Dissezione, elaborazione istologica e analisi dell'espressione genica del tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino

Summary

In questo articolo, forniamo una procedura pratica per la dissezione e l'esecuzione di analisi istologiche e di espressione genica del tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino.

Abstract

La termogenesi mediata dal tessuto adiposo bruno (BAT) svolge un ruolo importante nella regolazione del metabolismo e la sua morfologia e funzione possono essere notevolmente influenzate dagli stimoli ambientali nei topi e nell'uomo. Attualmente, il BAT interscapolare murino (iBAT), che si trova tra due scapole nel fianco dorsale superiore dei topi, è il principale deposito di BAT utilizzato dai laboratori di ricerca per studiare la funzione dei BAT. Recentemente, sono stati identificati alcuni depositi BAT precedentemente sconosciuti nei topi, tra cui uno analogo al tessuto adiposo bruno sopraclavicolare umano. A differenza dell'iBAT, il tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino (scBAT) si trova nello strato intermedio del collo e quindi non è facilmente accessibile.

Per facilitare lo studio di scBAT murini appena identificati, viene presentato un protocollo che descrive in dettaglio i passaggi per sezionare scBAT intatti da topi postnatali e adulti. A causa delle piccole dimensioni di scBAT rispetto ad altri depositi adiposi, le procedure sono state modificate e ottimizzate specificamente per il trattamento di scBAT. Tra queste modifiche c'è l'uso di un microscopio da dissezione durante la raccolta dei tessuti per aumentare la precisione e l'omogeneizzazione dei campioni scBAT congelati per aumentare l'efficienza della successiva analisi qPCR. Con queste ottimizzazioni, è possibile determinare l'identificazione, l'aspetto morfologico e la caratterizzazione molecolare dello scBAT nei topi.

Introduction

La crescente prevalenza dell'obesità negli Stati Uniti e in tutto il mondo ha suscitato un grande interesse per la comprensione della sua eziologia e l'identificazione di potenziali trattamenti ^1,2. Il tessuto adiposo svolge un ruolo fondamentale nel metabolismo e la disregolazione del tessuto adiposo può portare allo sviluppo dell'obesità. Generalmente, esistono due tipi di tessuto adiposo, il tessuto adiposo bianco e il tessuto adiposo bruno. Mentre il tessuto adiposo bianco (WAT) può immagazzinare energia chimica e secernere fattori endocrini, il tessuto adiposo bruno (BAT) può utilizzare l'energia chimica per generare calore e mantenere la temperatura corporea al freddo ^3,4. A causa di questa capacità unica, l'attivazione di BAT può anche aumentare il dispendio energetico e migliorare la sensibilità all'insulina⁵.

Il BAT esercita la sua funzione attraverso la termogenesi senza brividi, un processo mediato dal disaccoppiamento della proteina 1 (UCP1)⁶. I mammiferi, compresi i topi e gli esseri umani, possiedono quantità variabili di BAT. La visione classica del BAT è che questi tessuti adiposi sono più abbondanti nei topi e nei neonati che negli esseri umani adulti. iBAT, situato nel fianco dorsale superiore tra le scapole, è il deposito BAT più studiato nei topi. Applicando l'imaging con radioisotopi e i test bioptici, studi recenti hanno identificato diversi depositi di BAT in esseri umani adulti. Alcuni di essi, compresi i depositi trovati nella regione del collo profondo e sopraclavicolare, non erano stati precedentemente identificati nei topi o in altri animali modello 7,8,9,10,11. Tra questi depositi BAT, lo scBAT è il deposito più frequentemente osservato negli esseri umani adulti. Per comprendere meglio l'origine e il contributo molecolare di questi depositi BAT appena scoperti nell'uomo, è essenziale identificare depositi equivalenti nei topi che consentano manipolazioni genetiche e molecolari per tracciare e testare il ruolo funzionale di questi depositi. Pertanto, noi e altri abbiamo identificato alcuni depositi di BAT precedentemente sconosciuti in diverse posizioni anatomiche nei topi, tra cui scBAT^12,13, BAT perivascolare toracico ^14,15, BAT perirenale¹⁶ e BAT periaortico¹⁷. Lo scBAT di topo assomiglia anatomicamente allo scBAT umano e morfologicamente assomiglia all'iBAT classico, esprimendo alti livelli di UCP1¹².

A differenza dell'iBAT di topo, che può essere facilmente sezionato, lo scBAT è situato nello strato intermedio del collo del topo, sotto le ghiandole salivari e lungo la vena giugulare esterna. L'isolamento di questo deposito per le analisi istologiche e molecolari può essere difficile. Qui, descriviamo in dettaglio la procedura per la dissezione di scBAT da topi postnatali e adulti e l'elaborazione di questo deposito per l'analisi istologica e dell'espressione genica.

Protocol

Le procedure sugli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso il Baylor College of Medicine. Tutte le procedure sono state eseguite su topi maschi C57BL/6J di età compresa tra 3 settimane e 3 mesi. Prima della dissezione, tutti i topi sono stati sottoposti a eutanasia utilizzando la procedura approvata per l'eutanasia dell'anidride carbonica dei roditori. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.

1. Dissezione di scBAT

1. Posiziona la carcassa del topo sul banco da lavoro e pulisci le forbici chirurgiche e le pinze a punta superfine con etanolo al 70%.
2. Spruzzare il collo ventrale del topo con etanolo al 70% per bagnare il pelo e ridurre al minimo la contaminazione del pelo.
3. Praticare un'incisione bilaterale, di circa 1,5 cm, lungo le clavicole.
4. Dalle estremità dell'incisione precedente, tagliare longitudinalmente verso le orecchie, lunghe circa 1 cm. Questo formerà un'incisione quadrata a forma di U intorno al collo (Figura 1A,B).
   NOTA: scBAT si trova nello strato intermedio del collo. Lo strato superficiale, composto dalla pelle, dal tessuto adiposo sottocutaneo e dalle ghiandole salivari, viene esposto durante questa fase. Lo strato intermedio, insieme a scBAT, contiene le vene giugulari e i muscoli del collo. Lo strato profondo del collo, contenente il BAT profondo del collo e le vene arteriose e giugulari, viene esposto rimuovendo il muscolo scheletrico.
5. Posizionare il topo sotto un microscopio da dissezione e mettere a fuoco il collo esposto (Figura 1C).
   NOTA: Questo passaggio aggiuntivo aumenta notevolmente la precisione della raccolta dei tessuti, necessaria date le piccole dimensioni di scBAT.
6. Esporre completamente le ghiandole salivari sollevando le sezioni di pelle incise con una pinza.
7. Usando forbici chirurgiche e pinze, scollegare il tessuto che collega le ghiandole salivari al tessuto intorno alle clavicole e tra loro.
8. Esporre i depositi scBAT sollevando le ghiandole salivari. Cerca il BAT lungo la vena giugulare esterna e possibilmente collegato alla parte inferiore delle ghiandole salivari. Identificalo per il suo colore arancione, che risalta contro il tessuto circostante.
9. Tenere il tessuto adiposo bersaglio con una pinza e staccarlo delicatamente dalle ghiandole salivari.
10. Una volta staccato dalle ghiandole salivari, continuare a scollegare lo scBAT dalla vena giugulare esterna e dalla muscolatura del collo fino a quando i depositi su entrambi i lati del collo non possono essere rimossi interi.
11. Ispezionare ogni campione di scBAT sezionato al microscopio da dissezione (Figura 1D,E), utilizzando una pinza per rimuovere il tessuto connettivo rimanente.
12. Mettere ogni campione in una fiala di vetro a scintillazione contenente 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e rimuovere il topo da sotto il microscopio.

2. Processamento e colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) di scBAT (illustrato nella Figura 2A)

1. Sostituire il PBS (passaggio 1.12) con 10 mL di paraformaldeide fredda al 4% (PFA) e posizionare il flaconcino su un nutator, oscillando a 4 °C per una notte per fissare l'scBAT.
   NOTA: La fissazione della perfusione può essere applicata nei topi postnatali, in particolare nei topi adulti, quando è necessaria un'ulteriore elaborazione per l'analisi immunoistochimica.
2. Il giorno successivo, rimuovere la soluzione di PFA dal flaconcino con una pipetta di trasferimento sterile e sostituirla con 10-15 mL di PBS. Posizionare il flaconcino su un nutator e agitare per 30 minuti a temperatura ambiente. Sostituire il PBS con una soluzione salina allo 0,85% e continuare a dondolare per altri 30 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: La soluzione salina è salina allo 0,85% (NaCl) p/v in acqua trattata con DEPC (priva di RNasi). Il PBS può essere sostituito alla soluzione salina in questa fase e in quella successiva.
3. Rimuovere la soluzione salina allo 0,85% con una pipetta di trasferimento e aggiungere 10 mL di soluzione salina al 70% di etanolo e soluzione salina allo 0,85% nel flaconcino. Conservare il flaconcino in frigorifero a 4 °C per una notte o fino al momento dell'inclusione in paraffina.
   NOTA: Il PBS può essere utilizzato se non è disponibile soluzione salina allo 0,85%. scBAT deve essere processato il prima possibile per facilitare il sezionamento e una migliore morfologia dei tessuti.
4. Prima dell'inclusione della paraffina, disidratare scBAT attraverso una serie di scambi di etanolo per rimuovere l'acqua dal tessuto.
   1. Per iniziare, rimuovere il 70% di etanolo/0,85% di soluzione fisiologica dal flaconcino con una pipetta di trasferimento e aggiungere 10-15 ml di alcool disidratante al 95%, facendo oscillare il flaconcino su un nutator a temperatura ambiente per 1 ora. Ripeti questo passaggio una volta.
      NOTA: L'etanolo può essere utilizzato al posto delle soluzioni alcoliche disidratanti.
   2. Successivamente, sostituire l'alcol disidratante al 95% con 10-15 ml di alcol disidratante al 100% e continuare a dondolare su un nutator per 1 ora. Riempire con nuovo alcool disidratante al 100% e continuare a dondolare per diverse ore o per tutta la notte, a seconda della quantità di scBAT nel flaconcino.
5. Per autorizzare scBAT per l'inclusione, aggiungere 10 mL di toluene al flaconcino e continuare a dondolare su un nutator fino a quando scBAT non è trasparente, circa 6-8 ore.
   NOTA: Il periodo di tempo necessario per ottenere una compensazione soddisfacente dipende dalle dimensioni dell'scBAT. Si consiglia di iniziare immediatamente la pulizia al mattino in modo che l'infiltrazione e l'incorporazione possano avvenire nel pomeriggio.
6. Per incorporare scBAT nella cera di paraffina, rimuovere il toluene e aggiungere 10 mL di cera di paraffina fusa per infiltrazione nel flaconcino. Mettere il flaconcino in forno a 65 °C per 1 h. Ripeti questo passaggio con nuova cera.
   NOTA: Iniziare a sciogliere i pellet di cera in un forno durante la notte prima dell'inizio dell'incorporazione per assicurarsi che la cera sia completamente liquida.
7. Sostituire la cera di paraffina di infiltrazione con cera di paraffina incorporante e porre il flaconcino alla stessa temperatura per 1 ora. Ripeti questo passaggio una volta.
   NOTA: La fase di infiltrazione può essere interrotta e continuata in un secondo momento. Togliere il flaconcino dal forno e conservarlo a temperatura ambiente fino al momento di continuare.
8. Incorporare il tessuto posizionandolo prima in uno stampo per l'inclusione dei tessuti, aggiungere la cera per inclusione fusa nello stampo e riorientare il tessuto sotto uno stereomicroscopio. Quindi, posizionare una cassetta di inclusione sopra la cera e continuare a versare la cera di inclusione sopra di essa fino a quando non è piena e il cappuccio di inclusione è fissato al blocco di cera. Trasferire il blocco in frigorifero a 4 °C per una notte per far rassodare e restringere la cera prima di rimuovere lo stampo metallico.
9. Sezionare lo scBAT con un microtomo a uno spessore di 5-6 μm¹⁸, da tre a quattro sezioni per vetrino da microscopio, e porlo in un bagno di galleggiamento a sezione di paraffina calda a ~42 °C per consentire alle sezioni di tessuto di appianarsi.
10. Trasferire le sezioni sui vetrini e posizionare i vetrini in posizione verticale contro il bagno di galleggiamento per consentire all'acqua di gocciolare dai vetrini.
11. Trasferire i vetrini su un rack per colorazione in acciaio inossidabile e posizionare il rack su un banco di asciugatura per vetrini ad asciugare per una notte.
    NOTA: I vetrini di paraffina possono essere conservati a lungo termine a temperatura ambiente prima di ottenere un'ulteriore lavorazione.
12. Eseguire la colorazione H&E¹⁹. Per iniziare, posizionare i vetrini in un rack per colorazione, quindi posizionare il rack in un barattolo di colorazione con xilene per 40 s. Ripeti questo passaggio una volta.
    NOTA: Se la paraffina è ancora visibile dopo le due fasi, attendere che si sia completamente sciolta prima di continuare.
13. Per reidratare il tessuto, posizionare il portavetrini in un barattolo di colorazione riempito con alcool disidratante al 100% per due fasi di 20 secondi, seguite da una fase di 15 secondi in alcool disidratante al 95% e da un risciacquo finale di 15 secondi in ddH₂O.
14. Mettere i vetrini in un piatto colorato riempito con soluzione di ematossilina per 75 s per ottenere la colorazione nucleare, quindi sciacquare i vetrini in un piatto colorante con ddH₂O per 45 s.
    NOTA: Il tempo può essere regolato in base al colore della macchia desiderato.
15. Differenziare la colorazione immergendo i vetrini in un piatto di colorazione riempito con soluzione di HCl-etanolo per 15 s, quindi trasferire i vetrini in un altro risciacquo ddH₂O per 15 s.
    NOTA: La soluzione di HCl-etanolo viene preparata secondo un metodo pubblicato¹⁹.
16. Per la colorazione citoplasmatica, immergere il vetrino in una soluzione di colorante di contrasto Eosina Y per 15 s.
17. Disidratare il tessuto immergendo i vetrini per 15 secondi ciascuno in tre stadi sequenziali di soluzione di alcol disidratante al 95%, quindi due bagni sequenziali di alcol disidratante al 100%, il primo per 15 secondi e il secondo per 45 secondi, per completare la disidratazione.
18. Infine, trasferire i vetrini in un bagno di xilene per 45 s per riacclimatare il tessuto ai solventi organici. Dopo questo passaggio, la colorazione è completata; Rimuovere il tessuto dalla soluzione.
19. Applicare il mezzo di montaggio su ciascun vetrino e coprioggetto all'interno di una cappa chimica. Asciugare per una notte prima dell'imaging. I risultati dell'imaging sono mostrati nella Figura 2B.

3. Analisi dell'espressione genica di scBAT

1. Raccolta di tessuti (macinazione)
   1. Dopo aver sezionato scBAT, inserire immediatamente il tessuto in una provetta per microcentrifuga, praticare un foro nella parte superiore della provetta con un ago sterile e congelare in azoto liquido.
      NOTA: I passaggi principali del protocollo qui descritti sono illustrati nella Figura 3A. Praticare un foro nella parte superiore del tubo prima di lasciarlo cadere nell'azoto liquido impedisce al tubo di scoppiare a causa dell'improvviso cambiamento di pressione.
   2. Riempi un bicchiere di plastica con azoto liquido e lascia in ammollo un pestello e una spatola sottile.
      NOTA: È importante mantenere la temperatura di tutti gli strumenti e dei campioni di tessuto il più fredda possibile, vicino alla temperatura dell'azoto liquido, durante l'intera procedura per evitare che il tessuto si scongeli. Il tessuto adiposo scongelato è molto aderente e rende la polverizzazione più impegnativa. Rimuovere gli strumenti e i campioni dai bagni di azoto liquido solo immediatamente prima dell'uso.
   3. Prelevare un campione di tessuto congelato a scatto alla volta e versarlo dalla provetta della microcentrifuga nel mortaio.
   4. Aggiungi una piccola quantità di azoto liquido al mortaio, quindi usa il pestello per macinare il tessuto congelato fino a quando non è completamente polverizzato.
      NOTA: Se il tessuto inizia a diventare morbido o appiccicoso in qualsiasi momento, si sta scongelando; Versare più azoto liquido nella malta.
   5. Utilizzare la spatola sottile per raschiare e trasferire con cura il tessuto polverizzato nella provetta della microcentrifuga. Versare l'azoto liquido nella malta mentre si raschia per raccogliere i pezzi di tessuto rimanenti prima di trasferirli con una spatola. Ripetere le fasi di trasferimento fino a quando tutto il tessuto non è stato rimosso dalla malta.
   6. Pulire la malta con un tergicristallo leggero e etanolo al 70% prima di scaricare il campione successivo da macinare. Conservare a lungo il fazzoletto in polvere in un congelatore a -80 °C.
2. Isolamento totale dell'RNA
   1. Preparazione
      1. Pulire il banco di lavoro, le pipette, i portapuntali e i rack per provette con etanolo al 70% e decontaminante superficiale per rimuovere la RNasi.
      2. Far funzionare la centrifuga fino a raggiungere i 4 °C.
      3. Riscaldare la soluzione di eluizione a 70 °C.
      4. Diluire la DNasi I mescolando 5 μL di DNasi I ricostituita con 75 μL di soluzione di diluizione DNasi per campione. Mettere la soluzione di DNasi I sul ghiaccio fino all'uso.
   2. Procedimento
      1. Per ogni campione, etichettare due provette per microcentrifuga, due provette per colonne (due provette per microcentrifuga graduate senza tappo) e una mini colonna di rilegatura.
      2. Aggiungere 500 μL di soluzione di isolamento dell'RNA a ciascun campione e sonicare utilizzando un pestello a pellet per 30 s.
      3. Prendi una siringa per ogni campione e pipetta su e giù 10 volte per lisare ulteriormente il tessuto. Assicurarsi che non siano visibili solidi dopo la siringa.
      4. Aggiungere 250 μL di cloroformio e vortice di tanto in tanto mentre si attende 5 minuti per l'incubazione dei campioni a temperatura ambiente.
      5. Centrifugare a 21.000 × g per 20 minuti a 4 °C.
      6. Trasferire la parte acquosa superiore in una nuova provetta per microcentrifuga e aggiungere una quantità equivalente di etanolo al 70% (~500 μL).
         NOTA: La parte acquosa superiore dovrebbe essere chiara, la parte inferiore dovrebbe essere la soluzione di isolamento dell'RNA rosso e tra i due strati dovrebbero esserci alcuni solidi indesiderati.
      7. Trasferire 500 μL del nuovo lisato nella colonna di legame. Centrifugare a 18.000 × g per 60 s e poi scartare il filtrato.
      8. Ripetere il passaggio precedente con il lisato rimanente per far entrare tutto l'RNA nella colonna di legame.
      9. Aggiungere 700 μL di lavaggio a bassa stringenza alla colonna di legatura, centrifugare per 30 secondi ed eliminare il filtrato.
      10. Aggiungere 80 μL di DNasi I diluita a ciascuna colonna di legame. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
      11. Aggiungere 700 μL di lavaggio ad alta rigore, centrifugare per 30 secondi ed eliminare il filtrato.
      12. Aggiungere 700 μL di lavaggio a basso rigore, centrifugare per 60 s ed eliminare il filtrato.
      13. Spostare le colonne di rilegatura nella 2a^nuova provetta di supporto della colonna senza tappo e centrifugare per 2 minuti per assicurarsi che tutti i liquidi vengano rimossi dalla colonna di rilegatura.
      14. Spostare le colonne di legame in una nuova provetta per microcentrifuga e aggiungere 30 μL di soluzione di eluizione riscaldata. Incubare a temperatura ambiente per 1 min.
      15. Centrifugare per 2 minuti per raccogliere l'RNA eluito sul fondo della provetta della microcentrifuga.
      16. Misurare la concentrazione totale di RNA utilizzando uno spettrofotometro.
          NOTA: Se la purezza totale dell'RNA è bassa, indicata da un valore 260/280 inferiore a 2,0 o 260/230 inferiore a 1,8, dopo il passaggio 3.2.2.12., i campioni possono essere lavati ancora una volta con un lavaggio a basso rigore seguito da un lavaggio con etanolo all'80% prima di continuare con il passaggio 3.2.2.13.
      17. Conservare l'RNA in un congelatore a -80 °C.
   3. Trascrizione inversa (RT)
      1. In una striscia di provette per PCR, aggiungere 0,5-1 μg di RNA totale diluito in acqua trattata con DEPC per un totale di 8 μL per ciascun campione di RNA in un pozzetto diverso.
         NOTA: La quantità di RNA utilizzata per la trascrizione inversa può essere aumentata o ridotta in base alle istruzioni del produttore.
      2. Aggiungere 1 μL di Oligo dT e 1 μL di dNTP a ciascun campione nella provetta PCR. Assicurarsi che il volume totale sia di 10 μL per campione.
      3. Posizionare la striscia di provette PCR in un termociclatore e impostarla a 65 °C per 5 minuti seguiti da 4 °C a tempo indeterminato.
      4. Dopo 5 minuti a 65 °C, estrarre la striscia di provetta PCR e posizionare la provetta su ghiaccio per almeno 2 minuti. Dopo l'incubazione su ghiaccio, aggiungere cinque reagenti: 4 μL di tampone 5x First-Strand, 2 μL di 25 mM MgCl₂, 2 μL di 0,1 M DTT, 1 μL di inibitore della RNasi e 1 μL di trascrittasi inversa a ciascun campione. Assicurarsi che il volume totale sia ora di 20 μL per campione.
      5. Riposizionare la striscia di provette PCR nel termociclatore e impostare il programma su 50 °C per 50 minuti, quindi 85 °C per 5 minuti, quindi 4 °C a tempo indeterminato.
      6. Una volta che il programma raggiunge i 4 °C, estrarre la striscia e aggiungere 1 μL di Ribonucleasi H (RNasi H).
         NOTA: La RNasi H viene utilizzata per rimuovere qualsiasi stampo di RNA rimanente nella reazione RT; in questo passaggio, l'RNA desiderato dovrebbe già essere convertito in cDNA.
      7. Riposizionare la striscia nel termociclatore e far funzionare 37 °C per 20 minuti e poi 4 °C a tempo indeterminato.
      8. La trascrizione inversa è completa; misurare la concentrazione di cDNA utilizzando uno spettrofotometro.
      9. Diluire il cDNA a 250 ng/μL; conservare il cDNA in un congelatore a -80 °C o -20 °C.
   4. PCR quantitativa (qPCR)
      1. Crea un foglio di calcolo per organizzare la posizione di ogni primer e campione sulla piastra qPCR a 96 pozzetti.
         NOTA: Uno dei primer deve essere un gene di riferimento per normalizzare l'espressione di tutti gli altri geni di interesse, come 36B4.
      2. Crea una miscela master di primer per ogni combinazione "primer + campione". A ciascun pozzetto di reazione qPCR, aggiungere 3 μL di acqua di grado biologico molecolare, 5 μL di miscela madre enzimatica qPCR, 0,5 μL di primer diretto e 0,5 μL di primer inverso, per un totale di 9 μL per reazione. Aggiungere 1 μL di cDNA per reazione per ottenere un totale di 10 μL per pozzetto di reazione.
         NOTA: Lo standard prevede tre repliche tecniche per ogni combinazione "primer + campione", quindi ogni master mix dovrebbe essere 4 volte le quantità di cui sopra.
      3. Aggiungere 1 μL di cDNA per ogni replicato a ciascuna miscela master di primer. Se ogni master mix è 4x, pipettare 4 μL di ciascun cDNA del campione nella propria provetta marcata.
      4. Infine, pipettare 10 μL di ciascuna miscela di reazione nella piastra qPCR a 96 pozzetti nelle posizioni determinate dal foglio di calcolo.
      5. Sigillare la piastra con una sigillante adesiva spessa, quindi centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 450 × g a 20 °C per 2 minuti.
         NOTA: È fondamentale che la piastra sia completamente sigillata per evitare che i campioni evaporino durante il ciclo di termociclo. Utilizzare panni per tessuti leggeri per premere il sigillo sulla piastra, in particolare sui bordi.
      6. Eseguire la piastra in uno strumento PCR in tempo reale. Programmare la reazione PCR secondo le istruzioni del produttore: 2 minuti a 50 °C, seguiti da altri 2 minuti a 95 °C e infine 40 cicli da 15 s a 95 °C e 30 s a 60 °C. I risultati dell'analisi dell'espressione genica qPCR sono mostrati nella Figura 3B.

Results

A differenza dell'iBAT, che si trova nello strato sottocutaneo della schiena tra due scapole, lo scBAT è situato nello strato intermedio del collo, che si estende in profondità tra gli strati del muscolo scheletrico e della ghiandola salivare mentre cresce lungo la vena giugulare esterna (Figura 1A). L'analisi di scBAT non è così semplice come iBAT. Qui, forniamo una procedura dettagliata che include passaggi cruciali per la dissezione di scBAT intatti da topi postnatali e adulti (Figura 1B,C). Dopo aver aperto il collo utilizzando il protocollo fornito, un sottile strato di scBAT può essere identificato con un microscopio da dissezione e staccato dalla ghiandola salivare collegata e dalla vena giugulare esterna con un paio di pinze (Figura 1D,E). Per valutare la morfologia del deposito, scBAT appena isolato è stato processato utilizzando la procedura di trattamento fornita in combinazione con una procedura di colorazione H&E^{precedentemente pubblicata 19} (Figura 2A). Come mostrato nella Figura 2B, scBAT possiede strutture tissutali tipiche dei depositi BAT ed è composto da molti piccoli adipociti multiloculari in topi sani postnatali e adulti. Per valutare i livelli di espressione genica in scBAT, l'RNA è stato estratto da depositi scBAT isolati utilizzando le procedure fornite (Figura 3A). I livelli di espressione dei geni di interesse possono quindi essere valutati con metodi standard di RT-qPCR (Figura 3A). Come mostrato in Figura 3B, i livelli di espressione differenziale dei geni coinvolti nella mediazione della funzione di scBAT, tra cui Pparg, il regolatore principale dello sviluppo di BAT; Fabp4 e Glut4, due trasportatori di nutrienti; e Ucp1 e Ppargc1a, due geni coinvolti nella termogenesi, possono essere facilmente determinati. Per fare un confronto, l'RNA è stato estratto da iBAT isolato e l'espressione dei geni sopra elencati è stata valutata utilizzando anche le procedure fornite (Figura 3A). I livelli di espressione di questi geni sono relativamente simili tra questi due depositi. (Figura 3B).

Figura 1: Localizzazione anatomica dello scBAT e processo di dissezione. (A) Posizione dello scBAT nello strato intermedio del collo. (B) Lo strato superficiale del collo prima e dopo la rimozione della pelle. Barra della scala = 250 μm. Le linee gialle tratteggiate delineano l'area che deve essere esposta dopo aver eseguito l'incisione a forma di U. (C) Immagine di una carcassa di topo posta sotto un microscopio da dissezione per aumentare la chiarezza visiva durante la dissezione. (D,E) Immagini rappresentative dello strato intermedio del collo prima e dopo la rimozione di scBAT da topi di età compresa tra 3 settimane e 3 mesi. Barra della scala = 250 μm. Linee gialle tratteggiate delineano i depositi scBAT bilaterali esposti; n = 2. Abbreviazioni: scBAT = tessuto adiposo bruno sopraclavicolare; SFI = strato superficiale; SG = ghiandola salivare; tr = trachea; jv = vena giugulare esterna; SM = muscolo scheletrico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Elaborazione di scBAT per la colorazione H&E. (A) Diagramma di flusso che illustra le fasi principali dell'elaborazione di scBAT per la colorazione H&E. Dopo aver sezionato il tessuto, viene fissato in sequenza, disidratato, incorporato, sezionato e colorato. (B) Immagini rappresentative di scBAT colorati con H&E da topi di età compresa tra 3 settimane e 3 mesi; n = 3 per ogni stadio di sviluppo; barra graduata = 250 μm per immagini con ingrandimento inferiore; Barra della scala = 50 μm per immagini con ingrandimento maggiore. Abbreviazioni: scBAT = tessuto adiposo bruno sopraclavicolare; PFA = paraformaldeide; H&E = ematossilina ed eosina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Preparazione dell'RNA da scBAT per l'analisi dell'espressione genica. (A) Diagramma di flusso che illustra le fasi dell'isolamento dell'RNA e l'analisi RT-qPCR dell'espressione genica di scBAT. Grazie alle sue dimensioni ridotte e alla sua consistenza morbida, il congelamento istantaneo del deposito scBAT e la sua macinazione in azoto liquido sono fondamentali per il successo dell'isolamento dell'RNA. (B) Espressione relativa di geni marcatori, tra cui Pparg, Fabp4, Glut4, Ucp1 e Ppargc1a, in scBAT e iBAT isolati da topi maschi di 3 mesi, n = 5. I dati sono presentati come media ± SEM. 36B4 è stato utilizzato come gene housekeeping per la normalizzazione. Abbreviazioni: scBAT = tessuto adiposo bruno sopraclavicolare; RT-qPCR = PCR quantitativa a trascrizione inversa; LN₂ = azoto liquido. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

In questo protocollo, presentiamo in dettaglio le procedure per la dissezione e l'elaborazione di scBAT per l'analisi di H&E e di espressione genica. Poiché lo scBAT risiede nello strato intermedio del collo e si trova lungo le grandi vene, l'isolamento di questo deposito richiede una tecnica precisa. In particolare, per ottenere una visione chiara del deposito, si consiglia di posizionare il topo sotto un microscopio da dissezione dopo l'apertura del collo. Utilizzando un paio di pinze a punta superfine per staccare lo scBAT dalla ghiandola salivare e dalle vene circostanti, è necessario prestare attenzione per evitare di perforare le vene. Un sanguinamento eccessivo può rendere più difficile l'individuazione dell'scBAT. Per elaborare scBAT per la colorazione H&E, abbiamo adattato l'uso di un protocollo^{pubblicato 19} con lievi modifiche per includere l'uso di PFA al 4%, alcoli disidratanti e un solvente organico, il toluene, per il trattamento dei tessuti, come mostrato nella sezione del protocollo. L'intera procedura richiede ~ 6 giorni per essere completata e i vetrini colorati con H&E possono essere sottoposti a imaging il giorno successivo al completamento della colorazione.

La RT-qPCR che utilizza l'RNA come materiale di partenza è il metodo più frequentemente utilizzato per l'analisi dell'espressione genica nel campo della biologia del tessuto adiposo. Poiché scBAT è un deposito di BAT relativamente piccolo rispetto a iBAT, ottenere una quantità sufficiente di RNA per l'espressione genica può essere difficile. Per aumentare la resa dell'RNA, si consiglia di applicare le fasi di preparazione del lisato sequenziale come descritto nella sezione del protocollo, iniziando con la polvere del tessuto utilizzando un pestello e un mortaio mentre è congelato. Utilizzando questo metodo di preparazione del lisato, abbiamo ottenuto con successo un campione di RNA ad alta resa e di alta qualità per l'analisi dell'espressione genica di scBAT da un topo adulto. Questo metodo di preparazione del lisato può essere applicato anche per ottenere lisati proteici di alta qualità da scBAT per il western blotting con l'uso di tampone di lisi proteica.

Utilizzando l'iBAT di topo, i ricercatori hanno acquisito conoscenze sostanziali sulla funzione di BAT nella termogenesi e nel metabolismo. La recente identificazione di alcuni depositi di BAT precedentemente non riconosciuti nei topi e negli esseri umani, tra cui scBAT, ha rivelato la necessità di ulteriori studi prima di poter comprendere appieno il contributo fisiologico del BAT nei topi e negli esseri umani adulti. In particolare, sono necessari studi che illuminino le origini, le funzioni e il coinvolgimento di questi depositi di BAT appena scoperti nella termogenesi e nel metabolismo regionale o di tutto il corpo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcool disidratante al 95% (Flex 95)	Epredia	8201
Alcool disidratante al 100% (Flex 100)	Epredia	8101
Piastra PCR a 96 pozzetti	Bio-Rad	MLL9601
Aurum Binding Mini colonna	Bio-Rad	7326826
Aurum High Stringency Wash	Bio-Rad	7326803
Aurum Low Stringency Wash	Stampi base Bio-Rad	7326804
(per inclusione)	Tissue-Tek	4122
BD Precision Glide Ago 21g x 1 1/2"	Becton Dickinson	305167
C1000 Touch Termociclatore	Bio-Rad	1840148
Provette per microcentrifuga senza tappo 2 mL	Fisherbrand	02-681-453
Centrifuga	Eppendorf	5430R
CFX Opus 96 Strumento per PCR in tempo reale	Bio-Rad	12011319
Cloroformio	Thermo Scientific Chemicals	383760010
Cytoseal 60 Mezzo di montaggio a bassa viscosità	Epredia	83104
Acqua trattata con DEPC	Ambion	AM 9906
Microscopio da dissezione	Nikon
Soluzione di diluizione della DNasi	Bio-Rad	7326805
DNasi I	Bio-Rad	7326828
dNTP Soluzione di	Invitrogen	18427013
	Bio-Rad	7326801
EM 400 paraffina media incorporante	Leica Biosystems	3801320
Eosina Y (0,5% p/v)	RICCA	2858-16
Formula R Mezzo di infiltrazione paraffina	Leica Biosystems	3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349	Bio Express	S-3200-2
Gill #3 Hematoxylin	Sigma-Aldrich	GHS332-1L
HCl (per HCL-Etanolo)	Fisher Chemical	A142212
IP VI Cassette di inclusione	Leica Biosystems	39LC-550-5-L
Etanolo puro Koptec - 200 Proof (per il 70% di etanolo)	Decon Labs	V1001
MgCl2 (25 mM)	Thermo Fisher Scientific	R0971
Provette per microcentrifuga 1,7 mL	Avantor	87003-294
Guarnizioni Microseal 'B' (guarnizioni adesive)	Bio-Rad	MSB1001
Microtomo	Leica Biosystems	RM2245
Grado di biologia molecolare	Corning	46-000-CM
Mortaio Coors Tek	Thomas Scientific	60310
NaCl (per soluzione salina allo 0,85%)	Fisher Bioreagents	BP358-212
Spettrofotometro	NanoDrop Tecnologie NanoDrop	ND-1000 UV/Vis
Oligo dT	Invitrogen	18418020
Sezione di paraffina Bagno di galleggiamento	Boekel Scientific	14792V
Paraformaldeide (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148-500G
PCR Tube Strip	Avantor	76318-802
Pestello di Coors Tek	Thomas Scientific	60311
Pestello Motore a pellet	Kimble	749540-0000
Soluzione salina tampone fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Precision Model 19 Forno a vuoto	Thermo Fisher Scientific	CAT# 51221162
Primer: 36B4  (avanti) 10 μ M 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3'			Chen lab Oligo database
Primer: 36B4 (inverso) 10 μ M 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (avanti) 10 μ M 5' ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (inverso) 10 μ M 5' CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (primer in avanti) 10 μ M 5' CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (inverso) 10 μ M 5' GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3'			Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (avanti) 10 μ M 5' AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3'			Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (riserva) 10 μ M 5' AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a (inverso) 10 μ M 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a(avanti) 10 μ M 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (avanti) 10 μ M 5' AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (inverso) 10 μ M 5' ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3'			Chen lab Oligo database
di isolamento dell'RNA (PureZol)	Bio-Rad	7326880
RNase Away (decontaminante superficiale)	Thermo Scientific	1437535
RNasi H	NEB	M0297S
Inibitore della RNasi (RNase Out)	Invitrogen	10777019
Fiala di scintillazione (vetro)	Microscopia elettronica Sciences	72632
Banco di asciugatura vetrini	Elettrotermico (Cole-Parmer)	MH6616
Rack di colorazione in acciaio inox	Microscopia elettronica Scienze	70312-54
Stereomicroscopio (per inclusione)	Olympus	SZ51
Forbici sugiche	McKesson	43-1-104
Pinza da dissezione diritta a punta superfine	Avantor	82027-402
Superfrost Plus Vetrini per microscopio	Fisher Scientific	12-550-15
trascrittasi inversa in apice III (include 5 tamponi del primo filamento e 0,1 M DTT)	Siringa Invitrogen	18080044
SUR-VET con ago 25 G x 5/8", 1 mL	Terumo	100281
SYBR Green (miscela master enzimatica qPCR)	Applied Biosystems	A25778
Tissue-Tek Manual Dyling Coloring Set (barattoli)	Scienze della microscopia elettronica	SKU: 62540-01
Toluene	Fisher Chemical	T324-1
Pipetta di trasferimento	Avantor	414004-005
Xilene	Fisher Chemical	X3P-1GAL