Articolo metodologico

Modellazione di microambienti vaginali sani e disbiotici in una vagina umana su chip

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DOI:

10.3791/66486

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16 febbraio 2024

 ,  ,  , 
1Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 2Vascular Biology Program and Department of Surgery, Boston Children's Hospital and Harvard Medical School, 3Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive un protocollo per la creazione di un dispositivo di coltura vagina-on-a-chip microfluidico (Vagina Chip) che consente lo studio delle interazioni dell'ospite umano con un microbioma vaginale vivente in condizioni microaerofile. Questo chip può essere utilizzato come strumento per studiare le malattie vaginali e per sviluppare e testare potenziali contromisure terapeutiche.

Abstract

La salute delle donne, e in particolare le malattie del tratto riproduttivo femminile (FRT), non hanno ricevuto l'attenzione che meritano, anche se un sistema riproduttivo malsano può portare a malattie potenzialmente letali, infertilità o esiti avversi durante la gravidanza. Un ostacolo nel campo è che c'è stata una carenza di modelli sperimentali preclinici che imitano fedelmente la fisiologia e la fisiopatologia dell'FRT. Gli attuali modelli in vitro e animali non ricapitolano completamente i cambiamenti ormonali, le condizioni microaerobiche e le interazioni con il microbioma vaginale. L'avvento della tecnologia di coltura microfluidica Organ-on-a-Chip (Organ Chip) in grado di imitare le interfacce tessuto-tessuto, la perfusione vascolare, i flussi di fluidi interstiziali e il microambiente fisico di una delle principali subunità di organi umani può potenzialmente servire come soluzione a questo problema. Recentemente, è stato sviluppato un chip vaginale umano che supporta la co-coltura di consorzi microbici vaginali umani con epitelio vaginale umano primario che è anche interfacciato con lo stroma vaginale e sperimenta un flusso fluido dinamico. Questo chip replica le risposte fisiologiche della vagina umana a microbiomi sani e disbiotici. In questo articolo è stato descritto un protocollo dettagliato per la creazione di chip vaginali umani.

Introduzione

Un microbioma vaginale dominato da Lactobacillus spp. che aiuta a mantenere un microambiente acido svolge un ruolo importante nel mantenimento della salute riproduttiva femminile1. Tuttavia, a volte può esserci un cambiamento nella composizione delle comunità microbiche che compongono il microbioma, che si traduce in un aumento della diversità dei batteri vaginali. Questi cambiamenti disbiotici, che spesso si traducono in un passaggio da uno stato dominato da Lactobacillus a uno dominato da specie batteriche anaerobi più diverse (ad esempio, Gardnerella vaginalis), sono associati a varie malattie del sistema riproduttivo, come vaginosi batterica, vaginite atrofica, infezione del tratto urinario, candidosi vulvovaginale, uretrite e corioamnionite 2,3,4,5 . Queste malattie, a loro volta, aumentano le possibilità di una donna di contrarre malattie sessualmente trasmissibili e malattie infiammatorie pelviche 6,7,8,9. Rappresentano anche un rischio maggiore di parto pretermine e aborti spontanei nelle donne in gravidanza 10,11,12 e sono stati anche implicati nell'infertilità 13,14,15,16.

Sebbene siano stati compiuti sforzi per modellare la disbiosi vaginale utilizzando cellule epiteliali vaginali coltivate in sistemi di coltura statici e bidimensionali (2D)17,18, non imitano efficacemente la fisiologia e la complessità del microambiente vaginale19. Modelli animali sono stati utilizzati anche per studiare la disbiosi vaginale; tuttavia, le loro fasi mestruali e le interazioni ospite-microbioma differiscono notevolmente da quelle nell'uomo e, quindi, la rilevanza fisiologica dei risultati di questi studi rimane poco chiara 19,20,21. Per contrastare questi problemi, organoidi e modelli di inserto Transwell di tessuto vaginale umano sono stati utilizzati anche per studiare le interazioni ospite-patogeno nell'FRT 19,22,23,24. Ma poiché si tratta di colture statiche, possono supportare la co-coltura di cellule umane con microbi viventi solo per un breve periodo di tempo (<16-24 ore) e mancano di molte altre caratteristiche fisiche potenzialmente importanti del microambiente vaginale umano, come la produzione di muco e il flusso di fluidi22.

Gli Organ Chip sono sistemi di coltura microfluidica tridimensionali (3D) che contengono uno o più microcanali cavi paralleli rivestiti da cellule viventi coltivate sotto flusso di fluido dinamico. I chip a due canali consentono la ricreazione di interfacce tessuto-tessuto a livello di organo coltivando diversi tipi di cellule (ad esempio, epitelio e fibroblasti stromali o epitelio ed endotelio vascolare) sui lati opposti di una membrana porosa che separa i due canali paralleli (Figura 1). Entrambi i tessuti possono essere esposti in modo indipendente al flusso di fluidi e possono anche sperimentare condizioni microaerobiche per consentire la co-coltura con un microbioma complesso 25,26,27,28. Questo approccio è stato recentemente sfruttato per sviluppare un chip vaginale umano rivestito da epitelio vaginale primario sensibile agli ormoni interfacciato con fibroblasti stromali sottostanti, che sostiene una bassa concentrazione fisiologica di ossigeno nel lume epiteliale e consente la co-coltura con microbiomi sani e disbiotici per almeno 3 giorni in vitro29. È stato dimostrato che il Vagina Chip potrebbe essere utilizzato per studiare la colonizzazione da parte di consorzi ottimali (sani) di L. crispatus e rilevare infiammazioni e lesioni causate da consorzi contenenti G. vaginalis non ottimali (non sani). Qui descriviamo in dettaglio i metodi utilizzati per creare il Vagina Chip umano e per stabilire comunità batteriche sane e disbiotiche sul chip.

Protocollo

Questa ricerca è stata condotta in conformità con le linee guida istituzionali per l'uso delle cellule umane. Le cellule sono state ottenute commercialmente (vedi Tabella dei materiali). Tutte le fasi devono essere eseguite in modo asettico in una cappa di biosicurezza (BSC). Utilizzare solo puntali per pipette con filtro (o barriera) per questo protocollo.

1. Coltura di cellule epiteliali vaginali umane

  1. Riscaldare 50 ml di terreno epiteliale vaginale (VEM, vedere Tabella dei materiali) a 37 °C.
  2. Aliquotare 9 mL di VEM in una provetta da 15 mL. Quindi, scongelare una fiala di cellule epiteliali vaginali umane (HVEC) e aggiungerla alla provetta contenente VEM.
  3. Centrifugare la provetta da 15 mL a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) e aspirare il surnatante, lasciando il pellet.
  4. Risospendere delicatamente il pellet in 2 mL di VEM e aggiungere 1 mL a ciascuno dei due matracci T75 contenenti 14 mL di VEM.
  5. Incubare i matracci a 37 °C con CO 2 al 5%. Cambiare VEM ogni 2 giorni fino a quando gli HVEC non sono confluenti per circa il 70% (circa 5 giorni).

2. Coltura di cellule di fibroblasti uterini umani

  1. Preparare 10 mL di soluzione di poli-L-lisina (PLL) da 15 μg/mL in acqua distillata doppia (ddH2O). Aggiungere 5 mL di soluzione PLL a ciascuno dei due matracci T75 e incubare a 37 °C per 1 ora.
  2. Riscaldare 50 mL di terreno fibroblastico (FM, vedere Tabella dei materiali) a 37 °C.
  3. Aspirare la soluzione PLL e lavare ogni matraccio con 5 mL di ddH2O.
  4. Aliquotare 9 mL di FM in una provetta da 15 mL e scongelare una fiala di fibroblasti uterini umani (HUF).
  5. Aggiungere gli HUF alla provetta da 15 mL contenente FM.
  6. Centrifugare la provetta da 15 mL a 300 x g per 5 minuti a RT e aspirare il surnatante, lasciando il pellet cellulare.
  7. Risospendere delicatamente il pellet in 2 mL di FM e aggiungere 1 mL a ciascuno dei due matracci T75 contenenti 14 mL di FM.
  8. Incubare i matracci a 37 °C con CO2 al 5% fino a quando le cellule sono confluenti per circa il 70%, cambiando il terreno ogni 2 giorni.

3. Attivazione del truciolo e rivestimento del canale

  1. Degasare i trucioli (ottenuti in commercio, vedi Tabella dei materiali) per 30 minuti in un essiccatore sottovuoto.
  2. Lasciare che il reagente di attivazione 1 (AR-1) e il reagente di attivazione 2 (AR-2) (vedere la tabella dei materiali) si equilibrino a RT per 15 minuti senza rimuovere la confezione.
  3. Avvolgere una provetta conica da 15 ml in un foglio per proteggerla dalla luce. Aggiungere lentamente 1 mL di soluzione AR-2 alle pareti del flaconcino di AR-1 e mescolare bene. Trasferire il composto nella provetta da 15 ml avvolta nella pellicola.
  4. Aggiungere ripetutamente la soluzione di AR-2 al flaconcino di AR-1 con incrementi di 1 mL fino a quando la polvere di AR-1 non è completamente lavata via dal flaconcino.
  5. Rabboccare la soluzione ricostituita AR-1 a 10 mL con la soluzione AR-2.
  6. Aggiungere 200 μl di questa soluzione all'ingresso del canale apicale di ciascun chip durante l'aspirazione dall'uscita (Figura 1A). Ripetere per il canale basale. Tenere la pipetta perpendicolare al chip mentre si aggiunge la soluzione per mantenere una tenuta ermetica con un flusso senza ostacoli.
  7. Ripeti il passaggio 3.6 per tutte le fiches.
  8. Controlla che tutte le patatine non presentino bolle. Rimuovere eventuali bolle aggiungendo altra soluzione ai canali interessati.
  9. Aspirare tutta la soluzione AR-1 in eccesso dalla superficie del truciolo evitando gli ingressi e le uscite dei canali.
  10. Mettere le patatine in una capsula di Petri da 150 mm e inserire questa capsula scoperta in una scatola di luce UV.
  11. Rivolgi la scatola della luce UV sul retro del BSC e lascia i chip sotto la luce UV costante per 30 minuti. Il colore della soluzione nelle patatine cambierà dal rosa scuro al mogano.
  12. Lavare ogni canale aggiungendo 200 μl di soluzione AR-2 all'ingresso e contemporaneamente aspirare dall'uscita.
  13. Lavare ogni canale due volte aggiungendo 200 μl di DPBS freddo (-/-) all'ingresso aspirando contemporaneamente dall'uscita.
  14. Preparare il rivestimento del canale apicale (miscela di collagene I da 200 μg/mL e da 30 μg/mL di collagene IV in DMEM) (vedere la tabella dei materiali). Mantieni il ghiaccio.
  15. Preparare il rivestimento del canale basale (15 μg/mL di PLL e 200 μg/mL di miscela di collagene I in DMEM). Mantieni il ghiaccio.
  16. Aggiungere 200 μl di rivestimento del canale basale all'ingresso del canale basale. Collegare la presa con una punta P200 quando la soluzione di rivestimento appare alla presa. Erogare la soluzione fino a quando i volumi del puntale in ingresso e in uscita sono uguali, quindi rilasciare il puntale della pipetta dalla pipetta, lasciando il puntale nell'ingresso.
  17. Allo stesso modo, aggiungere 200 μL di rivestimento del canale apicale al canale apicale.
  18. Aspirare la soluzione in eccesso dalla superficie del truciolo.
  19. Controlla che tutte le patatine non presentino bolle. Rimuovere eventuali bolle aggiungendo altro rivestimento del canale ai canali interessati.
  20. Incubare le patatine per una notte in una piastra di Petri da 150 mm a 37 °C con il 5% di CO2.

4. Canale basale del chip di semina con HUF

  1. Osserva quotidianamente la crescita degli HUF nel pallone al microscopio.
  2. Una volta che le colture HUF sono confluenti al 70%-90% (~3 giorni dopo la piastra), riscaldare 25 mL di FM, 5 mL di DPBS libero da Ca2+/Mg2+ (DPBS (-/-), 10 mL di tripsina/EDTA e 15 mL di soluzione neutralizzante della tripsina (TNS, vedere la Tabella dei materiali) a 37 °C.
  3. Aspirare il terreno dai palloni Lavare con 5 ml di DPBS (-/-), quindi aspirare nuovamente.
  4. Aggiungere 4 mL di tripsina-EDTA a ciascun matraccio e incubare a 37 °C per 3-5 minuti fino a quando le cellule non si staccano.
  5. Aggiungere 6 mL di TNS a ciascun matraccio e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL.
  6. Mescolare bene la sospensione con una pipetta e prelevare un'aliquota di 10 μl per la conta cellulare. Miscelare 10 μL di sospensione cellulare con 10 μL di blu di tripano e contare utilizzando un emocitometro.
  7. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti a RT. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in FM caldo fino a una concentrazione finale di 7,5 x 105 cellule/mL.
  8. Lavare il canale basale con 200 μL di FM.
  9. Riscaldare 15 mL di VEM a 37 °C. Lavare il canale apicale con 200 μL di VEM.
  10. Aggiungere 200 μl di VEM completo all'ingresso del canale apicale tappando l'uscita con un puntale per pipetta. Erogare il terreno fino a quando i volumi dei puntali in ingresso e in uscita non sono uguali, quindi rilasciare il puntale della pipetta dalla pipetta, lasciando il puntale nell'ingresso. Tenere il canale superiore pieno e tappato sia all'ingresso che all'uscita.
  11. Pipettare lentamente 50 μL di sospensione cellulare HUF nell'ingresso del canale basale aspirando contemporaneamente dall'uscita. Rimuovere il puntale della pipetta dall'ingresso quando ~2 μl della sospensione cellulare rimangono nel puntale della pipetta senza premere o rilasciare lo stantuffo della pipetta per evitare la formazione di bolle. Tappare l'ingresso e l'uscita con i puntali delle pipette.
  12. Verificare la presenza di bolle al microscopio. Se sono presenti, lavare il canale basale con FM e ripetere il passaggio 4.11.
  13. Capovolgere i chip tappati su un rack per provette da 15 mL e incubare a 37 °C con CO2 al 5% per 1 ora. Osservare i chip dopo l'incubazione e verificare l'attaccamento delle cellule.
  14. Tappare l'uscita del canale basale con un puntale per pipetta. Aggiungere 200 μl di FM all'ingresso del canale basale senza spingere verso il basso lo stantuffo della pipetta. Rilasciare il puntale dalla pipetta e lasciare che il fluido fluisca liberamente attraverso il canale fino al puntale della pipetta di uscita mediante flusso gravitazionale.
  15. Incubare le chips con semi di HUF per una notte a 37 °C con il 5% di CO2.

5. Canale apicale del chip di semina con cellule epiteliali vaginali

  1. Riscaldare 50 mL di VEM a 37 °C.
  2. Preparare il rivestimento del canale apicale (200 μg/mL di collagene I in DMEM). Mantieni il ghiaccio.
  3. Collegare l'uscita del canale apicale con una punta per pipetta.
  4. Aggiungere 200 μl di rivestimento del canale apicale all'ingresso del canale apicale. Erogare la soluzione di rivestimento apicale fino a quando i volumi del puntale in ingresso e in uscita non sono uguali, quindi rilasciare il puntale della pipetta dalla pipetta, lasciando il puntale nell'ingresso.
  5. Aspirare la soluzione in eccesso dalla superficie del truciolo.
  6. Incubare i trucioli a 37 °C con il 5% di CO2 per 1 ora.
  7. Dopo 1 ora, lavare il rivestimento del canale apicale aggiungendo 200 μL di VEM all'ingresso del canale apicale durante l'aspirazione dall'uscita.
  8. Controllare la crescita HVEC al microscopio per una confluenza del ~70%-90%.
  9. Se le cellule sono confluenti al 70%-90%, riscaldare 6 mL di terreno epiteliale vaginale completo e 4 mL di tripsina/EDTA per pallone, a 37 °C.
  10. Aspirare il terreno dal pallone HVEC e lavare con 5 ml di DPBS (-/-), quindi aspirare.
  11. Aggiungere 4 mL di tripsina in ciascun matraccio e incubare a 37 °C con CO2 al 5% per 3-5 minuti fino al distacco delle cellule.
  12. Aggiungere 6 mL di VEM al pallone per inattivare la tripsina e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL.
  13. Mescolare bene la sospensione con una pipetta e prelevare un'aliquota di 10 μl per la conta cellulare. Miscelare 10 μL di sospensione cellulare con 10 μL di blu di tripano e contare utilizzando un emocitometro.
  14. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti a RT. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in VEM fino a una concentrazione finale di 3,5-4 milioni di cellule/mL.
  15. Riscaldare 25 mL di FM a 37 °C.
  16. Collegare l'uscita del canale apicale con una punta per pipetta. Pipettare lentamente almeno 40 μL di sospensione cellulare HVEC nell'ingresso del canale apicale. Erogare la sospensione cellulare fino a quando i volumi del puntale in ingresso e in uscita non sono uguali, quindi rilasciare il puntale della pipetta dalla pipetta, lasciando il puntale nell'ingresso. Tenere il canale basale pieno di FM e collegato sia all'ingresso che all'uscita.
  17. Aspirare con cura il terreno in eccesso sulla superficie dei trucioli e verificare la presenza di bolle al microscopio. Se sono presenti, ripetere il passaggio 5.16.
  18. Mettere le patatine in una grande capsula di Petri e incubare a 37 °C con il 5% di CO2 per una notte.
  19. Il giorno successivo, osserva i chip al microscopio per l'attacco cellulare.
  20. Rimuovere i puntali della pipetta dagli ingressi e dalle uscite dei canali apicali e basali.
  21. Collegare l'uscita del canale basale con un puntale per pipetta e aggiungere 200 μl di FM all'ingresso del canale basale senza spingere verso il basso lo stantuffo della pipetta. Rilasciare il puntale della pipetta dalla pipetta e lasciare che il fluido fluisca liberamente attraverso il canale fino al puntale della pipetta di uscita mediante flusso gravitazionale.
  22. Ripetere il passaggio 5.21 per il canale apicale utilizzando VEM.
  23. Incubare i trucioli a doppia semina a 37 °C con il 5% di CO2 per 24 ore.

6. Collegamento di chip a pod e differenziazione delle cellule epiteliali vaginali

  1. Aliquotare 50 mL di FM e VEM per separare le provette coniche da 50 mL e riscaldarle a 37 °C.
  2. Degasare i fluidi FM e VEM riscaldati a 37 °C sotto vuoto sterile per 5 minuti.
  3. Disinfettare e pulire i vassoi per il Dynamic Flow Module (DFM, vedere Tabella dei materiali). Togliere le cialde dalla confezione e metterle nelle vaschette.
  4. Aggiungere 2 ml di VEM degassato al serbatoio di ingresso apicale (serbatoio in alto a destra; Figura 1B). Aggiungere del terreno lungo le pareti del serbatoio per evitare la formazione di bolle.
  5. Aggiungere 3 mL di FM degassato al serbatoio di ingresso basale (serbatoio in alto a sinistra, Figura 1B). Aggiungere del terreno lungo le pareti del serbatoio per evitare la formazione di bolle.
  6. Aggiungere 500 μl di VEM degassato al serbatoio di uscita apicale (serbatoio in basso a destra, Figura 1B). Inclinare il pod in modo che il fluido copra l'intera superficie inferiore del serbatoio.
  7. Aggiungere 500 μl di FM degassato al serbatoio di uscita basale (serbatoio in basso a sinistra, Figura 1B). Inclinare il pod in modo che il fluido copra l'intera superficie inferiore del serbatoio.
  8. Far scorrere i vassoi contenenti le cialde in DFM ed eseguire il ciclo Prime due volte. Verificare la presenza di goccioline che fuoriescono dalle porte sul lato inferiore di ciascun pod.
  9. Se non si forma una gocciolina dopo 4 cicli di "Prime", entrare in contatto diretto con la porta all'interno del serbatoio di uscita della capsula (Figura 1B) e pipettare 200 μL del rispettivo fluido per consentire al fluido di fluire tra il serbatoio e il canale. Questo si chiama "adescamento manuale".
  10. Rimuovere i puntali delle pipette dai chip e posizionare una goccia del rispettivo terreno su tutte le porte per ciascun chip.
  11. Far scorrere le patatine nei baccelli e posizionarli sui vassoi.
  12. Aspirare qualsiasi supporto sulla superficie dei chip e far scorrere ogni vassoio in un DFM.
  13. Impostare i seguenti parametri sul DFM come: Superiore e Inferiore - Liquido; Flusso apicale (canale superiore) - 15 μL/h; Flusso basale (canale inferiore) - 30 μL/h; Allungamento = 0%; Frequenza = 0 Hz.
  14. Eseguire il ciclo di regolazione sul DFM e consentire il flusso durante la notte.
  15. Dopo 24 ore, modificare le impostazioni di flusso a 0 μL/h per il canale apicale e mantenere il canale basale a una portata di 30 μL/h per altre 24 ore.
  16. Preparare 500 ml di terreno di differenziazione (SS) aggiungendo 4 mM di L-glutammina, 20 mM di idrocortisone, 1x ITES, 20 nM di triiodotironina, 100 μM di O-fosforil etanolammina, 180 μM di adenina, 3,2 mM di cloruro di calcio, 2% di FBS inattivato termicamente, 1% di Pen-strep e 120 mL di terreno F-12 di Ham a DMEM a basso contenuto di glucosio (vedere Tabella dei materiali) e sterilizzare con filtro.
  17. Riscaldare 50 mL di SS a 37 °C.
  18. Aggiungere 20 μL di estradiolo 10 μM (vedere Tabella dei materiali) ai 50 mL di SS, mescolare bene e degassare sotto vuoto sterile per 5 minuti.
  19. Riscaldare 50 mL di VEM a 37 °C a bagnomaria e degassare sotto vuoto sterile per 5 minuti.
  20. Rimuovere i vassoi dal DFM, posizionarli in un BSC e aspirare i fluidi dai pod, evitando le porte nei serbatoi (Figura 1A). Quindi, aggiungere 2 mL di VEM al serbatoio di ingresso del canale apicale e 3 mL di DM al serbatoio di ingresso del canale basale.
  21. Riportare i vassoi al DFM e impostare il flusso del canale apicale a 15 μL/h e il flusso del canale basale a 30 μL/h.
  22. Lasciare scorrere il DFM per 4-7 ore. Quindi, arrestare il flusso del canale apicale impostandolo a 0 μL/h. Lasciare che il flusso del canale basale continui a 30 μL/h.
  23. Cambiare il supporto seguendo i passaggi 6.16-6.19 ogni 48 ore.
  24. Flusso intermittente nel canale apicale per 4-7 ore al giorno per altri 5 giorni seguendo i passaggi 6.20-6.21.
  25. Preparare la soluzione salina bilanciata di Hanks a bassa capacità tampone con terreno di glucosio (HBSS (LB/+G)) aggiungendo 1.26 mM di cloruro di calcio, 0.49 mM di cloruro di magnesio esaidrato, 0.406 mM di solfato di magnesio, 5.33 mM di cloruro di potassio, 137.93 mM di cloruro di sodio, 0.441 mM di fosfato di potassio monobasico e 5.55 mM di D-glucosio a dd H2O (vedi Tabella dei materiali); pH 4,8.
  26. Preparare 500 ml di DM senza streptococco aggiungendo 4 mM di L-glutammina, 20 mM di idrocortisone, 1x ITES, 20 nM di triiodotironina, 100 μM di O-fosforil etanolammina, 180 μM di adenina, 3,2 mM di cloruro di calcio, 2% di FBS inattivato termicamente e 120 ml di terreno F-12 di Ham a DMEM a basso contenuto di glucosio e sterilizzare con filtro.
  27. Il giorno 6, sostituire il terreno del canale apicale con (HBSS (LB/+G)) e il terreno del canale basale con DM privo di Pen-Streptococco seguendo i passaggi 6.16-6.19.
  28. Impostare il flusso sul DFM a 15 μL/h per il canale apicale e 30 μL/h per il canale basale per 24 h prima di procedere con l'inoculo batterico.

7. Inoculo batterico di trucioli differenziati

NOTA: Eseguire i seguenti passaggi in un laboratorio e in un BSC conformi alle normative per la manipolazione dei microbi.

  1. Calcolare le CFU/mL di ciascun ceppo batterico da includere nell'inoculo. Miscelare la quantità necessaria di ciascun ceppo batterico per un totale di ~5 x 106 CFU/mL.
  2. Centrifugare la miscela a 7.000 x g per 7 minuti a 4 °C e rimuovere con cautela il surnatante. Risospendere il pellet in (HBSS (LB/+G)). Questo sarà l'inoculo batterico.
  3. Staccare le patatine dai baccelli. Tappare l'uscita del canale basale con un puntale per pipetta e aggiungere 200 μl di DM privo di Streptococco con penna all'ingresso del canale basale senza spingere verso il basso lo stantuffo della pipetta. Rilasciare il puntale della pipetta dalla pipetta e lasciare che il fluido fluisca liberamente attraverso il canale fino all'uscita mediante flusso gravitazionale.
  4. Aggiungere 37 μl di inoculo batterico all'ingresso del canale apicale, aspirando dall'uscita. Quando rimangono circa 2 μl nel puntale della pipetta, estrarre il puntale e tappare l'ingresso e l'uscita del canale apicale con i puntali della pipetta.
  5. Per i chip di controllo (non inoculati), ripetere il passaggio 7.4 con 37 μL di (HBSS (LB/+G)).
  6. Aspirare qualsiasi supporto sulla superficie del chip. Mettere i trucioli in una capsula di Petri da 150 mm e incubare a 37 °C con CO2 al 5% per 24 ore.
  7. Posizionare le cialde (senza trucioli) sui vassoi e metterle nell'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO2 per 24 ore.
  8. Riscaldare 50 mL di (HBSS (LB/+G)) e 50 mL di DM privo di Strep a 37 °C.
  9. Aggiungere 20 μL di estradiolo 10 μM ai 50 mL di DM senza Streptococco penna, mescolare bene e degassare sotto vuoto sterile per 5 minuti. Degasare il (HBSS (LB/+G)) sotto vuoto per 5 min.
  10. Aspirare con cautela il fluido nelle cialde evitando le porte di ingresso e uscita del serbatoio.
  11. Aggiungere 3 ml di degasato (HBSS (LB/+G)) al serbatoio della capsula di ingresso apicale e 500 μl di degasato (HBSS (LB/+G)) al serbatoio della capsula di uscita apicale.
  12. Aggiungere 3 mL di DM degassato privo di Pen-Streptococco al serbatoio del pod di ingresso basale e 500 μL di DM degassato privo di antibiotici al serbatoio del pod di uscita basale.
  13. Far scorrere i vassoi con le cialde (senza le patatine) nel DFM ed eseguire due volte il ciclo Prime. Verificare la presenza di goccioline che fuoriescono da ciascuna porta sul lato inferiore del pod.
    NOTA: Se non si forma una gocciolina dopo 4 cicli di "Prime", entrare in contatto diretto con la porta all'interno del serbatoio di uscita della capsula (Figura 1B) e pipettare 200 μL del rispettivo fluido per consentire al fluido di fluire tra il serbatoio e il canale.
  14. Rimuovere i puntali delle pipette dai chip e posizionare una goccia dei rispettivi supporti su tutti gli ingressi e le uscite dei canali.
  15. Far scorrere le patatine nei baccelli e posizionarli nei vassoi.
  16. Aspirare il fluido nei serbatoi delle capsule di uscita apicale e basale e qualsiasi mezzo sulla superficie dei trucioli. Quindi, far scorrere i vassoi nel DFM.
  17. Impostare i seguenti parametri sul DFM: Superiore e Inferiore - Liquido; Flusso apicale (superiore) - 40 μL/h; Flusso basale (inferiore) - 40 μL/h; Allungamento - 0%; Frequenza - 0 Hz. Eseguire il ciclo Regola.
  18. Interrompere il flusso dopo 4 ore e raccogliere l'effluente, cioè il fluido nei serbatoi di uscita apicale e basale.
  19. Misurare e registrare i volumi degli effluenti.
  20. Riposizionare i trucioli nel DFM e impostare la portata apicale a 0 μL/h e il flusso basale a 30 μL/h. Avviare il flusso in modo che venga eseguito durante la notte.
  21. Aliquotare l'effluente raccolto per vari saggi pianificati e conservarli a temperature adeguate.
    NOTA: Per la misurazione delle UFC, aggiungere glicerolo a una concentrazione finale del 16% e conservare immediatamente a -80 °C.
  22. Aspirare il fluido solo nei serbatoi di uscita basali e impostare le portate apicali e basali a 40 μL/h nel DFM. Avviare il flusso per 4 ore e ripetere i passaggi 7.18-7.21. Questa sarà la raccolta degli effluenti per 48 ore.
  23. Ripetere il passaggio 7.22 per 72 ore o fino alla fine dell'esperimento.
  24. Al termine dell'esperimento, raccogliere gli effluenti seguendo i passaggi 7.18-7.19.
  25. Preparare la soluzione digestiva aggiungendo 1 mg/mL di collagenasi IV in TrypLE express. Scaldare 10 mL di soluzione digestiva a 37 °C.
  26. Collegare la porta di uscita del canale basale con un puntale per pipetta. Aggiungere 100 μl di soluzione di digestione al canale basale. Mescolare bene e, utilizzando una pipetta, raccogliere tutta la soluzione dal canale in una provetta etichettata come "Provetta B".
  27. Collegare la porta di uscita del canale apicale con un puntale per pipetta. Aggiungere 100 μl di soluzione digestiva al canale apicale. Mescolare bene e, utilizzando una pipetta, raccogliere tutta la soluzione dal canale in una provetta etichettata come "Provetta A".
  28. Aggiungere altri 100 μl di soluzione digestiva agli ingressi del canale apicale e basale mentre si tappano le uscite con i puntali delle pipette. Incubare i trucioli e le provette A e B a 37 °C per 1-1,5 ore.
  29. Mescolare bene il contenuto della digestione all'interno dei canali utilizzando i puntali tappati già posizionati negli ingressi e nelle uscite. Raccogliere il contenuto dei canali apicali e basali rispettivamente nei tubi A e B. Questi sono i digeriti apicali e basali del chip.
  30. Contare le cellule nella provetta A utilizzando un emocitometro. Inoltre, rimuovere un'aliquota dai digest del chip per la misurazione delle UFC seguendo il punto 7.21.

8. Analisi degli effluenti di trucioli e dei digestati

  1. Per il conteggio dei batteri dagli effluenti e dai digestati, diluire in serie gli effluenti o i digestati in DPBS sterile (-/-) e dissodare su una piastra di terreno adatta, incubare a 37 °C per 24-48 ore e contare le colonie sulla piastra.
  2. Per la misurazione del pH, prelevare 10 μl dell'effluente di 72 ore immediatamente dopo la raccolta e utilizzare una striscia di pH per misurare il pH dell'effluente.
  3. Per l'analisi delle citochine, utilizzare gli effluenti per rilevare citochine specifiche utilizzando il saggio basato su Luminex, ELISA o qualsiasi altra tecnica applicabile29,30.

Risultati

La vagina umana è rivestita da un epitelio stratificato che si sovrappone a uno stroma di collagene ricco di fibroblasti. Per modellare questo, è stata creata un'interfaccia tissutale coltivando epitelio vaginale umano primario e fibroblasti sui lati opposti di una membrana porosa comune all'interno di un dispositivo Organ Chip microfluidico a due canali. La formazione dell'epitelio vaginale viene monitorata mediante imaging microscopico in campo chiaro, che rivela la formazione di un foglio continuo di cellule che forma progressivamente più strati cellulari (Figura 2A). Rapporti precedenti hanno confermato che questa morfologia è correlata allo sviluppo di un epitelio completamente stratificato se osservato nella sezione trasversale29. Tuttavia, se lo strato epiteliale appare irregolare e discontinuo (Figura 2B), il chip vaginale potrebbe non essere adatto per l'uso negli esperimenti.

La Figura 3 mostra una rappresentazione schematica della generazione del chip vaginale. Per convalidare la funzionalità del Vagina Chip, i chip sono stati inoculati con L. crispatus e G. vaginalis per modellare rispettivamente ambienti vaginali sani e disbiotici. G. vaginalis è il batterio principalmente coinvolto nella vaginosi batterica. Per verificare se batteri sani e disbiotici si innestano sui chip vaginali, la carica batterica è stata quantificata nei chip vaginali inoculati con le diverse popolazioni batteriche placcando gli effluenti dei canali e gli strati cellulari digeriti su terreni di crescita batterici selettivi (agar De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) per L. crispatus e agar sanguigno Brucella (BBA) per G. vaginalis) (vedi Tabella dei materiali) e confrontandoli con colture simili utilizzando l'inoculo originale. Colonie di L. crispatus e G. vaginalis sono state rilevate entro 48 ore dalla placcatura (Figura 2C), confermando che sia i batteri sani che quelli disbiotici si sono innestati nei chip vaginali. Tuttavia, se si osservano colonie batteriche sulle piastre contenenti gli inoculi ma non si osservano sulle piastre contenenti l'effluente o il digestato dopo l'incubazione richiesta, si può concludere che i batteri non si sono innecchiati.

Un ambiente vaginale sano è acido e la disbiosi provoca un aumento del pH vaginale31. Pertanto è stato analizzato anche il pH dell'effluente del canale epiteliale apicale del Vagina Chip. Il pH dei chip vaginali inoculati con L. crispatus era simile a quello dei chip di controllo non inoculati e, quando co-coltivati con G. vaginalis , hanno sperimentato un aumento significativo del pH (Figura 2D). Se si osserva che il pH di un chip vaginale non infetto è alto, indica che c'è un problema e questi chip non devono essere utilizzati per esperimenti.

Lo stato infiammatorio del tessuto vaginale è anche sensibile alla composizione del microbioma vaginale, con un microbioma disbiotico che stimola l'infiammazione. Dopo l'analisi delle citochine pro-infiammatorie nel canale apicale del Vagina Chip 3 giorni dopo l'inoculazione con L. crispatus o G. vaginalis, la risposta pro-infiammatoria è risultata essere più alta con G. vaginalis rispetto alle patatine non infette e alle patatine inoculate con L. crispatus (Figura 2E). Nel loro insieme, questi risultati mostrano che il Vagina Chip imita da vicino il microambiente vaginale umano sia in stato sano che disbiotico.

figure-results-1
Figura 1: Un chip a due canali e il suo pod. (A) Immagine di un chip PDMS a due canali che ne illustra i canali e le porte. (B) Immagine di un baccello raffigurante i serbatoi e le porte per i canali apicali e basali. (C) Diagramma schematico che mostra la vista in sezione trasversale di un chip vaginale infetto da microbi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Il chip vaginale imita i microambienti vaginali umani sani e disbiotici. (A) Cellule epiteliali vaginali nel canale apicale di un robusto chip vaginale. La barra della scala rappresenta 1 mm del chip nell'immagine in alto e 500 μm nell'immagine in basso. (B) Cellule epiteliali vaginali nel canale apicale di un chip vaginale inadeguato. La barra della scala rappresenta 1 mm del chip nell'immagine in alto e 500 μm nell'immagine in basso. (C) attecchimento di L. crispatus (LC) e G. vaginalis (GV) nel chip vaginale. (D) pH delle patatine vaginali dopo 72 ore di incubazione con L. crispatus (LC) e G. vaginalis (GV) rispetto alle patatine vaginali non infette (di controllo). (E) Risposta pro-infiammatoria dei chip vaginali a L. crispatus (LC) e G. vaginalis (GV) dopo 72 ore di incubazione, rispetto ai chip vaginali non infetti (controllo). (C-E) I grafici raffigurano la media ± SD per 4-6 chip; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 rispetto alle patatine vaginali di controllo; Ciascuno (●) rappresenta i dati di 1 chip. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Rappresentazione schematica del protocollo per la generazione del Vagina Chip. Rappresentazione schematica delle fasi coinvolte nella semina delle cellule e nella generazione del Vagina Chip. HVEC - Cellule epiteliali vaginali umane; HUFs - Fibroblasti uterini umani; VEM - Mezzo epiteliale vaginale; FM - Terreno di coltura fibroblastico; DM - Mezzo di differenziazione; PS - Penicillina Streptomicina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

I modelli in vitro della vagina umana del passato non replicano fedelmente le strutture del tessuto vaginale, il flusso di fluidi e le interazioni ospite-patogeno19,22. I modelli animali sono anche limitati dalla variazione interspecie del microbioma e dalle differenze nel ciclo estrale o mestruale19,22. Questo manoscritto descrive un protocollo per creare un modello di Organ Chip della vagina umana in grado di imitare efficacemente le risposte umane a comunità microbiche sane e disbiotiche.

Questo protocollo prevede la semina di cellule epiteliali e fibroblastiche vaginali su lati opposti di una membrana porosa condivisa che separa i microcanali paralleli in un dispositivo Organ Chip a due canali disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali). La membrana porosa consente la migrazione di fattori di crescita e altre forme di comunicazione intercellulare. Tuttavia, il rivestimento di collagene e la presenza dei monostrati cellulari impediscono la miscelazione dei terreni tra i canali. Alla formazione di un monostrato di cellule epiteliali vaginali nel canale apicale, i fattori di differenziazione vengono introdotti nel mezzo che scorre nel canale basale, che passa attraverso lo spazio interstiziale e quindi promuove la differenziazione delle cellule epiteliali vaginali per formare un epitelio stratificato. La densità delle cellule epiteliali vaginali al momento della semina è un determinante cruciale per la salute del Vagina Chip alla fine della fase di differenziazione. Pertanto, la densità delle cellule epiteliali vaginali dovrebbe essere valutata prima di iniziare la differenziazione, che non dovrebbe essere iniziata fino a quando non viene stabilito un monostrato. L'esposizione ai fattori di differenziazione può essere continuata fino a ottenere la densità desiderata delle cellule epiteliali vaginali e prima dell'inoculazione batterica. Inoltre, va notato che il tasso di crescita può variare per le cellule epiteliali vaginali primarie di diversi donatori (o fonti commerciali), il che potrebbe influire sulla qualità del Vagina Chip generato. In tutti gli studi microfluidici sui chip d'organo, è della massima importanza rimuovere eventuali bolle che potrebbero formarsi nei canali in tutta la coltura del chip, poiché interferiscono con il flusso del terreno e alla fine si tradurranno in una ridotta disponibilità di nutrienti e in una perdita di vitalità cellulare.

Questo protocollo descrive anche come utilizzare il Vagina Chip per stabilire comunità batteriche sul chip che imitano lo stato vaginale sano o la vaginosi batterica. Il Vagina Chip può anche essere utilizzato per studiare altre malattie o disturbi vaginali; tuttavia, è necessario prestare attenzione a comprendere le caratteristiche di ciascuna malattia e i mezzi migliori per correlare i risultati con i risultati clinici durante l'esecuzione di questi studi. In sintesi, il Vagina Chip umano apre nuove strade per studiare una pletora di malattie e condizioni legate all'FRT e può essere uno strumento prezioso per indagare su potenziali terapie.

Dichiarazioni

Donald Ingber è fondatore, membro del consiglio di amministrazione, presidente del comitato consultivo scientifico e azionista di Emulate. Gli altri autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata sponsorizzata da finanziamenti della Bill and Melinda Gates Foundation (INV-035977) e del Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering dell'Università di Harvard. Ringraziamo anche Gwenn E. Merry, Wyss Institute, per aver curato questo manoscritto. Il diagramma nella Figura 1 è stato creato con BioRender.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,22 & micro; m SteriflipMilliporo SCGP00525Per degassare i mezzi
Chip a 2 canaliEmulaBRK-S1-WER-24Parte del kit Chip a due canali
200 & mu; Punte barriera a L (o punte filtrante)Thomas Scientific, SHARP1159M40Consigli usati per la semina delle pattigelle
Reagente di Attivazione 1 (o polvere ER-1) EmulaKit di ricerca di base Chip S1-24PKParte del kit Chip a due canali; Temperatura di conservazione -20 ° C   
Reagente di Attivazione 2 (o soluzione ER-2) EmulaKit di ricerca di base Chip S1-24PKParte del kit Chip a due canali; Temperatura di conservazione 4 e gradi; C
AdeninaSigma Aldrich & nbsp;A2786Componente dei media di differenziazione
Piastre di agar di sangue di BrucellaVWR International Inc. 89405-032con Hemin e vitamina K; Per l'enumerazione di Gardnerella vaginalis
DPBS libero Ca2+ e Mg2+ (DPBS (-/-)ScienCell303Per lavare celle
Cloruro di calcioSigma Aldrich & nbsp;C5670Componente dei media di differenziazione
Cloruro di calcio (anidrico) Sigma Aldrich & nbsp;499609Componente dell'HBSS (LB/+G)
Collagene I Corning354236Per la soluzione di rivestimento per HVEC
Collagene IV e nbsp;Sigma Aldrich & nbsp;C7521Per la soluzione di rivestimento per HVEC
Collagenasi IVGibco17104019Per la dissociazione delle cellule dai Vagina Chips
Mezzo completo per fibroblasti  ScienCell2301Media per la cultura della HUF
Mezzo epiteliale vaginale completoLinea di vitaLL-0068Media per la cultura dell'HVEC
D-Glucosio (destrosio) Sigma Aldrich & nbsp;158968Componente dell'HBSS (LB/+G)
DMEM (Low Glucosio) Thermofisher12320-032Componente dei media di differenziazione
Modulo di Flusso Dinamico (o Zoë)EmulaZoë-CM1Regola la portata dei chip
Ham F12Thermofisher11765-054Componente dei media di differenziazione
FBS inattivato dal calore Thermofisher 10438018Componente dei media di differenziazione
Fibroblasti uterini umaniScienCell7040HUF
Cellule epiteliali vaginali umaneLinea di vitaFC-0083HVEC
IdrocortisoneSigma Aldrich & nbsp;H0396Componente dei media di differenziazione
ITESLonza17-839ZComponente dei media di differenziazione
L-glutaminaThermofisher25030081Componente dei media di differenziazione
Cloruro di magnesio esaidratoSigma Aldrich & nbsp;M2393Componente dell'HBSS (LB/+G)
Solfato di magnesio eptaidratoSigma Aldrich & nbsp;M1880Componente dell'HBSS (LB/+G)
Piastre agar MRSVWR International Inc. 89407-214Per l'enumerazione di Lactobacillus
O-fosforiletanolamminasticaSigma Aldrich & nbsp;P0503Componente dei media di differenziazione
Pen/StreptococcoThermofisher 15070063Componente dei media di differenziazione
Strisce pHFischer-Scientific13-640-520Per la misurazione del pH 
Capsule (1/chip) e nbsp;EmulaBRK-S1-WER-24Parte del kit Chip a due canali
Poli-L-lisinaScienCell403Per la soluzione di rivestimento per HUF
Cloruro di potassio Sigma Aldrich & nbsp;P3911Componente dell'HBSS (LB/+G)
Monobasico fosfato di potassioSigma Aldrich & nbsp;P0662Componente dell'HBSS (LB/+G)
Sterile 80% glicerolo  MP Biomedicals 113055034Per congelare campioni batterici
TriiodotironinaSigma Aldrich & nbsp;  T6397Componente dei media di differenziazione
Soluzione Trippan Blue (0,4%) Sigma Aldrich & nbsp;T8154Per contare cellule vive e morte
TrypLE ExpressThermofisher 12605010Per la dissociazione delle cellule dai Vagina Chips
Soluzione neutralizzante della tripsina (TNS) e nbsp;ScienCell113Per la neutralizzazione della tripsina
Solutiom di tripsina/EDTA (0,25%)ScienCell103Per dissociazione cellulare  
β-estradiol Sigma Aldrich & nbsp;E2257Ormone per i mezzi di differenziazione

Riferimenti

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