Emostasi della ferita da puntura e preparazione di campioni per l'analisi al microscopio elettronico ad ampia area montata

Kelly Ball; Irina Pokrovskaya; Brian Storrie

doi:10.3791/66479

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Articolo metodologico

Emostasi della ferita da puntura e preparazione di campioni per l'analisi al microscopio elettronico ad ampia area montata

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DOI:

10.3791/66479

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24 maggio 2024

Kelly Ball¹ , Irina Pokrovskaya¹ , Brian Storrie¹

¹Department of Physiology and Cell Biology, University of Arkansas for Medical Sciences

In questo articolo

Sommario

Qui viene presentata una procedura di puntura per la formazione di trombi emostatici. I trombi formati sono grandi e hanno un diametro di centinaia di micron. Pertanto, gli approcci di imaging volumetrico sono appropriati. Suggeriamo la microscopia elettronica a trasmissione ad ampia area montata come approccio ad alta risoluzione disponibile per molti e dettagliamo un protocollo preparativo.

Abstract

L'emostasi, il processo di normale controllo fisiologico del danno vascolare, è fondamentale per la vita umana. Tutti noi subiamo piccoli tagli e ferite da puntura di tanto in tanto. Nell'emostasi, l'aggregazione piastrinica autolimitante porta alla formazione di un trombo strutturato in cui la cessazione del sanguinamento deriva dalla tappatura del foro dall'esterno. La caratterizzazione dettagliata di questa struttura potrebbe portare a distinzioni tra emostasi e trombosi, un caso di eccessiva aggregazione piastrinica che porta alla coagulazione occlusiva. Qui viene presentato un approccio basato sull'imaging alla struttura del trombo della ferita da puntura che si basa sulla capacità della microscopia elettronica a sezione sottile di visualizzare l'interno dei trombi emostatici. Il passaggio più fondamentale in qualsiasi protocollo sperimentale basato sull'imaging è una buona preparazione del campione. Il protocollo fornisce procedure dettagliate per la preparazione di ferite da puntura e trombi ricchi di piastrine nei topi per la successiva microscopia elettronica. Viene fornita una procedura dettagliata per la fissazione in situ del trombo della ferita da puntura in formazione e la sua successiva elaborazione per la colorazione e l'inclusione per la microscopia elettronica. La microscopia elettronica è presentata come la tecnica di imaging finale a causa della sua capacità, se combinata con il sezionamento sequenziale, di visualizzare i dettagli dell'interno del trombo ad alta risoluzione. Come metodo di imaging, la microscopia elettronica fornisce un campionamento imparziale e un output sperimentale che scala da nanometri a millimetri in 2 o 3 dimensioni. Viene citato un software di microscopia elettronica freeware appropriato che supporterà la microscopia elettronica ad ampia area in cui centinaia di fotogrammi possono essere miscelati per fornire immagini su scala nanometrica di intere sezioni trasversali di trombi di ferite da puntura. Pertanto, qualsiasi sottoregione del file immagine può essere facilmente inserita nel contesto dell'intera sezione trasversale.

Introduzione

La formazione di un trombo da puntura che porta alla cessazione dell'emorragia è uno degli eventi più essenziali nella vita¹. Eppure, nonostante questa essenzialità, la conoscenza di ciò che accade strutturalmente durante la formazione di trombi, che si tratti di una vena, di un'arteria, di un evento aterosclerotico o di un coagulo occlusivo, è stata limitata dalla risoluzione e dalla profondità dell'imaging. La microscopia ottica convenzionale è limitata in profondità rispetto a un trombo di una ferita da puntura completamente formato, da 200 a 300 μm in Z¹, e in livello di risoluzione ....