Il protocollo presentato in questo studio illustra l'efficacia del cAMP Difference Detector In Situ nella misurazione del cAMP attraverso due metodi. Un metodo utilizza uno spettrofotometro per la lettura di piastre a 96 pozzetti con celle HEK-293. L'altro metodo dimostra le singole cellule HASM sotto un microscopio a fluorescenza.
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Articolo metodologico
Dinamica del cAMP in tempo reale in cellule vive utilizzando il rivelatore di differenza fluorescente cAMP in situ
In questo articolo
Sommario
Abstract
cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) è un nuovo biosensore che consente la misurazione continua dei livelli di cAMP nelle cellule viventi. Il biosensore è creato da una proteina fluorescente permutata circolarmente legata alla regione cerniera di Epac2. Questo crea un singolo biosensore fluoroforo che mostra un aumento o una diminuzione della fluorescenza al legame del cAMP. Il biosensore esiste nelle versioni rosse e verdi verso l'alto, così come nelle versioni verdi verso il basso e in diverse versioni rosse e verdi mirate alle posizioni subcellulari. Per illustrare l'efficacia del biosensore, è stata utilizzata la versione verde verso il basso, che diminuisce in fluorescenza dopo il legame con il cAMP. Vengono dimostrati due protocolli che utilizzano questo sensore: uno che utilizza uno spettrofotometro di lettura a piastra a 96 pozzetti compatibile con lo screening ad alto rendimento e un altro che utilizza l'imaging a singola cellula su un microscopio a fluorescenza. Sul lettore di piastre, le cellule HEK-293 coltivate in piastre a 96 pozzetti sono state stimolate con 10 μM di forskolina o 10 nM di isoproterenolo, che ha indotto rapide e ampie diminuzioni della fluorescenza nella versione verde verso il basso. Il biosensore è stato utilizzato per misurare i livelli di cAMP in singole cellule muscolari lisce delle vie aeree umane (HASM) monitorate al microscopio a fluorescenza. Il biosensore verde verso il basso ha mostrato risposte simili a popolazioni di cellule quando stimolato con forskolina o isoproterenolo. Questo test a singola cellula consente la visualizzazione della posizione del biosensore con un ingrandimento di 20x e 40x. Pertanto, questo biosensore di cAMP è sensibile e flessibile e consente la misurazione in tempo reale del cAMP sia in cellule immortalizzate che primarie e con singole cellule o popolazioni di cellule. Questi attributi rendono cADDis uno strumento prezioso per studiare le dinamiche di segnalazione del cAMP nelle cellule viventi.
Introduzione
L'adenosina 3',5'-monofosfato ciclico, cAMP, svolge un ruolo centrale nella comunicazione cellulare e nel coordinamento di vari processi fisiologici. Il cAMP agisce come un secondo messaggero, trasmettendo segnali esterni da ormoni, neurotrasmettitori o altre molecole extracellulari per avviare una cascata di eventi intracellulari1. Inoltre, il cAMP è coinvolto in modo complesso in varie vie di segnalazione, comprese quelle associate ai recettori accoppiati a proteine G (GPCR) e alle adenilil ciclasi. Comprendere il ruolo del cAMP nella segnalazione cellulare è fondamentale per svelare i complessi meccanismi che sono alla base delle normali fun....
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Protocollo
I dettagli di tutti i reagenti e le attrezzature utilizzate per lo studio sono elencati nella tabella dei materiali.
1. Saggio ad alto rendimento con spettrofotometro a lettura su piastra
- Semina di cellule HEK-293 con il vettore cADDis BacMam in una piastra a 96 pozzetti (Giorno 1)
- Dividere e infettare le cellule in un cappuccio virale.
- Caldo in HEK (Tabella 1) e tripsina-EDTA allo 0,25% in un bagno d'acqua a 37 °C.
- Disinfettare la cappa e i materiali strofinandoli con fazzoletti imbevuti di EtOH.
- Rimuovere ed eliminare il terreno HEK dal pall....
- Dividere e infettare le cellule in un cappuccio virale.
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Risultati
Il presente studio ha convalidato il biosensore citosolico sia in saggi con lettore di piastre che al microscopio. Una volta che le cellule hanno espresso il biosensore, sono state stimolate con 10 μM di forskolina (un attivatore diretto dell'adenilil ciclasi), 10 nM di isoproterenolo (un agonista a ß1AR e ß2AR) o veicolo (Figura 1). Le successive variazioni della fluorescenza, indicative della produzione di cAMP, sono state catturate ogni 30 s.
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Discussione
Una misurazione accurata e sensibile del cAMP è fondamentale per comprendere il suo ruolo in vari processi cellulari e per studiare l'attività delle vie di segnalazione dipendenti dal cAMP. Esistono diversi metodi comunemente impiegati per misurare i livelli di cAMP, tra cui ELISA, test radioimmunologico, biosensori FRET e il test cAMP GloSensor 14,15,16,17,18.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo studio è stato supportato dal National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) (HL169522).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra a 96 pozzetti (trasparente) | Fisherbrand | 21-377-203 | |
| Piastra da 35 mm | Greiner Bio-One | 627870 | Piastre per colture cellulari con fondo in vetro |
| Piastra a 96 pozzetti | Corning | 3904 | Nero con fondo piatto trasparente |
| Antibiotico-Antimicotico (100x) | Gibco | 15240062 | Per terreni HEK e HASM |
| Microscopio a fluorescenza BZ-X | Keyence | ||
| Cloruro di calcio (IM) | Quality Biological Inc | E506 | Per terreni HASM |
| Provetta da centrifuga (15 mL) | Thermo Scientific | 339651 | |
| DMEM ( 1x) | Gibco | 11965092 | HEK media |
| DPBS con Mg2+ e Ca2+ | Gibco | 14040-133 | |
| DPBS senza Mg2+ e Ca2+ | Corning | 14040-133 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | R& Sistemi D | S11195 | per terreni HEK e HASM |
| Forskolin | Millipore | 344270 | |
| Farmaco Green Down cADDis cAMP Kit di analisi | Montana Molecolare | #D0200G | Reagente |
| F-12K | Gibco | 21127022 | Per terreni HASM |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | Per terreni HASM |
| Isoproterenolo | Sigma | I6504 | Farmaco |
| L-glutammina 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Per terreni HASM |
| Provetta per microcentrifuga (2 mL) | Eppendorf | 22363352 | |
| Primocin | Invitrogen | ant-pm-1 | Antibiotico per terreni HASM |
| RNAsi via | Thermo Scientific | 700511 Reagente | |
| Soluzione di idrossido di sodio | Sigma | S2770 | Per mezzi HASM |
| Lettore di piastre Spectrmax M5 | Molecular Devices Tricostatina | ||
| A | TCI America | T2477 | Reagente |
| Tripsina EDTA | Gibco | 25200-056 |
Riferimenti
- Krishna, G., Weiss, B., Brodie, B. B. A simple, sensitive method for the assay of adenyl cyclase. J Pharmacol Exp Ther. 163 (2), 379-385 (1968).
- Post, S. R., Ostrom, R. S., Insel, P. A. Biochemical methods for detection and measurement of cyclic amp an....
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Ristampe e permessi
