Dinamica del cAMP in tempo reale in cellule vive utilizzando il rivelatore di differenza fluorescente cAMP in situ

Summary

Il protocollo presentato in questo studio illustra l'efficacia del cAMP Difference Detector In Situ nella misurazione del cAMP attraverso due metodi. Un metodo utilizza uno spettrofotometro per la lettura di piastre a 96 pozzetti con celle HEK-293. L'altro metodo dimostra le singole cellule HASM sotto un microscopio a fluorescenza.

Abstract

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) è un nuovo biosensore che consente la misurazione continua dei livelli di cAMP nelle cellule viventi. Il biosensore è creato da una proteina fluorescente permutata circolarmente legata alla regione cerniera di Epac2. Questo crea un singolo biosensore fluoroforo che mostra un aumento o una diminuzione della fluorescenza al legame del cAMP. Il biosensore esiste nelle versioni rosse e verdi verso l'alto, così come nelle versioni verdi verso il basso e in diverse versioni rosse e verdi mirate alle posizioni subcellulari. Per illustrare l'efficacia del biosensore, è stata utilizzata la versione verde verso il basso, che diminuisce in fluorescenza dopo il legame con il cAMP. Vengono dimostrati due protocolli che utilizzano questo sensore: uno che utilizza uno spettrofotometro di lettura a piastra a 96 pozzetti compatibile con lo screening ad alto rendimento e un altro che utilizza l'imaging a singola cellula su un microscopio a fluorescenza. Sul lettore di piastre, le cellule HEK-293 coltivate in piastre a 96 pozzetti sono state stimolate con 10 μM di forskolina o 10 nM di isoproterenolo, che ha indotto rapide e ampie diminuzioni della fluorescenza nella versione verde verso il basso. Il biosensore è stato utilizzato per misurare i livelli di cAMP in singole cellule muscolari lisce delle vie aeree umane (HASM) monitorate al microscopio a fluorescenza. Il biosensore verde verso il basso ha mostrato risposte simili a popolazioni di cellule quando stimolato con forskolina o isoproterenolo. Questo test a singola cellula consente la visualizzazione della posizione del biosensore con un ingrandimento di 20x e 40x. Pertanto, questo biosensore di cAMP è sensibile e flessibile e consente la misurazione in tempo reale del cAMP sia in cellule immortalizzate che primarie e con singole cellule o popolazioni di cellule. Questi attributi rendono cADDis uno strumento prezioso per studiare le dinamiche di segnalazione del cAMP nelle cellule viventi.

Introduction

L'adenosina 3',5'-monofosfato ciclico, cAMP, svolge un ruolo centrale nella comunicazione cellulare e nel coordinamento di vari processi fisiologici. Il cAMP agisce come un secondo messaggero, trasmettendo segnali esterni da ormoni, neurotrasmettitori o altre molecole extracellulari per avviare una cascata di eventi intracellulari¹. Inoltre, il cAMP è coinvolto in modo complesso in varie vie di segnalazione, comprese quelle associate ai recettori accoppiati a proteine G (GPCR) e alle adenilil ciclasi. Comprendere il ruolo del cAMP nella segnalazione cellulare è fondamentale per svelare i complessi meccanismi che sono alla base delle normali funzioni cellulari e per lo sviluppo di potenziali terapie per un'ampia gamma di condizioni mediche².

In passato, sono stati impiegati vari metodi per misurare il cAMP direttamente o indirettamente. Questi includevano la radiomarcatura dei pool cellulari di ATP seguita da purificazione della colonna, HPLC, saggi radioimmunologici e saggi immunologici enzimatici ^1,2. Questi saggi legacy sono limitati dal fatto che si tratta di misure end-point, che richiedono un gran numero di campioni per costruire risposte dipendenti dal tempo. Più recentemente, i sensori FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) sono stati sviluppati per creare saggi nelle cellule viventi, producendo dati dinamici in tempo reale e consentendo ai sensori di essere indirizzati in diverse posizioni subcellulari³. FRET sfrutta due fluorofori, un donatore fluorescente e un accettore fluorescente che, quando si trovano nelle immediate vicinanze, il fluoroforo accettore sarà eccitato dall'uscita fluorescente del donatore. I due fluorofori più utilizzati sono la proteina fluorescente ciano (CFP) e la proteina fluorescente gialla (YFP) poiché hanno proprietà di eccitazione ed emissione compatibili. Oltre a CFP e YFP, l'utilizzo della proteina fluorescente verde (GFP) e della proteina fluorescente rossa (RFP) è comunemente utilizzato per i biosensori FRET. I biosensori FRET cAMP funzionano con un donatore e un accettore alle estremità opposte della proteina legante il cAMP Epac2. Il legame cAMP altera la conferma di Epac e aumenta la distanza tra i fluorofori donatore e accettore ^3,4. Questo cambiamento conformazionale è rilevato da una perdita di FRET, cioè dall'eccitazione del fluoroforo accettore da parte dell'energia trasferita dalle gocce di fluoroforo donatore³. Sebbene sia un processo apparentemente semplice, ci sono molte limitazioni e problemi con il biosensore FRET per la ricerca cAMP⁵. Uno dei quali è la selezione di proteine fluorescenti, ad esempio la GFP, che possono dimerizzare naturalmente, riducendo così la sensibilità⁶. I biosensori cAMP basati su FRET sono stati mirati a specifici microdomini⁷, ma potrebbero esserci limitazioni a causa delle grandi dimensioni di un costrutto con due fluorofori⁶. Un altro problema significativo è il basso rapporto segnale/rumore dei segnali FRET risultante dalla sovrapposizione tra eccitazione ed emissione del fluoroforo, con conseguente elevata frequenza di campionamento e complicando l'analisi dei risultati ^4,5.

Più recentemente, il nuovo biosensore (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis ha risolto queste e altre limitazioni quando si tratta di studiare la regolazione della segnalazione cAMP⁸. Un miglioramento importante è la dipendenza da un singolo fluoroforo. Ciò consente di ottenere un segnale rapido ed efficiente con una gamma dinamica più ampia e un elevato rapporto segnale/rumore. Di conseguenza, ci può essere una maggiore precisione in quanto c'è una gamma meno ampia di lunghezze d'onda da pettinare⁸. Come le sonde FRET, il biosensore è stato mirato alle posizioni subcellulari, consentendo la ricerca sulla teoria della compartimentazione e l'esplorazione in zattere lipidiche e non-zattere e altri domini subcellulari⁹. Forse la cosa più importante è l'idoneità di un singolo biosensore fluoroforo per lo screening ad alto rendimento, che ha migliorato la sensibilità e la riproducibilità rispetto ai biosensori basati su FRET. Il biosensore è inserito in un vettore BacMam per una facile trasduzione di un'ampia gamma di tipi di cellule e un controllo preciso sull'espressione proteica.

Il controllo dell'espressione tramite il vettore BacMam può essere particolarmente utile nei saggi che utilizzano ortologhi GPCR di specie diverse per facilitare l'interpretazione dei dati provenienti da studi sugli animali. Inoltre, il controllo sull'espressione dei recettori è fondamentale per misurare i diversi gradi di efficacia dei farmaci (ad esempio, agonisti inversi e agonisti parziali), e bassi livelli di espressione dei recettori sono utili per imitare i bassi livelli riscontrati nei tessuti animali. BacMam è un vettore di baculovirus che è stato modificato per trasdurre cellule di mammifero come colture cellulari primarie e linee HEK-293¹⁰. I marcatori dominanti selezionabili consentono a BacMam di fornire una maggiore stabilità rispetto alle tradizionali infezioni plasmidiche¹¹. Tali promotori selettivi consentono una consegna e un'espressione genica più efficienti. Inoltre, l'aggiunta di tricostatina A (un inibitore dell'istone deacetilasi) aumenta i livelli di proteina reporter¹¹. I livelli di espressione possono essere controllati tramite il titolo del virus BacMam utilizzato e devono essere ottimizzati per ogni tipo di cellula. Nel caso di questo biosensore, una proteina fluorescente rossa o verde è legata all'Epac ai terminali N e C. Quando il cAMP si lega, un cambiamento conformazionale nel biosensore sposta gli amminoacidi adiacenti alla proteina fluorescente. Tale spostamento sposta l'assorbanza dallo stato anionico allo stato neutro a 400 nm, diminuendo così la fluorescenza.

Ci sono 90-120 GPCR espressi in una singola cellula che rispondono a un'ampia varietà di segnali neuroumorali¹². Pertanto, si può ipotizzare che almeno diverse dozzine di GPCR per cellula possano stimolare o inibire il cAMP attraverso l'accoppiamento Gs o Gi, rispettivamente. Sebbene siano stati compiuti progressi nel monitoraggio di questo secondo messenger in tempo reale, come FRET, sono necessari metodi più efficienti. Qui viene presentata la metodologia per monitorare la sintesi e la degradazione dei segnali cAMP utilizzando cADDis in tempo reale. La variazione della fluorescenza può essere monitorata in tempo reale utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza per saggi ad alta produttività o utilizzando un microscopio a fluorescenza per saggi su singola cellula. Questi metodi sono utili per un'ampia gamma di questioni biologiche riguardanti la segnalazione GPCR tramite cAMP.

Protocol

I dettagli di tutti i reagenti e le attrezzature utilizzate per lo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Saggio ad alto rendimento con spettrofotometro a lettura su piastra

1. Semina di cellule HEK-293 con il vettore cADDis BacMam in una piastra a 96 pozzetti (Giorno 1)
   1. Dividere e infettare le cellule in un cappuccio virale.
      1. Caldo in HEK (Tabella 1) e tripsina-EDTA allo 0,25% in un bagno d'acqua a 37 °C.
      2. Disinfettare la cappa e i materiali strofinandoli con fazzoletti imbevuti di EtOH.
      3. Rimuovere ed eliminare il terreno HEK dal pallone con una pipetta sierologica.
      4. Aggiungere 5 mL di DPBS libero da Mg²⁺ e Ca²⁺ (37 °C) con una pipetta sierologica. Inclinare il pallone avanti e indietro per lavare il fondo con DPBS. Rimuovere ed eliminare DPBS con una pipetta sierologica.
      5. Tripsinizzare le cellule aggiungendo 3 mL di tripsina-EDTA riscaldata allo 0,25% con una pipetta sierologica. Inclinare il pallone per assicurarsi che il reagente ricopra completamente il fondo del pallone. Mettere il coperchio sul pallone e lasciare riposare il reagente per 3-5 minuti per consentire alle cellule di staccarsi dal pallone.
         NOTA: Questo esperimento è ottimizzato per un pallone da 75 cm² ; Potrebbe essere necessario effettuare aggiustamenti del volume dei reagenti se si utilizza un apparato di coltura di dimensioni diverse.
      6. Aspirare 5 ml di terreno fresco contenente antibiotici. Espellere e prelevare il volume del pallone per lavare le pareti del pallone e staccare fisicamente le cellule.
      7. Raccogliere il volume totale del matraccio (8 mL) e centrifugare (25 °C) in una provetta da 15 mL a 200 x g per 5 minuti.
      8. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante con una pipetta sierologica, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
      9. Per lavare le celle senza disturbare il pellet, aggiungere 500 μL di DPBS senza Mg²⁺ e Ca²⁺ DPBS sul lato della provetta da 15 mL. Dopo aver aggiunto delicatamente il DPBS, rimuovere ed eliminare quanto più tampone possibile senza disturbare il pellet. Ripeti ancora una volta.
      10. Contare le cellule e regolare fino a una densità cellulare di 250.000 cellule/mL di cellule.
      11. Preparare una miscela master in base ai volumi di reagente necessari per pozzetto di una piastra nera trasparente a 96 pozzetti. Questo è indicato come "piastra di tessuto". Vedi i volumi qui sotto:
          NOTA: Esempio di 1 pozzetto (volume totale 200 μL): 40 μL del vettore BacMam del biosensore (stock di 2 x 10¹⁰ geni virali/mL), 2 μL di tricostatina A (stock di 100 μM; concentrazione finale 1 μM), 158 μL di densità cellulare di 250.000 cellule/mL. Esempio di 10 pozzetti (volume totale 2 mL): 400 μL del vettore BacMam del biosensore (stock di 2 x 10¹⁰ geni virali/mL), 20 μL di tricostatina A (stock di 100 μM), 1.580 μL di terreno con densità cellulare di 250.000 cellule/mL.
      12. Aggiungere 200 μl di master mix per pozzetto. Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO₂ in un incubatore per 24 ore prima di utilizzarle sullo spettrofotometro a lettura di piastre.
2. Esecuzione su un lettore di targhe
   1. Su un banco, rimuovere con cautela tutti i terreni in ciascun pozzetto e sostituirli con 180 μl di DPBS con Mg²⁺ e Ca²⁺ a 37 °C.
   2. Ispeziona le cellule al microscopio per confermare la salute delle cellule.
   3. Avvolgere la piastra in un foglio di alluminio e incubare a 37 °C per 30 min-1 h.
   4. Durante l'incubazione, preparare i farmaci per la lettura a diluizione 1:10 (detta anche 10 volte) per la dose finale desiderata. Quindi, preparare 100 μM di forskolina e 100 nM di isoproterenolo.
   5. Aggiungere 60 μl di ciascun farmaco in modo colonnare a una piastra trasparente a 96 pozzetti (denominata "piastra del farmaco").
      NOTA: Con l'adeguata diluizione del farmaco e per ottimizzare la lettura, i farmaci vengono aggiunti a una piastra trasparente a 96 pozzetti, denominata "piastra del farmaco", per essere trasferiti al momento della lettura alla "piastra di tessuto" utilizzando un pipettatore multiplo a 96, consentendo al farmaco di essere aggiunto a tutti i pozzetti contemporaneamente e di essere letto rapidamente dallo spettrofotometro fluorescente.
3. Configurazione del lettore di piastre a fluorescenza
   1. Regolare le impostazioni del lettore di piastre a fluorescenza.
      1. Modalità di lettura: fluorescenza. Tipo di lettura: cinetico. Lettura delle lunghezze d'onda: 494 nm e 522 nm.
      2. Tempo di lettura: Inserire 3 minuti per la lettura fluorescente di base e 7 minuti per l'aggiunta post-farmaco. Intervallo" viene immesso come 00:00:30 per 30 s tra ogni lettura.
         NOTA: Il tempo di lettura può essere ottimizzato e aumentato in base al tempo richiesto.
4. Acquisizione dati
   1. Rimuovere la piastra di tessuto dall'incubatrice, rimuovere il foglio di alluminio e il coperchio della piastra e posizionare la piastra di tessuto nel lettore di piastre. Chiudere il cassetto del lettore per consentire alla piastra di tessuto di riposare e bilanciarsi alla temperatura del lettore (37 °C).
   2. Posizionare la piastra trasparente a 96 pozzetti (piastra per farmaci) con le diluizioni del farmaco sotto la pipetta multipla a 96 e fare pratica con l'estrazione di 20 μl dai pozzetti. Assicurarsi che ci sia un volume uniforme di farmaco aspirato nelle punte del pipettatore.
   3. Avviare un'esecuzione di misurazione "di base".
      NOTA: 40 RFU o superiori sono considerati dati validi. Se i dati sono inferiori a questo valore, l'esperimento deve essere interrotto ed eliminato.
   4. La piastra di tessuto verrà espulsa dal lettore al termine dell'esecuzione di base. Aggiungere rapidamente e con attenzione 20 μl dalla piastra del farmaco trasparente alla piastra di tessuto nero. Quindi, inizia rapidamente la corsa di "trattamento". La piastra di tessuto non deve essere fuori dal lettore per più di 30 secondi dopo l'aggiunta dei farmaci.
      NOTA: Se il farmaco viene aggiunto troppo rapidamente, le cellule si staccano dalla piastra di tessuto, creando un esperimento inutilizzabile. Inoltre, le cellule sono infettate da una proteina fluorescente verde sensibile alla luce; Pertanto, l'aggiunta rapida e tempestiva dei farmaci e l'inizio della seconda lettura sono imperativi per evitare di perdere la parte iniziale della risposta.
   5. Una volta completata la seconda lettura, assicurarsi che la piastra di tessuto sia espulsa dal lettore e che la raccolta dei dati sia conclusa.
      NOTA: Prima di smaltire la piastra di tessuto, è buona norma verificare che le cellule siano ancora attaccate alla piastra. Osserva le cellule al microscopio. Se le celle si staccano, i risultati non sono validi e devono essere eliminati. L'esperimento dovrà essere ripetuto.
   6. Esporta i dati risultanti come file Excel.
   7. Apri i dati leggibili in Excel esportati dal lettore di lastre e copia e incolla le informazioni rilevanti nel modello di conversione Excel. I dati si trasformeranno dalla configurazione del lettore di piastre a un singolo pozzetto, con le letture delle colonne a destra dei dati copiati.
      NOTA: Le colonne di fluorescenza per un pozzo nel tempo sono elencate in RFU (trasformazione di colonna titolata) e come variazione decimale relativa alla lettura RFU alla lettura iniziale (t₀ intitolato Delta F). Nel modello Excel, la tabella Delta F è impostata sull'ultima lettura di base prima dell'aggiunta del farmaco. Questo è il 6° punto di^{raccolta dati.}
   8. Dopo la trasformazione dei dati, copiare i dati da Delta F e incollarli nel software di analisi dei dati come decadimento o decadimento relativo in fluorescenza nel tempo.
   9. Modificare il titolo X in "time (s)" e il titolo Y in "ΔF/F₀" per i valori decimali relativi.

2. Saggio su singola cellula utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita

1. Semina di cellule (HASM) con il vettore cADDis BacMam in una piastra da 35 mm (Giorno 1)
   1. Dividere e infettare le cellule in un cappuccio virale.
      1. Terreno HASM caldo (Tabella 1), tripsina-EDTA allo 0,25% in un bagno d'acqua a 37 °C.
      2. Disinfettare la capottina e i materiali e pulire la calotta con fazzoletti imbevuti di EtOH.
      3. Rimuovere ed eliminare il terreno HASM dal matraccio con una pipetta sierologica.
      4. Aggiungere 5 mL di DPBS libero da Mg²⁺ e Ca²⁺ (37 °C) con una nuova pipetta sierologica e inclinare il pallone per lavare il fondo con il DPBS.
      5. Tripsinizzare le cellule aggiungendo 3 mL di tripsina-EDTA riscaldata allo 0,25% con una pipetta sierologica. Inclinare il pallone per assicurarsi che il reagente ricopra completamente il fondo del pallone. Lasciare riposare il reagente per 3-5 minuti per consentire alle cellule di staccarsi dal pallone.
      6. Aspirare 5 mL di terreno fresco contenente antibiotici ed espellere la pipetta per rimuovere le cellule dal fondo del pallone.
      7. Raccogliere il volume totale della centrifuga in un pallone da centrifuga a 200 x g per 5 minuti.
      8. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante con una pipetta sierologica, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
      9. Senza disturbare il pellet, aggiungere 500 μL di DPBS senza Mg²⁺ e Ca²⁺ DPBS sul lato della provetta da centrifuga. Rimuovere ed eliminare quanto più liquido possibile e ripetere ancora una volta.
         NOTA: Questo esperimento è ottimizzato per un pallone da 75 cm² ; Potrebbe essere necessario effettuare aggiustamenti del volume dei reagenti se si utilizza un apparato di coltura di dimensioni diverse.
      10. Contare le cellule e regolare la densità a 40.000 cellule/mL.
      11. Preparare una miscela master in base al volume di reagente necessario per pozzetto di una piastra da 35 mm. Vedi i volumi qui sotto:
          NOTA: Esempio di 1 pozzetto (volume totale 500 μL): 20 μL del vettore BacMam del biosensore (stock di 2 x 10¹⁰ geni virali/mL), 5 μL di tricostatina A (stock di 100 μM, concentrazione finale 1 μM), 500 μL di densità cellulare di 40.000 cellule/mL. Esempio per 4 pozzetti (volume totale 2 mL): 80 μL del vettore BacMam del biosensore (stock di geni virali/mL), 20 μL di tricostatina A (stock di 100 μM, concentrazione finale 1 μM), 2000 μL di terreno 40.000 cellule/mL di densità cellulare.
      12. Aggiungere 500 μl di miscela master per pozzetto. Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO₂ per 24 ore prima di continuare l'esperimento.
          NOTA: Il numero di celle può variare in base alla linea cellulare. Per evitare la sovrapposizione di celle per l'analisi, utilizzare un numero di celle basso.
2. Preparazione degli agenti farmacologici (Giorno 2)
   1. Rimuovere con cautela il terreno in ciascun pozzetto e sostituirlo con 450 μl di DPBS con Mg²⁺ e Ca²⁺ a 37 °C.
   2. Avvolgere la piastra in un foglio di alluminio e incubare il disco da 35 mm a 37 °C per 30 min-1 h.
   3. Ispeziona le cellule al microscopio per confermare la salute delle cellule.
   4. Nel frattempo, preparare i farmaci per la lettura di 1 unità logaritmica al di sopra della concentrazione finale desiderata (10 volte maggiore). Quindi, preparare 100 μM di forskolina e 100 nM di isoproterenolo.
   5. Per i titoli di dose logaritmica, preparare il farmaco a 10 mM e utilizzare diluizioni seriali per ottenere 100 μM di forskolina e 100 nM di isoproterenolo.
3. Acquisizione dati
   NOTA: Le seguenti impostazioni si riferiscono a un microscopio invertito fluorescente. Il software che accompagna ogni microscopio può differire; Le impostazioni generali utilizzate nel protocollo corrente sono descritte qui.
   1. Accendere il mozzo centrale, quindi il microscopio a fluorescenza invertito.
   2. Apri il software che verrà utilizzato per l'acquisizione e scegli l'opzione di acquisizione time-lapse .
   3. Posizionare un portacampione da 35 mm nel tavolino del microscopio.
   4. Impostare la lente dell'obiettivo su x20.
   5. Usa l'autofocus e ottieni un'immagine il più chiara possibile. Se è difficile trovare le singole celle, inizia con un obiettivo 4x, quindi passa a 20x. Mettere a fuoco manualmente il campione se il microscopio non dispone di una funzione di messa a fuoco automatica.
      NOTA: L'ingrandimento di 40x può essere utilizzato se sono necessari dettagli morfologici cellulari più significativi.
   6. Regolare le seguenti impostazioni per ottenere un'acquisizione ottimale dei dati: Luminosità automatica (esposizione), Lunghezza d'onda di eccitazione, Bilanciamento del nero (per ridurre il rumore di fondo), Messa a fuoco automatica.
   7. Dopo aver trovato un'area di vista con diverse cellule citoplasmatiche fluorescenti, acquisire i dati utilizzando l'acquisizione time-lapse per 20 minuti ogni 30 s.
   8. Clicca su vai per iniziare la lettura.
   9. Corri per 3 minuti per raccogliere la linea di base. Non appena viene eseguita la cattura di 3 minuti, aggiungere delicatamente 50 μl di farmaco nel pozzetto appropriato. Quando i farmaci vengono aggiunti, la concentrazione finale sulla piastra sarà di 10 μM di forskolina e 10 nM di isoproterenolo.
      NOTA: Il farmaco deve essere aggiunto con attenzione; Non toccare la piastra con la punta della pipetta, poiché ciò potrebbe spostare il campo visivo realizzato e rendere impossibile l'analisi del campione.
   10. Lasciare l'esperimento in esecuzione per altri 17 minuti con l'acquisizione dei dati ogni 30 s.
   11. Una volta completato il test, assicurarsi che i dati siano pronti per l'analisi.
       NOTA: Sebbene l'attuale protocollo non incorpori un controllo per la deriva focale, potrebbe essere utile includerne uno nell'esperimento. Ad esempio, l'uso di coloranti nucleari può aiutare a gestire la deriva focale durante l'analisi al microscopio, specialmente quando si acquisiscono immagini di cellule vive per periodi prolungati. I biosensori cADDis sono in genere ampiamente distribuiti all'interno della cellula, rendendo un piano focale ampio l'acquisizione più efficace e riducendo la necessità di controllare la deriva focale⁹.
4. Analisi dei dati
   NOTA: Il software fornito con ciascun microscopio può differire, quindi le impostazioni generali che devono essere utilizzate per analizzare le immagini acquisite sono descritte qui.
   1. Aprire i file di immagine acquisiti durante l'esperimento.
   2. Utilizzare lo strumento poligono o cerchio per selezionare la regione di interesse di ciascuna cella per eseguire l'analisi. L'analisi dovrebbe fornire la luminosità di ciascuna cella in ogni punto temporale.
      NOTA: La migliore pratica consiste nel selezionare singole celle e non celle che toccano la parete della piastra o altre celle. Ciò garantisce la migliore raccolta di dati possibile. Selezionare un minimo di 5 celle per l'analisi all'interno di ciascuna condizione e replicare l'esperimento almeno tre volte.
   3. Dopo aver analizzato i dati, apri i dati in un foglio Excel e calcola la luminosità media per ogni condizione ad ogni foto, iniziando dall'immagine appena prima di aggiungere gli agenti farmacologici o il veicolo. In questo esempio, al minuto 3 o alla sesta^foto scattata al microscopio, poiché ogni foto viene scattata ogni 30 s.
   4. Calcola ΔF/F₀ per ogni valore medio in ogni condizione.
   5. Caricare in un software di analisi statistica e tracciare ΔF/F₀ rispetto al tempo in s.
      NOTA: La Figura 1 fornisce una panoramica schematica dei passaggi principali dei protocolli.

Results

Il presente studio ha convalidato il biosensore citosolico sia in saggi con lettore di piastre che al microscopio. Una volta che le cellule hanno espresso il biosensore, sono state stimolate con 10 μM di forskolina (un attivatore diretto dell'adenilil ciclasi), 10 nM di isoproterenolo (un agonista a ß₁AR e ß₂AR) o veicolo (Figura 1). Le successive variazioni della fluorescenza, indicative della produzione di cAMP, sono state catturate ogni 30 s.

I dati sono stati trasformati come la variazione della fluorescenza rispetto alla fluorescenza iniziale (ΔF/F₀). Ai dati di fluorescenza è stato applicato un modello di decadimento a un sito per quantificare le variazioni temporali dei livelli di cAMP nelle diverse condizioni (Figura 2 e Figura 3). I parametri di queste curve di decadimento possono essere utilizzati per quantificare la risposta a una data concentrazione del farmaco. È stato utilizzato il prodotto del tasso di decadimento (k) e del plateau come un singolo valore che quantifica la risposta al farmaco, e questi sono stati utilizzati per creare curve concentrazione-risposta quando vengono applicate più concentrazioni dello stesso farmaco¹³.

Sul lettore di piastre, dopo stimolazione con 10 μM di forskolina, il sensore citosolico ha mostrato una notevole diminuzione dell'intensità della fluorescenza in pochi secondi ed è progredito nell'arco di molti minuti (dal basale 0 ΔF/F_o a 200 s a -0,7 ΔF/F_o a 600 s) nelle cellule HEK-293 (Figura 2A). Dato il design del sensore verde, una diminuzione della fluorescenza indica un aumento della produzione di cAMP, indicando che la forskolina ha causato un aumento uniforme dei livelli di cAMP nel citosol. La stimolazione delle cellule HEK-293 con una concentrazione sub-massima di isoproterenolo (10 nM) ha portato a diminuzioni rapide ma più piccole della fluorescenza del biosensore (-0,3 ΔF/F_o a 600 s, Figura 2A). Quando queste concentrazioni più basse di isoproterenolo (10 nM e 100 nM) sono state esaminate in un singolo pozzetto di cellule nel tempo, sono state osservate oscillazioni dei livelli di cAMP nelle cellule HEK-293 (Figura 2B). La periodicità di queste oscillazioni era costantemente intorno ai 200 s. L'analisi dei dati di routine include l'adattamento della risposta a un modello di decadimento di un singolo sito, che calcola la media di queste oscillazioni (vedi linea di collegamento). La media di più esperimenti insieme ha tipicamente portato a queste oscillazioni che vengono oscurate nei dati. Ciononostante, il biosensore mostra una sensibilità e una cinetica rapide che consentono l'osservazione delle oscillazioni del cAMP.

I cADDis possono essere misurati anche utilizzando un microscopio a fluorescenza. Questo approccio consente il monitoraggio del cAMP in singole cellule e può anche essere adattato per visualizzare biosensori mirati a diverse posizioni subcellulari. Nel presente studio, il biosensore è stato utilizzato nelle cellule primarie della muscolatura liscia delle vie aeree umane (HASM). La stimolazione dell'HASM con uno dei due veicoli, 10 μM di forskolina o 10 nM di isoproterenolo porta a una diminuzione osservabile dell'intensità della fluorescenza nel tempo (dal basale 0 ΔF/F_o a 120 s a -0,9 ΔF/F_o a 410 s) (Figura 3) (Video 1, Video 2 e Video 3). La fluorescenza è distribuita uniformemente in tutto il citosol delle cellule ed esclude il nucleo (vedi i video time-lapse). Pertanto, la forskolina e l'isoproterenolo hanno prodotto una diminuzione rapida e considerevole delle cellule HASM a fluorescenza. Questi dati dimostrano la capacità di utilizzare il biosensore in colture cellulari primarie.

Figura 1: Rappresentazione schematica delle fasi del protocollo del biosensore. Inizialmente, le cellule di coltura vengono divise e risospese con terreni freschi, quindi infettate con il virus BacMam che trasporta i sensori cADDis. Le cellule post-trasfezione vengono stimolate con agenti farmacologici che innescano percorsi cellulari che alterano il cAMP. Le variazioni dell'intensità della fluorescenza in risposta alla variazione della concentrazione di cAMP vengono catturate utilizzando uno spettrofotometro a lettura di piastre (A) o un microscopio a fluorescenza (B), fornendo una quantificazione in tempo reale della dinamica del cAMP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Monitoraggio in tempo reale del cAMP in celle HEK-293 vive su uno spettrofotometro a lettura di piastra. La fluorescenza delle cellule HEK-293 su piastre a 96 pozzetti che esprimono il biosensore è stata misurata nel tempo. Dopo che la fluorescenza al basale è stata stabilita, il decadimento della fluorescenza è stato monitorato per 7 minuti. (A) Il decadimento della fluorescenza dopo l'aggiunta di 10 μM di forskolina o 10 nM di isoproterenolo è tracciato come il SEM medio ± di 10-15 esperimenti. (B) Le oscillazioni di decadimento della fluorescenza sono mostrate tracciando un singolo esperimento dopo l'aggiunta di 10 nM o 100 nM di isoproterenolo. I dati in entrambi i grafici sono adattati a un modello di decadimento di un singolo sito (linea di collegamento). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Monitoraggio in tempo reale del cAMP in cellule HASM vive su un microscopio a fluorescenza. La fluorescenza delle cellule HASM su piastre da 35 mm che esprimono il biosensore è stata misurata nel tempo. Dopo aver stabilito i valori basali, il decadimento della fluorescenza è stato misurato ogni 30 s per 20 minuti. L'agente indicato è stato aggiunto a 120 s (freccia). Le curve di decadimento della fluorescenza del biosensore in risposta a entrambi i veicoli, 10 μM di forskolina o 10 nM di isoproterenolo. I dati di un singolo esperimento vengono visualizzati con una linea di collegamento. Sono inclusi video time-lapse di cellule trattate con veicolo (controllo), forskolina o isoproterenolo per fornire una rappresentazione visiva delle risposte fluorescenti del biosensore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Video time-lapse del monitoraggio in tempo reale del cAMP in celle HASM in tempo reale in risposta al veicolo. Curve di decadimento della fluorescenza del biosensore in risposta al veicolo (controllo). Ogni fotogramma è stato catturato ogni 30 s per 20 minuti. Barra di scala: 40 μM. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 2: Video time-lapse del monitoraggio in tempo reale del cAMP in cellule HASM vive in risposta a 10 μM di forskolina. Curve di decadimento della fluorescenza del biosensore in risposta a 10 μM di forskolina. Ogni fotogramma è stato catturato ogni 30 s per 20 minuti. Barra di scala: 40 μM. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 3: Video time-lapse del monitoraggio in tempo reale del cAMP in cellule HASM vive in risposta a 10 nM di isoproterenolo. Curve di decadimento della fluorescenza del biosensore in risposta all'isoproterenolo 10 nM. Ogni fotogramma è stato catturato ogni 30 s per 20 minuti. Barra di scala: 40 μM. Clicca qui per scaricare questo video.

Formulazione dei terreni
HASM medio
Nome	Volume
F-12K di Ham	419,65 ml
FBS	50 ml
HEPES (1M)	12,5 ml
Soluzione di idrossido di sodio	6 ml
L-glutammina 200 mM (100X)	5 ml
Cloruro di calcio (1 M)	0,850 ml
Antibiotico-antimicotico (100X)	5 ml
Primocina	1 ml
HEK medio
Nome	Volume
DMEM (1x)	444 ml
FBS	50 ml
Antibiotico-antimicotico (100X)	5 ml
Primocina	1 ml

Tabella 1: Formulazione dei terreni di HASM e HEK.

Discussion

Una misurazione accurata e sensibile del cAMP è fondamentale per comprendere il suo ruolo in vari processi cellulari e per studiare l'attività delle vie di segnalazione dipendenti dal cAMP. Esistono diversi metodi comunemente impiegati per misurare i livelli di cAMP, tra cui ELISA, test radioimmunologico, biosensori FRET e il test cAMP GloSensor 14,15,16,17,18. Ogni test cAMP presenta punti di forza e di debolezza. Il protocollo consente il rilevamento e il monitoraggio in tempo reale, che vanno da minuti a ore, e la misurazione della dinamica del cAMP all'interno delle cellule viventi senza la necessità di includere inibitori della fosfodiesterasi. Quest'ultimo punto è fondamentale per i ricercatori interessati a studiare il ruolo delle isoforme della fosfodiesterasi nella regolazione del segnale del cAMP¹⁹. Il biosensore è disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali) in diverse versioni: un fluoroforo verde che riduce la fluorescenza al legame con il cAMP, un fluoroforo rosso che mostra una maggiore fluorescenza al legame con il cAMP e un fluoroforo verde che mostra una maggiore fluorescenza al legame con il cAMP. La versione discendente del biosensore è molto utile poiché il principale fattore limitante è il livello di espressione del biosensore, e questa versione mostrerà la massima fluorescenza al basale prima di iniziare un esperimento, alleviando la necessità di valutare l'espressione del biosensore aggiungendo uno stimolo cAMP massimale. Il biosensore è disponibile anche in versioni mirate ai microdomini di membrana, alle ciglia primarie o al nucleo. Queste diverse versioni consentono di misurare il cAMP contemporaneamente nei compartimenti citosolico e membrana/ciliale all'interno della stessa cellula. Questi nuovi strumenti sono particolarmente abili nella visualizzazione e quantificazione delle dinamiche del cAMP in diversi componenti cellulari, un'area di studio importante e in rapida evoluzione²⁰.

I biosensori offrono un metodo semplice per monitorare efficacemente le dinamiche del cAMP in tempo reale, consentendo ai ricercatori di osservare rapidi cambiamenti nei livelli di cAMP con un'eccezionale risoluzione temporale. Uno dei principali punti di forza del biosensore risiede nella sua elevata sensibilità, che consente di rilevare variazioni sia sottili che significative nelle concentrazioni di cAMP⁸. Un esempio di ciò nelle oscillazioni del cAMP si osserva a bassi livelli di stimolo isoproterenolo nelle cellule HEK-293 senza la presenza di inibitori della fosfodiesterasi (Figura 2B). Questo comportamento oscillatorio non è compreso e sembra unico per queste cellule, ma la sensibilità e la cinetica rapida del biosensore ne consentono il rilevamento. Va notato, tuttavia, che il biosensore può essere facilmente saturato, quindi questo biosensore può essere limitato nel quantificare le differenze tra segnali cAMP medi e grandi. Questa caratteristica limitante è particolarmente rilevante quando si impiegano inibitori della fosfodiesterasi che causano aumenti globali dei livelli di cAMP quando è presente anche uno stimolo recettoriale. Mentre presentiamo l'infezione da HASM in questo studio, è importante riconoscere la sfida associata all'infezione delle cellule primarie utilizzando il vettore BacMam. Le condizioni devono essere ottimizzate per i singoli tipi di cellule al fine di ottenere un'espressione sufficiente del biosensore. Tuttavia, la sensibilità e la scalabilità del biosensore lo rendono adatto per saggi ad alto rendimento.

Un altro miglioramento dell'utilizzo di questo biosensore rispetto ai sensori basati su FRET è la riduzione al minimo del fotosbiancamento. Molti biosensori fluorescenti sono soggetti a fotosbiancamento a seguito di eccitazione prolungata e ripetuta. I protocolli qui descritti prevedono eccitazioni di breve durata distanziate di 30 s l'una dall'altra. Il biosensore è anche estremamente luminoso, limitando così il potenziale fotobleaching per questo tipo di analisi. Il fotosbiancamento verrebbe osservato durante la linea di base iniziale letta come una deriva. Se si verificasse una deriva di base, si potrebbe sottrarre la linea di base di deriva dai dati prima di adattare la curva o aumentare l'intervallo di campionamento per ridurre la frequenza di eccitazione.

Come altri biosensori cAMP, questo biosensore ha un'elevata specificità per il legame con il cAMP. Di conseguenza, i segnali generati da questo test sono direttamente correlati ai livelli di cAMP, riducendo significativamente la potenziale interferenza da altri componenti cellulari e fornendo risultati affidabili. Inoltre, vale la pena sottolineare la versatilità del biosensore. Sebbene il test GloSensor sia ampiamente utilizzato sul campo, presenta alcune limitazioni. Ad esempio, affidarsi alla trasfezione transitoria può comportare inefficienze in tipi di cellule specifiche e l'analisi di più parametri o processi all'interno della stessa cellula è una sfida. Inoltre, il test si basa sugli enzimi della luciferasi che possono essere influenzati da determinati composti, portando potenzialmente a una compromissione dell'accuratezza dei risultati²¹. D'altra parte, il biosensore può essere impiegato in vari tipi di cellule e sistemi sperimentali, comprese le celle aderenti e in sospensione. La sua compatibilità con diversi contesti cellulari consente ai ricercatori di studiare le dinamiche del cAMP in diversi sistemi biologici 22,23,24. L'integrazione di questo test del biosensore con la microscopia a fluorescenza ne migliora ulteriormente l'utilità, poiché è possibile raccogliere anche informazioni morfologiche cellulari 25,26,27.

Questo test offre ai ricercatori una grande flessibilità nella progettazione sperimentale, consentendo un'ampia gamma di indagini relative alla segnalazione del cAMP. Serve a molteplici scopi, consentendo la misurazione dei livelli basali di cAMP, lo studio delle fluttuazioni del cAMP in risposta a diversi stimoli o trattamenti e l'esplorazione della dinamica del cAMP in varie condizioni fisiologiche o patologiche. Uno dei principali punti di forza del test è la sua compatibilità con altre tecniche, che consente una comprensione più completa della segnalazione cAMP. Combinando il biosensore con metodi come la colorazione in immunofluorescenza o la manipolazione genetica¹⁰, i ricercatori possono ottenere informazioni più approfondite sulla precisa regolazione spaziale e temporale del cAMP all'interno di specifici compartimenti cellulari o vie di segnalazione. Attraverso questa integrazione, i ricercatori possono studiare le diverse funzioni del cAMP in vari contesti, portando a preziose intuizioni sulla complessità dei processi cellulari mediati dal cAMP. L'impiego di queste tecniche consente ai ricercatori di visualizzare e quantificare i livelli di cAMP sia a livello di singola cellula che di popolazione, offrendo una comprensione completa della sua distribuzione all'interno della cellula, compresa l'identificazione dei pool di cAMP. Di conseguenza, la combinazione di questi metodi consente l'acquisizione di dati precisi, contribuendo in modo significativo alla nostra conoscenza della segnalazione cAMP.

Mentre i metodi tradizionali sono stati preziosi per l'analisi del cAMP, l'introduzione dei cADDis rappresenta un progresso promettente in questo campo. La sua specificità, sensibilità e capacità in tempo reale lo rendono un'aggiunta preziosa al kit di strumenti del ricercatore, in particolare grazie alla sua compatibilità con le cellule viventi. Grazie alla capacità di monitorare i livelli di cAMP in tempo reale e alla sua elevata sensibilità, il biosensore offre un vantaggio significativo in vari contesti sperimentali. Questi progressi contribuiscono a una comprensione più profonda della natura dinamica della segnalazione del cAMP e delle sue implicazioni funzionali nei processi sia fisiologici che patologici.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastra a 96 pozzetti (trasparente)	Fisherbrand	21-377-203
Piastra da 35 mm	Greiner Bio-One	627870	Piastre per colture cellulari con fondo in vetro
Piastra a 96 pozzetti	Corning	3904	Nero con fondo piatto trasparente
Antibiotico-Antimicotico (100x)	Gibco	15240062	Per terreni HEK e HASM
Microscopio a fluorescenza BZ-X	Keyence
Cloruro di calcio (IM)	Quality Biological Inc	E506	Per terreni HASM
Provetta da centrifuga (15 mL)	Thermo Scientific	339651
DMEM ( 1x)	Gibco	11965092	HEK media
DPBS con Mg2+ e Ca2+	Gibco	14040-133
DPBS senza Mg2+ e Ca2+	Corning	14040-133
Siero fetale bovino (FBS)	R& Sistemi D	S11195	per terreni HEK e HASM
Forskolin	Millipore	344270
Farmaco Green Down cADDis cAMP Kit di analisi	Montana Molecolare	#D0200G	Reagente
F-12K	Gibco	21127022	Per terreni HASM
HEPES (1M)	Gibco	15630080	Per terreni HASM
Isoproterenolo	Sigma	I6504	Farmaco
L-glutammina 200 mM (100x)	Gibco	25030-081	Per terreni HASM
Provetta per microcentrifuga (2 mL)	Eppendorf	22363352
Primocin	Invitrogen	ant-pm-1	Antibiotico per terreni HASM
RNAsi via	Thermo Scientific		700511 Reagente
Soluzione di idrossido di sodio	Sigma	S2770	Per mezzi HASM
Lettore di piastre Spectrmax M5	Molecular Devices Tricostatina
A	TCI America	T2477	Reagente
Tripsina EDTA	Gibco	25200-056