Questo protocollo descrive una procedura modificata per isolare rapidamente ovociti puliti allo stadio I in zebrafish privi di cellule della granulosa, fornendo così un metodo conveniente per la ricerca specifica per gli ovociti.
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Articolo metodologico
Isolamento rapido di ovociti in stadio I in zebrafish privi di cellule della granulosa
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo studio dello sviluppo degli ovociti ha implicazioni significative nella biologia dello sviluppo. Il pesce zebra (Danio rerio) è stato ampiamente utilizzato come organismo modello per studiare i primi processi di sviluppo dall'ovocita all'embrione. Nel pesce zebra, gli ovociti sono circondati da un singolo strato di cellule della granulosa somatica. Tuttavia, la separazione delle cellule della granulosa dagli ovociti rappresenta una sfida, poiché il raggiungimento di ovociti puri è fondamentale per un'analisi precisa. Sebbene siano stati proposti vari metodi per isolare gli ovociti di zebrafish in diversi stadi di sviluppo, le tecniche attuali non sono in grado di rimuovere completamente le cellule della granulosa, limitando l'accuratezza dell'analisi del genoma focalizzata esclusivamente sugli ovociti. In questo studio, abbiamo sviluppato con successo un processo rapido ed efficiente per isolare gli ovociti puri allo stadio I nel pesce zebra, eliminando al contempo la contaminazione cellulare della granulosa. Questa tecnica facilita l'analisi biochimica e molecolare, in particolare nell'esplorazione degli aspetti epigenetici e della struttura del genoma specifici degli ovociti. In particolare, il metodo è facile da usare, riduce al minimo il danno agli ovociti e fornisce una soluzione pratica per la ricerca e l'analisi successive.
Introduzione
Il pesce zebra è tra i più importanti sistemi modello nella biologia dello sviluppo. Negli ultimi anni, numerosi studi hanno utilizzato il pesce zebra come modello per studiare importanti eventi biologici e processi regolatori dall'ovocita all'embrione. Questi comprendono gli intricati processi di sviluppo e maturazione degli ovociti1, la funzionalità dei geni materni2, la regolazione delle transizioni materno-zigotiche3 e ampie analisi omiche4.
Le cellule della granulosa, le cellule somatiche che avvolgono e nutrono l'ovocita in via di sviluppo all'interno del follicolo ovarico 5,6, svolgono un ruolo fondamentale in questo processo di sviluppo. Quando le cellule germinali primordiali (PGC) si evolvono in oogonia, vengono circondate da un monostrato di cellule della granulosa7. Insieme alle cellule tecali esterne, l'ovocita e le cellule della granulosa circostanti costituiscono un follicolo maturo8. Data la distinzione fondamentale tra cellule germinali e cellule somatiche, ottenere un campione di ovociti puri è imperativo, soprattutto per le analisi relative al genoma.
All'interno della struttura follicolare del pesce zebra, le cellule della granulosa mostrano tipicamente un diametro di soli pochi micron8, sottolineando l'intima interconnessione tra le cellule della granulosa e gli ovociti9. Questa stretta associazione rappresenta una sfida per raggiungere la completa separazione a causa della notevole differenza sia nel numero che nel volume delle cellule della granulosa rispetto agli ovociti (centinaia di cellule della granulosa rispetto a un singolo ovocita)10,11. Anche una contaminazione minima con una singola cellula della granulosa può ostacolare le analisi a valle mirate specificamente agli ovociti. Pertanto, per gli studi incentrati sulle caratteristiche genomiche ed epigenetiche, l'eliminazione delle cellule della granulosa è essenziale.
Beneficiando di criteri morfologici ben caratterizzati, gli ovociti in ogni stadio possono essere distinti in base al diametro11. Il processo di ovogenesi nel pesce zebra è classificato in cinque fasi in base alla morfologia e al cariotipo11. Gli ovociti di stadio I (7-140 μm di diametro) comprendono gli ovociti dall'inizio della meiosi allo stadio iniziale della meiosi I. Fondamentalmente, questi ovociti sono trasparenti e consentono l'osservazione del nucleo centrale attraverso la luce trasmessa (Figura 1Ai). Gli ovociti di stadio II (diametro 140-340 μm) diventano gradualmente schiumosi e traslucidi. Con l'ingrossamento dei follicoli e la proliferazione degli alveoli corticali, le vescicole germinali al centro diventano difficili da distinguere12 (Figura 1Aii). Gli ovociti allo stadio III (340-690 μm di diametro) accumulano progressivamente vitellogenina e i follicoli freschi diventano sempre più opachi (Figura 1Aiii). La meiosi continua negli ovociti allo stadio IV (690-730 μm di diametro) quando i cromosomi entrano nel mezzo della meiosi II, dove ristagnano (Figura 1Aiv). Gli ovociti dello stadio V (730-750 μm di diametro) sono maturati e sono pronti per l'ovulazione 7,11 (Figura 1Av).
Sulla base delle caratteristiche uniche di ciascuna delle fasi sopra menzionate, è stato proposto un metodo per isolare gli ovociti dagli stadi I a III digerendo le ovaie di zebrafish utilizzando una soluzione digestiva contenente collagenasi I, collagenasi II e ialuronidasi, seguita da filtrazione attraverso un colino cellulare di dimensioni specifiche13. Tuttavia, mentre questo metodo consente di ottenere ovociti in diverse fasi di sviluppo, non riesce a separare completamente gli ovociti e le cellule della granulosa. Altri ricercatori hanno anche suggerito metodi per separare le cellule della granulosa dagli ovociti. Tuttavia, questi metodi si basano principalmente su approcci meccanici, che possono causare danni agli ovociti, richiedono molto tempo e sono inadeguati per ottenere un numero sostanziale di ovociti per l'analisi 14,15.
Dati i limiti dei metodi esistenti e le specifiche esigenze di ricerca, questo studio mira a stabilire una procedura per separare completamente gli ovociti e le cellule della granulosa e ottenere un numero sufficiente di ovociti puliti di stadio I per l'analisi. Ampliando il metodo13 di riferimento, impieghiamo un tampone di digestione migliorato (vedi Tabella dei materiali) che è più delicato e facilita la dispersione degli ovociti e la dissociazione delle cellule della granulosa. Successivamente, gli ovociti vengono fatti passare attraverso un colino cellulare, seguito da un lavaggio e da un'ulteriore selezione microscopica, consentendo l'acquisizione di un gran numero di ovociti puliti allo stadio I.
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Protocollo
Tutti i pesci zebra sono stati allevati seguendo le rigorose linee guida per la cura degli animali delineate dagli enti nazionali e/o locali competenti per il benessere degli animali. L'allevamento e la manipolazione del pesce hanno ricevuto l'approvazione sia dalle autorità locali che dal comitato etico animale del West China Hospital dell'Università del Sichuan (approvazione n. 20220422003). Le ovaie del pesce zebra contengono una miscela di ovociti multistadio, con ogni stadio di sviluppo presente nelle ovaie adulte del pesce zebra. Tuttavia, i giovani di zebrafish sono stati selezionati per questo studio a causa della predominanza di ovociti in fase avanzata (stadio II-III) nelle ovaie dei pesci adulti, che sono grandi e opachi. Al contrario, i giovani hanno ovaie piatte e allungate costituite principalmente da ovociti allo stadio I (Figura 1B) (Figura 1B). Ricerche precedenti hanno dimostrato che le caratteristiche morfologiche dell'ovogenesi precoce nel pesce zebra adulto e giovane sono altamente coerenti, supportando la fattibilità dell'utilizzo del novellame di pesce zebra13. Le procedure descritte di seguito, descritte nella Figura 2, forniscono una descrizione dettagliata del processo di isolamento, dalla dissezione all'ottenimento di ovociti puliti allo stadio I. Per ulteriori riferimenti, i reagenti, i tamponi e le attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Dissezione ovarica
- Seleziona diverse femmine di pesce zebra con una lunghezza standard (SL) che va da 10 mm a 15 mm.
NOTA: Il SL, misurato dal muso alla base della coda in millimetri, serve come criterio affidabile per la selezione del pesce appropriato. Si consiglia di utilizzare pesci giovani tra le 5 e le 7 settimane dopo la fecondazione (wpf) con una SL compresa tra 10 mm e 15 mm per questa procedura. Le ovaie dei giovani di zebrafish sono prevalentemente occupate da ovociti precoci, fornendo le condizioni ottimali per ottenere facilmente ovociti allo stadio I (Figura 1B). - Sopprimere le femmine giovani mettendole in acqua ghiacciata (0-4 °C).
NOTA: Le seguenti procedure devono essere eseguite per garantire l'eutanasia e ridurre al minimo il dolore provato dal pesce zebra durante l'eutanasia: confermare che la temperatura dell'acqua ghiacciata sia compresa tra 0 e 4 °C utilizzando un termometro, trasferire rapidamente il pesce zebra nell'acqua ghiacciata e mantenerlo nell'acqua ghiacciata per almeno 10 minuti dopo la cessazione del movimento opercolare16, 17,18. - Asciugare l'acqua in eccesso sulla superficie del pesce utilizzando carta assorbente.
- Seziona il pesce zebra al microscopio stereoscopico seguendo questi passaggi:
- Tagliare la testa usando delle micro-forbici lungo il margine posteriore della copertura branchiale; Taglia la coda lungo la cloaca. Trasferire il tronco centrale in un piatto da 35 mm contenente 2 ml di terreno L-15 (con L-glutammina).
- Sezionare il tronco centrale nel mezzo L-15. Tagliare lungo l'asse centrale dell'addome e rimuovere i visceri e la vescica natatoria.
NOTA: I visceri del pesce zebra sono collegati. Pertanto, pizzica l'intestino posteriore vicino alla regione anale e sollevalo per rimuovere facilmente l'intera massa viscerale. - Staccare le ovaie bilaterali dall'addome usando una pinzetta. Rimuovere il tessuto adiposo, le squame e gli altri tessuti corporei attaccati all'ovaio.
NOTA: Le ovaie sono ricoperte di tessuto adiposo. Pertanto, è meglio rimuoverli insieme per evitare danni meccanici agli ovociti.
ATTENZIONE: Maneggiare le pinzette con cura per evitare lesioni.
2. Digestione
- Trasferire le ovaie in una piastra a 6 pozzetti contenente 2 mL di soluzione di dissociazione cellulare di Kinger e incubare per 2-3 ore a 28,5 °C. Agitare la piastra a 6 pozzetti ogni 30 minuti per favorire la dispersione.
NOTA: Utilizzare una pinzetta per separare le ovaie in piccoli blocchi di tessuto per migliorare l'efficacia della digestione. Il tempo di digestione è variabile; monitorare e terminare regolarmente il processo quando un numero significativo di ovociti in stadio I viene disperso sotto lo stereomicroscopio. La soluzione di dissociazione cellulare di Kinger è la soluzione di lavoro e può essere utilizzata direttamente. Può essere conservato stabilmente a -20 °C dopo il confezionamento e scongelato a bassa temperatura (4 °C) prima dell'uso. - Aggiungere L-15 medium preriscaldato a 28,5 °C al tampone di digestione per arrestare la digestione.
3. Filtrazione
- Posizionare un filtro cellulare da 100 μm in un altro pozzetto della piastra a 6 pozzetti, aggiungere il terreno L-15 e assicurarsi che il livello del fluido sia superiore al filtro.
NOTA: Il diametro teorico degli ovociti dello stadio I è inferiore a 140 μm. Tuttavia, gli ovociti con diametri maggiori possono ancora passare attraverso il colino cellulare. Pertanto, in questa fase è stato selezionato un filtro cellulare con un diametro inferiore al bersaglio. Le dimensioni delle maglie possono essere regolate in base alle specifiche esigenze sperimentali. - Aspirare il terreno digestivo attraverso il colino cellulare utilizzando una pipetta. Attendere 1-2 minuti fino a quando tutti gli ovociti dello stadio I sono passati attraverso il colino, quindi rimuoverlo. Assicurarsi che gli ovociti rimangano nel liquido durante tutto il processo di trasferimento.
NOTA: Mantenere gli ovociti nel terreno aiuta a mantenere la loro integrità e la loro condizione ottimale. Se gli ovociti vengono esposti all'aria per un periodo prolungato, potrebbero seccarsi e danneggiarsi, compromettendo l'efficienza di separazione finale. Tenere la pipetta sotto la superficie del liquido durante il trasferimento degli ovociti attraverso il colino cellulare piuttosto che aggiungerli in modo sospeso.
4. Lavaggio
- Rimuovere il terreno in eccesso utilizzando una pipetta. Aggiungere 4 mL di terreno L-15 fresco e risospendere delicatamente gli ovociti. Attendere 1-2 minuti, quindi rimuovere il surnatante.
NOTA: Utilizzare strumenti con basse proprietà di adesione per evitare danni agli ovociti. - Ripetere il passaggio 4.1 5-6 volte fino a quando non sono presenti altre impurità.
NOTA: Una manipolazione delicata durante il processo di lavaggio è fondamentale per evitare danni agli ovociti. Nonostante l'ottenimento di un'abbondanza di ovociti allo stadio I (circa 200-400 ovociti allo stadio I da un pesce zebra) dopo le precedenti fasi di lavaggio, gli ovociti possono ancora essere mescolati con frammenti cellulari, ovociti di altri stadi o piccoli granuli formati da ovociti rotti in fase avanzata. Inoltre, alcune cellule della granulosa possono ancora aderire alla superficie di diversi ovociti a causa di una digestione enzimatica incompleta. Pertanto, per le applicazioni che richiedono un livello di purezza più elevato, come il sequenziamento del genoma, sono necessari ulteriori passaggi per selezionare ovociti completamente puliti. Per risolvere questo problema, procedere con i passaggi 5 e 6.
5. Selezione per il controllo qualità
- Trasferire gli ovociti della fase I lavati in una piastra da 35 mm contenente terreno L-15 fresco.
- Al microscopio con un ingrandimento uguale o superiore a 10x, rimuovere frammenti cellulari, ovociti di altro stadio e ovociti di stadio I aderiti dalle cellule della granulosa utilizzando uno strumento che può essere manipolato con precisione, come un ago per iniezione smussato.
NOTA: Questo passaggio richiede pazienza da parte dello sperimentatore, ma garantisce l'isolamento di ovociti puliti e intatti.
ATTENZIONE: Maneggiare gli aghi per iniezione con cura per evitare lesioni.
6. Conferma mediante colorazione nucleare
NOTA: Per un ulteriore raffinamento degli ovociti isolati, è stata impiegata la colorazione con Hoechst 33342 per identificare e rimuovere i singoli ovociti aderiti con cellule della granulosa che potrebbero essere stati persi nel passaggio precedente.
- Aggiungere una concentrazione finale di 5 μg/mL di Hoechst 33342 al terreno L-15 e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Osservare la fluorescenza di Hoechst attraverso un microscopio a fluorescenza sotto eccitazione laser UV.
NOTA: Hoechst è tipicamente eccitato nella regione dell'ultravioletto, di solito a lunghezze d'onda comprese tra 310 e 360 nm. Si consiglia di utilizzare un ingrandimento compreso tra 80x e 100x durante questo processo. Utilizzare la modalità di esposizione automatica. La lunghezza d'onda di eccitazione e il tempo di esposizione possono essere regolati in base al modello di microscopio specifico e alle esigenze individuali. - Utilizzando un ago, selezionare con cura gli ovociti che non soddisfano i criteri desiderati.
NOTA: Quando si visualizzano le cellule, una grande cromatina nucleare è presente al centro dell'ovocita. Se le cellule della granulosa aderissero all'ovocita, sarebbero visibili nuclei piccoli e luminosi, aggrappati al bordo dell'ovocita (Figura 3). Sceglili al microscopio. - Lavare accuratamente e ripetutamente gli ovociti con L-15 per rimuovere l'eccesso di Hoechst.
- Utilizzare direttamente gli ovociti di stadio I identificati per la successiva estrazione o conservarli a -80 °C dopo il congelamento rapido in azoto liquido.
ATTENZIONE: Indossare una maschera facciale protettiva e guanti criogenici quando si maneggiano congelatori ad azoto liquido e a bassissima temperatura.
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Risultati
La Figura 1 illustra la morfologia ovarica osservata sia nel pesce zebra adulto che in quello giovane, mostrando gli ovociti in diversi stadi di sviluppo come riferimento. La Figura 1A fornisce una rappresentazione grafica della morfologia e delle dimensioni degli ovociti in ogni fase dello sviluppo, a partire dalla fase di crescita primaria (stadio I) e terminando con l'ovulo ovulato (stadio V). Le figure 1Ai-v illustrano i diametri corrisponde...
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Discussione
In questo studio, abbiamo sviluppato un metodo per isolare ovociti puri e puliti allo stadio I, escluse le cellule della granulosa, per l'analisi a valle (in particolare le analisi genomiche). Confrontando questo metodo modificato con il metodo di riferimento13, gli ovociti dello stadio I ottenuti con questo metodo sono morfologicamente intatti, in numero sufficiente e privi di contaminazione con altre cellule somatiche, il che li rende adatti per vari studi e ana...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (32170813 e 31871449) e dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia del Sichuan (2024NSFSC0651) e dal progetto 1·3·5 per discipline di eccellenza–Clinical Research Fund, West China Hospital, Sichuan University (2024HXFH035). Gli autori desiderano ringraziare Zhao Wang e Yanqiu Gao del Laboratorio di Chirurgia Pediatrica per l'allevamento di pesci zebra legati a questo lavoro. Gli autori desiderano inoltre ringraziare tutti i revisori che hanno partecipato alla revisione, nonché MJEditor (www.mjeditor.com) per aver fornito servizi di revisione in inglese durante la preparazione di questo manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di dissociazione cellulare di Kinger | PlantChemMed | PC-33689 | soluzione di dissociazione cellulare di Kinger può essere conservata stabilmente a -20 ° C dopo l'imballaggio e può essere utilizzato dopo lo scongelamento a bassa temperatura (4 ° C). Può essere utilizzato direttamente per dissociare le ovaie del pesce zebra. La temperatura ottimale è di 28,5 gradi C, per circa 2-3 ore. La durata può essere regolata in base alle specifiche condizioni di dissociazione, accorciata o estesa (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689). |
| Filtri cellulari (100 μ m ) | Falcon | 352360 | |
| Microscopio a fluorescenza | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Pinze | Dumont | #5 | |
| Ago capillare in vetro | / | / | Smussato bruciando con accendino |
| Hoechst | Yesen | 40732ES03 | |
| Puntali per pipette a basso adsorbimento (10 μ l ) | Labsellect | T-0010-LR-R-S | |
| Leibovitz' s L-15 medio medio (con L-glutammina) | Hyclone | SH30525.01 | |
| Secchiello per il ghiaccio | / | / | L'acqua ghiacciata viene utilizzata per l'eutanasia del pesce zebra |
| Incubatrice | WIGGENS | WH-01 | |
| Pesce giovane | / | / | 5– 6 settimane dopo la fecondazione, lunghezza standard [SL] di 10– Piatto di plastica da 15 mm |
| (35 mm) | Stereomicroscopio SORFA | 230101 | |
| Motic | SMZ-161 | ||
| Piastra per colture tissutali (6 pozzetti) | Forbici a molla SORFA | 0110006 | |
| Vannas | Fine Science Toosl | #15000-00 |
Riferimenti
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