Caratterizzazione di sistemi di efflusso multifarmaco in Acinetobacter baumannii utilizzando un ceppo batterico carente di efflusso e un sistema di espressione genica a singola copia

Summary

Descriviamo una procedura semplice per la complementazione cromosomica a singola copia di un gene della pompa di efflusso utilizzando un sistema di espressione basato su mini-Tn7 in un ceppo ingegnerizzato di Acinetobacter baumannii con deficit di eflusso. Questo preciso strumento genetico consente un'espressione genica controllata, che è fondamentale per la caratterizzazione delle pompe di efflusso in patogeni multiresistenti ai farmaci.

Abstract

L'Acinetobacter baumannii è riconosciuto come un patogeno Gram-negativo impegnativo a causa della sua diffusa resistenza agli antibiotici. È fondamentale comprendere i meccanismi alla base di questa resistenza per progettare nuove ed efficaci opzioni terapeutiche. Sfortunatamente, la nostra capacità di studiare questi meccanismi in A. baumannii è ostacolata dalla scarsità di strumenti di manipolazione genetica adeguati. Qui, descriviamo i metodi per utilizzare un sistema cromosomico basato su mini-Tn7 per ottenere l'espressione genica a singola copia in un ceppo di A. baumannii che manca di meccanismi funzionali di efflusso di tipo RND. L'inserzione di una singola copia e l'espressione della pompa di efflusso inducibile sono piuttosto vantaggiose, poiché la presenza di operoni di efflusso RND su plasmidi ad alto numero di copie è spesso mal tollerata dalle cellule batteriche. Inoltre, l'incorporazione di vettori di espressione ricombinanti di mini-Tn7 nel cromosoma di un ospite surrogato di A. baumannii con una maggiore sensibilità all'efflusso aiuta ad aggirare l'interferenza di altre pompe di eflusso. Questo sistema è prezioso non solo per studiare le pompe di efflusso batterico non caratterizzate, ma anche per valutare l'efficacia di potenziali inibitori che prendono di mira queste pompe.

Introduction

L'Acinetobacter baumannii è un patogeno prioritario dell'Organizzazione Mondiale della Sanità a causa della sua resistenza a tutte le classi di antibiotici¹. È un agente patogeno opportunista che colpisce principalmente persone ospedalizzate, ferite o immunocompromesse. A. baumannii elude in gran parte gli antibiotici attraverso le pompe di efflusso, la più rilevante delle quali è la famiglia di esportatori Resistance-Nodulation-Division (RND)². Capire come funzionano meccanicamente queste pompe di efflusso consentirà di sviluppare opzioni terapeutiche mirate.

Un modo comune in cui i processi cellulari possono essere distinti in modo specifico è attraverso la manipolazione genetica. Tuttavia, gli strumenti disponibili per gli studi genetici di A. baumannii sono limitati e, per confondere ulteriormente il disegno sperimentale, gli isolati clinici sono spesso resistenti agli antibiotici utilizzati di routine per la selezione nelle manipolazioni genetiche³. Un secondo ostacolo che si incontra quando si studiano le pompe di efflusso in modo specifico è che sono strettamente regolate, spesso da fattori sconosciuti, rendendo difficile isolare e attribuire con precisione la funzione a una singola pompa⁴. Vedendo questa necessità di espandere la gamma di strumenti di ricerca, abbiamo sviluppato un sistema di espressione inducibile basato su mini-Tn7, a singola copia, che incorpora una cassetta di bersagli ricombinasi Flp (FRT), che consente la rimozione del marcatore di selezione ^5,6,7 (Figura 1). Creato per la prima volta per Pseudomonas ^8,9,10, questo elegante sistema di clonazione ed espressione è stato utilizzato per generare complementi di pompa di efflusso a copia singola in un ceppo di A. baumannii carente di pompa di efflusso RND (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: di seguito denominato A. baumannii AB258) che abbiamo generato¹¹. Essendo in grado di studiare una pompa di efflusso alla volta e non sovraccaricare le cellule batteriche con un'elevata espressione di copie (come generalmente si vede con i sistemi di espressione basati su plasmidi), si possono conoscere meglio gli aspetti critici e fisiologici di ciascuna pompa di efflusso con interferenze minime e complicanze ridotte.

Questo articolo descrive come utilizzare il sistema mini-Tn7 per integrare un gene di interesse eliminato, la pompa di efflusso RND adeIJK, nel cromosoma di A. baumannii AB258 attraverso una serie di passaggi semplici eseguiti nel corso di 9 giorni⁷. La prima serie di passaggi reintroduce i geni della pompa di efflusso eliminati clonati nel plasmide di inserzione basato su mini-Tn7 (Figura 2A) nel singolo sito di inserzione attTn7 a valle del gene glmS ben conservato (Figura 3A). Questo processo è facilitato da un plasmide helper non replicativo (Figura 2B) che codifica per i geni della trassposasi necessari per l'inserimento guidato da Tn7. La seconda serie di passaggi utilizza un plasmide di escissione (Figura 2C) per la rimozione mediata dalla ricombinasi Flp del gene della gentamicina affiancato da siti FRT (Figura 3B) per creare un ceppo non marcato. Sebbene questo sistema sia utilizzato per chiarire i ruoli essenziali e i possibili inibitori delle pompe di efflusso RND rispetto alla resistenza agli antibiotici, può essere utilizzato per studiare qualsiasi gene di interesse.

Protocol

1. Preparazione sperimentale

1. Purificare il plasmide pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (plasmide di inserzione, Figura 2A) con il gene di interesse.
   NOTA: In questo caso, il gene di interesse è adeIJK. La concentrazione finale del plasmide deve essere ≥100 ng/μL.
2. Purificare il plasmide helper (pTNS2)⁹ e il plasmide di escissione (pFLP2^ab)⁶ (Figura 2B,C, rispettivamente), idealmente fino a una concentrazione finale di DNA plasmidico di ≥100 ng/μL.
3. Preparare 50 ml di acqua ultrapura sterile e 25 ml di brodo sterile LB (Lennox) (vedere la tabella dei materiali).
4. Preparare un minimo di 10 LB di piastre di agar, ciascuna con i seguenti additivi: semplice (senza additivi), gentamicina (Gm) a 50 μg/mL, carbenicillina (Cb) a 200 μg/mL (per la selezione tramite il gene di resistenza all'ampicillina) e saccarosio al 5% (vedere Tabella dei materiali).
5. Striare il ceppo da utilizzare per l'inserimento su agar LB e incubare a 37 °C per 16-18 h. Qui viene utilizzato A. baumannii AB258.
   NOTA: Questo protocollo deve essere eseguito il più possibile in un ambiente sterile utilizzando un bruciatore Bunsen al banco o una cabina di sicurezza biologica. Tutti i materiali di consumo (puntali per pipette, anse di inoculazione, provette per microfuge, ecc.) devono essere sterili.

2. Preparazione della coltura

1. Inoculare una singola colonia di A. baumannii AB258 in 4 ml di brodo LB in una provetta sterile da 13 ml utilizzando un'ansa di inoculazione sterile o un bastoncino di inoculazione sterile in legno.
   NOTA: Una singola coltura da 4 mL viene utilizzata per un campione e un controllo. Aumentare il numero di colture in base al numero di campioni necessari.
2. Incubare per una notte a 37 °C con agitazione (250 giri/min).
3. Posizionare una bottiglia di acqua distillata sterile (25-50 ml) a 4 °C durante la notte per l'uso nella fase 3.

3. Preparazione delle celle elettrocompetenti

1. Posizionare tutte le provette sterili da 1,5 mL di microfuge (due per coltura) e le cuvette sterili per elettroporazione (due per coltura) sul ghiaccio (vedere la tabella dei materiali). Tenere i campioni sul ghiaccio il più possibile durante la procedura.
2. Mettere la bottiglia di acqua sterile conservata a 4 °C su ghiaccio.
3. Trasferire 1,5 mL di coltura batterica durante la notte in una delle provette da 1,5 mL.
4. Centrifugare a 13.000 x g per 2 minuti per pellettare le cellule.
   NOTA: La centrifugazione dovrebbe essere eseguita idealmente a 4 °C, ma la centrifugazione a temperatura ambiente è accettabile e non dannosa.
5. Utilizzando una pipetta da 1 mL, rimuovere tutto il surnatante senza disturbare il pellet cellulare.
6. Aggiungere altri 1,5 mL di coltura batterica nella stessa provetta per microfuge. Centrifugare a 13.000 x g per 2 minuti, quindi rimuovere tutto il surnatante.
7. Ripetere il passaggio 3.6 un'ultima volta con il restante 1 ml di coltura.
8. Aggiungere 1 mL di acqua sterile ghiacciata al pellet cellulare e risospendere con un pipettaggio delicato fino a quando il pellet non si trova più sul fondo della provetta per microfuge.
9. Centrifugare le cellule risospese a 13.000 x g per 2 min.
10. Rimuovere con cautela il surnatante utilizzando una pipetta da 1 mL. Non versare il surnatante, soprattutto nelle successive fasi di lavaggio quando le cellule tendono a formare pellet meno compatti.
11. Ripetere questa fase di lavaggio con acqua sterile ghiacciata, dai passaggi da 3.8 a 3.10, altre due volte.
12. Risospendere delicatamente il pellet cellulare finale in 200 μL di acqua sterile ghiacciata.
13. Trasferire 100 μL della sospensione cellulare finale nella seconda provetta microfuge ghiacciata da 1,5 mL. Questa seconda aliquota diventerà il controllo negativo per l'elettroporazione. Conservare i campioni di cellule sul ghiaccio.

4. Elettroporazione

1. Preriscaldare 1 mL di brodo LB e una piastra agar LB + Gm⁵⁰ (preparata nella fase 1.4) per ciascun campione e controllare in un incubatore statico impostato a 37 °C.
2. In un volume combinato di 5 μL o meno, aggiungere 100-200 ng ciascuno del plasmide helper pTNS2 e del plasmide di inserzione pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK a un'aliquota di cellule elettrocompetenti.
3. Miscelare con la punta delle dita per garantire la completa miscelazione dei plasmidi con le cellule elettrocompetenti senza introdurre bolle.
4. Aggiungere un volume equivalente di acqua distillata sterile nell'aliquota della cella di controllo negativo e mescolare delicatamente come sopra.
5. Incubare i campioni su ghiaccio per 20 min.
6. Trasferire l'intero campione di cellule in una cuvetta per elettroporazione ghiacciata, quindi riposizionare la cuvetta sul ghiaccio. Ripetere l'operazione per il campione della cella di controllo negativo.
7. Elettroporare il campione di cellule.
   1. Accendere l'elettroporatore e impostarlo a 2,0 kV (25 μF, 200 Ω) (vedere la tabella dei materiali).
   2. Pulire la superficie della cuvetta con un panno morbido per rimuovere il ghiaccio o l'umidità aderenti.
   3. Inserire la cuvetta nell'elettroporatore ed erogare la scossa elettrica.
   4. Aggiungere immediatamente 0,9 ml di brodo LB preriscaldato alle cellule nella cuvetta e pipettare delicatamente su e giù per mescolare le cellule con il terreno.
   5. Trasferire l'intera sospensione cellulare in una nuova provetta da 1,5 mL (temperatura ambiente).
   6. Controllare il valore della costante di tempo sull'elettroporatore; Per ottenere i migliori risultati, questo valore deve essere compreso tra 4 e 6.
8. Ripetere la procedura di elettroporazione (passaggi da 4.7.1 a 4.7.6) per il campione di cella di controllo negativo.
9. Incubare i campioni elettroporati a 37 °C per 1 ora a 250 giri/min per consentire il recupero delle cellule.
10. Utilizzando uno spandiconcime di inoculazione, distribuire 100 μL di ciascun campione di cellule elettroporate su una piastra di agar LB + Gm⁵⁰ preriscaldata.
    1. Centrifugare i campioni rimanenti a 13.000 x g per 2 minuti per pellettare le cellule.
    2. Dopo aver rimosso tutto il surnatante utilizzando una pipetta, risospendere le cellule in 100 μL di brodo LB.
    3. Distribuire ogni intero campione su singole piastre di agar LB + Gm⁵⁰ preriscaldate.
       NOTA: L'efficienza dell'elettroporazione può dipendere dalla deformazione. Quando si elettropola un ceppo per la prima volta, può essere utile plastare diversi volumi, o addirittura diluizioni, del campione di elettroporazione per assicurarsi che le piastre risultanti abbiano colonie isolate.
11. Incubare le piastre a 37 °C per 16-18 ore.

5. Selezione di colonie trasformate per lo screening basato sulla PCR

1. Controllare le piastre per elettroporazione. Il controllo negativo non dovrebbe avere colonie; Il campione deve avere colonie distinte.
   NOTA: Le piastre con colonie, in questa fase e in tutte le fasi successive in cui vengono prodotte piastre di agar con colonie o cerotti, possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 3 giorni prima di procedere.
2. Usando degli stuzzicadenti sterili, prelevare fino a 10 colonie singole dalle piastre di agar LB + Gm⁵⁰ e metterle su una piastra di agar LB + Gm⁵⁰ fresca.
3. Incubare le piastre a 37 °C per 16-18 ore.

6. Verifica dell'inserzione cromosomica mediante PCR di colonia

1. Rimuovere dall'incubatrice le piastre di agar LB + Gm⁵⁰ contenenti le colonie rattoppate.
2. Utilizzando uno stuzzicadenti sterile o una punta di pipetta sterile, rimuovere una piccola porzione (delle dimensioni di una grande colonia) da un cerotto in 20 μL di acqua distillata sterile in una provetta PCR da 0,2 mL; Mescolare bene. Il campione d'acqua dovrebbe diventare visibilmente torbido man mano che le cellule vengono rilasciate dallo stuzzicadenti. Preparare un numero qualsiasi di campioni che devono essere sottoposti a screening, ma 6 dovrebbero essere sufficienti.
3. Incubare la provetta PCR contenente la sospensione batterica a 100 °C per 5-10 min.
4. Utilizzando una mini-centrifuga (vedi Tabella dei materiali), far ruotare il campione alla velocità massima fissata per 2 minuti per pellet di detriti cellulari.
5. Trasferire il surnatante in una nuova provetta PCR da 0,2 mL e posizionarla su ghiaccio. Questo campione contiene il DNA stampo per la reazione PCR.
   NOTA: Questo modello di DNA può essere conservato a -20 °C prima di procedere con la PCR.
6. Preparare una miscela di reazione PCR contenente 1x tampone polimerasi, 200 μM di dNTP, 0,18 μM ABglmS2_F_New primer diretto, 0,18 μM Tn7R primer inverso (Tabella 1), 1 U di Taq DNA polimerasi e 1 μL del DNA modello preparato in un volume totale di 25 μL. Preparare un controllo senza stampo (NTC), che includa tutto tranne il DNA modello (vedere Tabella dei materiali).
7. Inserire le condizioni di reazione in un termociclatore: 95 °C per 2 min; 95 °C per 30 s, 49 °C per 30 s e 72 °C per 30 s per un totale di 35 cicli; 72 °C per 10 min; Mantenimento di 12 °C. Eseguire gli esempi.
8. Dopo l'aggiunta del colorante di caricamento del DNA a una concentrazione finale di 1x, caricare 10 μL di ciascuna reazione PCR su un gel di agarosio al 2% e far funzionare a 80 V per 40 minuti. La dimensione prevista dell'amplicone per questa coppia di primer è di 382 bp. L'NTC non dovrebbe avere bande.
9. Identificare i campioni che hanno prodotto il prodotto PCR atteso. Preparare una piastra di striatura su piastre di agar LB + Gm⁵⁰ da uno qualsiasi dei cerotti positivi alla PCR; incubare a 37 °C per 16-18 h. L'obiettivo è quello di generare una piastra con singole colonie per la preparazione di uno stock di glicerolo per preservare questo ceppo marcato e come punto di partenza per la creazione di un ceppo non marcato (descritto di seguito).

7. Rimozione del marcatore Gm^R con pFLP2^ab

1. Seguire la procedura descritta nella fase 2: Preparazione della coltura. Il campione utilizzato per preparare la coltura notturna è una singola colonia delle piastre di agar LB + Gm⁵⁰ preparate per generare colonie discrete nella fase 6.9.
2. Seguire la procedura indicata al punto 3: Preparazione delle celle elettrocompetenti. Preparare le cellule della coltura notturna per l'elettroporazione.
3. Seguire la procedura indicata al punto 4: Elettroporazione. In questo caso, il plasmide da introdurre nelle cellule è pFLP2^ab (100-200 ng), che rimuoverà il gene di resistenza alla gentamicina, affiancando il gene di interesse inserito cromosomicamente.
4. Dopo che le cellule si sono riprese per 1 ora (fase 4.9), distribuire 100 μL del campione di cellule elettroporate su una piastra di agar LB + Cb²⁰⁰ preriscaldata (preparata nella fase 1.4). Questa pressione selettiva assicura che crescano solo le cellule che ospitano il plasmide di escissione pFLP2^ab .
5. Incubare le piastre a 37 °C per 16-18 ore.
6. Controllare la piastra per le colonie. La piastra di controllo negativo non deve avere colonie; la piastra campione di agar LB + Cb²⁰⁰ dovrebbe avere colonie distinte.
7. Utilizzando stuzzicadenti sterili, applicare un patch incrociato fino a 20 colonie isolate su una piastra di agar LB + Cb²⁰⁰ e una piastra di agar LB + Gm⁵⁰ .
8. Incubare le piastre per 16-18 h a 37 °C.
9. Controllare che le piastre non presentino toppe. I cloni che crescono sulla piastra di agar LB + Cb²⁰⁰ ma non sulla piastra di agar LB + Gm⁵⁰ hanno avuto il gene di resistenza alla gentamicina rimosso dall'inserto originale.
10. Selezionare i cerotti resistenti alla carbenicillina e suscettibili di gentamicina per striature su singole piastre di agar LB integrate con saccarosio al 5% (p/v), che forza l'espulsione del plasmide pFLP2^ab dai batteri. Scegli fino a 10 colonie.
11. Incubare le piastre per 16-18 h a 37 °C.
12. Controllare le piastre per le colonie.
13. Come conferma finale della perdita di plasmidi pFLP2^ab , è stato eseguito il cross-patch 4-6 colonie isolate dalle piastre di saccarosio al 5% su una piastra di agar LB + Cb²⁰⁰ e una piastra di agar LB.
14. Incubare le piastre per 16-18 h a 37 °C.
15. Scegli un clone che sta crescendo sulla piastra di agar LB e che è sensibile alla carbenicillina per la preparazione di un brodo di glicerolo per preservare questo ceppo non marcato.
    1. La verifica genetica del ceppo non marcato può essere eseguita con la PCR di colonia (fase 6: Verifica dell'inserimento cromosomico mediante PCR di colonia) utilizzando i primer che hanno come bersaglio il gene di resistenza alla gentamicina.
    2. Preparare una miscela di reazione PCR contenente 1 tampone polimerasi, 200 μM di dNTP, 0,18 μM Gm_F primer in avanti, 0,18 μM Gm_R primer inverso (Tabella 1), 1 U di Taq DNA polimerasi e 1 μL del DNA modello preparato in un volume totale di 25 μL. Preparare un controllo senza stampo (NTC) che includa tutto tranne il DNA stampo, e un controllo positivo utilizzando il DNA del ceppo marcato.
    3. Inserire le condizioni di reazione in un termociclatore: 95 °C per 2 min; 95 °C per 30 s, 50 °C per 30 s. e 72 °C per 40 s. per un totale di 35 cicli; 72 °C per 10 min; Mantenimento di 12 °C. Eseguire gli esempi.
    4. Dopo l'aggiunta del colorante di caricamento del DNA a una concentrazione finale di 1x, caricare 10 μL di ciascuna reazione PCR su un gel di agarosio all'1% e far funzionare a 80 V per 40 minuti. La dimensione prevista dell'amplicone per questa coppia di inneschi è di 525 bp. Il controllo positivo deve avere una singola banda; i campioni e l'NTC non devono avere bande.

Results

La procedura di inserimento cromosomico richiede solo 2 ore in totale in 3 giorni per vedere le colonie di risultati crescere su una piastra di agar selettiva (Figura 1A-C). Il numero atteso di colonie sulla piastra di trasformazione dipende dal ceppo: si possono vedere 20-30 o anche centinaia di colonie poiché l'inserimento di Tn7 nei siti attTn7 è specifico ed efficiente⁹. Il patching delle colonie di piastre di trasformazione su terreni selettivi (Figura 4A) preserva il ceppo trasformato e fornisce il materiale di partenza per lo screening PCR delle colonie (Figura 1E e Figura 4B). Lo screening delle colonie mediante PCR può essere ridotto al minimo: non dovrebbero essere necessarie più di 10 colonie e la maggior parte dovrebbe dare un risultato positivo per l'inserimento. Il prodotto PCR per i primer di screening, ABglmS2_F_New e Tn7R (Tabella 1), è di 382 bp (Figura 4B corsia 4); i controlli negativi per la reazione includono A. baumannii ATCC 17978 wild-type (Figura 4B corsia 2), AB258 (Figura 4B corsia 3) e nessun modello (Figura 4B corsia 5). Le colonie che sono PCR-positive rappresentano ceppi complementari e marcati.

La rimozione del gene di resistenza alla gentamicina (unmarking) richiede meno di 3 ore, nell'arco di 6 giorni, poiché le cellule trasformate con il plasmide di escissione devono essere scelte attraverso la placcatura selettiva, quindi il plasmide di escissione deve essere curato dai batteri (Figura 1F). L'escissione basata sulla ricombinazione Flp-FRT è precisa ed efficace e dovrebbe portare a ≥20 colonie sulla piastra di trasformazione. Le colonie che sono incrociate con carbenicillina (selezionando la resistenza al β-lattamico conferita dal plasmide di escissione) e la gentamicina (cercando la perdita della resistenza alla gentamicina) dovrebbero essere tutte resistenti alla carbenicillina e sensibili alla gentamicina, rispettivamente. Il plasmide di escissione viene espulso dai batteri dalla crescita su piastre di agar al 5% di saccarosio. La crescita sul saccarosio costringe le cellule ad eliminare pFLP2^ab poiché il gene sacB sul plasmide promuove la conversione del saccarosio in levans, un polisaccaride tossico per i batteri^12,13. Tutte le colonie che crescono su terreni di saccarosio al 5% dovrebbero quindi crescere solo su piastre di agar LB semplici; Non ci dovrebbe essere crescita sulle piastre di agar carbenicillina. Le colonie che crescono sulle piastre di agar LB della pianura rappresentano ceppi non marcati. La conferma della perdita del marcatore gentamicina può essere ottenuta mediante PCR di colonia utilizzando i primer Gm_F e Gm_R (Tabella 1 e Figura 5). Questa coppia di primer produce un amplicone di 525 bp solo nel controllo positivo (la deformazione marcata inizialmente creata, Figura 5 corsia 4); ATCC 17978 wild-type (Figura 5 corsia 2), AB258 (Figura 5 corsia 3), qualsiasi colonia testata (Figura 5 corsia 5) e il controllo senza modello (Figura 5 corsia 6) non dovrebbero mostrare amplificazione.

Una volta confermato il ceppo non marcato, i test funzionali possono iniziare con saggi fenotipici. In questo caso, la prima scelta ovvia è determinare la concentrazione minima inibitoria (MIC) di una serie di antibiotici: la ciprofloxacina è un substrato noto di AdeIJK, la tetraciclina può essere rimossa da AdeIJK (la principale pompa di efflusso è AdeAB) e la kanamicina ha un effetto relativamente minore su A. baumannii ATCC 17978 ^2,14. Utilizzando il metodo di micro-diluizione del brodo secondo le linee guida CLSI¹⁵, il ceppo non marcato complementare AB258::adeIJK è stato testato con ciascun antibiotico in assenza e presenza di 50 μM IPTG; Il ceppo wild-type ATCC 17978 e il ceppo AB258 carente di efflusso RND sono stati inclusi come controlli (Tabella 2). Nel complesso, l'andamento osservato nei valori di MIC indica la prevista suscettibilità di AB258::adeIJK alla ciprofloxacina e alla tetraciclina con l'espressione indotta della pompa di efflusso, verificando che l'inserimento di adeIJK abbia avuto successo.

Figura 1: Panoramica della procedura. (A) Viene preparata una coltura notturna del ceppo A. baumannii da completare. (B) Le cellule della coltura notturna vengono lavate con acqua 3 volte tramite centrifugazione e mantenute in ghiaccio. (C) I plasmidi di rilascio e di supporto vengono aggiunti alle cellule e incubati su ghiaccio per 20 minuti. Il campione viene elettroporato, viene aggiunto il terreno LB e le cellule vengono lasciate recuperare per 1 ora a 37 °C. Un'aliquota di 100 μL di cellule viene sparsa su piastre di agar LB + Gm⁵⁰ e incubata a 37 °C per una notte. (D) Le colonie della piastra di trasformazione vengono patchate su una piastra di agar LB + Gm⁵⁰ e coltivate per una notte a 37 °C. (E) Le colonie patchate vengono preparate per la PCR per lo screening della presenza di un prodotto di amplificazione che si estende sul sito di inserzione cromosomica. L'amplificazione della PCR viene visualizzata mediante elettroforesi su gel di agarosio. I campioni positivi alla PCR rappresentano l'inserimento riuscito del gene di interesse nel cromosoma e la creazione di un ceppo marcato. (F) Una colonia positiva per la gentamicina viene preparata come nei passaggi (A-C), con elettroporazione del plasmide^{pLFP2 ab} per rimuovere la cassetta della gentamicina dall'inserzione cromosomica. La placcatura selettiva su agar LB + Cb²⁰⁰ conferma l'assorbimento del plasmide. Il patching duplicato su piastre di agar LB + Cb²⁰⁰ e LB + Gm⁵⁰ rivela colonie che sono Cb^R e Gm^S confermando la perdita della cassetta di gentamicina dall'inserzione. La crescita di colonie selezionate di Cb^R con saccarosio al 5% cura il plasmide pLFP2^ab dalle cellule. Le colonie della piastra di saccarosio al 5% vengono patchate su agar LB + Cb²⁰⁰ e agar LB per rivelare le colonie di Cb^S e Gm^S desiderate e confermare la creazione del ceppo non marcato. Gm⁵⁰, gentamicina a 50 μg/mL; Cb²⁰⁰, carbenicillina a 200 μg/mL; ^R, resistente; ^S, sensibile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Plasmidi utilizzati in questo protocollo. Mappe plasmidiche generali di (A) pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm (plasmide di inserzione), (B) pTNS2 (plasmide helper) e (C) pFLP2^ab (plasmide di escissione). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Schema di inserimento e smarcamento. (A) Inserimento. Il singolo sito di inserzione di Tn7 nel cromosoma A. baumannii si trova a 24 bp dalla fine del gene glmS2 . La co-elettroporazione del plasmide di inserzione e del plasmide helper consente la complementazione del gene di interesse (gene inserito, viola) insieme al resto della cassetta di inserzione (siti FRT per l'escissione del marcatore, giallo; gene accC1 per la resistenza alla gentamicina, verde; gene lacIq per l'espressione inducibile, blu) nel cromosoma. (B) Smarcamento. L'elettroporazione del ceppo di inserzione complementato e marcato con il plasmide di escissione pFLP2^ab facilita la rimozione del gene di resistenza alla gentamicina (accC1, verde) tramite la ricombinazione Flp-FRT (siti FRT, giallo), creando un ceppo non marcato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Trasformazione, patching e conferma dell'inserimento mediante PCR di colonia. Risultato rappresentativo di (A) la crescita delle colonie di trasformazione dopo il patching e (B) l'amplificazione della PCR della colonia con primer ABglmS_F_New (grigio) e Tn7R (arancione) per confermare l'inserzione cromosomica. Corsia 1: Scala del DNA a basso peso molecolare; Corsia 2: ATCC 179798; Corsia 3: AB258; Corsia 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; Corsia 5: controllo senza modello. La banda prevista di 382 bp è etichettata. Si noti che i primer specifici per la gentamicina (Gm_F e Gm_R, verde) potrebbero anche essere utilizzati per affermare l'inserzione cromosomica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Conferma della perdita del marcatore mediante PCR di colonia. Risultato rappresentativo dell'amplificazione della PCR di colonia con primer specifici per gentamicina (Gm_F e Gm_R) per confermare la perdita del marcatore antibiotico tramite escissione basata su pFLP^ab. Corsia 1: scala del DNA a basso peso molecolare; Corsia 2: ATCC 179798; Corsia 3: AB258; Corsia 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; Corsia 5: AB258::adeIJK; Corsia 6: controllo senza modello. La banda prevista di 525 bp è etichettata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Ceppi, plasmidi e primer	Caratteristiche rilevanti	Riferimento
Macchia
A. baumannii ATCC 17978	Tipo di ceppo	ATCC (Canale di controllo della
A. baumannii ATCC 17978 AB258	ΔadeAB,Δ adeFGH,Δ adeIJK	11
Plasmidi
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC	GmR, AmpR	9
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC-adeIJK	GmR, AmpR, adeIJK	Questo studio
pTNS2	AmplificatoreR	9
pFLP2ab	pWH1266 origine o replicazione, sacB, AmpR	7
Primer	Sequenza (5′–3′)
ABglmS_F_New	CACAGCATAACTGGACTGATTTC	7
Tn7R	TATGGAAGAAGTTCAGGCTC	7
Gm_F	TGGAGCAGCAACGATGTTAC	Questo studio
Gm_R	TGTTAGGTGGCGGTACTTGG	Questo studio

Tabella 1: Ceppi batterici, plasmidi e primer utilizzati in questo protocollo. Gm, gentamicina; Amp, ampicillina; ^R, resistente.

	Ciprofloxacina		Tetraciclina		Kanamicina
IPTG	−	+	−	+	−	+
ATCC 17978	0.250	Nd	0.500	Nd	1.5	Nd
AB258	0.031	Nd	0.063	Nd	4	Nd
AB258::adeIJK	0.016	0.063	0.031	0.125	8	2
Cambio di piega		4.01		4.03		0.25

Tabella 2: Test della funzionalità dei geni inseriti attraverso la suscettibilità agli antibiotici. Confronto dei valori di concentrazione minima inibitoria (MIC) per A. baumannii ATCC 17978, AB258, AB258::adeIJK non indotto e AB258::adeIJK indotto da IPTG contro ciprofloxacina, tetraciclina e kanamicina. Variazione di piega = indotta (+ IPTG)/non indotta (− IPTG); nd = non determinato.

Discussion

Anche se questa procedura per l'inserimento cromosomico di un sistema di espressione genica inducibile a singola copia in A. baumannii è tecnicamente semplice e non laboriosa, ci sono alcuni passaggi importanti che devono essere sottolineati. Innanzitutto, la preparazione delle cellule competenti deve essere eseguita il più possibile su ghiaccio poiché le cellule diventano fragili durante la sostituzione del terreno con acqua ghiacciata. Idealmente, le fasi di centrifugazione vengono eseguite a 4 °C, ma la centrifugazione a temperatura ambiente è accettabile. Data la crescente fragilità delle cellule durante i lavaggi con acqua, anche il pipettaggio delicato è fondamentale. In secondo luogo, l'elettroporazione è sensibile alla presenza di ioni. Il lavaggio delle celle con più cicli di pellettizzazione e la risospensione in acqua assicurano che il terreno sia completamente rimosso. Inoltre, i plasmidi devono essere appena purificati e possono essere eluiti in tamponi di eluizione standard in kit (normalmente tampone TE) purché la concentrazione di DNA plasmidico sia sufficientemente elevata. Miriamo ad aggiungere <5 μL di plasmide a 100 μL di sospensione cellulare per mantenere la forza ionica del campione molto bassa, anche se dovrebbero essere tollerati fino a 10 μL. In terzo luogo, le piastre di agar selettive devono essere preparate secondo necessità per garantire l'efficacia dell'antibiotico aggiunto. Si noti che la carbenicillina è stata utilizzata al posto della solita ampicillina per la selezione durante la trasformazione del plasmide di escissione, pFLP2^ab. A. baumannii è intrinsecamente resistente alle aminopenicilline (ampicillina)¹⁶; La sostituzione di una carbossipenicillina (carbenicillina) consente una selezione continua con la β-lattamasi codificata dal plasmide.

L'ottimizzazione del protocollo sperimentale è più sfumata e varierà tra le diverse specie di Acinetobacter (o anche ceppi geneticamente manipolati all'interno della stessa specie) e possibilmente i particolari reagenti utilizzati in laboratorio. Ad esempio, la tensione utilizzata per l'elettroporazione può variare tra 1,8 e 2,5 kV e potrebbe essere necessario modificare leggermente le condizioni di termociclo a seconda della DNA polimerasi utilizzata per la PCR. Suggerimenti utili da considerare se le cellule crescono male dopo l'elettroporazione includono la riduzione della concentrazione di gentamicina nelle piastre di agar da 50 μg/mL a 30 μg/mL e/o l'estensione del tempo di incubazione delle piastre di agar a ≥24 ore. Per quanto riguarda i passaggi per rimuovere la cassetta di gentamicina, si può ottenere un successo migliore utilizzando piastre di agar LB con saccarosio al 10% e/o incubandole a 30 °C per ≥24 ore se la resistenza alla carbenicillina persiste.

In letteratura si possono trovare numerosi metodi di preparazione delle cellule di A. baumannii per l'uso con l'elettroporazione, ma spesso includono una fase di subcoltura dopo la coltura notturna iniziale e poi una lunga fase di crescita fino a una densità ottica prescritta. Abbiamo scoperto che una semplice cultura notturna può essere utilizzata in modo altrettanto efficace. L'elettroporazione di A. baumannii è stata ben descritta e i lettori possono ottenere ulteriori informazioni su questo aspetto specifico del protocollo qui^17,18. I principali vantaggi di questo sistema di complementazione genica cromosomica mini-Tn7 rispetto a un sistema di complementazione basato su plasmidi sono la capacità di regolare il livello di espressione del gene complementato attraverso il sistema repressore lacI^q controllabile da IPTG e la scelta di rimuovere il marcatore della gentamicina (gene aacC1) tramite i siti FRT fiancheggianti. È stato osservato che la tolleranza delle cellule all'espressione delle pompe di efflusso può variare a seconda della pompa inserita. Ad esempio, le cellule sono più sensibili all'espressione di AdeIJK rispetto ad AdeABC o AdeFGH; questo problema può essere affrontato modificando la concentrazione di IPTG in condizioni di coltura. La rimozione del marcatore antibiotico riduce il rischio di mutazione per il ceppo dovuto alla costante pressione selettiva e consente anche indagini di suscettibilità agli antibiotici senza restrizioni³.

Questo sistema mini-Tn7 è stato utilizzato con successo con le specie Pseudomonas ^9,10, Yersinia⁹, Burkholderia¹⁹, Xanthomonas²⁰ e Acinetobacter ^5,6,21,22, tuttavia esistono alcune limitazioni. Ad esempio, in A. baumannii c'è un solo sito di inserzione attTn7 funzionale nel genoma⁵, quindi un ceppo può essere creato con più delezioni, ma solo un gene alla volta può essere completato. Inoltre, questo sistema non si è ancora dimostrato efficace per i batteri Gram-positivi¹⁰.

Le pompe di efflusso RND sono importanti facilitatori della resistenza agli antibiotici in A. baumannii. Ciò che li rende così potenti è la loro struttura in tre parti che si estende attraverso le membrane interne ed esterne, consentendo la rimozione degli antibiotici dal periplasma all'esterno della cellula. Le pompe RND più studiate e onnipresenti, denominate AdeABC, AdeFGH e AdeIJK, hanno dimostrato di eliminare gli antibiotici che comprendono tutte le classi. Chiarire in dettaglio la funzione della pompa di efflusso fornirà un buon punto di partenza per progettare nuove opzioni terapeutiche contro ceppi multiresistenti. L'utilizzo del ceppo di delezione a tripla pompa RND AB258 e il completamento di una pompa alla volta consente lo studio di ciascuna pompa indipendentemente dalle altre, discernendo per ciascuna i loro profili di substrato unici e gli inibitori più efficaci. Naturalmente, le pompe di efflusso hanno anche un ruolo "quotidiano" nella normale funzione del batterio. La comprensione di questi ruoli potrebbe portare a una paralisi indiretta delle pompe, che, a sua volta, interromperebbe l'efflusso di antibiotici, rendendo forse i batteri multiresistenti suscettibili agli antibiotici comunemente usati ancora una volta. Generalmente, il sistema mini-Tn7 può essere utilizzato per introdurre qualsiasi gene di interesse per uno studio dettagliato o marcatori utili, ad esempio proteine fluorescenti per l'imaging microscopico⁶.

La crescente prevalenza di batteri multiresistenti è una preoccupazione per tutti noi. Comprendere i meccanismi protettivi forniti dalle pompe di efflusso in agenti patogeni come A. baumannii è fondamentale per combattere le infezioni gravi. Questo sistema di espressione genica cromosomica a singola copia è un potente strumento per gli studi meccanicistici e per l'identificazione di inibitori per contrastare la funzione della pompa di efflusso.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provetta PCR da 0,2 mL	VWR	20170-012	Per preparazioni di bollitura di colonie e reazioni PCR
Provette microfuge da 1,5 mL	Sarstedt	72-690-301
13 mL per uso generale, Pyrex	Fisher	14-957K	Recipienti per colture liquide
6x tampone di caricamento del DNA	Froggabio	LD010	Elettroforesi su gel di agarosio colorante di caricamento del campione
Acetico acido, glaciale	Fisher	351271-212	Componente tampone in gel di agarosio
Agar	Bioshop	AGR003	Terreno di crescita solido
Agarosio	BioBasic	D0012	Separazione elettroforetica dei prodotti della reazione PCR; utilizzato a una concentrazione di 0,8– 2%
Unità di elettroforesi su gel di agarosio	Fisher	29-237-54	Elettroforesi su gel di agarosio; separazione dei prodotti della reazione PCR
Carbenicillina	Fisher	50841231	Terreni selettivi
Chiusure delle provette di coltura	Fisher	13-684-138	Chiusura in acciaio inossidabile per provette di coltura da 13 mL
Set di deossinucleotide trifosfato (dNTP)	Biobasic	DD0058	componente della reazione PCR; fornito come 100 mM ciascuno dATP, dCTP, dGTP, dTTP; miscelato e diluito per 10 mM ciascuno dNTP
Bagno a secco/riscaldatore a blocchi	Fisher	88860023	Isotemp bagno a secco digitale per preparazioni
ebollizione Cuvette per elettroporazione	VWR	89047-208	Cuvette per elettroporazione da 2 mm con tappo rotondo
Elettroporatore	Cole Parmer	940000009	110 VAC, 60 Hz Elettroporatore
Bromuro di etidio	Fisher	BP102-1	Visualizzazione dei prodotti della reazione PCR e del marcatore del DNA in gel di agarosio
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Componente tampone di corsa in gel di agarosio
Gentamicina	Biobasic	GB0217	Per la preparazione di terreni selettivi
Glicerolo	Fisher	G33	Preparazione di stock batterici per la conservazione a lungo termine in un incubatore a bassissimo congelatore
(agitazione)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Incubatore Agitatore per la crescita di colture liquide
Incubatore (statico)	Fisher	11-690-550D	Isotemp Incubator Forno Modello 550D per la crescita di colture solide (LB agar)
Ciclo di inoculazione	Sarstedt	86.1562.050	Striature di colonie su piastre di agar
Spandiconcime di inoculazione	Sarstedt	86.1569.005	Diffusione di coltura su piastre di agar
Brodo di lisogenesi (LB), Lennox	Fisher	BP1427	Terreni di crescita liquidi (20 g/L: 5 g/L di cloruro di sodio, 10 g/L di triptone, 5 g/L di estratto di lievito)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 per la centrifugazione dei campioni
Mini-centrifuga	Fisher	S67601B	Centrifugazione di provette PCR da 0,2 mL
Piastre di Petri	SPL Life Sciences	10090	Per terreni di crescita solidi (piastre di agar): 90 x 15 mm
Pipette	Mandel	Varie	pipette Gilson a canale singolo (P10, P20, P200, P1000)
Alimentazione	Biorad	1645050	PowerPac Alimentatore di base per elettroforesi
Primer	IDT	NA	PCR; specifico per il gene di interesse; preparato a 100 μ M come indicato nella scheda tecnica del prodotto
Saccarosio	BioBasic	SB0498	Per la preparazione di terreni controselettivi per la rimozione del plasmide pFLP2ab da A. baumannii
Taq DNA polimerasi	FroggaBio	T-500	componente di reazione PCR; polimerasi fornita con un termociclatore 10x tampone
	Biorad	1861096	Modello T100 per PCR
Stuzzicadenti	Fisher	S24559	Per il patching di colonie su piastre di agar
Base Trizma	Sigma	T1503	Componente tampone per l'esecuzione in gel di agarosio
Acqua ultrapura	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ: acqua ultrapura per la preparazione di terreni e soluzioni e il lavaggio cellulare
Marcatore DNA ad ampio raggio	Biobasic	M103R-2	Determinazione delle dimensioni dei prodotti PCR su un gel di agarosio
Bastoncini di inoculazione in legno	Fisher	29-801-02	Inoculazione di colture con colonie da piastre di agar