Method Article

DNAzyme 10-23 - Nanomacchine basate sul riconoscimento degli acidi nucleici

DOI:

10.3791/66461

⸱

February 9th, 2024

 ,  ,  ,  , 
1ITMO University, 2University of Central Florida

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le nanomacchine basate su DNAzyme possono essere utilizzate per il rilevamento altamente selettivo e sensibile degli acidi nucleici. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per la progettazione di nanomacchine basate su DNAzyme con un nucleo 10-23 utilizzando software libero e la loro applicazione nel rilevamento di un frammento di virus di Epstein-Barr come esempio.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le nanomacchine basate su DNAzimi (DNM) per la rilevazione di sequenze di DNA e RNA (analiti) sono strutture multifunzionali costituite da oligonucleotidi. Le loro funzioni includono lo stretto legame dell'analita, il riconoscimento altamente selettivo dell'analita, l'amplificazione del segnale fluorescente mediante molteplici scissioni catalitiche di un substrato reporter fluorogenico e l'attrazione del substrato fluorogenico per un aumento della risposta del sensore. Le unità funzionali sono attaccate a un'impalcatura comune di DNA per la loro azione cooperativa. I DNM 10-23 con scissione dell'RNA presentano una sensibilità migliorata rispetto alle sonde di ibridazione non catalitica. La stabilità del DNM e le maggiori possibilità di riconoscimento del substrato sono fornite da un frammento di DNA a doppio filamento, una piastrella. DNM è in grado di differenziare due analiti con una differenza di singolo nucleotide in un RNA ripiegato e in un DNA a doppio filamento e rilevare analiti a concentrazioni ~1000 volte inferiori rispetto ad altre sonde di ibridazione senza proteine. Questo articolo presenta il concetto alla base del potenziale diagnostico dell'attività delle nanomacchine a DNA e una panoramica della progettazione, dell'assemblaggio e dell'applicazione del DNM nei saggi di rilevamento degli acidi nucleici.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uno dei primi metodi per la rilevazione dell'acido nucleico è il legame complementare di oligonucleotidi selettivi alle sequenze di RNA o DNA analizzate. Questo metodo impiega frammenti di acido nucleico (sonde) che possono formare coppie di basi di Watson-Crick con un analita di DNA o RNA1 mirato. Il complesso viene quindi differenziato dall'analita e dalla sonda non legata mediante una varietà di tecniche. Alcuni metodi, come il Northern blotting, l'ibridazione in situ o qPCR, si basano sul fenomeno del legame complementare2. Le sonde di ibridazione più comuni presentano due svantaggi significativi: bassa sensibilità (possono raggiungere livelli da micromolari a nanomolari) e bassa selettività alle variazioni di singolo nucleotide (SNV), comprese le mutazioni puntiformi. La questione richiede un approccio sofisticato poiché le soluzioni a questi inconvenienti sono in conflitto tra loro3. Per fornire la migliore selettività, l'oligonucleotide rivelatore deve essere mantenuto sufficientemente corto da formare ibridi instabili con analiti non corrispondenti. Tali oligonucleotidi corti non sono in grado di legare strettamente gli acidi nucleici bersaglio e di svolgere le loro strutture secondarie, quindi spesso non riescono a fornire un segnale rilevabile. È particolarmente difficile rilevare frammenti ricchi di CG nell'RNA biologico, o DNA a doppio filamento (dsDNA). D'altra parte, le sonde lunghe sono insensibili a SNV3. Per sbloccare la situazione, è stato sviluppato il concetto di sonda binaria4.

I sensori binari dividono una singola sonda di rilevamento in due parti e ne specializzano i frammenti, mantenendone uno a lungo per srotolare le forcine o invadere il dsDNA. Il secondo frammento di sonda binaria rimane corto per essere sensibile a una base non corrispondente, fornendo così un mezzo per rilevare SNV. Il segnale verrà prodotto se le due parti binarie del sensore sono unite insieme4. L'intero complesso può essere visualizzato tramite FRET5, sonda beacon molecolare 6,7 o G-quadruplex con attività simile alla perossidasi 8,9,10, oppure 11,12,13 DNAzima che scissa l'RNA. I sensori binari con un nucleo di DNAzima 10-23 sono stati ampiamente descritti. Sono stati adattati per rilevare frammenti di acido nucleico a singolo filamento creati sinteticamente11 o prodotti di amplificazione a singolo filamento 14,15. La rilevazione senza amplificazione è possibile, ad esempio, anche nel caso dell'rRNA 16S estratto da una coltura cellulare, poiché questa molecola è abbondante nelle cellule 12,16. I sensori binari con un nucleo DNAzyme 10-23 possono anche essere adattati per la rilevazione di acidi non nucleici, come per gli ioni piombo17. Tuttavia, la bassa sensibilità è ancora considerata uno dei principali svantaggi dei sensori binari 10-23 DNAzyme e per risolvere questo problema sono stati sviluppati vari approcci, tra cui le cascate18 o i metodi alternativi di miglioramento del segnale19. Sfortunatamente, le tecniche di cui sopra aumentano drasticamente il costo e l'instabilità dei componenti del sensore, e quindi non sono entrate in pratica.

L'esperimento descritto in questo lavoro utilizza 10-23 nanosensori di DNA basati su DNAzima denominati DNA-nanomacchine (DNM)20,21. Queste strutture includono sensori binari e anche (1) facilitatori di DNA che fiancheggiano la sonda binaria, svolgendo le regioni strutturate e invadendo il DNA a doppio filamento, e (2) una piastrella di DNA che tiene insieme tutte le parti DNM in stretta vicinanza e aumenta le possibilità di formazione del segnale (Figura 1). Complessivamente, i DNM basati su DNAzima 10-23 riducono il limite di rilevabilità (LOD) fino all'intervallo picomolare21; possono essere utilizzati per rilevare il 16rRNA nei lisati cellulari22 o segnalare la presenza di RNA virale senza amplificazione23,24. Allo stesso tempo, i DNM rimangono sensibili all'SNV e possono anche essere utilizzati per genotipizzare gli alleli in organismi eterozigoti25. Il metodo DNM può essere utilizzato come tecnica complementare a qualsiasi tipo di amplificazione per la visualizzazione del prodotto o l'identificazione del prodotto in una miscela complessa con elevata selettività. I DNM, a differenza delle sonde TaqMan e beacon convenzionali, non richiedono il riscaldamento del campione e quindi possono essere utilizzati nei protocolli di rilevamento degli endpoint, rendendo il rilevamento complessivo conveniente.

Questo articolo descrive lo sviluppo in silico di un DNM e illustra le procedure per l'assemblaggio e la caratterizzazione funzionale del DNM. Il lavoro è stato eseguito utilizzando un frammento sintetico del virus di Epstein-Barr (EBV) corrispondente alle posizioni 13972-14154 del DNA virale (OR652423.1) (vedi Tabella dei materiali).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Progettazione DNM

  1. Seleziona una regione unica all'interno del genoma di interesse.
    NOTA: Questo lavoro utilizza una regione del genoma del virus di Epstein-Barr (EBV) nelle posizioni 13972-14154 (OR652423.1).
  2. Crea un set di primer per l'amplificazione del frammento selezionato, ad esempio, tramite lo strumento Primer3 incorporato in Ugene26.
  3. Aprire lo strumento web UNAFold27 (vedere Tabella dei materiali) e inserire la regione selezionata. Modificare la temperatura di ripiegamento a 55 °C e le condizioni ioniche a 250 mM di ioni monovalenti e 200 mM di Mg2+.
    1. Aprire la struttura secondaria risultante del frammento di ssDNA e selezionare una forcina stabile. Localizzare il sito di legame delle nanomacchine a DNA nelle regioni non strutturate o, in alternativa, sugli anelli delle strutture a forcina per ottenere un legame più forte del bersaglio.
  4. Se il sito dell'analita di destinazione è piegato in una struttura ad anello dello stelo, posizionare i bracci 1 e 2 come segue: Assicurarsi che il braccio 2 leghi un lato dello stelo, l'ansa e 3-5 nt del secondo lato dello stelo; Il braccio 1 lega un frammento del secondo lato del gambo.
  5. Aprire lo strumento DinaMelt28 (vedi Tabella dei materiali) e analizzare le sequenze dei bracci e le loro sequenze di complemento inverso. Utilizzare lo strumento DinaMelt per assicurarsi che la Tm dei bracci 2 e 3 sia superiore a 65 °C: almeno 10 °C al di sopra della temperatura del saggio (55 °C).
    1. Mantenere la Tm del braccio 1 ad almeno 1-3 °C al di sopra della temperatura di reazione (55 °C) se si vuole raggiungere un'elevata selettività di riconoscimento29.
  6. Combina le sequenze Arms 1 e 2 con le metà del nucleo DNAzyme e i frammenti di legame F-sub13.
  7. Analizza la struttura secondaria dei filamenti di DNA progettati utilizzando UNAFold27.
    NOTA: 55 °C (temperatura del saggio), 200 mM Mg2+, 250 mM di ioni monovalenti (HEPES, Na+, K+).
    1. Utilizzare il design solo se il ΔG di piegatura è inferiore a - 4 kcal/mol. Cerca di evitare lunghe sequenze ricche di CG. Se la struttura secondaria è troppo stabile, introdurre una mutazione nel braccio per aumentare il ΔG di ripiegamentodi 30. In alternativa, posizionare il braccio 3 a 2-3 nt di distanza dal braccio 2 è un'altra strategia per modificare la sequenza del braccio 3 per evitare strutture intermolecolari stabili.
  8. Crea una sequenza casuale per il frammento di tessera di DNA lunga quanto il braccio 3. Combina la sequenza Arm 3 con la sequenza di tessere di DNA tramite (dT)4-6 o glicole etilenico (ad esempio, glicole trietilenico (TEG) o glicole esaetilenico (HEG)). La versione DNM presentata nell'esperimento utilizza (dT)6.
  9. Collegare Arm 2 con la sequenza complementare al frammento di piastrella di DNA selezionato nel passaggio 1.8 tramite un linker.
  10. Analizza la struttura secondaria dei filamenti di DNA progettati utilizzando l'app web UNAFold. Assicurarsi che l'energia di ripiegamento di ciascun filamento di DNA sia superiore a 4 kJ/mol a 55 °C ed evitare lunghe sequenze arricchite di CG. Preferibilmente, cambia la sequenza delle tessere di DNA.
  11. Disegna la struttura utilizzando qualsiasi software di grafica vettoriale disponibile. Questo articolo utilizza Biorender e Pixelmator Pro per la visualizzazione (vedi Tabella dei materiali). Verificare l'accuratezza nelle direzioni 5'->3' per ogni filo.
    NOTA: Ottenere le sequenze da un fornitore commerciale affidabile.

2. Test funzionale del DNM

  1. Preparazione del tampone e dei reagenti
    1. Preparare il tampone di reazione composto da 50 mM di HEPES (pH 7,5-7,8), 50 mM di NaCl, 150 mM di KCl e 200 mM di MgCl2. Riempire con acqua deionizzata fino a 50 mL.
    2. Preparare aliquote da 10 μM di oligonucleotidi Dzb-Tile e Tile-Arm3. Preparare 1 μM di soluzione di Dza, un F-sub da 100 μM e analiti da 1 nM, 10 nM, 100 nM in RNasi/acqua libera o acqua deionizzata sterile. I dettagli delle sequenze oligonucleotidiche sono forniti nella Tabella dei Materiali.
  2. Assemblaggio DNM
    1. Scongelare completamente le soluzioni di oligonucleotidi prima dell'uso. Mescolare delicatamente picchiettando (non vorticare intensamente). Centrifugare (rapidamente, per alcuni secondi) la soluzione utilizzando una microcentrifuga.
    2. Miscelare 1 μM ciascuno di Dzb-Tile e Tile-Arm3 in 200 μL del tampone di reazione in provette per microcentrifuga da 0,5 mL.
    3. Mescolare delicatamente il tubo e far girare la soluzione.
    4. Avvolgere il coperchio del tubo chiuso con pellicola di paraffina. In alternativa, utilizzare tubi con tappo a vite.
    5. Incubare la provetta in un becher da 500 ml con acqua bollente per 2 minuti, quindi spegnere il riscaldatore e lasciare raffreddare passivamente la temperatura per una notte.
    6. Preparare il 12% nativo PAGE: Miscelare 1 mL di tampone 10х TBE, 3 mL di AA:BA al 40%, acqua deionizzata fino a 10 mL, 50 μL di APS e 5 μL di TEMED (vedere la Tabella dei materiali). Sposta la miscela nella cassetta del gel e lasciala polimerizzare.
    7. Miscelare 1 μl di ciascun campione, ovvero DNM, Dzb-Tile e Tile-arm3 assemblati, con 1 μl di colorante di caricamento 4x e caricarli nel gel.
    8. Inserire la cassetta nella camera, riempirla con 1x tampone TBE e lasciare scorrere il gel per 90 minuti a 80 V.
    9. Colorare il gel con bromuro di etidio e visualizzarlo utilizzando un sistema di documentazione in gel (vedi Tabella dei materiali).
  3. Saggio LOD
    1. Preparare 160 μl di 200 nM F-sub nel tampone di reazione. Questo viene fatto per valutare il fondo di base della stabilità del substrato.
    2. Preparare 7 aliquote da 160 μL di DNM, F-sub e Dza preassemblati a concentrazioni di 20 nM di DNM e Dza e 200 nM di F-sub nel tampone di reazione. Delle sette provette, tenere la provetta #1 come sfondo bianco per valutare l'assemblaggio spontaneo del nucleo del DNAzyme.
    3. Aggiungere l'analita nelle provette #2-7 alle concentrazioni finali di 1 pM, 10 pM, 100 pM, 200 pM, 500 pM e 1000 pM.
    4. Miscelare delicatamente, centrifugare le provette e classificare le soluzioni in tre porzioni da 50 μl in una piastra nera a 96 pozzetti. Sigillare la piastra con una pellicola otticamente trasparente.
    5. Incubare la piastra in bagnomaria a 55 °C per 1 ora. Girare il piatto.
    6. Misurare la fluorescenza a 525 nm (λex = 495 nm). Calcola la media e la deviazione standard per ogni punto.
    7. Calcola il rapporto bianco/base dividendo il segnale del tubo che contiene F-sub e DNM per il segnale del tubo che contiene solo F-sub. Assicurarsi che il rapporto sia compreso tra 1,1 e 1,5.
    8. Calcolare il rapporto segnale/bianco dividendo il segnale della provetta che contiene F-sub, DNM e l'analita per il segnale della provetta che contiene solo F-sub e DNM. Considera il segnale come vero positivo se è superiore alla media di fondo più tre deviazioni standard.
    9. Ripetere l'esperimento due volte e assicurarsi che la deviazione standard tra le ripetizioni analitiche sia inferiore a 0,5.

Results

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Lo scopo del primo esperimento era quello di mostrare l'assemblaggio del DNM prima del frammento sintetico dell'analita. Tutti i filamenti DNM costituenti sono stati aggiunti al tampone di reazione e assemblati nel becher. Il complesso DNM assemblato è stato valutato per le sue dimensioni e omogeneità corrette mediante PAGE nativo. La PAGINA nativa mostra il DNM assemblato con l'analita nella corsia 1 e due filamenti DNM nelle corsie 2 e 4. Se la nanomacchina del DNA non fosse assemblata, sarebbero visibili 2 o 3 bande separate invece di una singola banda a bassa mobilità (corsia 2 nella Figura 2A).

La seconda parte del Protocollo implica la caratterizzazione funzionale delle prestazioni DNM e la rilevazione di acidi nucleici bersaglio. In questo studio è stato utilizzato il frammento sintetico di EBV 13972-14154. A tale scopo, i frammenti di DNM preassemblati, insieme allo Dza, sono stati incubati con varie concentrazioni dell'analita per 1 ora a 55 °C. Sono stati misurati due valori del segnale fluorescente di controllo: quello dei frammenti di DNM preassemblati e del Dzb senza l'analita (bianco) e quello del fondo da F-sub (basico). Sono state effettuate tre misurazioni tecniche. Per le statistiche, sono stati condotti anche tre studi indipendenti. È interessante notare che la concentrazione di magnesio in questo studio è superiore a quella che si può trovare in letteratura30. Alti livelli di ioni magnesio aumentano il segnale in tutte le provette di prova, poiché promuovono una scissione spontanea di F-sub31. Abbiamo ottimizzato la composizione del tampone di reazione durante le fasi preliminari dello sviluppo tecnologico e non abbiamo ripetuto questo processo ad ogni studio intrapreso.

Dopo 1 ora di incubazione, la fluorescenza del campione è stata misurata utilizzando uno spettrofluorimetro (vedi Tabella dei materiali). Per confermare la rilevazione del DNA analizzato da parte del DNM, abbiamo confrontato il segnale fluorescente del sensore assemblato con il DNA analizzato e quello del controllo negativo, che non contiene alcun analita aggiunto. Il rapporto segnale/bianco (un rapporto tra le unità di fluorescenza relative medie dei pozzetti contenenti l'analita e dei pozzetti senza analita) non deve essere inferiore a 1,5 per confermare il successo del rilevamento32. Il rapporto bianco/base (fluorescenza della risposta del sensore in assenza di analita divisa per quella del solo controllo F-sub) dovrebbe essere compreso tra 1,1 e 1,5; questo rapporto può essere regolato modificando le concentrazioni di DNM e Dzb (l'intervallo di concentrazione tipico per ciascuno è 5-20 nM). Nella nostra pratica, il LOD è quantificato come l'intersezione della linea di tendenza e tre deviazioni standard al di sopra del blank medio (Figura 2B). Il DNM è efficace se il LOD è <100 pM33. Il DNM deve essere riprogettato se il LOD è superiore a 100 pM.

figure-results-1
Figura 1: Il DNM a tre bracci utilizzato in questo studio. Tre oligonucleotidi, Dza, Dzb-Tile e Tile-Arm3, sono contrassegnati rispettivamente come verde, blu e viola. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Caratterizzazione DNM. (A) Assemblaggio del DNM tramite elettroforesi nativa in gel di poliacrilammide al 12%, 80 V, 1 h, utilizzando una scala di DNA da 50 bp+. (B) Il limite di rilevazione del DNA sintetico dopo 60 minuti di incubazione a 55 °C. La linea orizzontale rappresenta la soglia e la linea verticale è il livello di dettaglio. I valori medi di tre misurazioni indipendenti sono presentati con una deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

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La progettazione di macchine per DNA è semplice, ma richiede una certa esperienza nella progettazione di sonde di ibridazione o nanostrutture funzionali di DNA. È opportuno mantenere il frammento dell'analita il più corto possibile per ridurre il numero di possibili strutture secondarie e semplificare l'invasione del DNM alla struttura secondaria. Il contenuto di CG dovrebbe essere preferibilmente inferiore al 60% per evitare strutture intramolecolari stabili. Il corretto assemblaggio del DNM si ottiene a velocità di raffreddamento lente. In alcuni casi, i DNM possono essere assemblati spontaneamente nel tubo e la fase di ricottura può essere eliminata. L'assemblaggio DNM può essere eseguito in un termociclatore con 0,1-0,3 °C/min o in grandi volumi di acqua di raffreddamento. In caso di montaggio improprio del DNM, si consiglia di rallentare la variazione di temperatura durante la fase di ricottura.

Per misurare il LOD, sono necessari almeno sette punti di concentrazione dell'analita: la concentrazione dell'analita a 0 pM, che è F-sub + DNM, e sei diverse concentrazioni dell'analita, ad esempio, nell'intervallo da 1 nM a 1 pM per osservare la dipendenza lineare (Figura 2B). Spesso, per una maggiore precisione, sono stati utilizzati più di sette punti di concentrazione. Per ogni punto di concentrazione devono essere effettuate tre prove tecniche (50 μl ciascuna). Pertanto, il volume totale per ciascuna concentrazione era di 160 μl (10 μl in eccesso, considerando l'errore della pipetta).

La tecnica DNM presenta una sensibilità più elevata per gli SNV rispetto ad altri sistemi basati sull'ibridazione. Un'elevata selettività nei confronti dell'SNV può essere rilevante per alcuni obiettivi, come l'identificazione di mutazioni puntiformi associate alla genotipizzazione batterica22 o la selezione di eterozigoti nelle piante25. Gli analiti non specifici richiederebbero la stessa procedura sperimentale. Per evitare qualsiasi incomprensione di SNV ad una bassa concentrazione di analita, suggeriamo di confrontare il segnale dell'analita sperimentale sconosciuto con quello del segnale di un analita noto completamente complementare della stessa concentrazione.

Il metodo può essere applicato con successo a ssDNA, miRNA, RNA ripiegato o ampliconi di dsDNA. I frammenti lunghi di RNA o dsDNA, in particolare quelli ricchi di CG, possono richiedere DNM dotati di 4-6 bracci leganti l'analita, mentre due bracci leganti l'analita sono sufficienti per analiti a filamento singolo con una struttura secondaria instabile (ripiegamento del ΔG superiore a -10 kcal/mol). Il metodo può essere applicato per il rilevamento di ampliconi PCR, SDA o LAMP. Il DNM può essere utilizzato per la rilevazione senza amplificazione dell'rRNA in campioni bolliti di coltura batterica senza isolare l'RNA totale 22,34,35. La tecnica potrebbe non funzionare bene con concentrazioni così basse come il livello femtomolare e con frammenti di dsDNA, il cui contenuto di CG nelle regioni fiancheggianti è superiore al 65%. Il contenuto CG può essere stimato, ad esempio, con il calcolatore del contenuto CG Biologics36. Suggeriamo di aggiungere parti di gancio37 ai progetti DNM per aumentare la sensibilità o trasformare il dsDNA in ssDNA nei casi di alto contenuto di CG. Un'altra limitazione del metodo è che i DNM sono sensibili alla qualità dei campioni, quindi gli acidi nucleici devono essere accuratamente purificati. Lo stesso vale per la qualità delle sequenze oligonucleotidiche dei DNM. Si suggerisce quindi di verificare la stabilità e la purezza di ogni apporto di oligonucleotidi. Rispetto alle tecniche di amplificazione convenzionali, la progettazione dei DNM richiede competenze e, alla data di pubblicazione dell'articolo, è quasi interamente manuale. I DNM necessitano di alcuni test preliminari su frammenti sintetici prima di sottoporli a campioni di DNA o RNA reali, aumentando così la durata complessiva dello sviluppo del sistema di test.

Il metodo è versatile e può adottare diversi tipi di sonde reporter. Può essere multiplexato38 e la tecnica può essere trasformata in una versione colorimetrica se l'F-sub viene sostituito con un substrato G-quadruplex39. La presenza di polimerasi è associata a errori nella crescita del filamento; pertanto, questo metodo è vantaggioso rispetto alla PCR in tempo reale convenzionale e alla PCR digitale, nonché ad altre tecniche nucleasi-dipendenti, come SHERLOCK e DETECTR, a causa della mancanza di enzimi proteici deperibili e della procedura di rilevamento robusta e semplice40,41.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano Ekaterina V. Nikitina per aver gentilmente fornito il gDNA di EBV. Muhannad Ateiah, Maria Y. Berezovskaya e Maria S. Rubel ringraziano il Ministero dell'Istruzione e della Scienza della Federazione Russa (sovvenzione n. FSER-2022-0009) e il programma Priority 2030.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Provetta da 1,5 mLBiofilCFT011015
100 bp+ Scala DNAEvrogenNL002
100-1000 µ L pipettaKirgenKG-Pro1000
10-100 &; L pipettaKirgenKG-Pro100
1-10 & micro; L pipettaKirgenKG-Pro10
20-200 &; L pipettaKirgenKG-Pro200
2-20 &; L pipettaKirgenKG-Pro20
4x Gel Loading DyeEvrogenPB020
Acrilammide 4KAppliChemA1090,0500
Ammonio persolfatoCarl Roth2809447
BiorenderBiorenderhttps://www.biorender.com
BisacrilammideMolekula22797959
Acido boricoTechSnabH-0202
Sistema di imaging ChemiDocBioRad12003153
Costar Piastra in polistirene nero a 96 pozzettiCorningCOS3915
DinaMeltRNA Institutehttp://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTAAmrescoAm-O105
Bromuro di etidioBioLabMixEtBr-10
HEPESAmrescoAm-O485
Cloruro di magnesioAppliChem131396
Mini Protean Tetra CellBioRad1658001EDU
pipetta 10 &; Puntali a LKirgenKG1111-L
pipetta 1000 &; L puntaliKirgenKG1636
pipetta 200 &; micro; Punte a LKirgenKG1212-L
Pixelmator ProPixelmator Teamhttps://www.pixelmator.com/pro/
Cloruro di potassioCarl Roth1782751
PowerPac Alimentatore di baseBioRad1645050
Acqua priva di RNAsi/DNAsiInvitrogen10977049
Pellicola sigillante per piastre PCRSovtechP-502
Cloruro di sodioVektonHCh (0,1)
Lettore di micropiastre multimodale Spark TecanSpark- 10M
Amplificatore T100BioRad10014822
TEMEDMolekula68604730
Tris(idrossimetil)amminometanoAmrescoAm-O497
UNAFoldRNA Institutehttp://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
BagnomariaLOIPLB-140
Oligo usati
Analyte:Evrogenordine diretto, purificazione
standard di desalinizzazioneGAGCACTTGGTCAGGCACACGG
ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG
TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG
GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG
CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:Evrogenordine diretto, purificazione standard di desalinizzazione
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT
TTGCTGACTACTGTCACCTCT
CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG
TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC
CGCTGACCACAACGAGAGGAA
ACCTT		Evrogenordine diretto, purificazione standard di desalinizzazione
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT
GTCCGTGTGCCTGACCA		Evrogenordine diretto, purificazione
standard di desalinizzazioneF-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU
CCCTGGGCA-BHQ1		DNA-Syntezordine diretto, purificazione HPLC

References

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