Il presente protocollo descrive il metodo per stabilire un modello murino di xenotrapianto derivato da paziente (PDX) utilizzando tessuto di osteosarcoma umano.
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Articolo metodologico
Istituzione di un modello murino di xenotrapianto derivato da paziente con tessuti di osteosarcoma umano
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'osteosarcoma è il tumore osseo maligno primario più comune nei bambini e negli adolescenti. Nonostante lo sviluppo di nuovi piani di trattamento negli ultimi anni, la prognosi per i pazienti con osteosarcoma non è migliorata in modo significativo. Pertanto, è fondamentale stabilire un modello preclinico robusto con un'elevata fedeltà. Il modello di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) preserva fedelmente le caratteristiche genetiche, epigenetiche ed eterogenee delle neoplasie maligne umane per ciascun paziente. Di conseguenza, i modelli PDX sono considerati autentici modelli in vivo per lo studio di vari tumori negli studi di trasformazione. Questo articolo presenta un protocollo completo per la creazione e il mantenimento di un modello murino PDX che rispecchia accuratamente le caratteristiche morfologiche dell'osteosarcoma umano. Ciò comporta il trapianto immediato di tessuto di osteosarcoma umano appena resecato in topi immunocompromessi, seguito da un successivo passaggio. Il modello descritto funge da piattaforma per studiare la crescita, la resistenza ai farmaci, la recidiva e le metastasi dell'osteosarcoma. Inoltre, aiuta a selezionare le terapie target e a stabilire schemi di trattamento personalizzati.
Introduzione
L'osteosarcoma è un tumore maligno osseo primario derivato dalle cellule del lobo interosseo ed è più comune negli adolescenti e nei bambini. Si verifica spesso nell'epifisi della diafisi lunga ed è caratterizzata da elevata malignità, metastasi precoci e prognosi infausta 1,2. Le metastasi polmonari sono la principale causa di morte nei pazienti con osteosarcoma. Il tasso di sopravvivenza a 5 anni dei pazienti con osteosarcoma non metastatico è del 65%-70%3. Tuttavia, negli ultimi 40 anni, il tasso di sopravvivenza a 5 anni (solo il 20%) dei pazienti con osteosarcoma metastatico non è migliorato in modo significativo e il 25% dei pazienti con osteosarcoma presenta metastasi al momento della diagnosi4. Attualmente, i farmaci di prima linea per il trattamento dell'osteosarcoma hanno raggiunto un consenso, ma ci sono ancora differenze significative nel regime chemioterapico e nel tempo di trattamento5. È importante eseguire esperimenti preclinici basati su modelli animali appropriati per ottenere regimi chemioterapici più efficaci.
Attualmente, i modelli comunemente utilizzati per gli esperimenti preclinici sull'osteosarcoma includono colture cellulari in vitro basate su linee cellulari e xenotrapianti derivati da cellule in vivo (CDX), nonché xenotrapianti derivati da pazienti (PDX)6,7.
Le linee cellulari sono utili per la coltura e per l'uso in studi in vitro , o per il trapianto in topi immunodeficienti per stabilire modelli CDX8. Tuttavia, le linee cellulari coltivate in vitro potrebbero non riflettere accuratamente l'eterogeneità dei tumori maligni e le caratteristiche individuali dei pazienti a causa di potenziali mutazioni che si verificano per adattarsi all'ambiente di coltura in vitro durante passaggi ripetuti. Inoltre, mancano del microambiente e del sistema immunitario necessari per la crescita e lo sviluppo del tumore in vivo. Sebbene i modelli CDX offrano alcuni vantaggi rispetto alla coltura cellulare in vitro , potrebbero ancora non riflettere pienamente le caratteristiche individuali dei pazienti con osteosarcoma, sebbene i tessuti tumorali ottenuti dai modelli CDX abbiano una limitata eterogeneità intratumorale e rappresentazione del sistema immunitario rispetto alle linee cellulari coltivate in vitro9. Pertanto, è fondamentale stabilire un modello preclinico ad alta fedeltà.
I modelli PDX prevedono il trapianto immediato di tessuti tumorali umani appena resecati in topi immunodeficienti. Questo metodo consente di preservare fedelmente le caratteristiche genetiche, epigenetiche ed eterogenee delle neoplasie maligne umane per ciascun paziente, anche dopo passaggi successivi nei topi. Inoltre, i modelli PDX sono noti per prevedere con precisione gli esiti clinici successivi10, rendendoli strumenti preziosi per la creazione di trattamenti personalizzati e l'avanzamento della ricerca sulla medicina di precisione11.
Questo lavoro descrive la procedura per stabilire un modello di PDX in topi immunodeficienti mediante trapianto di tessuto di osteosarcoma umano. Tali modelli fungono da piattaforme per condurre esperimenti preclinici per l'osteosarcoma.
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Protocollo
Tutti gli studi che coinvolgono tessuti umani sono stati approvati dal Comitato di revisione etica istituzionale dell'ospedale Longhua, affiliato all'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai (Shanghai, Cina) (2013LC52), e il consenso informato scritto è stato ottenuto dai pazienti in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Il numero IACUC per questo studio sugli animali è PZSHUTCM221017013. Ai topi maschi di quattro settimane di CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl è stata fornita una dieta per roditori irradiata a doppio leone GB 14924.3 e acqua sterile, e sono stati alloggiati in una gabbia per topi IVC con cinque topi per gabbia, in condizioni SPF con un ciclo luce/buio di 12 ore. La Tabella dei Materiali include informazioni dettagliate su tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.
1. Preparazione del tessuto dell'osteosarcoma umano
NOTA: In questo studio, il tessuto dell'osteosarcoma umano è stato resecato12 dalla lesione del femore di un paziente di 15 anni con osteosarcoma prima della chemioterapia.
- Conservare immediatamente il tessuto dell'osteosarcoma appena resecato in una soluzione protettiva dei tessuti per massimizzare la conservazione dell'attivazione delle cellule dell'osteosarcoma dopo il risciacquo con soluzione fisiologica sterile.
NOTA: I tessuti dell'osteosarcoma appena resecati devono essere trapiantati nei topi il prima possibile. Possono essere conservati nella soluzione protettiva dei tessuti per un massimo di 24 ore prima del trapianto. I tessuti dell'osteosarcoma utilizzati per la modellazione devono provenire da pazienti che non sono stati sottoposti a chemioterapia. L'attività delle cellule tumorali dei pazienti che hanno ricevuto la chemioterapia sarà scarsa, portando al fallimento della creazione del modello e alla perdita di alta fedeltà. - Trasferire il prima possibile i tessuti dell'osteosarcoma appena resecati conservati nella soluzione protettiva tissutale.
- Predisporre strumenti e materiali sperimentali per la messa a punto del modello PDX: bisturi (Figura 1A); pinzette oftalmiche (Figura 1B, C); forbice oftalmica (Figura 1D); ago da sutura (Figura 1E); linea di sutura (Figura 1F); porta aghi diritto (Figura 1G); pennarello (Figura 1H).
NOTA: Assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici siano sterilizzati in autoclave prima dell'uso. - Sciacquare due volte i tessuti dell'osteosarcoma con soluzione fisiologica sterile pre-raffreddata in una cappa sterile.
- Rimuovere le aree del tessuto dell'osteosarcoma con sanguinamento e necrosi.
- Tagliare il tessuto pulito dell'osteosarcoma in3 pezzi di 3 mm con un bisturi in una piastra di coltura contenente soluzione fisiologica sterile pre-raffreddata e tenerlo in ghiaccio.
2. Costituzione di modelli PDX mediante trapianto di tessuto di osteosarcoma nella regione del fianco del topo
- Somministrare l'analgesia preoperatoria di meloxicam (5 mg/kg/24 h) mediante iniezione sottocutanea nei topi e posizionare i topi nudi su teli chirurgici sterili. Fornire supporto termico durante tutta la procedura.
- Indurre l'anestesia nei topi esponendoli al 3% di isoflurano e al 97% di ossigeno. Dopo che i topi sono stati completamente anestetizzati, trasferirli sul cono del naso e mantenere l'anestesia con isoflurano all'1,5% e ossigeno al 98,5%.
- Pizzica le dita dei piedi per assicurarti che i topi siano completamente anestetizzati e attendi più a lungo se ci sono ancora spasmi o reazioni convulsive.
NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite utilizzando apparecchiature sterili in una cappa sterile. Evita la secchezza dei topi durante l'anestesia applicando un unguento oftalmico sui loro occhi. - Fissare il mouse in posizione di decubito laterale (Figura 2A). Disinfettare un lato della regione del fianco del topo per il trapianto di tessuto di osteosarcoma 3 volte con cicli alternati di iodio povidone e batuffoli di cotone disinfettante all'etanolo al 70%.
NOTA: La disinfezione chirurgica viene eseguita in uno schema circolare, iniziando dal centro e procedendo a spirale verso l'esterno. - Segnare il sito dell'incisione chirurgica sulla pelle con un pennarello.
- Praticare un'incisione di 5 mm dalla pelle ai tessuti sottocutanei con un bisturi (Figura 2B).
- Sollevare la pelle laterale superiore del margine dell'incisione con una pinzetta oftalmica usando la mano sinistra ed eseguire la dissezione smussata verso l'alto sotto il derma dei topi con un portaago dritto usando la mano destra (Figura 2C).
- Tenere la pelle laterale superiore dell'incisione con le pinzette oftalmiche usando la mano sinistra e posizionare il tessuto dell'osteosarcoma sotto la pelle a circa 5 mm sopra il margine dell'incisione con una pinzetta oftalmica usando la mano destra per trapiantare il tessuto dell'osteosarcoma (Figura 2C).
NOTA: Assicurarsi che il tessuto dell'osteosarcoma sia trapiantato appena sotto il derma della pelle. La dissezione smussata viene eseguita con una pinza di dissezione diritta e smussata, come un portaago dritto, per evitare di penetrare nella cavità toracica del topo mentre si trova lo strato dermico della pelle del topo. - Sutura l'incisione utilizzando una sutura riassorbibile con 2-3 punti di sutura per un'incisione di 5 mm (Figura 2D).
- Rimetti i topi in gabbie pulite e monitorali fino a quando non si riprendono completamente dall'anestesia.
NOTA: La PDX stabilita dal trapianto del tessuto dell'osteosarcoma umano è designata come passaggio 0 (P0), la PDX stabilita dal trapianto del tessuto PDX a P0 è designata come passaggio 1 (P1), seguita da P2 e P3.
3. Raccolta di tessuti tumorali PDX
- Misurare il volume del tumore una volta alla settimana. Quando la dimensione del tumore raggiunge i 1500 mm3, sopprimere i topi utilizzando il metodo della lussazione cervicale dopo l'inalazione di CO2 . Gli endpoint umanitari includono ulcerazioni tumorali o problemi con la mobilità degli arti anteriori.
NOTA: Misurare il diametro lungo (a) e il diametro corto (b) del tumore utilizzando un calibro. Calcolare il volume tumorale (V) utilizzando la formula: V = 1/2 × a × b2. - Posizionare il mouse lateralmente per esporre il tumore e disinfettare la pelle nel sito del tumore con un batuffolo di cotone imbevuto di alcol.
- Usa le forbici oftalmiche per separare l'intero tumore. Pesare la massa tumorale utilizzando una bilancia elettronica.
4. Esame patologico dei tessuti tumorali clinici primari e PDX
- Fissare i tessuti tumorali13 in una provetta da 50 mL contenente 30 mL di soluzione di formalina tamponata neutra al 10% per 24 ore. Sciacquare accuratamente i tessuti tumorali con acqua corrente per rimuovere il fissativo.
- Disidratare e incorporare i tessuti tumorali nella paraffina14.
- Affettare i tessuti tumorali ed eseguire l'esame istologico di routine15.
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Risultati
Questo protocollo descrive la procedura dettagliata per stabilire un modello murino di PDX, preservando le caratteristiche morfologiche dell'osteosarcoma umano dopo il trapianto immediato di tessuto di osteosarcoma umano appena resecato e passaggi successivi nei topi. Qui, un modello murino PDX è stato stabilito con successo utilizzando tessuto di osteosarcoma umano.
La Figura 3A mostra un topo rappresentativo di PDX a P0, due mesi dopo il trapianto di tessuto di ...
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Discussione
I modelli PDX possono simulare le caratteristiche dei tumori umani e mantenere una maggiore somiglianza con il tumore primario, comprese le alterazioni genetiche e genomiche, l'istologia, l'eterogeneità e il profilo di espressione genica 16,17,18,19. Pertanto, preservano i fenotipi molecolari e i genotipi dei pazienti oncologici, fornendo approcci innovativi pe...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato da sovvenzioni di (1) la National Nature Science Foundation (81973877 e 82174408); (2) Progetto di costruzione del Centro di ricerca prioritario di Shanghai (2022ZZ01009); (3) Programma nazionale di ricerca e sviluppo chiave della Cina (2020YFE0201600); (4) Centro di innovazione collaborativa di Shanghai per la trasformazione industriale della preparazione della MTC ospedaliera e (5) Progetti di ricerca all'interno del budget dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai (2021LK047).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione neutra in formalina al 10% | Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd | G1101-500ml | Fissare i tessuti |
| Autoclave | Giappone Hiryama Company | HVE-50 | Strumenti chirurgici per sterilizzazione |
| CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | Calibro per animali |
| Yantai Green Forest Tools Co., Ltd. | 034180A | Misurare il volume del tumore | |
| Piatto (60 mm) | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | 430166, Corning | Posizionamento del campione durante il trapianto |
| Batuffoli di cotone disinfettanti | Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd. | 20230627 | Disinfettare la pelle dei topi |
| Guanti sterili monouso | Guilin Hengbao Health Protection Co., Ltd. | YT21131 | Operazione sterile |
| Dieta per roditori irradiati con doppio leone | Suzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd. | GB 14924.3 | mangimi per animali |
| Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | 1-2000 | Pesare il peso del tumore | |
| Eosin | Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd | E4009-25G | Ematossilina eosina colorazione |
| Ematossilina Shanghai | Gengyun Biotechnology Co., Ltd | H3136-25G | Ematossilina eosina macchia |
| Isoflurano | Shenzhen RWD Life Tecnologia Co., Ltd | VETEASY | Anestesia del topo |
| IVC gabbia per topi | Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd. | HH-MMB-2 | Barriera animale |
| Mark pen | Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd. | YYST5 | Segna l'incisione chirurgica |
| Microscopio ottico Olympus | giapponese Olympus Company | BH20 | Scansiona fette di tessuto |
| Unguento oftalmico | Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd | SOICOEYEGRL Evitare | gli occhi asciutti dei topi durante l'anestesia |
| Forbici oftalmiche | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | Y00030 JZ | Taglia la pelle |
| Pinzette oftalmiche | Shanghai NianYue Biotechnology Co., | Ltd BS-ZER-S-100 Biosharp | Hold tessuti osteosarcoma durante il trapianto |
| Paraffina | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd. | 80200-0015 | Affettatrice per paraffina per tessuti osteosarcoma sepolti |
| Lyca Microsystem (Shanghai) Trading Co., Ltd. | RM2235 | Sezione tissutale osteosarcoma | |
| soluzione fisiologica soluzione salina | Guangzhou Jinsheng Biotechnology Co., Ltd. | 605-004057 | Risciacquo e conservazione temporanea del tessuto osteosarcoma |
| Scalpelli | Fabbrica di strumenti chirurgici di Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. | J11010-10# JZ | Separazione del tessuto dell'osteosarcoma e incisione chirurgica Cappuccio |
| sterile | Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd. | ECO0.9 | Tavolo operatorio |
| chirurgico sterile teli chirurgici Henan | Huayu Medical Equipment Co., Ltd. | 20160090 | Fornire un'area chirurgica sterile |
| Porta ago dritto | Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd | J31050 JZ | Sutura la linea |
| sutura | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd | F3124 | Sutura la ferita |
| Ago da sutura | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd | F3124 | Sutura la |
| ferita Soluzione protettiva dei tessuti | Nanjing Shenghang Biotechnology Co., LTD | BC-CFM-03 | Mantenere l'attività delle cellule tissutali |
| Tubo (50 mL) | Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd. | BLD-BL2002500 | Installa la soluzione di fissazione della formalina |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
