrilato.
  9. Chiudere la pelle utilizzando una semplice tecnica sottocuticolare interrotta o in esecuzione con monofilamento 5-0.
    1. Applicare la colla per la pelle sulle suture per aiutare a prevenire la deiscenza dell'incisione postoperatoria.
  10. Lasciare che i ratti si riprendano in una gabbia con una fonte di calore esterna (termoforo sotto la gabbia o scaldamani sterili nella gabbia) e osservare per 30 minuti dopo l'intervento.
  11. Diluire l'antibiotico trimetoprim-sulfametossazolo (200 mg di trimetoprim e 40 mg di sulfametossazolo in 5 ml) in acqua potabile (5 ml/200 ml di acqua) e somministrarlo in acqua potabile per roditori per 7 giorni dopo l'intervento. Assicurarsi che l'analgesia perioperatoria sia condotta secondo i protocolli istituzionali.
    NOTA: In questo studio, lo 0,25% di bupivacaina SC è stato somministrato prima dell'incisione chirurgica, 0,05 mg/kg di buprenorfina SC è stato somministrato prima del recupero dall'anestesia e 2 mg/kg di meloxicam IP è stato somministrato prima del recupero dall'anestesia e di nuovo la mattina seguente.

2. Raccolta, congelamento e analisi dei masseteri

  1. In momenti predeterminati, sacrificare i ratti inducendo un sovradosaggio di un agente chimico (ad es. CO2 o anestetico) nella camera di induzione dell'anestetico.
  2. Confermare il sacrificio del roditore eseguendo una toracotomia bilaterale utilizzando una singola incisione con bisturi attraverso la 4acostola ventralmente per perforare i polmoni (toracotomia bilaterale).
  3. Riaprire l'incisione chirurgica per consentire la visualizzazione del massetere e rimuovere la pelle sovrastante il massetere per facilitarne l'accesso.
  4. Sezionare e rimuovere il massetere dalla mandibola, iniziando con la separazione all'angolo mandibolare. Assicurarsi che la dissezione avvenga lungo la superficie ossea per catturare l'intero spessore del massetere.
    1. Sezionare anteriormente lungo la mandibola, recidendo il punto di attacco del tendine. Quindi, sezionare posteriormente lungo l'arco zigomatico (Figura 1D). Infine, seziona l'attacco posteriore poiché c'è un aumento del rischio di sanguinamento.
  5. Sciacquare il massetere asportato in 1x PBS a temperatura ambiente (RT) e rimuovere l'umidità in eccesso tamponando accuratamente il campione con un tovagliolo di carta.
  6. Posizionare il muscolo in un criomold e immergerlo in un terreno di inclusione a temperatura di taglio ottimale (OCT), con l'estremità anteriore rivolta verso il basso e l'estremità posteriore rivolta verso l'alto.
  7. Aggiungi l'isopentano in una tazza di metallo e raffreddalo immergendolo nell'azoto liquido con cura per evitare che l'azoto liquido vi penetri.
    1. Una volta che l'isopentano ha raggiunto la temperatura ottimale (da -140 a -149 °C) e si è leggermente addensato, tenere il criomold contenente OCT e il massetere parzialmente immersi nell'isopentano fino a quando l'OCT non si è congelato. Conservare il criomold congelato su ghiaccio secco fino a quando non viene trasferito in congelatore a -80 °C.
  8. La criosezione congela i campioni di massetere con l'orientamento tale che il polo anteriore viene sezionato per primo, muovendosi posteriormente attraverso il campione. Impostare la temperatura del blocco di tessuto a -20 °C e la temperatura della lama di criosezione a -15 °C. Per ogni 200 μm, tagliare 4 vetrini (2 con sezioni da 10 μm, 2 con sezioni da 6 μm) prima di spostare ulteriormente di 200 μm, tagliando 4 vetrini aggiuntivi e ripetendo in tutto il campione.
  9. Utilizzare le sezioni da 10 μm per l'analisi istologica (Tricromia di Masson, Ematossilina ed Eosina, Rosso Picrosirius, ecc.) e le sezioni da 6 μm per l'immunoistochimica.
    NOTA: Per l'istologia possono essere utilizzate anche sezioni da 6 μm.
  10. Acquisisci immagini utilizzando la microscopia a luce o a fluorescenza.
  11. Misura le aree della sezione trasversale di ~200 fibre muscolari del muscolo massetere utilizzando il software Image J.

3. Analisi immunoistochimica

  1. Per l'analisi immunoistochimica della catena pesante della miosina embrionale, fissare i vetrini in PFA al 4% per 1 ora a RT.
  2. Lavare i vetrini in PBS 3 volte a RT, lasciando riposare ogni lavaggio per 10 minuti.
  3. Permeabilizzare il tessuto incubando i vetrini con Triton X-100 allo 0,5% a RT per 15 minuti.
  4. Lavare i vetrini in PBS 3 volte a RT, lasciando riposare ogni lavaggio per 10 minuti.
  5. Incubare con anticorpo monoclonale primario di topi ospiti (1:200) in siero di capra normale al 2% (NGS) a 4 °C per una notte.
  6. Lavare i vetrini in PBS-Tween 3 volte a RT, lasciando riposare ogni lavaggio per 10 minuti.
  7. Incubare con anticorpo secondario anti-topo marcato con fluoroforo dall'ospite di coniglio (1:500) in NGS al 2% a RT per 2 ore.
  8. Lavare i vetrini in PBS-Tween 3 volte a RT, lasciando riposare ogni lavaggio per 10 minuti.
  9. Montare i vetrini utilizzando 3 gocce di supporto fluorescente DAPI prima di posizionare un vetrino coprioggetti.

Risultati

I risultati per la valutazione della VML craniofacciale e della rigenerazione tissutale utilizzando biomateriali includono risultati sia quantitativi che qualitativi.

La Figura 2 illustra un esempio di valutazione qualitativa utilizzando il modello descritto in precedenza. L'osservazione della crescita de novo delle fibre muscolari all'interno del nostro idrogel è un risultato qualitativamente positivo (Figura 2A) e suggerisce che un biomateriale può fornire un supporto architettonico sufficiente e un fattore di crescita o un apporto di nutrienti. La ritenzione di idrogel all'interno del letto della ferita (Figura 2B) è visibile sulla colorazione HE. Può essere effettuata una valutazione qualitativa di altri tessuti all'interno di un biomateriale, come l'identificazione dei vasi sanguigni utilizzando l'HE (Figura 2C) e la tricromia di Masson (Figura 2D). I rami mandibolare e vestibolare del nervo facciale sono visibili negli angoli in alto a sinistra e in alto a destra dell'immagine nella Figura 2B, confermando il corretto posizionamento dell'idrogel nel letto della lesione VML e fornendo l'orientamento. Uno strato di fascia è visibile sopra l'idrogel, confermando che la chiusura fasciale ha avuto successo ed è rimasta intatta durante il periodo postoperatorio. Un risultato negativo osservato in questa fase includerebbe la perdita completa di idrogel (Figura 2E) o la perdita della chiusura fasciale e dell'estrusione dal letto della ferita (Figura 2F), con l'HE che mostra evidenza di un letto della ferita o di una cicatrice fibrotica a seconda del tempo trascorso dopo l'intervento.

L'analisi immunoistochimica è fondamentale nella valutazione dei biomateriali per il trattamento della VML craniofacciale al fine di identificare i tipi cellulari e le interazioni molecolari a livello cellulare. Poiché la VML provoca la perdita di cellule residenti e di un'architettura in grado di rigenerare il muscolo scheletrico, la rigenerazione muscolare de novo nel sito danneggiato è un risultato importante nel trattamento4 e nella valutazione dell'efficacia nelle terapie basate su biomateriali per la VML. Le isoforme evolutive della miosina, tra cui la miosina embrionale (MYH3) e neonatale (MYH8), sono riespresse nella rigenerazione delle fibre muscolari scheletriche e forniscono un marcatore specifico per la rigenerazione delle fibre18,19. La Figura 3 mostra un esempio di come l'immunoistochimica possa essere utilizzata per identificare i tipi cellulari di interesse, in questo caso, la catena pesante della miosina embrionale.

Infine, ImageJ può essere utilizzato per quantificare le caratteristiche dei vetrini istologici, tra cui l'immunoistochimica e le colorazioni specializzate come il tricromo di Masson, per misurare la risposta fibrotica (Figura 4). La rimozione di una porzione di muscolo nelle lesioni VML modifica l'architettura e la composizione muscolare, portando ad un aumento della deposizione di collagene I e alla fibrosi del tessuto compartimentale 2,3. Molti studi che valutano i trattamenti basati su biomateriali per la VML confrontano la fibrosi tra il loro gruppo di intervento e i gruppi di controllo4. Utilizzando il metodo qui descritto, i letti di ferite negli animali che hanno subito lesioni VML possono essere identificati sul tricromo di Masson come cicatrici fibrotiche (Figura 4A). La deconvoluzione del colore tramite ImageJ può isolare e quantificare il canale blu corrispondente al tessuto connettivo (Figura 4B), quindi impostare la scala di grigi per la misurazione (Figura 4C). L'area della cicatrice può essere isolata e misurata utilizzando l'immagine J (Figura 4D) e calibrata su una barra di scala sull'immagine per ottenere dimensioni accurate e un'area riproducibile. Utilizzando questo approccio, è possibile misurare la deposizione di tessuto connettivo (Figura 4E).

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Figura 1: Schema chirurgico che illustra i passaggi. (A,B) Lesione chirurgica del massetere VML. (C) Applicazione di biomateriali. (D) Raccolta del massetere. (E) Morfologia muscolare dopo la raccolta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Colorazione tricromica di HE e Masson. (A) Sezioni di massetere di ratto colorate con HE dall'interfaccia idrogel-muscolo con frecce che indicano strutture morfologicamente identificate come fibre muscolari scheletriche. (B) Sezione di massetere di ratto colorata con HE che dimostra l'abbondanza di fibre muscolari scheletriche in tutto l'idrogel. (C) Tessuto colorato con HE e (D) Tessuto tricromato di Masson con frecce che indicano strutture morfologicamente identificate come vasi sanguigni. (E,F) Risultati negativi che mostrano rispettivamente la perdita completa di idrogel con gel aderito all'aspetto superficiale del massetere piuttosto che al letto della ferita e la perdita incompleta di idrogel con perdita della chiusura fasciale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Colorazione immunoistologica per la catena pesante della miosina embrionale (eMHC) e la laminina su sezioni trasversali di massetere di ratto. (A) 2 settimane dopo l'intervento. (B) 12 settimane dopo l'intervento. Un aumento della concentrazione di eMHC è stato osservato nel campione di 12 settimane rispetto al campione di 2 settimane. Immagini acquisite con ingrandimento 20x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Analisi quantitativa della fibrosi. (A) Sezione massetere di ratto con colorazione tricromica di Masson per la quantificazione della deposizione di tessuto connettivo come proxy per la fibrosi della ferita dopo lesione VML a 12 settimane. (B) L'immagine J è stata utilizzata per deconvoluzione del canale blu corrispondente al tessuto connettivo. (C) L'immagine è stata convertita in scala di grigi per l'analisi. (D) L'area corrispondente alla cicatrice fibrotica è stata isolata e (E) sono state calcolate l'area della sezione trasversale e le percentuali del campo corrispondenti al bianco (sfondo) e al nero (tessuto connettivo). Immagini acquisite utilizzando la microscopia ottica con ingrandimento 10x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo in cui è necessaria un'attenzione particolare per ottenere un risultato ottimale. Il passaggio 1.4 descrive l'incisione iniziale e la separazione smussata della pelle dalla fascia massetere superficiale. La dissezione smussata deve essere eseguita direttamente lungo la pelle con le forbici rivolte lontano dal muscolo sottostante e dalla fascia per evitare di intaccarsi e creare involontariamente una finestra attraverso la fascia. L'aspetto caudale del massetere superficiale deve essere evitato per evitare lesioni involontarie alla vena sottomandibolare o all'arteria carotide esterna. I passaggi 1.5 e 1.6 descrivono rispettivamente la creazione della finestra fasciale e del difetto VML. È necessario prestare attenzione per garantire che l'incisione fasciale abbia le dimensioni minime richieste per far passare la biopsia del punzone, poiché la fascia tende a contrarsi lontano dall'incisione e può essere difficile individuare i bordi nel passaggio 1.8 se viene praticata un'incisione troppo grande. Ancora una volta, la dissezione smussata sotto la fascia deve essere eseguita solo quanto basta per consentire alla biopsia del punch di adattarsi alla finestra e di essere angolata in modo appropriato per essere perpendicolare alla mandibola. Quando si crea la lesione VML, è importante identificare l'area più ampia tra i rami mandibolare e buccale del nervo facciale. Il nervo mandibolare distale si divide in una divisione superiore e inferiore e c'è una variazione nella posizione in cui la divisione superiore si dirama dalla divisione inferiore verso il ramo vestibolare del nervo facciale. Poiché questa divisione è superiore, alcuni animali possono avere la divisione superiore del nervo mandibolare direttamente nel ventre del massetere dove dovrebbe essere creato il difetto. In questi casi, l'animale non deve essere utilizzato per l'analisi, poiché è probabile che si verifichi una lesione del nervo periferico che confonde i dati. Durante la creazione della biopsia del punzone, può essere necessaria una leggera torsione per penetrare l'intera profondità di 5 mm. La fase 2.4 descrive l'asciugatura del campione di tessuto dopo il lavaggio per rimuovere l'umidità in eccesso. Questo viene fatto per prevenire la formazione di cristalli di ghiaccio durante il congelamento del tessuto e la conseguente riduzione degli artefatti da congelamento all'istologia20.

Uno dei vantaggi di questo metodo è la facilità di accesso al muscolo massetere superficiale e la relativa mancanza di strutture ad alto rischio che si possono incontrare durante l'intervento chirurgico. Poiché il sistema vascolare entra nell'estremità caudale del muscolo, nella maggior parte dei casi è possibile evitare un sanguinamento significativo. Questo è importante in quanto non solo riduce il rischio di morbilità, ma aumenta anche la standardizzazione e diminuisce la possibilità che l'ischemia abbia un effetto confondente sulla rigenerazione muscolare. A causa della disponibilità di un involucro fasciale, questo protocollo può essere utilizzato per valutare i biomateriali in fattori di forma liquidi o solidi. Mentre un idrogel acellulare è stato utilizzato come esempio per questo protocollo, questo metodo può essere replicato per testare biomateriali con incorporazione di cellule staminali umane utilizzando ratti immunodeficienti, come è stato fatto in precedenti studi sulle VML21 delle estremità.

Questo studio non definisce formalmente la lesione di dimensioni critiche nella VML, il punto preciso in cui i meccanismi di riparazione endogeni non possono più rigenerare il muscolo rimane poco chiaro. Mentre è ragionevole che la definizione possa comportare la rimozione di una certa percentuale del volume del muscolo, e in effetti il 20% è spesso citato, ci sono prove contrastanti e i dati suggeriscono che anche altri fattori, tra cui la posizione e la geometria della lesione, l'età dell'animale, tra gli altri, possono contribuire 16,21,22,23. Nonostante ciò, l'osservazione di cicatrice fibrosa e contrazione visibile del bordo muscolare osservata a 12 settimane dopo l'infortunio (Figura 4A) dimostra che si è verificato un rimodellamento patologico, suggerendo fortemente che le lesioni qui utilizzate sono di dimensioni critiche rispetto alla definizione standard.

Poiché i muscoli craniofacciali negli esseri umani, come i muscoli intrinseci della mano, sono piccoli rispetto ai muscoli degli arti prossimali e svolgono movimenti più precisi, sono più inclini ad avere la loro funzione influenzata dalla VML. Il massetere è stato selezionato in questo protocollo a causa dell'ingombro adeguato per i test e della facilità di accesso. Tuttavia, la geometria e la posizione della lesione sono fattori importanti nella valutazione della VML e le conclusioni generate utilizzando questo modello potrebbero non tradursi direttamente in altri muscoli craniofacciali. Il massetere è un muscolo della masticazione e, sebbene contribuisca all'espressione facciale nei bambini24, il suo ruolo nell'espressione facciale diminuisce nell'età adulta24. Le lesioni ad altri muscoli del viso, come lo zigomatico maggiore, possono causare una maggiore afflizione psicologica dopo la VML a causa del loro ruolo più diretto nell'espressione facciale per tutta la vita rispetto al massetere2 5,26. Inoltre, questo studio non ha valutato la produzione di forza in vivo, una limitazione che è un'area di necessità sul campo. Ad oggi, non è stato riportato alcun metodo riproducibile per il test funzionale del muscolo craniofacciale con una sensibilità sufficiente per confrontare i gruppi di trattamento, e questo è complicato dagli estesi muscoli compensatori all'interno del viso. Gli sviluppi futuri di questo protocollo mireranno a introdurre approcci per misurare direttamente la forza nei singoli muscoli facciali.

I metodi alternativi di analisi istologica del VML massetere in un modello di roditore sono molto limitati. Kim et al. hanno creato un sistema EMG indossabile per valutare la funzionalità dei muscoli masseteri danneggiati da VML nei topi. Tuttavia, il loro punto di tempo terminale era di 4 settimane, non hanno dimostrato la visualizzazione del biomateriale nelle immagini istologiche, non hanno descritto una chiusura fasciale e si sono concentrati principalmente sulla convalida del loro sistema EMG rispetto all'analisi della rigenerazione muscolare e della biocompatibilità dei trattamenti basati su biomateriali17. Sono necessari nuovi trattamenti per la perdita muscolare volumetrica craniofacciale e questo modello di VML massetere è sufficientemente riproducibile per valutare la risposta muscolare alla lesione VML e per valutare gli effetti dei trattamenti sulla rigenerazione, la fibrosi e la contrattura, specialmente nei primi 3 mesi dopo l'infortunio.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è supportata dal programma di borse di studio per la ricerca annuale dell'UCSF e dal programma di progetti traslazionali interdisciplinari C-Doctor. Grazie ai membri del Pomerantz Lab e del Programma di Biologia Craniofacciale dell'Università della California di San Francisco per i loro contributi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
F1.652 Anticorpo monoclonale a catena pesante (embrionale) della miosinaDSHBF1.652
Anticorpo secondario adsorbito incrociato anti-topo di capra, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21242
Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-coniglio di capra IgG (H+L), Alexa Fluor 488InvitrogenA-11034
Punzoni per biopsia standard Integra, punzone per biopsia standard monouso; 5 mm, diametro: 0,19 pollici, 0,5 cmIntegra12460411
Mezzo di montaggio con DAPI - Acquoso, FluoroshieldAbcamab104139
Coniglio Anti-Topo IgG H& L (Alexa Fluor 647) preadsorbitoAbcamab150127
Sulfametossazolo/Trimetoprim sospensione orale, aromatizzato alla ciliegia, 473 mLMed-Vet InternationalCOD: RXBAC-SUSP

Riferimenti

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