Articolo metodologico

Emostasi della ferita da puntura e preparazione di campioni per l'analisi al microscopio elettronico ad ampia area montata

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DOI:

10.3791/66479

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24 maggio 2024

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1Department of Physiology and Cell Biology, University of Arkansas for Medical Sciences

In questo articolo

Sommario

Qui viene presentata una procedura di puntura per la formazione di trombi emostatici. I trombi formati sono grandi e hanno un diametro di centinaia di micron. Pertanto, gli approcci di imaging volumetrico sono appropriati. Suggeriamo la microscopia elettronica a trasmissione ad ampia area montata come approccio ad alta risoluzione disponibile per molti e dettagliamo un protocollo preparativo.

Abstract

L'emostasi, il processo di normale controllo fisiologico del danno vascolare, è fondamentale per la vita umana. Tutti noi subiamo piccoli tagli e ferite da puntura di tanto in tanto. Nell'emostasi, l'aggregazione piastrinica autolimitante porta alla formazione di un trombo strutturato in cui la cessazione del sanguinamento deriva dalla tappatura del foro dall'esterno. La caratterizzazione dettagliata di questa struttura potrebbe portare a distinzioni tra emostasi e trombosi, un caso di eccessiva aggregazione piastrinica che porta alla coagulazione occlusiva. Qui viene presentato un approccio basato sull'imaging alla struttura del trombo della ferita da puntura che si basa sulla capacità della microscopia elettronica a sezione sottile di visualizzare l'interno dei trombi emostatici. Il passaggio più fondamentale in qualsiasi protocollo sperimentale basato sull'imaging è una buona preparazione del campione. Il protocollo fornisce procedure dettagliate per la preparazione di ferite da puntura e trombi ricchi di piastrine nei topi per la successiva microscopia elettronica. Viene fornita una procedura dettagliata per la fissazione in situ del trombo della ferita da puntura in formazione e la sua successiva elaborazione per la colorazione e l'inclusione per la microscopia elettronica. La microscopia elettronica è presentata come la tecnica di imaging finale a causa della sua capacità, se combinata con il sezionamento sequenziale, di visualizzare i dettagli dell'interno del trombo ad alta risoluzione. Come metodo di imaging, la microscopia elettronica fornisce un campionamento imparziale e un output sperimentale che scala da nanometri a millimetri in 2 o 3 dimensioni. Viene citato un software di microscopia elettronica freeware appropriato che supporterà la microscopia elettronica ad ampia area in cui centinaia di fotogrammi possono essere miscelati per fornire immagini su scala nanometrica di intere sezioni trasversali di trombi di ferite da puntura. Pertanto, qualsiasi sottoregione del file immagine può essere facilmente inserita nel contesto dell'intera sezione trasversale.

Introduzione

La formazione di un trombo da puntura che porta alla cessazione dell'emorragia è uno degli eventi più essenziali nella vita1. Eppure, nonostante questa essenzialità, la conoscenza di ciò che accade strutturalmente durante la formazione di trombi, che si tratti di una vena, di un'arteria, di un evento aterosclerotico o di un coagulo occlusivo, è stata limitata dalla risoluzione e dalla profondità dell'imaging. La microscopia ottica convenzionale è limitata in profondità rispetto a un trombo di una ferita da puntura completamente formato, da 200 a 300 μm in Z1, e in livello di risoluzione rispetto alle dimensioni degli organelli piastrinici e alla loro spaziatura, spesso inferiore a 30 nm2. La microscopia ottica a due fotoni può fornire la profondità di imaging necessaria, ma non migliora significativamente la risoluzione. I più recenti progressi nella microscopia ottica, ad esempio le tecniche di super-risoluzione, sono ancora limitati alla risoluzione, in pratica ~20 nm in XY e il doppio in Z, e alla profondità limitata, non più della microscopia ottica convenzionale. Inoltre, la microscopia ottica a super-risoluzione, come gran parte della microscopia ottica di ricerca, si basa sulla microscopia a fluorescenza, una tecnica che è intrinsecamente orientata verso un piccolo insieme di proteine candidate per le quali esistono buoni anticorpi o buoni costrutti marcati3. In conclusione, la microscopia elettronica a scansione convenzionale può, al massimo, visualizzare la superficie del trombo ricco di piastrine in formazione.

Per superare questi limiti tecnici alla caratterizzazione della struttura del trombo, avevamo tre obiettivi. In primo luogo, produrre in modo riproducibile una ferita da puntura definita in una vena o arteria di topo che potrebbe quindi essere prontamente stabilizzata in situ mediante fissazione chimica. In secondo luogo, applicare una procedura preparativa che enfatizzi la conservazione della membrana, un obiettivo coerente con l'obiettivo di definire la posizione delle singole piastrine all'interno del trombo in formazione. In terzo luogo, utilizzare una tecnica di visualizzazione imparziale che, in una singola immagine, potrebbe essere scalata da nanometri a quasi millimetri.

La microscopia elettronica montata su larga area è stata scelta come principale tecnica di visualizzazione finale per un unico importante motivo: nell'imaging al microscopio elettronico, si vede una vasta gamma di caratteristiche all'interno di una cellula che delinea i suoi organelli e le caratteristiche all'interno degli organelli. Piccoli oggetti come i ribosomi possono essere riconosciuti. Questa gamma di caratteristiche è dovuta al fatto che i coloranti di metalli pesanti densi di elettroni, uranile, piombo e osmio, che vengono utilizzati per la microscopia elettronica per produrre contrasto, si legano a un'ampia gamma di molecole. In un'immagine al microscopio elettronico, si vede molto di ciò che c'è, mentre con gli approcci di immunofluorescenza e marcatura delle proteine, si vede solo ciò che si illumina. Ciò significa, ad esempio, i siti antigenici presenti su una data singola specie proteica. Nel caso di una molecola marcata, spesso una proteina, è il sito o i siti in cui si trova quella proteina. Tutte le altre molecole sono scure e non illuminate. Tuttavia, questa scelta della microscopia elettronica è pratica? Un trombo da puntura ha una dimensione di 300 x 500 μm e, con una dimensione dei pixel di 3 nm, si tratta di un'immagine di 100.000 x 167.000 pixel. Una fotocamera per microscopio elettronico di alta qualità ha 4000 x 4000 pixel. Ciò significa che circa 1000 fotogrammi devono essere uniti/fusi per dare un'unica immagine. Questa è una possibilità che è stata presente nella maggior parte dei microscopi elettronici prodotti negli ultimi 15 anni. Il tavolino del microscopio è computerizzato e le immagini possono essere unite insieme con un computer. Questa è la logica che ha portato alle scelte alla base della formulazione del protocollo presentato.

In conclusione, presentiamo di seguito una serie di passaggi che forniscono una ferita riproducibile nella vena o nell'arteria dei topi che poi, seguendo le fasi di fissazione in situ e le successive fasi di inclusione, possono essere visualizzate mediante microscopia elettronica a trasmissione ad ampia area montata su scala nm e nell'immagine cucita visualizzata su scala vicina ai mm, la scala dell'effettiva trombo fisso. Una scalabilità di questo tipo è necessaria per comprendere la formazione di trombi sia come un problema in ematologia/salute che come un sistema di biologia dello sviluppo in cui le piastrine sono il principale tipo di cellula. Questi progressi offrono una delle principali virtù della microscopia elettronica, vale a dire che si vede ciò che c'è, non solo ciò che si illumina. Per un protocollo dettagliato sulla preparazione dei campioni per la microscopia elettronica a scansione frontale a blocchi seriali (SBF-SEM), il lettore è indirizzato a un recente articolo di Joshi et al.4.

Protocollo

Gli esperimenti sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università dell'Arkansas per le scienze mediche. Qui sono stati utilizzati topi C57BL/6 maschi e femmine di età compresa tra 8 e 12 settimane. Questi topi sono giovani adulti con scarso accumulo di grasso. Le stesse procedure sono applicabili ai mutanti dei topi per varie proteine importanti per l'emostasi, come il fattore di von Willebrand o la glicoproteina piastrinica VI (GPVI)5,6. Tutte le attrezzature, gli strumenti chirurgici, i reagenti e gli altri materiali utilizzati sono mostrati nella Figura 1 ed elencati nella Tabella dei materiali.

1. Ferita da puntura della vena giugulare/arteria femorale 1,7

  1. Anestetizzazione del topo
    1. Posiziona il mouse nella camera di induzione e accendi il vaporizzatore di isoflurano su un'impostazione di portata elevata (500 ml/min, 3% di isoflurano). L'isoflurano viene scelto perché ha scarso effetto sul diametro dei vasi sanguigni.
      ATTENZIONE: L'esposizione a lungo termine all'isoflurano può causare effetti negativi sulla salute. L'uso di un vaporizzatore a basso flusso, di bombolette per la cattura dei gas per anestesia e di una buona ventilazione della stanza possono ridurre notevolmente l'esposizione.
    2. Quando il mouse sembra addormentato, pizzica una delle dita dei piedi del mouse per vedere se il mouse reagisce. In tal caso, riposizionare il mouse nella camera di induzione per alcuni minuti e poi riprovare il test di pizzicamento. Se il mouse non reagisce, posizionarlo in posizione supina sulla piastra riscaldante (precedentemente coperta con un foglio di alluminio).
    3. Abbassa il vaporizzatore a una portata bassa (100 ml/min, 1,75% di isoflurano). Posiziona il naso del mouse nell'ono del naso. Estendi ogni arto e fissa con del nastro adesivo dei piccoli pezzi.
    4. Inserire la sonda di temperatura rettale e impostare la temperatura a 37 °C sul termoregolatore. Fissare con nastro adesivo il cavo della sonda di temperatura per evitare che la sonda venga estratta accidentalmente.
  2. Incisione del topo
    1. Usando il tagliaunghie, radere il collo e il torace del topo (per la vena giugulare) o l'interno della gamba destra (per l'arteria femorale). Pulisci i ritagli di pelo con un tampone imbevuto di alcol. Se necessario, ripassare l'area con le tosatrici per rimuovere il pelo rimasto.
    2. Pulisci nuovamente l'area con un tampone imbevuto di alcol fresco per eliminare tutti i ritagli. È molto importante che l'area sia il più pulita possibile. Confermare il piano chirurgico dell'anestesia tramite un pizzico di punta.
    3. Usando le forbici e una pinza smussata, sollevare e tagliare la pelle sopra la vena giugulare destra. Taglia una finestra rotonda nella pelle abbastanza grande da esporre la vena giugulare e parte del tessuto circostante.
  3. Pulizia della vena giugulare (gli stessi principi si applicano all'arteria femorale)
    1. Utilizzando la tecnica della dissezione smussata, spingere delicatamente da parte i linfonodi adiposi e il tessuto connettivo.
      NOTA: In questa fase viene eseguita una pulizia generale intorno al recipiente; Tuttavia, un'attenta e accurata pulizia avverrà al microscopio dopo che la vena giugulare è stata fissata in paraformaldeide per 24 ore.
    2. Riempire una siringa da 20 ml con soluzione fisiologica riscaldata a 37 °C. Caricare la siringa nella pompa di infusione della siringa. Collegare l'ago a farfalla da 27 G e il tubo associato alla siringa.
    3. Impostare la pompa a siringa su una portata di 0,5 ml/min. Il delicato flusso di soluzione salina laverà via il sangue dalla vena/arteria perforata. Posizionare il getto di soluzione salina a pochi mm dal lato del sito di puntura, non direttamente sopra di esso.
  4. Perforazione della vena giugulare/arteria femorale
    1. Avvia il timer. Procurarsi un ago ipodermico da 30 G (diametro nominale 300 μm) per la vena giugulare e un ago ipodermico da 33 G (diametro 200 μm) per l'arteria femorale. L'uso di un ago più piccolo offre solo un tempo di sanguinamento leggermente più lungo per la situazione arteriosa ad alta pressione.
    2. Girare lo smusso rivolto verso l'alto. Posizionare l'ago con un angolo di 25° sopra la vena giugulare/arteria femorale. Prendi nota dell'ora.
    3. Forare rapidamente il recipiente, assicurandosi di perforare solo la parte superiore del recipiente. Fare attenzione a non forare anche il fondo del recipiente. Notare il momento in cui l'emorragia si ferma completamente.
    4. Attendere il tempo appropriato per ottenere la formazione di trombi (Figura 2A) prima di iniziare la fissazione della perfusione (cioè 1, 5, 10 o 20 minuti per ottenere diversi stadi di sviluppo del trombo). Sopprimere l'animale mediante dissanguamento o seguire le linee guida istituzionali locali per l'eutanasia.
  5. Esecuzione della fissazione transcardica della perfusione
    1. Impostare la pompa peristaltica prima dell'inizio dell'intervento. Posizionare due provette coniche da 50 mL in un rack per provette. Riempire una provetta con una soluzione fissativa di paraformaldeide al 4% preparata in soluzione tampone di cacodilato di sodio (cacodilato di sodio 0,2 M, cloruro di sodio 0,15 M a pH 7,4) per studi di puntura giugulare e riempire l'altra provetta con una soluzione tampone di cacodilato di sodio.
      NOTA: Le condizioni qui descritte sono sufficienti per il caso di bassa pressione della giugulare e vengono quindi modificate per il caso di pressione più elevata di un'arteria. Per gli studi sui sistemi ad alta pressione con le arterie, cioè l'arteria femorale, il fissativo paraformaldeide è integrato con glutaraldeide allo 0,1% e la fissazione a goccia esterna è combinata con la fissazione per perfusione.
    2. Posizionare l'estremità di aspirazione del tubo della pompa nel tubo contenente la soluzione tampone. Collegare un ago a farfalla da 27 G con il tubo associato all'estremità di uscita del tubo della pompa e posizionare l'ago in un becher pulito.
    3. Impostare la pompa peristaltica su una portata di 10 mL/min. Accendere la pompa di perfusione.
    4. Quando la soluzione tampone inizia a fluire dall'ago nel becher, spegnere la pompa. Il tubo e l'ago sono ora pronti per la perfusione transcardica.
    5. Esporre la cavità toracica praticando un taglio sulla linea mediana della pelle dalla parte superiore dello sterno fino a pochi millimetri oltre la parte inferiore dello sterno utilizzando forbici da dissezione e pinze smussate. Praticare incisioni trasversali lungo la base della gabbia toracica, partendo dalla linea mediana e tagliando da mediale a laterale su ciascun lato.
    6. Immediatamente prima di iniziare la perfusione transcardiaca, aprire rapidamente la gabbia toracica e riflettere ogni lato per esporre il cuore.
    7. Accendere la pompa peristaltica. Posiziona la punta dell'ago a farfalla 27G alla base del ventricolo sinistro.
    8. Tenendo saldamente l'ago nel ventricolo sinistro, tagliare una fessura nel padiglione auricolare destro usando forbici da dissezione affilate per consentire al sangue e al liquido di perfusione di defluire. Annotare l'ora sul timer.
    9. Perfondere con una soluzione tampone per 3 minuti per espellere il sangue dal sistema circolatorio. Tenendo ancora fermo l'ago nel ventricolo sinistro, spegnere la pompa peristaltica e spostare l'estremità di aspirazione del tubo della pompa peristaltica sul tubo da 50 ml contenente la soluzione fissativa.
    10. Annotare l'ora sul timer. Riaccendere la pompa peristaltica e perfondere con la soluzione fissativa per 7 minuti. Spegnere la pompa peristaltica.
    11. Estrarre l'ago dal ventricolo sinistro e metterlo in un becher di scarto. Posizionare l'estremità di aspirazione del tubo della pompa in un becher di acqua distillata.
    12. Accendere la pompa peristaltica e far fluire circa 20 ml di acqua attraverso il tubo e far uscire l'ago da 27G nel becher di scarico per pulire il tubo. Assicurarsi di far uscire tutta l'acqua dal tubo e dall'ago prima di spegnere la pompa.

2. Raccolta di campioni per microscopia elettronica

  1. Dopo la fissazione per perfusione integrata con un fissativo esterno iniziale di 2 minuti nel caso di ferite da puntura dell'arteria femorale, sezionare attentamente la porzione della vena giugulare/arteria femorale contenente il sito di puntura e il trombo (Figura 2A). Con le forbici affilate, eseguire un taglio diagonale attraverso l'estremità distale del segmento del vaso e praticare un taglio dritto attraverso l'estremità prossimale del segmento del vaso.
    NOTA: Eseguire tagli in questo modo aiuta a orientare il vaso in un secondo momento e a identificare la direzione del flusso sanguigno nel vaso.
  2. Immergere il segmento del vaso in paraformaldeide fresca al 4% a temperatura ambiente in una soluzione tampone di cacodilato di sodio (cacodilato di sodio 0,2 M, cloruro di sodio 0,15 M a pH 7,4) e porre a temperatura ambiente per 1 ora.
  3. Trasferire il tessuto fissato a 4 °C per 24 ore. Il giorno successivo, prendi una piastra di coltura da 35 mm contenente un tappetino in silicone spesso ~5 mm (preparato in anticipo secondo le istruzioni del produttore). Versare una quantità sufficiente di soluzione tampone di cacodilato di sodio nel piatto per immergere il segmento della vena fissa.
  4. Durante l'osservazione al microscopio ottico (ingrandimento ~15x), trasferire con cura il tessuto nel piatto da 35 mm contenente la soluzione tampone e fissare ciascuna estremità del recipiente al tappetino in silicone utilizzando perni per minuzie in acciaio inossidabile e pinze sottili.
  5. Pulire accuratamente la vena giugulare/segmento dell'arteria femorale utilizzando un paio di micro forbici e una pinza molto sottile.
    1. Solo per la vena giugulare: rimuovere uno dei perni e, utilizzando le micro forbici, tagliare longitudinalmente la parete del vaso opposta al sito della puntura/trombo. Aprire delicatamente il recipiente e, utilizzando 4-5 spilli (ciascuno tagliato a metà con tronchesi), fissarlo al tappetino in silicone con il lato intraluminale rivolto verso l'alto.
  6. Aspirare la soluzione tampone, sostituirla rapidamente con una soluzione di paraformaldeide all'1% in soluzione tampone di cacodilato di sodio e posizionare il coperchio sul piatto. Non lasciare che il fazzoletto si asciughi in nessun momento. Tienilo sempre immerso nel liquido.
  7. Conservare il tessuto a 4 °C fino al momento di lavorarlo per la microscopia elettronica (Figura 2B). Processare alcuni campioni di ferita da puntura della vena giugulare/arteria femorale per l'imaging mediante SBF-SEM4 e altri per l'imaging mediante WA-TEM 8,9. I passaggi WA-TEM sono descritti in dettaglio di seguito.
    ATTENZIONE: Eseguire tutti i lavori che coinvolgono formaldeide, ossido di propilene, OsO4 e 2,4,6-Tris(dimetilamminometil)fenolo (DMP-30) in una cappa chimica. Si tratta di sostanze chimiche pericolose. L'esposizione a OsO4 può causare cecità e morte.
    NOTA: Tutti i volumi di risciacquo e colorazione sono almeno 2 volte il volume del campione. La soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x può essere sostituita dal tampone cacodilato di sodio 0,1 M. Durante la procedura di fissaggio, è molto importante non lasciare mai che i campioni si secchino, poiché ciò influenzerebbe in modo significativo l'ultrastruttura. Utilizzare tubi in polipropilene.

3. Preparazione del campione per la microscopia elettronica a trasmissione ad ampio raggio (WA-TEM)

NOTA: Questa fase rappresenta un punto decisionale in cui lo sperimentatore si impegna a prepararsi per il WA-TEM. Questa procedura preparativa non supporta SBF-SEM. Per SBF-SEM volume EM, tutte le colorazioni devono essere eseguite prima dell'inclusione nella plastica. Si prega di consultareil punto 4 per un protocollo di preparazione SBF-SEM.

  1. Lavare il campione di tessuto nella piastra da 35 mm 2 volte con la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) o PBS a temperatura ambiente (RT). Mantenere il campione bloccato, in modo da poter tracciare l'orientamento del campione attraverso queste fasi preparatorie.
  2. Fissare con 0,8 mL di verde malachite 0,05% / 2,5% glutaraldeide / 0,1 M di cacodilato di sodio (pH 6,7 - 7,0) per 20 minuti su ghiaccio.
  3. Rimuovere il fissativo e lavare il campione 4 volte per 5 minuti ciascuno con cacodilato di sodio 0,1 M. Rimuovere il cacodilato di sodio 0,1 M.
  4. Postfix con 0,8 mL di K3Fe(CN)6 allo 0,8% o K4Fe(CN)6 / 1,0% OsO4 K3Fe(CN)6 in cacodilato di sodio 0,1 M. Metti un coperchio sul piatto per tenere fuori la luce (OsO4 è sensibile alla luce). Macchiare per 20 minuti a 1 ora a RT.
  5. Rimuovere l'OsO4 e risciacquare 4 volte per 5 minuti ciascuno con tampone di cacodilato di sodio 0,1 M. Rimuovere il tampone di cacodilato di sodio e colorare con acido tannico all'1% per 20 minuti con ghiaccio.
  6. Rimuovere l'acido tannico e lavare per 5 minuti con tampone di cacodilato di sodio 0,1 M 1 volta e 2 volte per 5 minuti ciascuno con acqua distillata di grado molecolare (DI).
  7. Colorare con acetato di uranile (UA) allo 0,5% per 1 ora RT o durante la notte a 4 °C al buio.
  8. Rimuovere l'acetato di uranile e risciacquare 5 volte per 5 minuti ciascuno con acqua distillata di grado molecolare. Prima dell'ultimo lavaggio e mentre il campione è ancora immerso in acqua deionizzata, tagliare il tappetino in silicone attorno al campione appuntato con una lama di rasoio. Solleva questo piccolo pezzo di tappetino in silicone dalla piastra e inseriscilo in un tubo di polipropilene.
    NOTA: È importante che il campione rimanga appuntato al pezzo di silicone mentre è nel tubo. Il passaggio ai tubi in polipropilene in questa fase è necessario perché l'ossido di propilene utilizzato nelle fasi successive degraderà il polistirene delle lastre da 35 mm.
  9. Dopo aver rimosso l'ultimo tampone, sciacquare brevemente 1 volta con etanolo al 25%. Scartare l'etanolo al 25% e incubare con etanolo al 25% per 3 minuti con ghiaccio.
  10. Rimuovere l'etanolo al 25%. Sciacquare brevemente 1 volta con etanolo al 50%. Scartare l'etanolo al 50% e incubare con etanolo al 50% per 3 minuti con ghiaccio.
  11. Rimuovere l'etanolo al 50% e sciacquare brevemente 1 volta con etanolo al 75%. Scartare l'etanolo al 75% e incubare con etanolo al 75% per 3 minuti con ghiaccio.
  12. Rimuovere l'etanolo al 75% e sciacquare brevemente 1 volta con etanolo al 95%. Scartare l'etanolo al 95% e incubare con etanolo al 95% per 3 minuti con ghiaccio.
  13. Rimuovere l'etanolo al 95% e lavare 3 volte, almeno 10 minuti ogni volta, con etanolo al 100% (200 proof). Rimuovere l'etanolo al 100% e aggiungere l'ossido di propilene (PO). Risciacquare 3 volte almeno 10 minuti ciascuno, con PO.
  14. Preparare la miscela di resina come descritto di seguito.
    1. Riscaldare i componenti della resina a 60 °C per liquefare completamente. Miscelare accuratamente 12,5 mL di Embed-218, 7,5 mL di Araldite 502 e 27,5 mL di DDSA in una provetta da 50 mL a 60 °C. Questa miscela può essere conservata per 6 mesi a 4 °C. Scaldarlo a 60 °C prima dell'uso. Aliquotare la quantità richiesta prima dell'uso.
  15. Incorporare gli esempi come descritto di seguito.
    1. Mettere un'aliquota della miscela di resina in una provetta e aggiungere 20 μL/mL di attivatore DMP-30. Mescolare accuratamente ruotando a 60 °C; Il colore dovrebbe scurirsi.
    2. Diluire questa aliquota di resina attivata del 50% in PO e lasciare che la resina e il PO si mescolino completamente.
    3. Rimuovere l'ultimo risciacquo PO dalla provetta contenente il campione e sostituirla con la miscela di resina/PO al 50%, riempiendo quasi completamente la provetta. Ruotare il campione per una notte a temperatura ambiente.
    4. Il giorno seguente, miscelare una nuova aliquota di resina (1 mL per campione) con 20 μL/mL di DMP-30.
  16. Posizionare il campione in una capsula di polipropilene con un piccolo volume di miscela di resina/PO al 50% dalla provetta del campione sotto un microscopio da dissezione (ingrandimento ~6x) e rimuovere con cautela i perni dal tessuto. Trasferire solo il tessuto in un'altra capsula in polipropilene contenente una piccola quantità di resina al 100% con un attivatore DMP-30.
  17. Riempi uno stampo per inclusione in silicone con la resina al 100% con l'attivatore DMP-30 e posiziona con cura il campione nello stampo. Mettere lo stampo in forno e cuocere a 60 °C per almeno 48 h. Il campione preparato è mostrato nella Figura 2B.
  18. Eseguire l'imaging al microscopio elettronico a trasmissione ad ampio raggio (WA-TEM) come descritto in10,11. Vedere la Figura 3 per una rappresentazione del processo che va da una puntura iniziale a un trombo di 1 minuto reso in 3 dimensioni. L'inclusione di un protocollo dettagliato per l'imaging al microscopio elettronico WA-TEM montato non è inclusa qui e va oltre lo scopo dei presenti protocolli sulla preparazione del campione.
    NOTA: WA-TEM è una capacità sottovalutata della maggior parte dei moderni microscopi elettronici a trasmissione con tavolino computerizzato. Il software shareware che supporta queste funzioni10,11 è disponibile presso il gruppo del Dr. David Mastronarde, Università del Colorado, Boulder (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/, http://bio3d.colorado.edu/imod/.)

Risultati

Quantificazione degli effetti dei farmaci sul tempo di sanguinamento della ferita da puntura
I tempi di sanguinamento della ferita da puntura forniscono un modello fisiologico di un rischio farmacologico che può essere facilmente eseguito nei topi. I risultati che derivano da un esperimento su una ferita da puntura sono predittivi. Qui, mostriamo una curva di sanguinamento dose-risposta di dabigatran. Il dabigatran, un inibitore della trombina, è usato come anticoagulante orale ad azione diretta, un cosiddetto DOAC12. Il modello della ferita da puntura della vena giugulare è stato utilizzato per valutare il rischio inerente a diverse dosi di dabigatran attraverso un potenziale sanguinamento prolungato attraverso la formazione ritardata di trombi nei topi. Un dosaggio variabile di 15, 50 o 150 μg/kg di dabigatran è stato somministrato per via endovenosa (e.v.) 20 minuti prima della puntura della vena giugulare. Mostriamo la media del tempo di sanguinamento a varie concentrazioni di dabigatran (Figura 4). A livello di dose, si osserva un prolungamento significativo del tempo di sanguinamento, p <0,051. Ciò indica un fattore di rischio significativo nell'uso del farmaco nell'uomo. Sperimentalmente, il farmaco a queste dosi ha un effetto significativo sull'ultrastruttura del trombo in formazione.

Valutazione dello stato di attivazione piastrinica in un trombo della ferita da puntura in formazione
L'approccio WA-TEM fornisce sia una panoramica di un'area della ferita su un singolo piano se osservata a un ingrandimento inferiore, sia molti dettagli a un ingrandimento più elevato (Figura 5). I dettagli ottenuti possono essere inseriti direttamente nel contesto della panoramica. Abbiamo utilizzato questo approccio per valutare il reclutamento di piastrine di forma discoidale in un trombo della ferita da puntura in formazione. Le piastrine circolanti sono discoidi, da cui il nome, e contengono una serie completa di granuli secretori. Una domanda chiave è stata come le piastrine circolanti possono essere reclutate nel trombo in crescita senza disturbare le proprietà di flusso libero delle piastrine rimanenti. Il nostro lavoro punta a un'ipotesi di Tether and Activate in cui le piastrine circolanti vengono reclutate nel trombo, una per una, attraverso un processo di legatura come piastrine discoidi contenenti un set completo di organelli2. La prova di ciò proviene dal WA-TEM dei trombi della vena giugulare 1 minuto dopo la puntura. Dopo il sezionamento per ottenere fette di trombo complete dal centro della ferita ancora sanguinante, abbiamo ripreso 500-800 fotogrammi, 4.000 per 4.000 pixel, 3,185 nm di dimensione pixel in una griglia raster XY rettangolare attraverso l'intera dimensione del trombo in sezione trasversale utilizzando un tavolino automatizzato e un microscopio elettronico a trasmissione utilizzando il software SerialEM10. I fotogrammi sono stati poi cuciti insieme utilizzando il software eTomo, parte della suite di programmi IMOD11. Ciò si traduce in una singola immagine di dimensioni variabili, ad esempio 120.000 pixel per 90.000 pixel a schermo intero con zoom basso, 0,02, o a dettagli con zoom più alto, da 0,25 a 1,0 utilizzando il software 3DMOD, anch'esso parte della suite di programmi IMOD (Figura 5). In net, l'analisi guidata dal software ha rilevato che le piastrine discoidali associate al trombo legate perifericamente all'interno del foro di puntura erano distanziate come perline su una corda. A breve distanza all'interno del trombo, la forma discoidale era meno distinta e le piastrine erano più strettamente associate l'una all'altra. All'interno del trombo, le piastrine erano arrotondate, strettamente impacchettate e parzialmente degranulate. Una sequenza di morfologia suggeriva il legame iniziale delle piastrine al trombo attraverso una lunga molecola di legame, probabilmente il fattore di von Willebrand, e che qualsiasi ulteriore fase di attivazione piastrinica fosse limitata all'interno del trombo in formazione. Quindi, il reclutamento piastrinico nel trombo potrebbe avvenire senza disturbare la circolazione del sangue all'interno della vena giugulare.

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Figura 1: Impostazione chirurgica per eseguire un esperimento di trombo della ferita da puntura della vena giugulare/arteria femorale. Le attrezzature chirurgiche (A) e gli strumenti (B) sono disposti con cura per garantire l'efficienza del movimento, poiché il tempismo è fondamentale durante l'esperimento. (C) Dopo la fissazione per perfusione, la parte del vaso contenente il trombo della ferita da puntura viene fissata a un tappetino di silicone in un piatto di coltura da 35 mm durante la visualizzazione al microscopio ottico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Passaggio da un vaso sanguigno a campioni di plastica incorporati che verranno sezionati per WA-TEM o SBF-SEM. (A) Viene mostrata un'arteria femorale con una ferita da puntura e l'accumulo di formazione di trombi extravascolari (cerchio e freccia). (B) Un trombo (cerchio e freccia) è incorporato nella plastica per il sezionamento per WA-TEM con un microtomo per il successivo imaging 2D. (C) Un trombo (cerchio e freccia) è incorporato nella plastica, tagliato per fornire un bastoncino corto, inferiore a 1 mm, per il fissaggio a un perno all'interno di una camera di imaging SBF-SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Ferita da puntura alla formazione di trombi: uno schema del flusso preparativo da una ferita da puntura (A) a una fetta di immagine di un trombo della vena giugulare post-puntura di 1 minuto (B). La parete del vaso è etichettata in blu sulla fetta dell'immagine, i piccoli punti neri vicino alla parete del vaso sono globuli rossi e gli aggregati piastrinici del trombo appaiono come aree grigio scuro. Questa cifra è stata modificata da1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Un esempio di dati, in forma grafica, generati in un esperimento di puntura della vena giugulare. Viene mostrata una curva di sanguinamento dose-risposta di dabigatran. Questa cifra è stata modificata da1. Le medie del tempo di sanguinamento a varie concentrazioni di dabigatran sono mostrate insieme a barre di errore che indicano più o meno la deviazione standard. L'analisi statistica con il test t dello studente ha indicato un valore p di <0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Immagini WA-TEM di una fetta cucita insieme per formare un montaggio. (A) I singoli fotogrammi ad alta risoluzione vengono raccolti e poi uniti insieme allo scopo di collocare le caratteristiche in un contesto più ampio. (B) Ingrandendo, è possibile far emergere dettagli importanti nel contesto (poli: leucocita polimorfonucleato, endotelio, e col: fibre di collagene). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Presentiamo una procedura dettagliata per la produzione di trombi emostatici nelle vene giugulari e nelle arterie femorali, la loro fissazione di perfusione in situ e l'elaborazione del campione per la microscopia elettronica a trasmissione ad ampia area montata. Le procedure complessive sono utili per generare trombi emostatici per l'analisi ultrastrutturale e per confrontare i tempi di sanguinamento in topi sperimentali, ad esempio topi trattati con diversi tipi e dosaggi di farmaci. È anche utile per confrontare i tempi di sanguinamento nei topi wild-type di controllo con i tempi di sanguinamento nei topi knockout (cioè knockout per varie glicoproteine nelle piastrine che interagiscono con i ligandi adesivi) e la successiva microscopia elettronica ad alta risoluzione. Il protocollo può essere facilmente adattato all'analisi in immunofluorescenza come lettura primaria, con la perdita di caratteristiche che rendono la microscopia elettronica una scelta forte. D'altra parte, l'immunofluorescenza è uno strumento primario per localizzare le proteine all'interno di una struttura. Come per qualsiasi protocollo tecnico, ci sono alcuni passaggi che sono più critici di altri e ci sono passaggi all'interno del protocollo che possono essere trattati come punti di scelta importanti per l'analisi successiva.

I passaggi critici, i punti di scelta per l'analisi successiva e le limitazioni sono descritti di seguito. La fase effettiva della puntura dell'ago: la ferita da puntura viene eseguita con un ago da siringa tenuto ad un angolo di 25° rispetto alla vena o all'arteria. Ciò riduce al minimo la possibilità di perforare entrambi i lati della vena o dell'arteria. Un angolo di 90°, d'altra parte, massimizza le possibilità di non raschiare lo strato endoteliale intravascolare o di danneggiare la matrice di collagene extravascolare all'esterno del vaso sanguigno, ma comporta un rischio maggiore di perforare entrambi i lati della vena o dell'arteria. La scelta è quella dell'esperienza, delle mani e della fiducia.

La fissazione primaria qui viene eseguita con paraformaldeide perfusa, una piccola molecola contenente un singolo gruppo aldeidico reattivo. Poiché contiene un singolo gruppo chimicamente reattivo, la paraformaldeide ha poca tendenza a reticolare i componenti cellulari e poca tendenza a distruggere l'antigenicità e quindi, in sintesi, è considerata un fissativo relativamente debole per la glutaraldeide, un fissativo comune per la microscopia elettronica, che contiene due aldeidi reattive e quindi produce molta più reticolazione molecolare13. Si tratta di un passaggio in situ progettato per preservare la struttura. Le fasi di perfusione eliminano i globuli rossi non intrappolati nei trombi dal preparato. Ciò fornisce una preparazione priva della maggior parte dei globuli rossi e rende facile concentrarsi sulle proprietà piastriniche. Abbiamo esplorato l'utilizzo della fissazione in situ con una miscela di glutaraldeide/paraformaldeide applicata extravascolare. Questa procedura è efficace, in particolare in una situazione di flusso/pressione elevata. Tuttavia, fissa i globuli rossi circolanti in posizione. Ciò può complicare la successiva analisi di segmentazione delle micrografie elettroniche per la forma e la composizione degli aggregati piastrinici che formano il trombo della ferita da puntura. L'uso della glutaraldeide complica notevolmente le procedure alternative di immunofluorescenza a causa dell'alto livello di autofluorescenza generato dal fissativo.

Il bloccaggio/allargamento del vaso sanguigno fisso su un cuscinetto di silicone è fondamentale per localizzare il trombo ai fini dell'inclusione. In questa fase, l'orientamento del campione rispetto al flusso sanguigno viene tracciato e noto per le fasi successive. Il foro di puntura e il trombo formato possono essere facilmente localizzati nel vaso sanguigno aperto. Al contrario, il trombo è difficile da trovare nei vasi sanguigni asportati e intatti. Ciò sarebbe particolarmente vero in un campione ricco di globuli rossi circolanti fissi. Essere in grado di tracciare dove si trova l'ago nel pagliaio è fondamentale.

Dopo l'apertura del vaso sanguigno e la fotografia del punto in cui si trova il trombo formato, il foro di puntura, presenta un punto di scelta. Nel protocollo generale, i passaggi successivi presentati sono specifici per la preparazione del campione per WA-TEM. In questa fase, potrebbero essere effettuate altre scelte di protocollo. Da un lato, il campione potrebbe essere processato per la microscopia a immunofluorescenza piuttosto che per la microscopia elettronica. D'altra parte, il campione potrebbe essere processato per la microscopia elettronica a scansione frontale a blocchi seriali (SBF-SEM o un altro approccio di microscopia elettronica volumetrica) invece di WA-TEM. Le fasi di lavorazione per SBF-SEM sono decisamente diverse perché per prepararsi a questa procedura, tutte le fasi di colorazione dei metalli pesanti per la microscopia elettronica devono essere eseguite prima dell'inclusione4.

Le fasi di colorazione dei metalli pesanti in questo protocollo sono progettate per evidenziare le membrane rispetto ai ribosomi e ai cromosomi, complessi biologici ricchi di acido nucleico. Potrebbero essere utilizzati altri protocolli di colorazione con metalli pesanti, ad esempio Storrie e Attardi14 e Liu et al.15.

L'attenzione alle differenze nelle vene e nelle arterie è importante. La pressione più alta dell'arteria rispetto alla vena deve essere compensata16,17. Ad esempio, un ago di diametro inferiore viene utilizzato per produrre la ferita dell'arteria femorale rispetto alla ferita giugulare. Questo compensa la pressione più alta, dando un tempo di cessazione dell'emorragia quasi uguale. Nella procedura di puntura della vena giugulare, si preferisce utilizzare la paraformaldeide come fissativo in condizioni ipertoniche perché la paraformaldeide, come un piccolo fissativo contenente aldeidi singole, agisce rapidamente ma è un fissativo debole che tende a lasciare intatta l'antigenicità. Ciò significa che i protocolli qui descritti possono essere integrati da studi di localizzazione mediati da anticorpi sia alla luce che al microscopio elettronico18,19. Nel caso della ferita da puntura dell'arteria femorale, la glutaraldeide, un fissativo reticolante più forte, viene utilizzata in combinazione con la paraformaldeide in un tampone di cacodilato di sodio 0,1 M, pH 7,4, per stabilizzare e fissare i trombi arteriosi. Questa modifica è necessaria per compensare la pressione sanguigna più alta di un'arteria rispetto a una vena. Nel caso arterioso, la concentrazione di cacodilato di sodio è la metà della concentrazione utilizzata nella soluzione fissativa per i trombi della vena giugulare.

La procedura di elaborazione dei campioni per la microscopia elettronica qui presentata è adattata a WA-TEM e fornisce informazioni sulla microscopia elettronica a volume limitato. WA-TEM produce una serie limitata di immagini ad alta risoluzione, con pixel di 3,185 nm o inferiori, su sezioni trasversali di trombi complete parallele o perpendicolari al flusso1. Una combinazione di coltelli in vetro e diamante viene utilizzata per produrre manualmente una serie di sezioni trasversali stimate al 10%, 25%, 50%, 75% e 90% nel trombo. Per ottenere sezioni d'urto complete del trombo è necessario eseguire l'imaging di centinaia di fotogrammi con una fotocamera di qualità da microscopio elettronico da 4.000 x 4.000 pixel. I telai vengono poi cuciti insieme. Sono necessari quasi 400 - 800 fotogrammi per ottenere un'immagine a sezione trasversale completa. WA-TEM può essere integrato da SBF-SEM. SBF-SEM produce una serie di immagini sequenziali della faccia del blocco mentre viene progressivamente tagliata via a piccoli passi con un coltello diamantato racchiuso nel vuoto della camera di imaging SEM1. Queste immagini possono essere messe insieme per fornire una resa tridimensionale completa del trombo in formazione. Poiché il microtomo si trova all'interno della camera di imaging SEM, tutte le fasi di colorazione per SBF-SEM devono essere eseguite prima dell'inclusione. La combinazione di questi due approcci al microscopio elettronico consente di visualizzare con una risoluzione di ~3 nm o superiore su un numero limitato di sezioni trasversali, WA-TEM, o su tutta la profondità del trombo della ferita da puntura di dimensioni quasi millimetriche, SBF-SEM. La visualizzazione delle immagini WA-TEM unite nel software 3DMOD10 consente una rapida manipolazione tra vari livelli di zoom in modo che anche le viste ad alta risoluzione possano essere collocate nel contesto all'interno della sezione trasversale dell'intera larghezza del trombo.

In conclusione, presentiamo un protocollo collaudato per la produzione di trombi da puntura nei topi, fissandoli in situ e processandoli per la microscopia elettronica in modo tale che il trombo possa essere facilmente localizzato all'interno della vena o dell'arteria e tracciato il suo orientamento rispetto al flusso sanguigno. Vengono presentati vari punti decisionali in modo che l'utente possa fare scelte su come verranno analizzati i campioni. Ci concentriamo sulla preparazione per la microscopia elettronica che evidenzia le membrane rispetto ad altri componenti della cellula. Alla fine, la parte del protocollo che è più generale per altre indagini è l'apprezzamento da parte degli autori che la microscopia elettronica a trasmissione ad ampia area (WA-TEM) è un approccio di montaggio che supporta la conoscenza su scala nanometrica delle cellule, cioè delle piastrine all'interno di una struttura di grandi dimensioni, di dimensioni quasi millimetriche, qui il trombo in formazione. La capacità risultante di collocare i dettagli all'interno del contesto generale è il punto di forza centrale della combinazione delle varie fasi in una procedura completa.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse relativi a questo studio.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano i colleghi dell'Università dell'Arkansas per le Scienze Mediche (Jerry Ware e Sung W. Rhee), dell'Università della Pennsylvania (Tim Stalker e Lawrence Brass), dell'Università del Kentucky (Sidney W. Whiteheart e Smita Joshi) e del National Institute of Bioimaging and Bioengineering del National Institutes of Health (Richard D. Leapman e Maria A. Aronova) dai quali abbiamo imparato molto. Gli autori esprimono apprezzamento all'American Heart Association e al National Heart Lung and Blood Institute del National Institutes of Health (R01 HL119393, R56 HL119393, R01 155519 a BS e sovvenzioni secondarie da NIH sovvenzioni R01 HL146373 e R35 HL150818) per il sostegno finanziario.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione salina normale allo 0,9%MedlineBHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint set di vene del cuoio capellutoMedlineNDA26709
30G x 1/2 EXELint aghi ipodermiciMedlineNDA264372
33G x 1/2 EXELint aghi ipodermici specialiMedlineNDA26393
50 mL provette conicheFisher Scientific06-443-20
Tamponi per la preparazione dell'alcol (70% alcol isopropilico)MedlineMDS090670Z
foglio di alluminioFisher Scientific01-213-100
Piastra riscaldante per animaliPhysitemp InstrumentsHP-1M
Araldite GY 502 Microscopiaelettronica Scienze10900
Axiocam 305 Fotocamera per microscopia a colori R2Microscopia Carl Zeiss426560-9031-000
Siringhe BD Luer-Lok, 20 mLMedlineB-D303310Z
Cloruro di calcioFisher ScientificC79-500
Piastre per colture cellulari 35 mm x 10 mmCorning Inc.
Applicatori con punta in cotoneMedlineMDS202055H
Attivatore DMP-30 Microscopiaelettronica Scienze13600
Anidride dodecenilsuccinica / DDSAMicroscopia elettronica Scienze13700
Pinze per medicazione, 5", curve, seghettate, a punta strettaPinze per6-100
, 5", standard, seghettatoIntegra Miltex6-6
EMBED 812 Resin ElectronMicroscopy Sciences14900
Alcool etilico, anidro 200 proofMicroscopia elettronica Sciences15055
Fisherbrand Rack per tubi a 4 vieFisher Scientific03-448-17
Fisherbrand Timer digitaleFisher Scientific14-649-17
Fisherbrand Pompa per infusione a siringa singolaFisher Scientific7801001
Spugne di garza 2" x 2" - 4 stratiMedlineNON26224H
glutaraldeide (soluzione al 10%)Microscopia elettronica Sciences16120
Anestesia inalante liquida all'isoflurano, 100 mlMedline66794-017-10
Micro-Fine in stile gioielliere Pinze, stile 5FIntegra Miltex17-305Servono 2 paia.
L/S Tubo Pompa, Silicone, L/S 15; 25 ftVWRMFLX96410-15
Acido L-AsparticoFisher ScientificBP374-100
Nitrato di piomboFisher ScientificL-62
Malachite Green 4Microscopia elettronica Sciences18100
Masterflex L/S Easy-Load II Testa pompaVWRMFLX77200-62
Masterflex L/S Azionamento digitale a velocità variabileVWRMFLX07528-10
MSC Xcelite 5" TronchesiFisher Scientific50-191-9855
Tetrossido di osmio 4% Soluzione acquosaMicroscopia elettronica Scienze19150
Paraformaldeide (soluzione 16%)Microscopia elettronica Scienze15710
Regolatoredi temperatura PhysitempPhysitemp InstrumentsTCAT-2LV
Ferrocianuro di potassioSigma-AldrichP-8131
Ossido di propilene, reagente ACSMicroscopia elettronica Sciences20401
Becher in vetro PyrexFisher Scientific02-555-25B
Sonda di temperatura rettale per topiPhysitemp InstrumentsRET-3
Scotch Magic Nastro Invisibile, 3/4 "x 1000"3M Company305289
Tampone Cacodilato di Sodio 0.2M, pH 7.4Microscopia Elettronica Scienze11623
SomnoFlo Vaporizzatore Elettronico a Basso FlussoKent ScientificSF-01
SomnoFlo Starter Kit per TopiKent ScientificSF-MSEKIT
Perni in acciaio inossidabileMinuteen Science Strumenti26002-10
Stereomicroscopio steREO Discovery.V12Carl Zeiss Microscopia495015-9880-010
Sylgard 184 Elastomero siliconicoWorld Precision InstrumentsSYLG184tappetino in silicone
Acido TannicoMicroscopia ElettronicaScienze 21700
Tiocarbobidrazide (TCH)Sigma-Aldrich88535
Scienze della microscopia elettronica dell'acetato di uranile22400
Micro forbici a molla VannasStrumenti di scienza fine15000-08
Pinza per medicazione per occhi Von Graefe, 2,75", curva, seghettataIntegra Miltex18-818Servono 2 paia.
Wagner ForbiciFine Science Tools14068-12
Wahl MiniFigura Animal TrimmerBraintree ScientificCLP-9868
Zen Lite SoftwareCarl Zeiss Microscopy410135-1001-000
430165 medicazione Integra Miltex

Riferimenti

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