Articolo metodologico

Un compito di memoria di lavoro spaziale appetitivo per topi in un labirinto radiale semiautomatico a 8 bracci, che riduce l'associazione di memoria paurosa nel labirinto

DOI:

10.3791/66456

⸱

29 luglio 2025

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1The Wolfson Institute for Biomedical Research, University College London, 2Gerald Choa Neuroscience Institute, The Chinese University of Hong Kong

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La maggior parte degli esperimenti comportamentali per i roditori sono stati originariamente ideati per i ratti. A causa delle differenze comportamentali tra ratti e topi, a volte sono necessarie modifiche per i topi. Presentiamo un metodo per testare la memoria di lavoro spaziale nei topi, riducendo al minimo lo stress durante il compito di memoria di lavoro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo documento descrive in dettaglio un protocollo per testare la memoria di lavoro spaziale nei topi utilizzando un labirinto radiale semiautomatico a 8 bracci (RAM). Il RAM è un apparato parzialmente chiuso con 8 bracci orizzontali equidistanti che si irradiano da un hub centrale, da cui l'accesso a ciascun braccio può essere controllato individualmente da porte motorizzate servocomandate. Gli animali iniziano nell'hub centrale e possono esplorare il labirinto per ottenere una ricompensa in cibo alla fine di ogni braccio o braccio selezionato. L'attività RAM è stata originariamente progettata per i ratti, ma abbiamo adattato il protocollo per i topi, ad esempio, includendo più fasi di assuefazione. Nel nostro protocollo, tutte le braccia vengono inizialmente innescate con latte condensato zuccherato e i topi vengono ammessi in sequenza in quattro braccia selezionate in modo pseudo-casuale per raccogliere le ricompense ("corsa forzata") prima di aprire tutte le porte insieme per consentire ai topi di correre liberamente e trovare le restanti quattro ricompense ("corsa libera"). Viene introdotto un ritardo di 5 s tra le esecuzioni forzate e libere per sfidare la memoria di lavoro; Viene registrato un errore se il mouse entra in un braccio precedentemente visitato durante la corsa libera. L'attività è completa quando tutte le ricompense sono state recuperate. Dopo 6 giorni di assuefazione e 9 giorni di addestramento nel labirinto, i topi maschi C57BL/6 raggiungono regolarmente ≥ punteggio giornaliero dell'80% del tasso di successo, definito come 4/(4+E), dove E è il numero di errori. Questo compito semi-automatizzato potrebbe, in linea di principio, essere combinato con metodi di monitoraggio in vivo come l'elettrofisiologia, la microscopia a fotoni multipli o l'imaging del calcio.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La memoria di lavoro1 è un processo cognitivo che può contenere una quantità limitata di informazioni per un breve periodo mentre viene manipolata e utilizzata nella pianificazione e nell'esecuzione di un compito mentale, come memorizzare un numero di telefono o un percorso per una destinazione da una posizione diversa. È strettamente correlato all'intelligenza fluida, che è la capacità di ragionare rapidamente e pensare in modo astratto. Si ritiene che l'allenamento della memoria di lavoro possa migliorare l'intelligenza fluida2. La memoria di lavoro, quindi, è fondamentale per gli studi di ricerca.

Gli esperimenti comportamentali più popolari per i roditori sono stati originariamente ideati per i ratti negli anni '80 e i ricercatori oggi applicano spesso questi protocolli ai topi. Tuttavia, ci sono differenze comportamentali coerenti tra ratti e topi 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . In particolare, la gestione della paura è un fattore importante che può influenzare i risultati degli esperimenti, poiché i topi sono più inclini allo stress rispetto ai ratti 3,4,5,6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Pertanto, è importante considerare le differenze quando si applicano tali protocolli ai topi. Nel nostro protocollo, abbiamo cercato di ridurre al minimo i fattori di stress durante l'attività di memoria di lavoro nel labirinto a braccio radiale. Questo è stato fatto cronometrando attentamente le chiusure delle porte utilizzando il software di tracciamento del mouse e di controllo del labirinto. Inoltre, è stata evitata la cattura dei topi alla fine della sessione nell'hub centrale. Questo approccio ha permesso ai topi di scegliere il loro prossimo braccio senza associare la posizione alla paura di essere scoperti. Ritardare la cattura dei topi fino a quando tutte le ricompense non erano state raccolte nel labirinto assicurava che l'ultima ricompensa non fosse legata all'esperienza di essere catturati.

Il labirinto a braccio radiale terrestre (RAM) è un apparato popolare e comunemente usato per valutare l'apprendimento e la memoria spaziale e non spaziale e per testare la memoria di lavoro e di riferimento nei roditori. È uno degli apparati più popolari per l'apprendimento spaziale e la memoria nei topi 20,21,22. RAM sfrutta la naturale tendenza dei roditori a esplorare il labirinto, trovare novità e apprendere informazioni spaziali su base di tentativi ed errori, oltre al foraggiamento. Questa tendenza può essere aumentata limitando la loro dieta e premiandoli con il cibo preferito nel labirinto. Al giorno d'oggi, vengono utilizzate diverse varianti dell'apparato RAM, ad esempio con 6, 8, 12 o 16 bracci e un apparecchio parzialmente chiuso o aperto/rialzato 23,24,25. La maggior parte dei protocolli odierni si basa su quello di Olton et al.20,26, ma utilizza labirinti più semplici (a 6 o 8 bracci) 9,24,27,28,29. Testare la memoria di lavoro in un labirinto a braccia radiali (6 o 8 bracci) è più potente del labirinto a T (2 bracci) perché gli animali hanno più opzioni di braccia da esplorare.

Il RAM originale è stato progettato da Olton e Samuelson20 per valutare l'apprendimento spaziale e la memoria nei ratti utilizzando esche alimentari per il rinforzo positivo, a differenza dei labirinti d'acqua come il labirinto d'acqua di Morris e il labirinto d'acqua radiale a 8 bracci che utilizzano il rinforzo negativo, cioè l'immersione in acqua 20,30,31,32. Olton e Samuelsonhannoscoperto che i ratti hanno un'ottima memoria dei luoghi mentre passano attraverso il RAM. Hanno dimostrato che l'ippocampo è coinvolto nell'elaborazione delle informazioni spaziali. Essi, quindi, hanno introdotto il concetto di un sistema di memoria duale, comprendente la memoria di lavoro e la memoria di riferimento, nei roditori. Questo sistema a doppia memoria era stato suggerito in precedenza da Honig36 sulla base di esperimenti con i piccioni. Olton et al. hanno scoperto che la funzione dell'ippocampo è essenziale per la memoria di lavoro. Ciò è stato ottenuto effettuando lesioni nell'area entorinale, nel corpo della fimbria-fornice, anteriormente all'ippocampo, nel setto o nel fornice postcommissurale per interrompere ciascuna delle principali connessioni delle fibre estrinseche della formazione ippocampale 26,33,34,35. Le lesioni del fornice-fimbria non hanno influenzato la memoria di riferimento26.

Nei protocolli moderni, gli animali sono abituati all'ambiente consentendo loro di esplorare liberamente il labirinto per 10-15 minuti al giorno per 3 giorni consecutivi, seguiti da un addestramento al labirinto per 1-3 settimane con un cibo preferito alla fine di tutte le braccia o braccia fisse selezionate, testando la memoria di lavoro o la memoria di lavoro e la memoria di riferimento nello stesso esperimento, rispettivamente 9,29,37.

Spesso, questi protocolli non sono descritti in modo completo e le differenze comportamentali tra ratti e topi non sono ben considerate. Qui presentiamo in dettaglio il nostro protocollo e la nostra esperienza, in particolare come evitare di associare esperienze di paura con luoghi e tempi basati sulle differenze di gestione della paura tra ratti e topi. Questo protocollo è per i ricercatori che desiderano studiare la memoria di lavoro spaziale e applicarla all'elettrofisiologia, all'imaging in tempo reale e all'istologia utilizzando i topi.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati pre-approvati dal Comitato Etico dell'UCL e autorizzati ai sensi dell'Animals (Scientific Procedures) Act 1986 e della successiva legislazione del governo britannico.

1. Preparazione di programmi per il controllo automatizzato del labirinto su un'applicazione software

NOTA: Sono stati utilizzati il labirinto a bracci radiali automatizzato, come mostrato nella Figura 1A-C, e il layout della stanza nella Figura 1D.

  1. Preparare un flusso di lavoro sperimentale per la chiusura delle porte come descritto nella Figura 2.
  2. Impostare l'inizio della fase di assuefazione 1 (Figura 2A) su un'applicazione software. Per fare ciò, procedi nel seguente modo.
    1. Imposta l'inizio della prova e delle registrazioni video e chiudi tutti i bracci del software. 5 secondi dopo che il software ha riconosciuto il mouse nell'hub centrale del labirinto, inizia a tracciare e apre tutte le porte.
    2. Quando il mouse entra in un braccio e si trova a 4 cm di distanza dalla porta più vicina delle porte del mozzo centrale, chiudere tutte le porte. Quindi, subito dopo aver chiuso tutte le porte, aprire la porta del braccio selezionato dal mouse.
    3. Una volta che il mouse torna all'hub centrale, chiudi la porta e confinala nell'hub centrale per 5 s. Ripetere l'operazione per 30 minuti.
    4. Interrompere la registrazione e il tracciamento video quando sono trascorsi 30 minuti e il mouse torna all'hub centrale.
      NOTA: Lascia che il topo esplori liberamente il labirinto a suo piacimento.
  3. Stadio di assuefazione 2 (Figura 2B)
    1. Imposta l'inizio della prova e la registrazione video nel software associato e chiudi tutte le porte.
    2. 5 secondi dopo che il software ha riconosciuto il mouse nel fulcro centrale del labirinto, inizia il suo tracciamento e apri tutte le porte.
    3. Termina la prova se il mouse entra in ciascun braccio almeno due volte o dopo 30 minuti e poi ritorna all'hub centrale. Lascia che il topo esplori liberamente il labirinto a suo piacimento.
  4. Stadio di assuefazione 3 (Figura 2C)
    NOTA: Questa fase è la combinazione delle fasi 1 e 2.
    1. Impostare il software per avviare la prova e la registrazione video e chiudere tutte le porte.
    2. Impostare il software per controllare le porte del labirinto 5 secondi dopo che il software riconosce il mouse nell'hub centrale. Imposta l'inizio del tracciamento a questo punto e apri tutte le porte.
    3. Chiudere tutte le porte quando il mouse entra in un braccio e si trova a 4 cm di distanza dalla porta più vicina delle porte del mozzo centrale. Quindi aprire la porta del braccio.
    4. Chiudere la porta quando il mouse entra completamente nell'hub centrale e confinare il mouse nell'hub centrale per 3 s. Ripeti questa sequenza per 30 minuti o fino a quando il mouse non entra in ciascun braccio almeno una volta.
    5. Imposta la fine della prova dopo aver soddisfatto la condizione e quando il mouse entra completamente nell'hub centrale.
      NOTA: Lascia che il topo esplori liberamente il labirinto a suo piacimento.
  5. Attività di memoria di lavoro (Figura 2D, E)
    1. Imposta il software per avviare la prova e la registrazione e chiudi tutte le porte.
    2. 5 s dopo che il software ha riconosciuto il mouse nell'hub centrale, impostare il software per avviare il tracciamento.
    3. Avviare la fase di esecuzione forzata. Presenta al topo 4 braccia scelte pseudo-casualmente una per una.
    4. Quando il mouse entra nel primo braccio e si trova a 3 cm di distanza dal mozzo centrale, assicurarsi che la porta si chiuda e lo confina nel braccio per 15 s.
    5. Lascia che la porta si apra e lascia che il mouse torni all'hub centrale.
    6. Chiudere la porta e quindi aprire il secondo braccio.
    7. Ripeti l'operazione fino al quarto braccio.
    8. Quando il mouse ritorna all'hub centrale dopo il quarto braccio della fase di corsa forzata, confinarlo nell'hub centrale per 5 s.
    9. Lasciare che tutte le porte si aprano e iniziare la fase di corsa libera.
    10. Termina la prova quando il mouse torna all'hub centrale dopo aver raccolto tutte le ricompense/aver inserito tutte le braccia almeno una volta.

2. Preparazione delle gabbie domestiche per l'alloggio individuale

  1. Installa nuove gabbie utilizzando materiali di nidificazione standard per un nuovo esperimento.
    1. Metti nuova lettiera, segatura, un igloo di carta, un tunnel di carta, strisce di nidificazione di carta e un blocco di legno per ogni topo per l'esperimento.
    2. Posizionare la tramoggia del cibo e chiudere il coperchio.
      NOTA: I topi possono danneggiare le parti per la ventilazione se sono privi della tramoggia del cibo.

3. Manipolazione, pesatura e restrizione della dieta nella sala di detenzione degli animali (dal giorno -7 al giorno 0)

  1. Guida delicatamente il mouse verso il tunnel della carta fornito nella gabbia domestica a mano.
  2. Sollevare il mouse dalla gabbia raggruppata utilizzando il tunnel di carta 38,39,40 con la mano, tenerlo all'altezza del petto per alcuni secondi. In alternativa, lascia che il topo si arrampichi volontariamente sulla mano.
    NOTA: Maneggiare gli animali con il minimo stress è essenziale per gli esperimenti comportamentali. Non prenderli mai per la coda, il che è stressante per i topi. Anche abituare i topi allo sperimentatore è importante. I topi devono essere ben abituati e rilassati, altrimenti non impareranno bene nel labirinto in seguito.
  3. Tieni sempre premuto il mouse utilizzando lo stesso metodo di gestione. Metti il mouse sulla bilancia per il monitoraggio del peso corporeo e registra il suo peso corporeo.
    NOTA: Non stressare i topi con movimenti rapidi del corpo o emettendo rumori forti. È meglio farlo in un ambiente tranquillo. In caso contrario, potrebbero saltare dalla bilancia o dalla mano dello sperimentatore. Inoltre, se i topi sono stressati, possono mostrare occhi strabici, squittire e mordere la mano dello sperimentatore41,42.
  4. Dopo la pesatura, metti il topo nella nuova gabbia preparata in precedenza.
  5. Metti i topi a dieta con una quantità limitata per una settimana prima dell'esposizione al labirinto a braccio radiale. Questo li motiva a cercare nel labirinto le ricompense alimentari fornite. La ricompensa alimentare durante l'esperimento è il latte condensato zuccherato diluito.
  6. Metti 2 ~ 3 g di cibo standard nella gabbia e mantieni il peso corporeo tra l'85 ~ 90% del peso iniziale per tutta la durata dell'esperimento.
    NOTA: I topi C57BL/6 mangiano 3-4 g di cibo standard ogni giorno43.
  7. Osservare il calo notturno del peso corporeo come guida per standardizzare la quantità di cibo da somministrare il giorno successivo. Da quel momento in poi, somministrare una quantità giornaliera sufficiente di cibo standard per mantenere l'85-90% del peso corporeo iniziale durante l'esperimento.
    NOTA: Questi animali hanno bisogno di perdere peso lentamente. Monitora il peso corporeo e le espressioni facciali per evitare lo stress.
  8. Fornire 1 ml di latte condensato diluito (ricompensa; latte condensato zuccherato: acqua = 1 : 1) in un piccolo bicchiere di plastica nella gabbia domestica per abituare i topi fino alla fine della fase di assuefazione 1. Assicurati che i topi mangino la ricompensa. Cambia il cibo ricompensa se il ceppo di topi mostra neofobia al cibo presentato.
    NOTA: Dalla fase 2 dell'assuefazione, non fornire la ricompensa nella gabbia di casa. Se il peso corporeo di un topo scende al di sotto dell'80% del peso iniziale, dovrebbe essere soppresso secondo l'IACUC e le linee guida specifiche del paese. Se un topo non rientra nell'intervallo di peso corporeo normale per la linea di topi utilizzata (20-30 g a 8-12 settimane) al primo controllo del peso corporeo, non deve essere considerato nella coorte per evitare difficoltà a mantenere il suo peso corporeo nell'intervallo richiesto in seguito.

4. Portare i topi in sala prove

  1. Usa un carrello per portare lentamente i topi nella sala dei test comportamentali.
  2. Lasciare i topi indisturbati sul carrello per 5 minuti.

5. Allestimento della sala

  1. Impostare l'illuminazione della stanza illuminando indirettamente l'hub centrale, a 80 lux con lampadine a luce bianca calda, e riprodurre il rumore bianco a 70 dB misurato all'hub centrale. NOTA: È noto che l'esposizione a rumore bianco di intensità moderata porta i ratti a ottenere prestazioni migliori in un labirinto geometricamente complesso44,45. Il rumore bianco sembra fare di più che mascherare semplicemente il rumore inevitabile nell'ambiente; 70 dB di rumore bianco aumenta l'assorbimento di colina in diverse regioni cerebrali dei ratti, tra cui la corteccia prefrontale, l'ipotalamo e l'ippocampo (ma non nello striato)46 e le prestazioni della memoria di lavoro RAM sono note per dipendere dall'integrità delle vie colinergiche tra l'ippocampo, la corteccia frontale e il proencefalo32,47. È anche noto che gli animali usano segnali visivi sia distali che prossimali per navigare con precisione nei loro ambienti. Tuttavia, i topi dipendono dai segnali visivi distali più che dai segnali prossimali per navigare durante l'apprendimento spaziale48. In questo esperimento, i segnali prossimali stampati su un piccolo pezzo di carta sono stati introdotti sulle pareti posteriori di tutti i bracci del RAM a 8 bracci, ma non hanno ridotto il comportamento di collegamento a margherita. I segnali visivi distali geometricamente asimmetrici (sul soffitto e sulle pareti della stanza), d'altra parte, riducevano il collegamento a margherita ed erano essenziali per la navigazione spaziale nella RAM.

6. Fase di assuefazione 1 - Non ricompensato (Giorno 1 - 2)

NOTA: Nessuna ricompensa viene innescata nel labirinto. Questa fase serve ad abituare i topi alle porte del labirinto e ai loro suoni.

  1. Avvia il tracciamento del mouse e la registrazione video facendo clic sul pulsante Avvia sul software e portando il mouse nel labirinto senza stressarlo. Fallo muovendoti lentamente e modificando lentamente l'altezza mentre il mouse è nella mano dello sperimentatore. Posiziona il mouse nell'hub centrale.
    NOTA: Se i topi tremano sulla mano dello sperimentatore, rallentare i movimenti. È un segno di paura. I topi si muovono durante il periodo di confinamento di 5 secondi nell'hub centrale prima di iniziare la fase di corsa forzata. Possono essere rivolti verso qualsiasi lato quando vengono inseriti nel mozzo centrale.
  2. Continua a osservare il comportamento del mouse sul monitor del PC posizionato lontano dal labirinto o al di sotto del livello della parete del labirinto. Se il topo cerca di fuggire dal labirinto arrampicandosi sul muro, è sufficiente alzarsi dalla sedia per mostrare l'esistenza dello sperimentatore e camminare verso di esso, monitorando le sue prestazioni. Nel peggiore dei casi, spingi il mouse di nuovo nel labirinto.
    NOTA: Normalmente, i topi tornano al labirinto dopo aver sentito il rumore di attrito dei vestiti dello sperimentatore mentre si avvicinano. Questo deve essere fatto rapidamente. Se lo sperimentatore continua a farlo, i topi rimarranno nel labirinto dopo le fasi di assuefazione da 1 a 3. Se i topi continuano a saltare fuori dal labirinto, è consigliabile rimuoverli da ulteriori esperimenti e analisi.
  3. Dopo la prova, raccogli il topo da un braccio del labirinto lasciando che il topo si arrampichi volontariamente sulla mano dello sperimentatore mentre l'altra mano copre il braccio per impedirgli di saltare fuori dal labirinto.
  4. Spazzola via le feci di topo e pulisci il labirinto con un fazzoletto asciutto per rimuovere ogni traccia delle ricompense. Quindi, pulire con un fazzoletto umido e asciugare il labirinto con un fazzoletto asciutto (circa 2 minuti).
  5. Fallo per ogni topo a turno per due giorni.
    NOTA: Dopo 30 minuti, i topi potrebbero non aver visitato tutti gli 8 bracci del labirinto. Questo è normale e non è un problema. I topi tendono a visitare le braccia in uno schema non sistematico e non sequenziale e si muovono con cautela, trascorrendo tempi irregolari in ciascun braccio. I topi possono arrampicarsi sulle pareti del labirinto e/o saltare fuori dal labirinto in questa fase. Se ciò accade (ad esempio, il topo cerca di arrampicarsi sulle pareti), prevenilo assicurandosi che lo sperimentatore renda il topo consapevole della sua presenza avvicinandosi al labirinto e facendo un po' di rumore, come il fruscio dei vestiti. Pertanto, potrebbe essere necessaria un'attenta osservazione del comportamento del mouse nella RAM e un'azione rapida. Dopo alcune ripetizioni di questa procedura, i topi rimarranno nel labirinto. Se, nonostante tutto, il mouse non rimane nella RAM durante l'assuefazione, rimuovilo dall'analisi.

7. Fase di assuefazione 2 - Premiato (Giorno 3 - 4)

NOTA: Questa fase serve a incoraggiare i topi a esplorare liberamente il labirinto per ottenere ricompense in cibo.

  1. Mettere 70 μL di ricompensa alimentare in ogni pozzetto di cibo in ciascun braccio.
  2. Avviare il tracciamento del mouse e la registrazione video facendo clic sul pulsante Start sul software e quindi posizionando il mouse sull'hub centrale del labirinto come spiegato in 6.1.
  3. Continuate a osservare il comportamento del mouse sul monitor del PC da una posizione lontana e scrivetelo se necessario, ad esempio arrampicandovi sul muro o saltando giù dal labirinto. Termina la prova quando il mouse entra in ciascun braccio almeno due volte o sono trascorsi 30 minuti.
  4. Dopo la prova, raccogli il topo dal labirinto in un braccio lasciando che il topo si arrampichi volontariamente sulla mano dello sperimentatore mentre l'altra mano copre il braccio per impedirgli di saltare fuori dal labirinto.
  5. Pulire il labirinto come descritto al punto 6.4 (Fase di assuefazione 1; circa 2 min).
  6. Fallo per ogni topo a turno due volte al giorno per due giorni.
    NOTA: In questa fase, i topi possono mostrare un comportamento di collegamento a margherita, ma non è necessario preoccuparsi perché le voci aggiuntive di 4 braccia nell'attività di memoria di lavoro possono scoraggiare questo movimento. In questo passaggio, i topi possono fermarsi nel braccio senza consumare la ricompensa. Il giorno 4, i topi dovrebbero essere più addestrati rispetto al giorno 3, ma possono comunque fermarsi al centro del braccio.

8. Fase di assuefazione 3 - Premiato (giorno 5 - 6)

NOTA: Questa fase serve a consentire ai topi di abituarsi all'ambiente della combinazione delle fasi 1 e 2.

  1. Esche tutti i pozzetti di cibo con 70 μL di ricompensa.
  2. Avvia il tracciamento del mouse e la registrazione video facendo clic sul pulsante di avvio del software e posizionando il mouse nell'hub centrale del labirinto.
  3. Continua a osservare il comportamento del mouse sul monitor del PC da una posizione distante, fino a quando il mouse non entra in ciascun braccio almeno una volta o trascorrono 30 minuti. Se il topo cerca di fuggire dal labirinto, agisci rapidamente come indicato nella Fase di assuefazione 1 (6.2).
  4. Dopo la prova, rimuovi il topo dal labirinto lasciandolo arrampicare volontariamente sulla mano dello sperimentatore mentre l'altra mano copre il braccio per evitare che salti fuori dal labirinto.
  5. Pulire il labirinto come descritto al punto 6.4 (fase di assuefazione 1) (circa 2 min).
  6. Fallo per ogni topo due volte al giorno per due giorni.
    NOTA: In questa fase, è meglio rimuovere dall'analisi tutti i topi che tentano di fuggire dal labirinto.

9. Attività di memoria di lavoro - Ricompensato (Giorno 7 - Giorno 15)

  1. Adesca tutte le braccia con 40 μL della ricompensa. Posiziona la ricompensa in ogni pozzetto del cibo vicino all'hub centrale per rendere difficile per i topi vedere dall'hub centrale.
  2. Avvia il tracciamento e la registrazione del mouse facendo clic sul pulsante di avvio del software, quindi posiziona il mouse sull'hub centrale del labirinto senza stressarlo.
  3. Durante il confinamento di 5 secondi nell'hub centrale, allontanati e siediti da qualche parte lontano dal labirinto. Monitora il comportamento del topo e annota la sequenza del braccio che il topo visita nel labirinto (vedi File supplementare 1).
  4. Smetti di registrare la sequenza di visita del braccio quando il topo raccoglie tutte e otto le ricompense alimentari, che è la fine del compito di memoria di lavoro, e poi lascia che visiti quattro braccia in più.
    NOTA: In questo modo, i topi possono avere un po' più di tempo prima di essere scoperti, il che consente ai topi di concentrarsi sull'attività di memoria di lavoro. Questo passaggio consente inoltre ai topi di rafforzare il fatto che le ricompense non vengono reintegrate una volta raccolte.
  5. Dopo le quattro visite extra del braccio, rimuovi il topo dal labirinto alla fine dell'ultima visita del braccio lasciandolo arrampicare sulla mano mentre copre il braccio con l'altra mano.
    NOTA: Non catturando i topi nell'hub centrale, i topi non assoceranno l'essere catturati all'hub centrale, dove i topi decidono a quale braccio andare dopo. Una volta che i topi acquisiscono familiarità con il compito, comprese le visite extra al braccio, possono muoversi liberamente vicino all'ultimo pozzo del cibo o trascorrere un po' di tempo nell'hub centrale. Tuttavia, dovrebbero terminare le 4 visite extra al braccio entro 3 minuti. Se non lo finiscono entro 5 minuti, rimettili nella gabbia di casa.
  6. Seleziona la gabbia successiva per regolare il livello di eccitazione toccando la gabbia per la prova successiva.
  7. Pulire il labirinto come descritto al punto 6.4 (fase di assuefazione 1) (circa 2 min).
  8. Passa al mouse successivo e ripeti l'operazione 6 volte per ogni mouse a turno per 9 giorni.
    NOTA: La durata media delle quattro visite extra al braccio dovrebbe diventare più lunga nelle prove successive, poiché i topi imparano a riconoscere quando non sono disponibili ulteriori ricompense o che non ci sono nuovi bracci non visitati in cui entrare.

10. Punteggio

  1. Calcola il "punteggio giornaliero della percentuale di successo" (%) = 4(gol) / (numero totale di voci del braccio[4+Errori]) x 100.
    NOTA: Dopo la corsa forzata, solo quattro braccia vengono riempite con la ricompensa, gli obiettivi. Se entrano in un braccio che il topo ha visitato nella corsa forzata, contalo come un errore, così come i bracci ripetuti nella corsa libera.
  2. Calcola il "punteggio del rapporto di prova perfetto" (%) in 6 prove = [(numero di prove perfette) / 6 ] x 100
    NOTA: un punteggio perfetto significa che non c'è alcun errore di memoria di lavoro.
  3. Seleziona la velocità, la distanza e l'accelerazione del mouse nel software per l'analisi e calcola le medie per ogni giorno. Assicurarsi di escludere le quattro visite extra del braccio da queste analisi. Inoltre, misura la durata delle quattro visite extra al braccio esaminando i video di tracciamento del mouse dopo l'esperimento.
    NOTA: I topi possono fare giri rapidi subito dopo essere entrati in un braccio. Non contare e segnare questa voce come una voce, poiché è una correzione rapida dell'errore, il che significa che la memoria di lavoro è valida49. Tuttavia, se il mouse attraversa il punto medio del braccio o rimane nel braccio per più di 3 s, conta e segna l'ingresso. I punteggi delle percentuali di successo giornaliere indicano le curve di apprendimento dei topi e i punteggi del rapporto di prova perfetti indicano l'efficienza della conservazione della memoria di lavoro.

11. Statistiche

  1. Se si studia la differenza tra il controllo e una linea di topo knockout, come fatto nella precedente pubblicazione50, eseguire le statistiche come descritto di seguito.
    1. Confrontare i dati risultanti dei gruppi di controllo e sperimentali utilizzando l'ANOVA a due vie a misure ripetute con un'analisi post hoc (ad esempio, test di Bonferroni) [misurando ogni soggetto in 9 diversi punti temporali].
    2. Se si confrontano i gruppi, testare almeno 10 e preferibilmente ~20 topi in ciascun gruppo. Laddove l'effetto della manipolazione genetica, della formazione di lesioni o del trattamento farmacologico è evidente, le dimensioni del campione possono essere più piccole per concludere.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo è stato utilizzato nella nostra precedente pubblicazione, in cui ci siamo chiesti se nuovi oligodendrociti e guaine mieliniche siano necessari per l'esecuzione di compiti di memoria di lavoro spaziale utilizzando topi MyRF cKO e ilcontrollo 50. Abbiamo scoperto che le prestazioni del compito di memoria di lavoro erano migliorate nei mouse di controllo, ma non nei topi MyRF cKO. Il compito della memoria di lavoro ha stimolato e promosso la proliferazione e la differenziazione delle cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) e la mielinizzazione degli oligodendrociti (OL) nelle aree cerebrali correlate all'elaborazione della memoria di lavoro nei topi wild-type. Abbiamo anche eseguito il compito di alternanza ricompensata con labirinto a T per valutare la memoria di lavoro spaziale. Questo compito è stato eseguito per rilevare il deficit della memoria di lavoro nei topi MyRF cKO. Tuttavia, non sono state osservate differenze significative nell'analisi istologica tra il gruppo di topi che aveva il compito di alternanza ricompensato con il labirinto a T e il gruppo di controllo della gabbia domestica. Pertanto, abbiamo concluso che il protocollo qui presentato è più efficace del compito di alternanza ricompensato da T-maze per lo studio della memoria di lavoro.

Ogni topo ha avuto 6 prove del compito di memoria di lavoro al giorno che sono durate per un'ora in totale. Pertanto, questo protocollo ha consentito un massimo di 8 topi in una coorte. Nei primi giorni di assuefazione, i topi trascorrevano un tempo irregolare nelle braccia del labirinto e i loro movimenti erano lenti. Rimasero a lungo all'estremità delle braccia. Fino alla fine del giorno 5 dell'assuefazione nel labirinto, hanno trascorso tempi variabili nelle braccia del labirinto e potevano tornare al mozzo centrale senza toccare le ricompense (Figura 3A). Tuttavia, il sesto giorno, gli animali sono entrati in ciascun braccio almeno una volta entro 8-15 minuti, trascorrendo un periodo simile in ciascun braccio, il che indicava che gli animali erano abituati al labirinto ed erano pronti per il compito (Figura 3A, giorno 6 fila inferiore e Figura 3B).

Durante le fasi di assuefazione, spesso si alzavano sugli arti posteriori e guardavano in alto dalle braccia o dal mozzo centrale. Un comportamento simile è stato osservato durante il compito di memoria di lavoro, ma non necessariamente giravano nella stessa direzione (ad esempio, 2 -> 3-> 5 -> 8 [in senso orario] o 8 -> 5 -> 3 ->2 [in senso antiorario]). Potrebbero cambiare la loro direzione (ad esempio, 5 -> 4 -> 6 -> 1). I singoli topi non avevano alcuna tendenza comune apparente a scegliere la sequenza del braccio. I topi tendono a dedicare un po' più di tempo alla selezione dell'ultimo braccio premiato rispetto al primo braccio premiato nella corsa libera. Questo probabilmente perché avevano quattro opzioni tra cui scegliere alla prima scelta nella corsa libera e solo un'opzione per l'ultima ricompensa. Il primo braccio nella fase di corsa forzata è stato presentato ai topi almeno 50 (15+15+15+5) s prima dell'inizio della corsa libera. Pertanto, questo compito di memoria di lavoro non era molto facile da eseguire senza errori di memoria di lavoro. Il video supplementare 1 mostra un topo sottoposto a una prova perfetta il giorno 8 dell'allenamento del compito di memoria di lavoro.

Utilizzando entrambi i sistemi di punteggio, abbiamo scoperto che le loro prestazioni erano quasi piatte per i primi 3 giorni del periodo di test della RAM di 9 giorni, ma sono migliorate notevolmente in seguito (Figura 4A, B). Dopo 6 giorni di assuefazione e 9 giorni di addestramento al labirinto, i topi maschi C57BL/6 hanno regolarmente raggiunto ≥ punteggio del tasso di successo giornaliero dell'80% dal giorno 8, definito come 4/(4+E), dove E è il numero di errori. La distanza media percorsa nelle prove libere si è accorciata nel tempo, ma la velocità media e l'accelerazione sono state abbastanza costanti di giorno in giorno (Figura 4C-F). I topi potrebbero aver sviluppato un ricordo di paura di essere stati catturati durante le quattro visite aggiuntive del braccio, che potrebbe essere uno dei motivi per cui i topi hanno trascorso più tempo verso la fine dell'esperimento (Figura 4G).

In questo protocollo, le fasi di assuefazione duravano 6 giorni, il che poteva portare a regolare l'orologio biologico per l'esperimento, anche se il ciclo luce/buio non era invertito in una struttura per animali.

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Figura 1: Specifiche e caratteristiche della RAM. (A) Viste del labirinto dal CCD montato a soffitto e lateralmente, e le dimensioni. (B) Il pozzetto del cibo è stato scavato a 1,5 cm sotto il livello del pavimento del labirinto in modo che i topi non possano vedere il contenuto da >10 cm di distanza. (C) Ambientazione dell'arena del labirinto. Vengono mostrati il mozzo centrale e il braccio 1-8. (D) Schema della sala sperimentale e degli spunti visivi esterni con una fotografia della stanza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Diagrammi di flusso dei programmi di controllo del labirinto. (A) Fase di assuefazione 1 (giorni 1 e 2). (B) Fase di assuefazione 2 (giorni 3 e 4). (C) Fase di assuefazione 3 (giorni 5 e 6). (D) Attività di memoria di lavoro (giorni 7-15). (E) Schema del paradigma del task di memoria di lavoro. I topi passavano attraverso i quattro bracci di corsa forzata scelti pseudo-casualmente, venivano confinati nell'hub centrale per 5 secondi e poi andavano a correre liberamente per raccogliere le ricompense rimanenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Mappe di calore e mappe dei nidi d'uccello durante i 6 giorni di assuefazione. (A) Mappe termiche delle traiettorie dei topi durante i giorni di assuefazione 1-6, per tre topi. Per i giorni di assuefazione 3-6, i topi sono stati sottoposti a due prove al giorno; Le heatmap superiori mostrano le prime prove e quelle inferiori mostrano le seconde prove. (B) Mappe dei nidi d'uccello per il giorno 6 dell'assuefazione. I tre superiori mostrano i primi studi e i tre inferiori mostrano i secondi test sui topi 1, 2 e 3. La tabella inferiore elenca le durate delle prove per gli stessi tre topi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: L'attività di memoria di lavoro della RAM. (A) Punteggi medi giornalieri del tasso di successo (%) calcolati da [4/(numero di iscrizioni al braccio durante la corsa libera) x 100]. I punteggi di 6 prove sono stati calcolati in media per la giornata. (B) Punteggi di prova perfetti nei 9 giorni dell'attività. (C) Distanze individuali percorse e media. (D) Velocità di corsa individuali dei topi nel compito e la media. (E) Accelerazioni individuali dei topi e la media. (F) Decelerazioni individuali dei topi e la media. (G) Durata individuale e media delle ulteriori 4 visite del braccio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video supplementare 1: Il mouse viene sottoposto a una prova perfetta il giorno 8 dell'allenamento del compito di memoria di lavoro. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 1: Esempio di foglio di registrazione. Annota la sequenza delle visite del braccio mentre osservi il comportamento del topo. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

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Addestramento e test della memoria di lavoro nella RAM
La memoria di lavoro è un processo cognitivo che può contenere una quantità limitata di informazioni per un breve periodo mentre viene manipolata e utilizzata nella pianificazione e nell'esecuzione di un compito mentale. Gli esempi includono la memorizzazione del codice di accesso per una porta in una posizione remota o la memorizzazione del percorso verso una destinazione specifica. Il compito dual N-back e il compito di span spaziale sono compiti di memoria di lavoro visuospaziale comunemente usati in cui ai soggetti umani viene chiesto di memorizzare la posizione, l'identità e l'ordine temporale degli stimoli. Takeuchi et al. hanno scoperto che la quantità di allenamento in compiti di memoria di lavoro di successo negli esseri umani, che includono il compito dual N-back, è correlata con l'aumento dell'anisotropia frazionaria nella parte anteriore del corpo del corpo calloso nel loro studio utilizzando la risonanza magnetica51. Nel nostro precedente studio50, utilizzando il protocollo descritto in questo articolo, abbiamo scoperto che gli oligodendrociti mielinizzanti aumentavano nel corpo calloso anteriore e in altre aree del cervello che si pensava fossero coinvolte nell'elaborazione della memoria di lavoro, inclusa la corteccia cingolata anteriore, che si ritiene sia coinvolta nell'attenzione. L'aumento degli oligodendrociti è strettamente correlato alle prestazioni del loro compito di memoria di lavoro, il che è coerente con lo studio sull'uomo di Takeuchi et al 50,51,52. Tuttavia, è ancora necessario studiare se ci sono somiglianze nei processi psicologici tra gli esseri umani e i topi (ad esempio, l'elettrofisiologia). La memoria di lavoro è strettamente correlata all'attenzione. È correlato alle misure di "intelligenza fluida" negli esseri umani ed è importante per l'apprendimento, quindi è importante studiarlo. Olton e Samuelson hanno descritto un compito di labirinto radiale (RAM) a 8 bracci per l'addestramento e la valutazione della memoria spaziale nei ratti20. Nell'esperimento a libera scelta, hanno fornito a tutti i bracci del labirinto 0,1 g di cibo per ratti, che non è stato reintegrato durante il test. Quindi, in un test sono state ottenute solo otto ricompense. Tutte le braccia erano aperte e i ratti hanno avuto accesso immediato a tutte le braccia durante l'esperimento. Poiché le ricompense alimentari non venivano reintegrate, i ratti dovevano usare la memoria di lavoro per evitare di rivisitare le braccia visitate in precedenza, al fine di recuperare il maggior numero possibile di ricompense prima della fine del compito. Ogni ratto è stato posizionato nell'hub centrale all'inizio e gli è stato permesso di entrare in qualsiasi braccio a piacimento, per recuperare la ricompensa in cibo fino a quando non sono state effettuate 16 scelte di braccio o sono trascorsi 10 minuti. Olton et al. hanno contato il numero di bracci distinti che i ratti hanno visitato nelle prime 8 scelte e hanno scoperto che tutti i ratti hanno scelto una media di più di 7 bracci distinti entro 10 giorni20. Abbiamo provato un protocollo simile con i topi e abbiamo scoperto che i topi, a differenza dei ratti, mostravano il collegamento a margherita per alcuni giorni e non cambiavano la loro strategia in seguito, il che aggirava lo scopo di valutare la loro memoria di lavoro. Il topo è stato, quindi, confinato nell'hub centrale tra le visite del braccio, sperando che il confinamento nell'hub centrale avrebbe impedito il comportamento di collegamento a margherita.

Olton et al. hanno confinato i ratti nel mozzo centrale per 1 minuto o 15 secondi per interferire con qualsiasi sequenza di scelte. Ciò ha impedito loro di adottare la loro consueta tendenza a muoversi intorno al labirinto continuamente, in senso orario o antiorario20,53. Se la scelta di un braccio è casuale, ugualmente probabile e completamente indipendente dalle scelte precedenti, l'esperimento è un esempio del classico 'problema di occupazione'20, quindi le probabilità p(n,8) di selezionare n bracci distinti entro le prime otto visite successive del braccio sono: p(1,8)=4.8x10-7, p(2,8)=4.2x10-4, p(3,8)=0.019, p(4,8)=0,17, p(5,8)=0,42, p(6,8)=0,32, p(7,8)=0,067, p(8,8)=0,0024. Da queste probabilità, si può calcolare che la probabilità media di scegliere armi distinte è 5,3 (valore atteso = figure-discussion-1 = 5,25; 5,3/8= 66%) su 8. Olton et al. hanno riportato che, in un periodo di allenamento di 10 giorni, i ratti sono entrati in media in 5,7/8 bracci distinti (71%; intervallo: 4,2-6,6) nei giorni 1-5, aumentando a 7,6/8 bracci distinti (95%; intervallo: 7,2-8,0) durante i giorni 6-1020, che è significativamente più alto del caso. Ciò indicava che i ratti usavano la memoria di lavoro per evitare le braccia impoverite di cibo. Abbiamo provato un approccio simile con i topi, confinandoli nell'hub centrale per 5 secondi tra le visite del braccio. I topi sono entrati in media in una media di 5,7/8 bracci diversi per ogni studio a 8 bracci nei giorni 1-5 (71%; intervallo: 5,2-5,8; undici topi C57BL/6) e 5,9/8 bracci nei giorni 6-10 (74%; intervallo: 5,7-6,5; undici topi C57BL/6). Pertanto, i topi non sono stati in grado di imparare, o hanno imparato molto lentamente, per migliorare le loro prestazioni di ricerca della ricompensa significativamente al di sopra dei livelli di probabilità durante i 10 giorni dell'esperimento. Pertanto, i protocolli di cui sopra sono stati considerati inadatti per i topi, optando invece per un paradigma di 'corsa forzata/corsa libera', simile a quello descritto per i ratti da Sasaki et al.27

Nel protocollo di Sasaki et al.27, tutte le braccia sono state innescate all'inizio dell'esperimento, le ricompense non sono state reintegrate e ogni ratto è stato inizialmente confinato al mozzo centrale di un RAM aperto e rialzato a 8 bracci. Sono stati poi rilasciati in ciascuno dei 4 bracci preselezionati, un braccio alla volta, senza confinarli nei bracci e nel mozzo centrale tra le visite del braccio (la "corsa forzata"). Dopo la visita delquarto braccio, il ratto tornava all'hub centrale e tutte le porte venivano immediatamente aperte per consentire al topo di visitare tutte le braccia a piacimento (la "corsa libera"). Per raccogliere tutte le ricompense alimentari rimanenti nel modo più efficiente durante la corsa libera, gli animali devono ricordare ed evitare le braccia che hanno già visitato sia nella corsa forzata che in quella libera. Abbiamo usato un approccio molto simile (Figura 2E) con i topi. Dieci minuti di periodi di assuefazione all'inizio di ogni giorno di allenamento RAM in Sasaki et al.27 sono stati sostituiti con un singolo periodo di assuefazione di 6 giorni prima dell'allenamento. Un'altra modifica apportata è stata quella di consentire ai topi di effettuare quattro visite aggiuntive al braccio alla fine di ogni prova, una volta recuperate tutte le ricompense. Questo aveva lo scopo di rafforzare il fatto che le ricompense non vengono rifornite nelle armi visitate in precedenza. Inoltre, dal momento che i topi imparano a "evitare il rimpianto"54,55, potrebbe scoraggiare il comportamento di concatenamento a margherita nella prova successiva, perché tale comportamento non verrebbe ricompensato durante le quattro visite aggiuntive del braccio immediatamente prima dell'inizio della prova successiva. Un altro motivo per le visite aggiuntive a quattro bracci era quello di impedire ai topi di associare un recupero di successo di tutte le ricompense con l'esperienza possibilmente spaventosa di essere catturati dallo sperimentatore alla fine del compito. I topi potrebbero aver sviluppato una memoria di paura quando sono stati catturati durante le quattro visite aggiuntive del braccio, il che potrebbe essere uno dei motivi per cui hanno trascorso più tempo verso la fine dell'esperimento (Figura 4G). In effetti, i topi hanno interrotto il comportamento di concatenamento a margherita durante le ulteriori quattro visite del braccio, se lo hanno fatto nello studio. Inoltre, i topi sono stati confinati in ciascun braccio per 15 secondi durante la corsa forzata e poi nel mozzo centrale per 5 secondi prima di aprire tutte le porte per iniziare la corsa libera. Senza confinare il mouse nell'hub centrale, i topi tendevano a fare il collegamento a margherita come descritto sopra.

Per la corsa forzata, abbiamo selezionato da un set di cinque sequenze pseudocasuali a 4 bracci che contengono 3 o meno bracci adiacenti. Questi erano (1,3,5,7), (2,4,5,8), (1,4,5,7), (2,3,4,7), (1,2,5,6), e le loro variazioni di diversi ordini e rotazioni dei bracci, numerando i bracci da 1 a 8 in senso orario dall'alto (Figura 1C). Ogni topo di una coorte è stato sottoposto a sei prove (una prova = corsa forzata +5 s di confinamento nell'hub centrale + corsa libera) al giorno durante la fase post-assuefazione di 9 giorni del test RAM. Durante la corsa libera, se un topo faceva solo quattro visite al braccio per recuperare tutte e quattro le ricompense rimanenti dopo la corsa forzata, veniva definita una "prova perfetta". La loro prestazione durante i 9 giorni di allenamento è stata quantificata dal "punteggio giornaliero del tasso di successo", calcolato come 4/(4+E), dove E è il numero di errori durante la corsa libera o la proporzione di prove che sono state "prove perfette" (cioè E=0). Ad esempio, se un topo avesse bisogno di 7 visite al braccio per recuperare le 4 ricompense rimanenti durante la corsa gratuita, il "punteggio del tasso di successo giornaliero" sarebbe 4/7 = 0,57 o 57% e una prova perfetta otterrebbe un punteggio del 100% su questa scala; Se un topo facesse 5 prove perfette il giorno stesso, il punteggio del rapporto di prova perfetto sarebbe 5/6 = 83,3 %.

I punteggi giornalieri del tasso di successo ottenuti mediante il collegamento a margherita sono stati calcolati manualmente per ciascuno dei modelli di corsa forzata a 4 bracci impiegati (paragrafo precedente), supponendo che i topi inizino la loro corsa libera a caso in uno qualsiasi degli 8 bracci del RAM. Il punteggio medio in molte prove che può essere raggiunto con il collegamento a margherita è compreso tra il 53% e il 56% per i singoli modelli di braccio di corsa forzata, o ~55% dei modelli complessivi del braccio. La probabilità di ottenere un punteggio perfetto (100%) con il collegamento a margherita è zero, e quella con visite casuali al braccio è del <1% (4/8 x 3/7 x 2/7 x 1/7 = 0,87%), supponendo che i topi non tornino mai al braccio da cui sono appena usciti. Pertanto, i punteggi medi giornalieri del tasso di successo (>80%) e la percentuale di punteggi di prova perfetti (>60%) raggiunti dai nostri topi negli ultimi 2 giorni del periodo di test di 9 giorni (Figura 4A, B) potrebbero essere raggiunti in modo coerente solo utilizzando una strategia basata sulla memoria di lavoro.

I topi che avevano familiarità con il compito tendevano a bighellonare nell'ultimo pozzo del cibo, o nell'hub centrale, una volta consumate tutte le ricompense, e tendevano anche a dedicare più tempo alle visite extra di quattro braccia alla fine del compito (Figura 4G), suggerendo che avevano imparato la "regola" che ogni braccio conteneva una e una sola ricompensa. e anche che potessero tenere traccia del fatto che avevano visitato tutte le armi disponibili. Per i topi con un background genetico diverso da quello utilizzato qui (C57BL/6), i risultati potrebbero variare perché il background genetico è importante negli esperimenti comportamentali 56,57,58. Tuttavia, nel nostro precedente studio50, utilizzando topi con un background misto C57BL/6, CBA, 129P2 ma reincrociato con topi C57BL/6J, è stato riscontrato che le prestazioni del loro compito di memoria di lavoro sono state notevolmente migliorate utilizzando il protocollo qui descritto, con un minor numero di topi che ricorrono al collegamento a margherita durante la corsa libera. Koike et al.59 hanno riportato che tutti i 129 sottoceppi di topo inbred portano un polimorfismo di delezione del Disco-1 consistente in una delezione di 25 bp nell'esone 6 del Disco-1 che causa un frameshift e un troncamento della proteina DISC-1, influenzandone la funzionalità60,61. Questa mutazione ha causato una compromissione della memoria di lavoro quando studiata con il compito di alternanza ritardata59 del labirinto T-maze, un altro compito di labirinto win-shift motivato in modo apetitivo, forse spiegando perché i topi di controllo utilizzati nel nostro precedente studio50 avevano punteggi di memoria di lavoro leggermente inferiori rispetto ai topi consanguinei C57BL/6. Utilizziamo sempre topi che rientrano nel normale intervallo di peso corporeo per la loro età e sforzo per evitare difficoltà nel mantenere il loro peso tra l'85% e il 90%. Le dimensioni della cucciolata potrebbero influenzare la memoria spaziale e il comportamento ansioso a causa della sovralimentazione precoce in un ceppo chiamato NMRI62. Le piccole dimensioni della cucciolata causano una sovralimentazione e un aumento del peso corporeo sia nei ceppi di topo NMRI che in quelli C57BL/6. Tuttavia, i due ceppi hanno risolto i compiti di apprendimento spaziale in modo diverso. Mentre i topi C57BL/6 non hanno mostrato differenze tra le cucciolate di piccole dimensioni e quelle di controllo, i topi NMRI hanno mostrato una compromissione significativa nella fase di apprendimento con il test del labirinto d'acqua di Morris (MWM) e una leggera compromissione con il compito di alternanza spontanea del labirinto a Y, sebbene non fosse significativa. Inoltre, le piccole dimensioni della cucciolata hanno ridotto significativamente i livelli proteici del fattore neurotrofico derivato dal cervello ippocampale (BDNF) e hanno aumentato il contenuto proteico dell'interleuchina-1b ippocampale (IL-1b) dopo i test MWM e Y-maze nel ceppo NMRI. Tuttavia, questi cambiamenti non sono stati osservati nel ceppo C57BL/6. Il ceppo NMRI dei topi ha mostrato un aumento significativo dei comportamenti ansiosi e dei livelli di corticosterone indotti dallo stress quando allevati in cucciolate di piccole dimensioni. Al contrario, le piccole dimensioni della cucciolata per il ceppo C57BL/6 hanno portato a una riduzione sia dei comportamenti ansiosi che dei livelli di corticosterone. Pertanto, è importante considerare la dimensione della cucciolata del ceppo di topo quando si progettano esperimenti comportamentali.

Differenze comportamentali tra ratti e topi
La maggior parte dei compiti cognitivi sono stati originariamente progettati per i ratti. Inoltre, l'apprendimento spaziale/memoria è stato ampiamente studiato nei ratti. A causa del vantaggio delle odierne tecnologie transgeniche e di modifica del genoma per i topi, i ricercatori spesso applicano ai topi protocolli ideati per i ratti. Tuttavia, ci sono differenze comportamentali coerenti tra ratti e topi 3,4,5,6,7. Ad esempio, hanno differenze di preferenza (preferenza sociale da parte dei ratti e preferenza alimentare da parte dei topi)3 e utilizzano strategie diverse per negoziare diversi compiti di labirinto (labirinti acquatici o terrestri)4. Inoltre, i topi tendono a impiegare più tempo per ottenere buoni punteggi di apprendimento spaziale in RAMa 8 bracci 4,8,9, motivo per cui i topi sono generalmente considerati inferiori ai ratti nei compiti di apprendimento spaziale.

Ratti e topi differiscono anche nel comportamento/carattere generale, comprese le loro risposte allo stress o alla gestione della paura 3,4,5,6,7,10. Ad esempio, studi precedenti hanno riscontrato uno scarso apprendimento dell'estinzione della paura nei topi adolescenti 11,12,13,14, ma non nei ratti 15,16,17,18. Inoltre, i topi sono più inclini allo stress e non amano essere maneggiati rispetto ai ratti, che, quando hanno familiarità con la manipolazione, apparentemente amano essere solleticati dal conduttore e cercano di interagire con i conduttori per più solletico19. Pertanto, la gestione della paura è un fattore importante da considerare quando si studia il comportamento dei topi. Inoltre, Borrow et al.63 hanno riportato che lo stress cronico variabile diminuisce l'mRNA dell'ossitocina e aumenta il volume soma dei neuroni dell'ossitocina nel nucleo paraventricolare. Inoltre, studi recenti hanno dimostrato che la movimentazione dei tunnel può ridurre lo stress e migliorare le prestazioni negli esperimenti comportamentali 38,39,40. Pertanto, è importante evitare di stressare i topi durante o prima degli esperimenti comportamentali.

I topi non amano essere esposti all'aperto, ad esempio nel test in campo aperto o nel labirinto sopraelevato, preferendo luoghi più chiusi e più bui64,65. Nel contesto della RAM, l'hub centrale è lo spazio più aperto, ed è da lì che i topi decidono quale braccio visitare successivamente. Se sono ansiosi nell'hub centrale, potrebbero essere distratti dal compito e avranno prestazioni al di sotto della media. Per questo motivo, abbiamo deciso di catturare i topi in uno dei bracci radiali (vedi parte procedurale), non nel mozzo centrale, in modo che non associno il mozzo a un'esperienza spaventosa.

Quando esplorano la RAM a 8 bracci per ottenere ricompense in cibo, i ratti che emergono da un dato braccio tendono a girarsi ad angolo retto per la loro prossima visita al braccio, saltando il braccio intermedio, e raramente visitano i bracci in sequenza (ciò che chiamiamo "collegamento a margherita"); Vale a dire, i ratti tendono a visitare nell'ordine 1,3,5,7 e non 1,2,3,4 20,53,66. Al contrario, i topi spesso adottano una strategia di collegamento a margherita, probabilmente a causa delle loro dimensioni corporee e della loro flessibilità. La strategia del collegamento a margherita è un modo abbastanza economico per i topi di recuperare le ricompense alimentari, ma è un notevole svantaggio per lo sperimentatore che cerca di testare la memoria di lavoro spaziale perché elude lo scopo dell'esperimento67. Tuttavia, l'esposizione allo stress può influire sulla capacità di apprendimento e modificare la strategia di apprendimento68. Poiché l'approccio del collegamento a margherita può indicare stress, è importante assicurarsi che i topi rimangano non stressati. Descriviamo il nostro protocollo attuale come privo di stress per i topi durante l'attività di memoria di lavoro perché i topi non utilizzano la strategia di collegamento a margherita.

È noto che i topi si affidano a segnali visivi distali più che a segnali visivi prossimali quando navigano nel labirinto 48,69,70. Abbiamo scoperto che l'incorporazione di ulteriori segnali visivi prossimali che sono stati stampati su pezzi di carta e posizionati sulle pareti posteriori di tutte le braccia non ha ridotto tale comportamento, il che è coerente con l'affermazione di Olton et al. per i ratti20. Tuttavia, il posizionamento di beacon sui bracci della porta come segnale intralabirinto ha aiutato i topi più di extramaze a risolvere il compito della memoria di riferimento del labirinto radiale a 6 bracci e il test della memoria di lavoro in un esperimento71. Inoltre, diversi ceppi di topi mostrano diverse abilità visive72, ma la loro capacità di apprendimento visuo-spaziale e la memoria testate nel labirinto di Barnes non riflettono necessariamente la loro capacità visiva, suggerendo che i topi con scarse capacità visive, come BALB/c, possono fare affidamento su diversi processi cerebrali. Pertanto, gli sperimentatori devono considerare quali spunti vogliono utilizzare per adattarsi al meglio ai loro esperimenti.

Ridurre l'ansia nei topi durante la manipolazione
È noto che lo stress da manipolazione influenza gli animali dal punto di vista fisiologico e comportamentale 73,74,75,76,77. Inoltre, Sandi et al hanno dimostrato che la compromissione della memoria spaziale causata dallo stress acuto è associata a una ridotta espressione della molecola di adesione delle cellule neurali (NCAM) nell'ippocampo e nella corteccia prefrontale testando i ratti in un labirinto d'acqua dipendente dall'ippocampo utilizzando una gatta come fattore di stress tra l'ultima prova di apprendimento e il test della sonda78, suggerendo che l'ippocampo e la corteccia prefrontale sono vulnerabili ad alti livelli di stress. Pertanto, è importante ridurre lo stress/ansia negli animali da esperimento per evitare variazioni inspiegabili all'interno e tra gli studi sugli animali. In particolare, le attività di memoria di lavoro richiedono che gli animali si concentrino durante l'attività, quindi è necessario evitare distrazioni inutili. I protocolli pubblicati per testare la memoria di lavoro nei ratti, o la memoria di lavoro e la memoria di riferimento insieme, spesso non includono dettagli importanti come come, quando e da dove gli sperimentatori rimuovono gli animali dal labirinto alla fine del compito. Poiché i topi sono meno socievoli dei ratti con il conduttore e sono più inclini allo stress, tali dettagli sono più importanti per gli esperimenti con i topi. I roditori possono sviluppare la memoria episodica, che è una forma di memoria esplicita a lungo termine che include la memoria di tempi, luoghi ed emozioni associate 79,80,81. Pertanto, abbiamo scelto di non rimuovere i topi dal labirinto subito dopo aver raccolto tutte le ricompense alimentari nella RAM, ma abbiamo invece permesso loro di fare quattro visite successive al braccio senza ottenere ricompense alimentari. Questo è stato fatto per evitare che i topi associassero il successo del recupero di tutte le ricompense con l'esperienza possibilmente spaventosa di essere catturati dallo sperimentatore, il che è importante, soprattutto per la fase iniziale dell'apprendimento nella RAM. Inoltre, le quattro visite aggiuntive al braccio non premiate possono rafforzare il fatto che le ricompense alimentari non vengono reintegrate nelle braccia che i topi hanno visitato in precedenza. Se la manipolazione non è troppo stressante per i topi, interagiscono con lo sperimentatore più spesso38. Per evitare lo stress, sollevare il topo dalla sua gabbia domestica all'inizio dell'esperimento RAM utilizzando un tubo di carta nella gabbia domestica fornita quando sono stati separati dalla gabbia raggruppata per l'esperimento38, oppure lasciare che il topo si arrampichi volontariamente sulla mano dello sperimentatore, quando lo maneggia nella gabbia domestica prima dell'esperimento e quando lo porta dalla gabbia domestica al labirinto. Quando recuperi i topi dal labirinto alla fine di un esperimento, non inseguirli nel labirinto, ma bloccare invece l'ingresso del braccio del labirinto con una mano e lasciare che i topi si arrampichino su di esso volontariamente, coprendo il braccio del labirinto con l'altra mano per evitare che il topo salti fuori dal labirinto. Questo riduce lo stress di essere inseguiti nel labirinto o presi per la coda. Gli sperimentatori maschi sono a volte più stressanti delle sperimentatrici femmine, per quanto riguarda i topi82. Tuttavia, prestando attenzione ai passaggi di riduzione dello stress qui descritti, si è scoperto che gli sperimentatori maschi potevano condurre i test RAM senza grossi problemi. Pertanto, come gestire i topi è più importante.

Differenze di sesso
Solo i topi maschi sono utilizzati negli esperimenti qui riportati a causa dei vari impatti del sesso sulla cognizione, l'apprendimento e la memoria osservati in diverse specie (roditori e umani) e perché le risposte allo stress differiscono tra maschi e femmine 63,83,84,85,86,87. Tuttavia, quando si interpretano i risultati ottenuti con i roditori per i possibili benefici per l'uomo, è importante studiare entrambi i sessi. Le linee guida del NIH e di altri consigli di finanziamento suggeriscono anche di utilizzare animali sia maschi che femmine.

Vantaggi del protocollo
Il nostro labirinto radiale semiautomatico a 8 bracci è un labirinto chiuso con pareti in acrilico bianco opaco ma senza coperchi (vedere la Figura 1A per le dimensioni). Durante la navigazione nel labirinto, i topi non possono vedere lo sperimentatore, il che può essere una distrazione nei labirinti con pareti trasparenti o braccia aperte ed elevate, ma possono vedere i segnali visivi distali sopra il labirinto (vedi Figura 1). Inoltre, questo protocollo è, in linea di principio, applicabile all'imaging in vivo in tempo reale e all'elettrofisiologia perché non ci sono cavi sopra il labirinto e i topi possono apprendere il compito in modo efficiente.

Direzioni future
L'attuale protocollo dura 15 giorni dall'assuefazione alla fine del compito di memoria di lavoro. Abbiamo eseguito il protocollo senza interruzioni nei fine settimana; Tuttavia, fare una pausa nel fine settimana dopo l'assuefazione di 6 giorni non dovrebbe avere un impatto significativo sulla successiva attività di memoria di lavoro di 9 giorni. Fare una pausa nel fine settimana durante l'attività di memoria di lavoro di 9 giorni può rallentare l'apprendimento nei topi. Pertanto, avere due sperimentatori ben addestrati nel maneggiare i topi potrebbe aiutare a ridurre lo stress degli sperimentatori senza rallentare l'apprendimento dei topi. Secondo la Figura 4A, B, i primi tre giorni sono cruciali, poiché i topi ottengono in media più di una prova perfetta dopo il quarto giorno. Pertanto, si consiglia di evitare pause durante i primi tre giorni. Se l'attività di memoria di lavoro è troppo facile per i mouse di tuo interesse, potrebbe essere necessario aumentare il tempo di confinamento dopo le esecuzioni forzate. Questi devono essere adattati ai singoli casi.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo i nostri colleghi del Wolfson Institute for Biomedical Research per le utili discussioni e David Bannerman (Università di Oxford) per i consigli sul comportamento dei topi e per aver esaminato una prima bozza dell'articolo. Ringraziamo anche Matthew Grist per il supporto tecnico e amministrativo. Questa ricerca è stata finanziata dal Wellcome Trust [108726/Z/15/Z e 214286/Z/18/Z] e dal Gerald Choa Neuroscience Institute [PJ8425013].

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pinze per arterie o pinzaQualsiasiN/APer tagliare il cibo standard
C57BL/6J topiJackson laboratorio0006642~3 mesi
Latte condensato (garofano)NestléN/AUtilizzato come ricompensa nel compito
Acqua distillataQualsiasiN/APer la pulizia e il diluente del latte condensato
EthovisionXT13 NoldusN/AControlla le porte del labirinto e il mouse di inseguimento
- Modulo multiplo del punto del corpoNoldusN/APer l'inseguimento di più punti del corpo
- Prova & Modulo di controllo hardwareNoldusN/Aper prove e Controllo hardware
: scatola I/ONoldusN/AControlla le porte del labirinto
Estrude segnali visiviQualsiasiN/APer mappare il labirinto con i topi Telecamera
ad alta risoluzioneTracksysN/APer il tracciamento e le riprese del mouse
PennelloQualsiasiN/APer la pulizia
tunnel della cartaQualsiasiN/APer la gestione dei topi
Igloo di cartaQualsiasiN/APer il nesting
Strisce di nesting di cartaQualsiasiN/APer il nesting
Pipetteman P1000 GilsonF144059MPer fornire latte condensato diluito alla gabbia domestica
Punta per pipette P1000QualsiasiQualsiasi
Pipetteman P200GilsonF144058MPer innescare il labirinto
Punta per pipette P200Qualsiasi
Labirinto a braccio radialeTracksysN/ALampade per ambienti su misura
QualsiasiN/APer pari illuminazione nel labirinto
Piccolo bicchiere di plasticaQualsiasiN/APer fornire latte condensato diluito alla gabbia domestica
Altoparlanti per rumore biancoQualsiasiN/APer la riproduzione di rumore bianco
Chow standardQualsiasiN/APer restrizioni dietetiche
Carta velinaQualsiasiN/APer la pulizia
Lente verifocaleTracksysN/A5-50 mm, messa a fuoco manuale, iride manuale
Blocco morso in legnoQualsiasiN/APer l'annidamento
Tubo da centrifuga da 50 mlFalconFalcon™ 352070Per miscelare il latte condensato con acqua distillata (1:1)
del Qualsiasi

Riferimenti

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