Imaging al microscopio a forza atomica ad alta velocità del DNA con motivo a stella a tre punte Autoassemblaggio mediante maschiatura fototermica a bassa risonanza

Sommario

Qui, mostriamo il protocollo di imaging per l'osservazione delle interazioni biomolecolari con il rilevamento della risonanza fototermica (PORT), dove abbiamo ottimizzato i parametri di imaging, identificato i limiti del sistema e studiato potenziali miglioramenti nell'imaging dell'assemblaggio del motivo del DNA a tre punte.

Abstract

La microscopia a forza atomica ad alta velocità (HS-AFM) è una popolare tecnica di imaging molecolare per la visualizzazione di processi biologici a singola molecola in tempo reale grazie alla sua capacità di visualizzare in condizioni fisiologiche in ambienti liquidi. La modalità di maschiatura fototermica fuori risonanza (PORT) utilizza un laser di azionamento per far oscillare il cantilever in modo controllato. Questo azionamento diretto a sbalzo è efficace nella gamma dei MHz. In combinazione con l'utilizzo del ciclo di feedback sulla curva di forza nel dominio del tempo piuttosto che sull'ampiezza di risonanza, PORT consente l'imaging ad alta velocità fino a dieci fotogrammi al secondo con controllo diretto sulle forze punta-campione. È stato dimostrato che PORT consente l'imaging di delicate dinamiche di assemblaggio e il monitoraggio preciso dei modelli formati da biomolecole. Finora, la tecnica è stata utilizzata per una varietà di studi dinamici in vitro , inclusi i modelli di assemblaggio del motivo a stella a 3 punte del DNA mostrati in questo lavoro. Attraverso una serie di esperimenti, questo protocollo identifica sistematicamente le impostazioni ottimali dei parametri di imaging e i limiti ultimi del sistema di imaging HS-PORT AFM e il modo in cui influenzano i processi di assemblaggio biomolecolare. Inoltre, studia i potenziali effetti termici indesiderati indotti dal laser di azionamento sul campione e sul liquido circostante, in particolare quando la scansione è limitata a piccole aree. Questi risultati forniscono preziose informazioni che guideranno l'avanzamento dell'applicazione della modalità PORT nello studio di sistemi biologici complessi.

Introduzione

La microscopia a forza atomica ad alta velocità (HS-AFM) è una tecnica di imaging in rapida crescita 1,2,3,4. Funziona a velocità che consentono ai ricercatori di visualizzare le interazioni biomolecolari in tempo reale 5,6,7,8,9. La maschiatura fototermica fuori risonanza (PORT) è una modalità di imaging fuori risonanza simile alla maschiatura della forza di picco^10,11, alla modalità forza pulsata ^12,13 o alla modalità di salto¹⁴. Tuttavia, invece di far oscillare verticalmente lo scanner, PORT fa oscillare verticalmente solo il cantilever attraverso un laser di eccitazione focalizzato sul cantilever (di solito vicino al punto di serraggio). Il cantilever si deforma a causa dell'effetto bimorfo: un laser di eccitazione modulato in potenza riscalda periodicamente il cantilever rivestito, che si piega a causa dei diversi coefficienti di dilatazione termica del cantilever e dei materiali di rivestimento¹⁵. Il riscaldamento a sbalzo e del campione può essere ridotto al minimo utilizzando un laser di azionamento che viene periodicamente spento e riacceso durante ogni ciclo di oscillazione, piuttosto che utilizzare un azionamento sinusoidale completo⁵.

Il DNA è stato utilizzato per formare motivi biologicamente rilevanti, strutturalmente interessanti e biochimicamente utili per un certo numero di anni 16,17,18,19,20. Inoltre, le strutture del DNA si sono dimostrate ideali per caratterizzare la qualità dell'imaging AFM²¹ e per valutare l'effetto punta dell'AFM²² ad alta velocità. Le stelle a tre punti del DNA smussato (3PS) sono diventate pratiche come sistema modello programmabile per studiare l'organizzazione supramolecolare di molecole strutturate in modo simile in sistemi biologici altrimenti complessi¹⁹. In precedenza, l'autoassemblaggio di reticoli formati da monomeri di DNA trimerici con estremità smussata è stato monitorato tramite HS-AFM²³. Alla fine, questi si organizzano in grandi reti con ordine esagonale. Qui, l'autoassemblaggio del DNA delle stelle a 3 punti¹⁹ viene ripreso con la tecnica PORT a velocità di scansione sufficientemente elevate da tracciare l'autoassemblaggio e i suoi meccanismi di correzione²⁴, garantendo al contempo un'interruzione minima del processo o il danneggiamento del campione. Come per qualsiasi modalità HS-AFM, esiste un compromesso tra qualità dell'immagine ottenibile, velocità dell'immagine e disturbo indesiderato del campione. Scegliendo il giusto compromesso, si possono comprendere meglio i modelli di auto-organizzazione degli assemblaggi supramolecolari. Questo protocollo, quindi, utilizzerà una configurazione simile con DNA 3PS come sistema modello per ottimizzare i parametri specifici di PORT. Ciò consentirà il funzionamento a velocità di imaging elevate con dimensioni di scansione sufficientemente grandi, riducendo al minimo i danni al campione.

Protocollo

1. Campione e tamponi

NOTA: La piastrella di DNA utilizzata in questo studio è il motivo della stella a 3 punte sviluppato presso il laboratorio di Mao presso la Purdue University^19,25. Tutti gli oligonucleotidi utilizzati in questo studio sono stati acquistati da Integrated DNA Technologies, Inc. Raccogli i materiali e i reagenti necessari.

1. Mescolare i DNA a filamento singolo (ssDNA) con un rapporto molare 1:3:3 (S1, 0,6 μM, 1,8 μM per S2 e 1,8 μM per S3) nel tampone di ricottura (5 mM TRIS, 1 mM EDTA e 10 mM MgAc₂). La concentrazione finale del motivo del DNA deve essere di 0,6 μM (49 ng/μL con un peso molecolare di 3PS pari a 82020,3 g/mol).
2. Porre la soluzione di DNA in un contenitore resistente al calore e riscaldarla a 80 °C. Raffreddare lentamente la soluzione di DNA da 80 °C a 20 °C per un periodo di 4 ore. Questo processo di ricottura aiuta gli oligonucleotidi ssDNA a formare il motivo di DNA a doppio filamento desiderato.
3. Per la purificazione, caricare la soluzione di DNA ricotto su un gel di agarosio al 3% per rimuovere gli ssDNA in eccesso e qualsiasi prodotto collaterale indesiderato. Far funzionare il gel al 3% a 60 V per circa 2,5 ore in un tampone di corsa contenente 0,5x Tris-Borato-EDTA (TBE) e 10 mM di Mg(CH₃COO)₂.
4. Identifica e individua la fascia sul gel che contiene il motivo del DNA. Assicurati che il cinturino sia migrato in una posizione specifica in base alle sue dimensioni.
5. Asportare accuratamente la fascia contenente il motivo del DNA dal gel. Estrarre il motivo del DNA dal frammento di gel asportato ponendolo in una colonna di centrifugazione per l'estrazione del gel e centrifugando a 3.000 x g e 4 °C per 10 minuti.
6. Sostituire il tampone nel motivo di DNA estratto con il tampone di ricottura utilizzando un concentratore centrifugo. Centrifugare a 3000 x g a temperatura ambiente (o inferiore) fino a quando la soluzione concentrata è inferiore a 100 μL. Quindi, aggiungere 300 μl di tampone di ricottura e ripetere questo passaggio due volte per assicurarsi che il tampone venga sostituito.
7. Diluire il motivo del DNA a 6 nM per scopi di imaging. Utilizzare uno spettrofotometro o altri metodi appropriati per determinare e regolare con precisione la concentrazione. Il motivo del DNA è ora pronto per l'imaging.
   NOTA: Tutti i tamponi nel protocollo sono a pH 8,0. Le informazioni sulla sequenza per le tre rispettive bande sono le seguenti:
   S1: AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGT
   AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC
   S2: ACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACA
   CGGTAACG
   S3: CGTTACCGTGTGGTTGCATAGT

2. Crescita della punta a sbalzo

1. Montaggio a sbalzo sul supporto a sbalzo SEM: assicurarsi che i cantilever siano puliti e privi di contaminanti. Montare i cantilever su un apposito supporto compatibile con il sistema SEM. Il design del supporto a sbalzo su misura può essere condiviso su richiesta.
2. Iniezione di gas: Riscaldare il gas precursore (ad es. fenantrene C₁₄H₁₀ precursore per punte di carbonio amorfo) da utilizzare sul sistema di iniezione del gas per far crescere la nuova punta. Non appena il vuoto è inferiore a ^10-5 mbar, spurgare la linea di iniezione del gas 10 volte per 2 s per assicurarsi che non ci siano residui di aria indesiderati nella linea dell'ugello (che deve essere fatto con la valvola della camera della pistola chiusa).
3. Regolazione della posizione della punta: utilizzare la microscopia elettronica a scansione (SEM) per individuare l'estremità del cantilever. Inclinare il supporto a sbalzo a un angolo (ad esempio, 11° in questo caso) equivalente a quello che il cantilever presenterà quando posizionato sul supporto a sbalzo AFM rispetto alla superficie in modo che la punta cresciuta sia perpendicolare alla superficie durante l'imaging. Regola la posizione e la messa a fuoco del SEM per ottenere una visione chiara della punta del cantilever, dove verrà coltivata una nano-punta di carbonio affilata.
4. Deposizione indotta da fascio di elettroni focalizzato (FEBID):
   1. Impostare i parametri di deposizione sul software selezionato (in questo caso, SmartFIB), come la corrente del fascio (I) e la tensione di accelerazione (V), la distanza di lavoro (WD), l'ingrandimento, la forma esposta, il tempo di dose/deposizione e il tempo di permanenza. I seguenti parametri sono stati utilizzati per far crescere punte di carbonio amorfo, che presentano buone proprietà meccaniche per l'imaging AFM, portando a lunghezze intorno a 130 nm e raggi nell'intervallo di 2-4 nm:
      Seleziona punto/punto come forma esposta
      WD = 5 mm
      I = 78 pA e V = 5 kV
      Tempo di permanenza = 1 μs
      Dose = 0,05 nC e tempo di deposizione = 0,64 s
      Ingrandimento = 20000x
   2. Iniziare il processo di deposizione per far crescere la punta irradiando il fascio di elettroni in un punto sulla punta a sbalzo e contemporaneamente iniettare il gas precursore, chiudendo il gas quando la deposizione è terminata. In questo caso, il software SmartFIB esegue questa operazione automaticamente dopo aver impostato la ricetta sopra menzionata.
5. Analisi post-crescita: eseguire l'imaging SEM post-crescita per esaminare la punta appena cresciuta e garantirne la qualità e le caratteristiche (raggio e lunghezza della punta). Attendere 1-2 minuti dopo la crescita della punta per assicurarsi che tutto il gas precursore venga pompato fuori per evitare la ri-deposizione durante l'imaging SEM. Rimuovere il portacampioni dalla camera SEM.
6. Riciclaggio a sbalzo: nel caso in cui il sistema SEM abbia installato anche un fascio ionico focalizzato combinato (FIB), rimuovere una punta precedentemente cresciuta danneggiata o sporca fresandola con il sistema FIB utilizzando basse correnti FIB (ad esempio, 1 pA, per evitare danni al cantilever). Eseguire la rimozione della punta fresando in una forma di sezione trasversale, dall'estremità della punta alla base, per evitare il collasso della punta. Questo permetterà di ricrescerne uno nuovo.

3. Hardware HS-AFM

1. La configurazione dell'imaging è composta dalla testa PORT^{5, 26} (Figura 1A), dallo scanner ad alta velocità²⁶ con un disco campione con mica sulla parte superiore, dal controller^{compatibile 27}, dall'amplificatore ad alta tensione con l'elevata larghezza di banda richiesta per l'imaging ad alta velocità, dalla base AFM e dal PC con il software necessario per controllare l'apparecchiatura sopra menzionata²⁷.
   NOTA: In questo caso, si tratta di componenti open source per i quali è possibile ottenere i piani presso il Laboratorio per la biostrumentazione e la nanostrumentazione dell'EPFL^{27, 28}. È inoltre possibile partecipare a workshop su come costruire la testa PORT e il controller²⁹, nonché scaricare e utilizzare il software basato su LabView.
2. Posizionare con cautela un cantilever ultra-corto (ad es. AC10DS o equivalente) sotto la clip a molla sul supporto del cantilever utilizzando una pinzetta. Assicurarsi che il chip a sbalzo sia fisso e stabile.
3. Aggiungere 50 μl di liquido utilizzando una siringa attraverso la porta di accesso al fluido sinistra, come mostrato nella Figura 1B. Con il laser di eccitazione ancora spento, allineare il laser di lettura sul cantilever utilizzando le tre manopole dedicate sulla testa AFM mostrate nella Figura 1A. Fallo osservando l'ombra del cantilever su un foglio bianco massimizzando la somma (metodo dell'ombra). Quindi, centrare lo spot laser sul fotodiodo utilizzando le due manopole dedicate.
4. Accendere e allineare il laser di azionamento selezionando la casella Excitation Enable in Excitation VI, in modo che attivi e faccia oscillare il cantilever. Mostra il segnale di eccitazione a sbalzo e il segnale di deflessione a sbalzo su un oscilloscopio collegato. Se l'oscillazione di deflessione è troppo bassa (o inesistente), è possibile che il laser di azionamento sia molto lontano dal cantilever. In tal caso, utilizzare il metodo dell'ombra e spegnere il laser di deflessione per facilitare l'allineamento. Massimizzare l'ampiezza dell'oscillazione utilizzando le manopole di regolazione del laser di azionamento mostrate nella Figura 1A.
5. Per regolare l'ampiezza dell'oscillazione a sbalzo in PORT, inserire nel controllo corrispondente del software la tensione picco-picco inviata al circuito di controllo del diodo laser (d'ora in poi, ingresso CA picco-picco) in Eccitazione VI. Per mantenere il diodo laser in regime di conduzione e, quindi, laser, aggiungere una tensione CC al circuito di controllo del diodo laser (d'ora in poi, ingresso offset CC), che viene eseguito anche da una casella di configurazione in Excitation VI. Entrambi influenzeranno anche la potenza del laser, che può essere misurata con un misuratore di potenza laser e viene utilizzata per regolare l'ampiezza dell'oscillazione a sbalzo.
6. Determinare la frequenza massima di eccitazione fototermica che può essere applicata al cantilever, che deve essere inferiore alla frequenza di risonanza del cantilever. Determinare la frequenza di risonanza mediante una sintonizzazione termica o uno sweep di frequenza. I cantilever utilizzati in questo studio (AC10DS), la cui frequenza di risonanza nei liquidi è di circa 400 kHz (1 MHz in aria)³⁰, hanno una regione di flessione quasistatica inferiore a 300 kHz⁵. Pertanto, devono essere utilizzate frequenze PORT inferiori a tale limite (circa 100-200 kHz).
7. Regolare i parametri di imaging e le impostazioni per la velocità PORT e la velocità di scansione sui valori richiesti rispettivamente in Eccitazione e Scansione Vista (i parametri utilizzati in questo articolo sono indicati nelle descrizioni delle figure). Una volta configurati i parametri di configurazione e di imaging, eseguire gli esperimenti di imaging necessari per osservare e tracciare le interazioni molecolari.
   NOTA: Poiché i cantilever AC10DS non sono più in vendita, potrebbe essere necessario utilizzare un'alternativa come Fastscan D o BioLever³¹ fino a quando non sarà disponibile un equivalente.

4. Ottenere curve di interazione corrette

1. Inizialmente, avvicinarsi alla superficie del campione in modalità di contatto facendo clic su Start sullo Z-controller VI impostato su Contact Mode.
   1. In questa modalità, la punta dell'AFM entra in contatto diretto con il campione. Una volta raggiunta la superficie, eseguire una curva forza in funzione della distanza nella rampa VI per ottenere la calibrazione della sensibilità alla deflessione a sbalzo.
   2. Inoltre, stimare la costante della molla a sbalzo, sia dalle specifiche del fornitore di cantilever (meno accuratamente), ottenute con un interferometro, sia attraverso una calibrazione basata sulla sintonizzazione termica dopo la calibrazione della sensibilità alla deflessione. Una taratura precisa del cantilever è essenziale per un accurato controllo della forza del puntale.
2. Dopo aver ritirato completamente lo Z-piezo dalla superficie in cui la punta non può raggiungere la superficie facendo clic su Su nel controller Z VI, passare alla modalità PORT nel controller Z VI e attivare il laser di eccitazione nella casella di controllo Excitation VI. Per iniziare, impostare la modalità PORT in modo che funzioni alla frequenza desiderata in Excitation VI, che, in questo caso sperimentale, è di 100 kHz, utilizzando un cantilever AC10DS.
3. Registrare l'oscillazione senza sbalzo da vicino ma senza toccare la superficie. Quindi, accendere il feedback nel controller Z a contatto con la superficie da registrare e fare clic su Correggi per ottenere l'oscillazione del cantilever quando il cantilever è a contatto intermittente con la superficie, entrambi in nanometri. Sottrarre la curva di oscillazione libera dalla curva di contatto intermittente per ottenere la vera curva di interazione, convertendola in pN utilizzando la costante della molla a sbalzo (in questo caso, 0,1 N/m).

5. Imaging HS-AFM

1. Preparare una soluzione di Mg(CH₃COO)₂ alla concentrazione di 10 mM. Utilizzando una siringa Hamilton, iniettare 50 μl della soluzione preparata di 10 mM Mg(CH₃COO)₂ nel canale fluidico del supporto a sbalzo, creando una goccia di liquido che ingloba il cantilever.
2. Avvicina gradualmente il cantilever alla superficie facendo clic su Start sullo Z Controller VI. Una volta rilevata la superficie, attivare il feedback e trovare il picco della curva di interazione nelle curve di forza ORT VI. Trova il setpoint di forza più basso che consenta un corretto tracciamento (inferiore a 300 pN per evitare il danneggiamento di fragili campioni biologici).
3. Impostare la dimensione della scansione VI su 800 nm per 800 nm e la velocità della linea su 100 Hz. Eseguire la scansione della superficie facendo clic sulla freccia Frame (giù) in Scan VI per verificare la qualità della superficie. Se vengono rilevate contaminazioni, risolvere il problema pulendo la superficie, il cantilever e/o il supporto del cantilever prima di procedere.
4. Dopo la scansione, ritrarre il cantilever dalla superficie facendo clic su Ritira nel controller Z VI. Rimuovere la soluzione tampone dal foro nel supporto a sbalzo con una siringa Hamilton per evitare problemi di volume morto.
5. Preparare una soluzione diluita di DNA 3PS dalla parte 1 del protocollo. Iniettare 50 μl della soluzione diluita di DNA 3PS nel canale dedicato del supporto a sbalzo.
6. Avviare il processo di imaging ripetendo i passaggi 5.2-5.3, scansionando un'area di 800 nm per 800 nm a una velocità di linea predefinita di 100 Hz (256 linee × 256 pixel). Dopo la scansione iniziale, regolare le dimensioni e la velocità dell'immagine in Scan VI sui valori specificati per un'ulteriore acquisizione dei dati.
7. Mantenere il setpoint della forza di ingresso dell'interazione punta-campione nella casella Setpoint del controller Z VI al livello più basso richiesto per un corretto tracciamento (inferiore a 300 pN) durante il processo di imaging per ridurre al minimo il danno/disturbo del campione, se non diversamente specificato. Ripetere questo processo per tutte le aree di campionamento richieste.

6. Elaborazione delle immagini

1. Configura l'ambiente per l'esecuzione del codice di elaborazione batch Pygwy (Python for Gwyddion) personalizzato, assicurandoti che Python e tutte le librerie necessarie. Ulteriori informazioni possono essere trovate sul sito Web di Gwyddion³² sono installati correttamente sul sistema. Ciò garantisce che il codice funzioni senza problemi e possa accedere alle funzionalità richieste.
2. Apri il codice di elaborazione batch Pygwy personalizzato (fornito su richiesta). Ciò fornirà l'accesso agli strumenti e alle funzionalità necessarie per l'elaborazione e l'analisi delle immagini.
3. Iniziare l'elaborazione delle immagini eseguendo la correzione della linea mediana orizzontale sulle immagini. Questa fase ha lo scopo di rimuovere eventuali irregolarità o artefatti presenti nelle linee di scansione, garantendo che le successive fasi di elaborazione si basino su dati accurati. Dopo la rimozione dello sfondo del piano, applicare la correzione della linea. Usa la rimozione delle cicatrici per migliorare ulteriormente le immagini eliminando eventuali segni o imperfezioni indesiderate causati da fattori esterni. Questo passaggio migliora l'aspetto visivo generale delle immagini.
4. Migliora la visibilità e il contrasto delle immagini regolando la mappa dell'altezza dei colori. In questo modo si garantisce che le caratteristiche di interesse siano chiaramente visualizzate e risaltino nelle immagini.
5. Seleziona le immagini elaborate che devono essere combinate in un video. Determina la frequenza fotogrammi desiderata per il video. In questo caso, impostalo su 7 fotogrammi al secondo (fps).
6. Calcola la durata di ogni fotogramma. Usa Fiji (ImageJ) per combinare le immagini elaborate in un video. Assicurati che la frequenza dei fotogrammi e la durata dei fotogrammi siano impostate correttamente.

Risultati

In questa indagine, il processo di assemblaggio dinamico dei motivi delle stelle a 3 punte del DNA in isole stabili è stato osservato con successo utilizzando le capacità dell'HS-PORT AFM. Questa tecnica ci ha permesso di catturare l'assemblaggio di queste strutture in tempo reale. Nella Figura 2A, B, otteniamo una scansione chiara dell'immagine a velocità di linea di 100 Hz e 200 Hz, rispettivamente, per una velocità PORT di 100 kHz (800 nm per 800 nm di dimensione di scansione). Ciò corrisponde rispettivamente a 3,9 e 1,95 cicli di oscillazione per pixel. Tuttavia, l'imaging a velocità più elevate senza aumenti concomitanti della velocità PORT che consentirebbe un minimo di un ciclo di oscillazione per pixel ridurrà drasticamente la qualità dell'immagine, come si può vedere nella Figura 2C (0,78 di un ciclo di oscillazione per pixel). La velocità di imaging è limitata dalla velocità con cui il cantilever sonda la superficie con un appropriato controllo della forza del campione di punta, poiché la velocità di variazione topografica diventa troppo veloce per essere tracciata alla frequenza di campionamento della superficie.

Oltre a impostare una velocità di PORT sufficientemente elevata, è importante che le curve di PORT contengano le informazioni necessarie per controllare le forze. In particolare, la resistenza idrodinamica e la bassa larghezza di banda di rilevamento possono oscurare la forza applicata. La Figura 3 mostra la deflessione a sbalzo a diverse distanze dalla superficie del campione e i tassi di frequenza di eccitazione utilizzando una media di 4096 curve per ridurre il rumore. Le curve blu nella Figura 3A (per la velocità PORT di 100 kHz) e nella Figura 3D (per la velocità PORT di 500 Hz) rappresentano il movimento a sbalzo quando il cantilever è lontano dalla superficie e oscilla liberamente (non toccando la superficie durante un ciclo di oscillazione). Le curve rosse mostrano la deflessione del cantilever quando il cantilever oscilla vicino alla superficie e entra in contatto in modo intermittente con la superficie, sondando il campione. Per ottenere la vera curva di interazione e, quindi, l'interazione punta-campione, sottraiamo la curva blu dalla curva rossa per ottenere rispettivamente la Figura 3B,E. Un esempio di una chiara curva di interazione richiesta per l'imaging non distruttivo di campioni biologici è illustrato nella Figura 3B. Questa configurazione porta alla buona qualità dell'immagine mostrata nella Figura 3C, dove la velocità PORT è di 100 kHz. Man mano che aumentiamo la frequenza di eccitazione vicino alla risonanza a sbalzo, a un certo punto il controllo del feedback si deteriora, anche quando il cantilever mostra un'oscillazione di ampiezza sufficiente per staccarsi dalla superficie dopo aver aumentato la potenza del laser di eccitazione (Figura 3E). Se la frequenza PORT è troppo vicina alla frequenza di risonanza del cantilever, la risonanza del cantilever limita la risposta temporale della dinamica del cantilever. La flessione a sbalzo, quindi, non rappresenta più accuratamente l'interazione punta-campione e la curva di interazione che otteniamo è oscurata. Ciò porta a un degrado della qualità dell'immagine, come mostrato nella Figura 3F.

Una curva di interazione compromessa a frequenze PORT più elevate potrebbe verificarsi anche a causa della ridotta efficienza di attuazione a frequenze più alte³³, che è attualmente uno dei fattori limitanti dei cantilever AFM commerciali ad alta velocità. Questa diminuzione raggiunge infine un livello di soglia nel roll-off, al quale l'imaging corretto è ostacolato: l'ampiezza dell'oscillazione potrebbe essere insufficiente per staccarsi dalla superficie e la punta è sempre a contatto, danneggiando le strutture del campione. Per contrastare la diminuzione dell'ampiezza causata da velocità PORT più elevate, abbiamo esplorato un aumento della potenza del laser. Abbiamo utilizzato una testa PORT in grado di raggiungere potenze laser più elevate per osservare meglio questo effetto. La potenza del laser di eccitazione, che abbiamo misurato con un misuratore di potenza, è stata suddivisa in componenti CC e CA. La potenza totale viene controllata regolando sul software la tensione picco-picco (ingresso CA picco-picco) e la tensione CC (ingresso offset CC) inviate al circuito di controllo del diodo laser. La Figura 4A mostra l'ampiezza dell'oscillazione a sbalzo picco-picco risultante da un aumento dell'ingresso c.a. picco-picco. Come previsto, l'ampiezza dell'oscillazione è ben correlata con il valore di ingresso CA. È importante notare che queste ampiezze picco-picco sono superiori a quelle normalmente utilizzate nell'imaging PORT. Quando si esegue l'imaging di campioni fragili, l'ampiezza CA è dell'ordine di 10-30 nm. La Figura 4B mostra l'ampiezza dell'oscillazione a sbalzo picco-picco per aumentare gli ingressi di offset CC. L'ampiezza dell'oscillazione picco-picco rimane abbastanza costante nell'intervallo di tensione di offset CC. Attribuiamo le piccole variazioni a non linearità nel rilevamento. La Figura 4C mostra l'aumento dei componenti di potenza laser CA e CC risultante dall'aumento della CA picco-picco. La Figura 4D mostra l'aumento dei componenti di potenza laser CA e CC risultante dall'aumento dell'offset dell'ingresso CC.

Gli effetti dell'aumento dell'ingresso CA picco-picco e dell'ingresso di offset CC sono stati testati separatamente per determinare i rispettivi effetti sulla potenza totale e sull'ampiezza dell'oscillazione. Un aumento della potenza del laser provoca l'interruzione del campione, probabilmente a causa dell'aumento della temperatura, mentre un aumento dell'ampiezza dell'oscillazione aumenterà la forza d'impatto sul campione⁵. L'aumento esclusivo dell'ingresso CA picco-picco avrà un impatto minore sull'aumento totale della potenza del laser, come mostrato nella Figura 4C, e aumenterà prevalentemente l'ampiezza dell'oscillazione a sbalzo (e di conseguenza la forza d'impatto), come mostrato nella Figura 4A. L'aumento dell'ingresso di offset CC avrà un effetto maggiore sull'aumento della potenza del laser, come mostrato nella Figura 4D, che riscalda il campione ma avrà un effetto trascurabile sull'ampiezza della deflessione, come mostrato nella Figura 4B. I risultati dell'imaging sono rappresentati nella Figura 4E, F. La Figura 4E illustra il DNA 3PS per l'ingresso CA da picco a picco più basso (immagine a sinistra, cerchiato in blu) e l'ingresso CA picco-picco più alto (immagine a destra, cerchiato in rosso), che si traduce in danni al campione presumibilmente a causa delle forze più elevate. La Figura 4F mostra il DNA 3PS per l'input di offset CC più basso (immagine a sinistra, cerchiato in blu) e l'input di offset CC più alto (immagine a destra, cerchiato in rosso), dove le strutture sono danneggiate.

Figura 1: La configurazione HS-AFM. (A) La testa PORT sullo scanner e la base dell'AFM, che mostra la (i) manopola per la regolazione della messa a fuoco del laser di lettura sul cantilever, (ii) manopola per la regolazione della posizione del laser di lettura sul cantilever, (iii) manopola per la regolazione della posizione orizzontale del laser sul fotodiodo, (iv) manopola per la regolazione della posizione verticale del laser sul fotodiodo, e (v) manopole per la regolazione della posizione del laser di azionamento fototermico sul cantilever. (B) Un primo piano del cantilever nella vista della sezione trasversale della testa con lo stadio del campione, dove (vi) è la clip a molla che tiene il cantilever. Il canale per l'iniezione del liquido è contrassegnato in rosso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Campione di DNA 3PS ripreso con AC10 a 100 kHz di velocità PORT a diverse velocità di linea. (A) 100 Hz (3,9 cicli di oscillazione per pixel), (B) 200 Hz (1,95 cicli di oscillazione per pixel) e (C) 500 Hz (0,78 cicli di oscillazione per pixel). Le immagini sono state scattate a setpoint di 350 pN o meno. Barra di scala 200 nm. Dopo l'imaging è stata presa una curva di forza per ottenere la sensibilità alla deflessione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Deflessione a sbalzo, curva di interazione e qualità dell'immagine a velocità PORT di 100 KHz e 500 kHz. (A) Deflessione a sbalzo (oscillazione libera a sbalzo vicina ma non a contatto con la superficie in blu, e oscillazione dello sbalzo quando lo sbalzo è a contatto intermittente con la superficie in rosso), (B) curva di interazione e (C) rispettiva qualità dell'immagine per una velocità PORT di 100 kHz. (D) Deflessione del cantilever (oscillazione libera del cantilever vicina ma non a contatto con la superficie in blu, e oscillazione del cantilever quando il cantilever è in contatto intermittente con la superficie in rosso), (E) curva di interazione e (F) rispettiva qualità dell'immagine per una velocità PORT di 500 kHz. Le immagini sono state scattate a una velocità di linea di 100 Hz. Barra di scala 200 nm. Dopo l'imaging è stata presa una curva di forza per ottenere la sensibilità alla deflessione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Effetto della tensione di ingresso CA picco-picco Tensione di ingresso offset CC. Effetto dell'aumento della tensione di ingresso CA picco-picco (A) e della tensione di ingresso offset CC (B) sull'oscillazione picco-picco del cantilever. Effetto dell'aumento della tensione di ingresso CA picco-picco (C) e della tensione di ingresso offset CC (D) sulla potenza laser CA e CC. Qualità dell'immagine alla tensione di ingresso c.a. picco-picco (E) minima (cerchiata in blu) e massima (cerchiata in rosso) (E) e tensione di ingresso offset c.c. (F). Quando si aumenta la tensione di ingresso CA picco-picco, la tensione di ingresso di offset CC è stata mantenuta a 600 mV. Quando si aumenta la tensione di ingresso di offset CC, la tensione di ingresso CA picco-picco è stata mantenuta a 200 mV. L'integrità del campione è compromessa per la configurazione ad alta potenza. La velocità PORT è stata mantenuta a 100 kHz e la velocità di linea a 100 Hz. Barra di scala 200 nm. Dopo l'imaging è stata presa una curva di forza per ottenere la sensibilità alla deflessione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Quando si esegue l'imaging di campioni biologici delicati, le modalità di imaging di maschiatura fuori risonanza in AFM sono particolarmente utili poiché possono controllare direttamente le forze di interazione punta-campione¹⁰. Tra queste, la modalità PORT si distingue per le velocità di oscillazione più elevate che può raggiungere, che consente velocità di scansione più elevate. Poiché PORT aziona direttamente e solo il cantilever con un laser, consente l'eccitazione a frequenze molto più elevate rispetto alle modalità di tapping off-resonance convenzionali, in particolare quando si utilizzano cantilever ultracorti con alte frequenze di risonanza⁵. Tuttavia, quando si utilizza PORT per HS-AFM, è necessario prestare attenzione ai parametri di imaging per ottenere una buona qualità dell'immagine.

Come illustrato nella Figura 2, l'aumento delle velocità di scansione senza aumentare contemporaneamente le velocità di PORT porterà a un imaging di cattiva qualità. Innanzitutto, le velocità di PORT, che si traducono in meno di un ciclo di oscillazione per pixel, ridurranno drasticamente la qualità dell'immagine. La velocità di imaging è intrinsecamente limitata dalla velocità con cui il cantilever sonda la superficie con un appropriato controllo della forza punta-campione. In PORT, il controllo di retroazione agisce discretamente alla fine di ogni ciclo di oscillazione³⁴. Questa frequenza di campionamento limitata induce un ritardo puro nel ciclo di retroazione, limitando così la larghezza di banda di retroazione ottenibile. Se la velocità di variazione della topografia diventa troppo veloce per essere tracciata alla frequenza di campionamento PORT, la topografia non può più essere rilevata o tracciata con precisione dal ciclo di feedback. La velocità PORT, quindi, deve essere aumentata per risolvere fedelmente il campione a velocità superficiali più elevate. Tuttavia, la frequenza di risonanza del cantilever limita intrinsecamente la velocità massima di PORT che possiamo utilizzare. Se la velocità PORT è vicina alla frequenza di risonanza del cantilever, la deflessione misurata con il metodo della leva ottica non rappresenta più fedelmente le forze punta-campione. Per ottenere una corretta curva di interazione punta-campione, sia la larghezza di banda meccanica del cantilever che la larghezza di banda elettrica del sistema AFM devono essere sufficientemente grandi da rilevare componenti di Fourier della curva di deflessione che sono diverse volte quella della frequenza PORT. Se una di queste larghezze di banda è troppo bassa, la curva di interazione non mostra più il taglio unilaterale (Figura 3A), ma piuttosto un comportamento sinusoidale (Figura 3D) che oscura l'effettiva interazione del campione di punta (Figura 3E). Ciò porta a uno scarso controllo della forza nell'imaging (Figura 3F). Per aumentare ulteriormente la velocità di PORT, sono quindi necessari anche cantilever più piccoli che mostrano un'elevata frequenza di risonanza, che possiedono allo stesso tempo basse costanti elastiche. Tali velocità di PORT e velocità di scansione rappresentano una sfida per l'elettronica AFM, richiedendo un software accurato e una progettazione elettronica che presenti le elevate larghezze di banda richieste e strategie di elaborazione del segnale digitale ottimizzate.

Uno dei vantaggi di PORT rispetto alla modalità di maschiatura AFM ad alta velocità è che la velocità di campionamento della superficie può essere regolata. In modalità di maschiatura AFM, la frequenza di campionamento della superficie è data dalla frequenza di risonanza del cantilever. Quando si opera in PORT ben al di sotto della frequenza di risonanza a sbalzo, si presume che ogni campionamento di superficie fornisca un punto dati valido. Pertanto, la larghezza di banda di rilevamento PORT è data dalla frequenza di Nyquist a metà della velocità PORT. Nel caso della modalità di maschiatura, la larghezza di banda di rilevamento è data da f₀/2Q³⁵. Con gli ultimi sviluppi in PORT, possiamo aumentare gradualmente la velocità PORT fino alla frequenza di risonanza. In questa situazione, PORT e la modalità di tapping diventano quasi identiche perché, a quelle frequenze, PORT non è in grado di rilevare con precisione l'interazione tra cantilever e punta del campione, come mostrato nella Figura 3E. Quando si opera alla frequenza di risonanza, la maggiore ampiezza di oscillazione di PORT rispetto alla modalità di tapping diventa uno svantaggio. L'obiettivo per aumentare la frequenza di imaging PORT, quindi, rimane quello di aumentare la frequenza di risonanza a sbalzo per mantenere il funzionamento con la frequenza PORT sufficientemente al di sotto della frequenza di risonanza.

Man mano che aumentiamo la velocità PORT per consentire velocità di scansione più elevate, ci troveremo di fronte a un altro problema inerente all'eccitazione fototermica a sbalzo: a frequenze più elevate, l'ampiezza dell'oscillazione si riduce a causa di una diminuzione dell'efficienza di eccitazione fototermica, fino al punto in cui è necessario aumentare la potenza del laser, con conseguente aumento della temperatura del campione. L'aumento della velocità PORT ostacolerà il bilanciamento della potenza del laser e dell'ampiezza dell'oscillazione, poiché è necessaria una potenza di eccitazione più elevata per compensare una ridotta efficienza di attuazione che porta al danneggiamento del campione. A livelli più elevati di potenza laser, non potevamo più osservare il campione, nonostante utilizzassimo il set point di forza più basso possibile (pannelli a destra nelle Figure 4E, F). Dobbiamo stare attenti a come aumenteremo l'ampiezza dell'oscillazione a sbalzo e aumenteremo la potenza del laser. Ci sono due parametri che possiamo regolare per aumentare la potenza del laser. Innanzitutto, l'ingresso CA picco-picco che controlla il segnale sinusoidale inviato al diodo laser per variare sinusoidalmente l'intensità della potenza laser erogata. In secondo luogo, la tensione di ingresso di offset CC che mantiene il diodo laser sul regime di conduzione e, quindi, sul laser. Un aumento del primo deve essere combinato con un aumento del secondo poiché un aumento dell'ampiezza del segnale CA inviato al laser richiede un aumento della tensione CC per evitare di superare la soglia del laser. Tuttavia, solo l'ingresso c.a. picco-picco influenza l'ampiezza dell'oscillazione a sbalzo, come mostrato nella Figura 4A. Le tensioni CC non portano a variazioni delle ampiezze di oscillazione (Figura 4B). Pertanto, se vogliamo l'attuazione sinusoidale, dobbiamo impostare la tensione CC alla tensione minima che consente al laser a diodi di essere in regime laser. In alternativa, possiamo ridurre al minimo il riscaldamento spegnendo e riaccendendo periodicamente il diodo laser durante ogni ciclo di oscillazione piuttosto che utilizzare un azionamento sinusoidale completo⁵. L'oscillazione di temperatura necessaria per azionare il cantilever nell'eccitazione fototermica può essere raggiunta in modo più efficiente spegnendo il laser durante una parte del ciclo, il che abbassa la temperatura del cantilever e, quindi, porta alla flessione del cantilever. Ciò ridurrà al minimo l'energia erogata al cantilever e al campione e quindi diminuirà la temperatura totale nell'ambiente circostante, mitigando i danni da calore del campione.

In questo studio, mostriamo i limiti dei parametri di imaging in HS-PORT che prevengono il danneggiamento del campione di calore e un corretto controllo del feedback. La comprensione di questi limiti aiuterà a sfruttare al meglio lo stato attuale del metodo PORT AFM, consentendo un migliore controllo sull'interazione punta-campione e contribuendo a preservare lo stato nativo dei motivi del DNA in queste misurazioni. Grazie alle elevate velocità di scansione raggiunte combinate con un buon controllo del feedback, PORT ci ha permesso di ottenere immagini chiare e dettagliate del DNA 3PS e delle loro interazioni ^7,8,36. Con la possibilità di aumentare la velocità di imaging e il controllo diretto della forza punta-campione²³, siamo in grado di tracciare la crescita e la riorganizzazione degli assemblaggi biomolecolari in modo più preciso e osservare dinamiche dettagliate.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
AC10DS	Olympus	BL-AC10FS-A2	fuori produzione
Biometra Compact XS/S	Biometra GmbH	846-025-199	Unità di elettroforesi
Biometra TRIO	Biometra GmbH	207072X	termociclatore per ricottura
Configurazione AFM personalizzata	Laboratorio per la strumentazione Bio-Nano, Istituto Interfacoltà di Bioingegneria, Scuola di Ingegneria, Ecole Polytechnique Fé dé rale Losanna		Ottenibile tramite laboratorio per Bio-Nano Strumentazione
EDTA	ITW Reagenti	A5097	In tampone di ricottura
Misuratore di potenza laser	Thorlabs	PM100D	Digitale Palmare Ottico  Console del contatore di potenza ed energia
Lively 3AP Alimentatore, MP-310	Major Science	MP-310	Alimentatore per elettroforesi
MgAc2	ABCR GmbH	AB544692	In tampone di ricottura
TBE	Thermo Scientific	327330010	Tampone di funzionamento per elettroforesi
TRIS	Bio-Rad	1610719	In tampone di ricottura