Questo articolo descrive un protocollo per la creazione di un dispositivo di coltura vagina-on-a-chip microfluidico (Vagina Chip) che consente lo studio delle interazioni dell'ospite umano con un microbioma vaginale vivente in condizioni microaerofile. Questo chip può essere utilizzato come strumento per studiare le malattie vaginali e per sviluppare e testare potenziali contromisure terapeutiche.
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Articolo metodologico
Modellazione di microambienti vaginali sani e disbiotici in una vagina umana su chip
In questo articolo
Sommario
Abstract
La salute delle donne, e in particolare le malattie del tratto riproduttivo femminile (FRT), non hanno ricevuto l'attenzione che meritano, anche se un sistema riproduttivo malsano può portare a malattie potenzialmente letali, infertilità o esiti avversi durante la gravidanza. Un ostacolo nel campo è che c'è stata una carenza di modelli sperimentali preclinici che imitano fedelmente la fisiologia e la fisiopatologia dell'FRT. Gli attuali modelli in vitro e animali non ricapitolano completamente i cambiamenti ormonali, le condizioni microaerobiche e le interazioni con il microbioma vaginale. L'avvento della tecnologia di coltura microfluidica Organ-on-a-Chip (Organ Chip) in grado di imitare le interfacce tessuto-tessuto, la perfusione vascolare, i flussi di fluidi interstiziali e il microambiente fisico di una delle principali subunità di organi umani può potenzialmente servire come soluzione a questo problema. Recentemente, è stato sviluppato un chip vaginale umano che supporta la co-coltura di consorzi microbici vaginali umani con epitelio vaginale umano primario che è anche interfacciato con lo stroma vaginale e sperimenta un flusso fluido dinamico. Questo chip replica le risposte fisiologiche della vagina umana a microbiomi sani e disbiotici. In questo articolo è stato descritto un protocollo dettagliato per la creazione di chip vaginali umani.
Introduzione
Un microbioma vaginale dominato da Lactobacillus spp. che aiuta a mantenere un microambiente acido svolge un ruolo importante nel mantenimento della salute riproduttiva femminile1. Tuttavia, a volte può esserci un cambiamento nella composizione delle comunità microbiche che compongono il microbioma, che si traduce in un aumento della diversità dei batteri vaginali. Questi cambiamenti disbiotici, che spesso si traducono in un passaggio da uno stato dominato da Lactobacillus a uno dominato da specie batteriche anaerobi più diverse (ad esempio, Gardnerella vaginalis), sono associati a varie malattie del sistema riprodutt....
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Protocollo
Questa ricerca è stata condotta in conformità con le linee guida istituzionali per l'uso delle cellule umane. Le cellule sono state ottenute commercialmente (vedi Tabella dei materiali). Tutte le fasi devono essere eseguite in modo asettico in una cappa di biosicurezza (BSC). Utilizzare solo puntali per pipette con filtro (o barriera) per questo protocollo.
1. Coltura di cellule epiteliali vaginali umane
- Riscaldare 50 ml di terreno epiteliale vaginale (VEM, vedere Tabella dei materiali) a 37 °C.
- Aliquotare 9 mL di VEM in una provetta da 15 mL. Quindi, scongelare una fial....
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Risultati
La vagina umana è rivestita da un epitelio stratificato che si sovrappone a uno stroma di collagene ricco di fibroblasti. Per modellare questo, è stata creata un'interfaccia tissutale coltivando epitelio vaginale umano primario e fibroblasti sui lati opposti di una membrana porosa comune all'interno di un dispositivo Organ Chip microfluidico a due canali. La formazione dell'epitelio vaginale viene monitorata mediante imaging microscopico in campo chiaro, che rivela la formazione di un foglio continuo di cellule che forma.......
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Discussione
I modelli in vitro della vagina umana del passato non replicano fedelmente le strutture del tessuto vaginale, il flusso di fluidi e le interazioni ospite-patogeno19,22. I modelli animali sono anche limitati dalla variazione interspecie del microbioma e dalle differenze nel ciclo estrale o mestruale19,22. Questo manoscritto descrive un protocollo per creare un modello di Organ Chip della vagina um.......
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Dichiarazioni
Donald Ingber è fondatore, membro del consiglio di amministrazione, presidente del comitato consultivo scientifico e azionista di Emulate. Gli altri autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sponsorizzata da finanziamenti della Bill and Melinda Gates Foundation (INV-035977) e del Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering dell'Università di Harvard. Ringraziamo anche Gwenn E. Merry, Wyss Institute, per aver curato questo manoscritto. Il diagramma nella Figura 1 è stato creato con BioRender.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,22 & micro; m Steriflip | Milliporo | SCGP00525 | Per degassare i mezzi |
| Chip a 2 canali | Emula | BRK-S1-WER-24 | Parte del kit Chip a due canali |
| 200 & mu; Punte barriera a L (o punte filtrante) | Thomas Scientific, SHARP | 1159M40 | Consigli usati per la semina delle pattigelle |
| Reagente di Attivazione 1 (o polvere ER-1) | Emula | Kit di ricerca di base Chip S1-24PK | Parte del kit Chip a due canali; Temperatura di conservazione -20 ° C |
| Reagente di Attivazione 2 (o soluzione ER-2) | Emula | Kit di ricerca di base Chip S1-24PK | Parte del kit Chip a due canali; Temperatura di conservazione 4 e gradi; C |
| Adenina | Sigma Aldrich & nbsp; | A2786 | Componente dei media di differenziazione |
| Piastre di agar di sangue di Brucella | VWR International Inc. | 89405-032 | con Hemin e vitamina K; Per l'enumerazione di Gardnerella vaginalis |
| DPBS libero Ca2+ e Mg2+ (DPBS (-/-) | ScienCell | 303 | Per lavare celle |
| Cloruro di calcio | Sigma Aldrich & nbsp; | C5670 | Componente dei media di differenziazione |
| Cloruro di calcio (anidrico) | Sigma Aldrich & nbsp; | 499609 | Componente dell'HBSS (LB/+G) |
| Collagene I | Corning | 354236 | Per la soluzione di rivestimento per HVEC |
| Collagene IV e nbsp; | Sigma Aldrich & nbsp; | C7521 | Per la soluzione di rivestimento per HVEC |
| Collagenasi IV | Gibco | 17104019 | Per la dissociazione delle cellule dai Vagina Chips |
| Mezzo completo per fibroblasti | ScienCell | 2301 | Media per la cultura della HUF |
| Mezzo epiteliale vaginale completo | Linea di vita | LL-0068 | Media per la cultura dell'HVEC |
| D-Glucosio (destrosio) | Sigma Aldrich & nbsp; | 158968 | Componente dell'HBSS (LB/+G) |
| DMEM (Low Glucosio) | Thermofisher | 12320-032 | Componente dei media di differenziazione |
| Modulo di Flusso Dinamico (o Zoë) | Emula | Zoë-CM1 | Regola la portata dei chip |
| Ham F12 | Thermofisher | 11765-054 | Componente dei media di differenziazione |
| FBS inattivato dal calore | Thermofisher | 10438018 | Componente dei media di differenziazione |
| Fibroblasti uterini umani | ScienCell | 7040 | HUF |
| Cellule epiteliali vaginali umane | Linea di vita | FC-0083 | HVEC |
| Idrocortisone | Sigma Aldrich & nbsp; | H0396 | Componente dei media di differenziazione |
| ITES | Lonza | 17-839Z | Componente dei media di differenziazione |
| L-glutamina | Thermofisher | 25030081 | Componente dei media di differenziazione |
| Cloruro di magnesio esaidrato | Sigma Aldrich & nbsp; | M2393 | Componente dell'HBSS (LB/+G) |
| Solfato di magnesio eptaidrato | Sigma Aldrich & nbsp; | M1880 | Componente dell'HBSS (LB/+G) |
| Piastre agar MRS | VWR International Inc. | 89407-214 | Per l'enumerazione di Lactobacillus |
| O-fosforiletanolamminastica | Sigma Aldrich & nbsp; | P0503 | Componente dei media di differenziazione |
| Pen/Streptococco | Thermofisher | 15070063 | Componente dei media di differenziazione |
| Strisce pH | Fischer-Scientific | 13-640-520 | Per la misurazione del pH |
| Capsule (1/chip) e nbsp; | Emula | BRK-S1-WER-24 | Parte del kit Chip a due canali |
| Poli-L-lisina | ScienCell | 403 | Per la soluzione di rivestimento per HUF |
| Cloruro di potassio | Sigma Aldrich & nbsp; | P3911 | Componente dell'HBSS (LB/+G) |
| Monobasico fosfato di potassio | Sigma Aldrich & nbsp; | P0662 | Componente dell'HBSS (LB/+G) |
| Sterile 80% glicerolo | MP Biomedicals | 113055034 | Per congelare campioni batterici |
| Triiodotironina | Sigma Aldrich & nbsp; | T6397 | Componente dei media di differenziazione |
| Soluzione Trippan Blue (0,4%) | Sigma Aldrich & nbsp; | T8154 | Per contare cellule vive e morte |
| TrypLE Express | Thermofisher | 12605010 | Per la dissociazione delle cellule dai Vagina Chips |
| Soluzione neutralizzante della tripsina (TNS) e nbsp; | ScienCell | 113 | Per la neutralizzazione della tripsina |
| Solutiom di tripsina/EDTA (0,25%) | ScienCell | 103 | Per dissociazione cellulare |
| β-estradiol | Sigma Aldrich & nbsp; | E2257 | Ormone per i mezzi di differenziazione |
Riferimenti
- Smith, S. B., Ravel, J. The vaginal microbiota, host defence and reproductive physiology. J Physiol. 595 (2), 451-463 (2017).
- Van De Wijgert, J., Jespers, V. The global health impact of vaginal dysbiosis. Res Microbiol. 168 (9-10), 859-864 (2017).
- Ralph, S. G., Rutherf....
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Ristampe e permessi
