Approccio microfluidico per risolvere la secrezione simultanea e sequenziale di citochine di singole cellule polifunzionali

Sommario

Il protocollo descrive una piattaforma microfluidica avanzata per misurare quantitativamente le dinamiche di secrezione di citochine di singole cellule mononucleate del sangue periferico umano. La piattaforma misura fino a tre citochine in parallelo (IL-6, TNFα e IL-1β) per ogni singola cellula stimolata con lipopolisaccaride come esempio.

Abstract

Infezioni, malattie autoimmuni, risposte immunologiche desiderate e avverse al trattamento possono portare a una risposta citochinica complessa e dinamica in vivo. Questa risposta coinvolge numerose cellule immunitarie che secernono varie citochine per orchestrare la reazione immunitaria. Tuttavia, le dinamiche di secrezione, le quantità e la co-occorrenza delle diverse citochine da parte di vari sottotipi cellulari rimangono poco comprese a causa della mancanza di strumenti appropriati per studiarle. Qui, descriviamo un protocollo che utilizza una piattaforma di goccioline microfluidiche che consente la misurazione quantitativa risolta nel tempo della dinamica della secrezione per diverse citochine in parallelo a livello di singola cellula. Ciò è reso possibile dall'incapsulamento di singole cellule in goccioline microfluidiche insieme a un test immunologico multiplex per la quantificazione parallela delle concentrazioni di citochine, la loro immobilizzazione per l'imaging fluorescente dinamico e l'analisi delle rispettive immagini per derivare quantità e dinamiche secrete. Il protocollo descrive la preparazione di nanoparticelle magnetiche funzionalizzate, gli esperimenti di calibrazione, la preparazione delle cellule e l'incapsulamento delle cellule e delle nanoparticelle in goccioline per l'imaging fluorescente e la successiva analisi di immagini e dati utilizzando l'esempio delle cellule mononucleate del sangue periferico umano stimolate da lipopolisaccaridi. La piattaforma presentata ha identificato un comportamento distinto di secrezione di citochine per cellule singole e co-secernenti, caratterizzando l'eterogeneità fenotipica attesa nel campione di cellule misurato. Inoltre, la natura modulare del test ne consente l'adattamento e l'applicazione per studiare una varietà di proteine, citochine e campioni di cellule, portando potenzialmente a una comprensione più profonda dell'interazione tra diversi tipi di cellule immunitarie e del ruolo delle diverse citochine secrete dinamicamente per modellare la risposta immunitaria strettamente regolata. Queste nuove intuizioni potrebbero essere particolarmente interessanti negli studi sulle disregolazioni immunitarie o nell'identificazione di popolazioni target nella terapia e nello sviluppo di farmaci.

Introduzione

Le infezioni spesso causano reazioni complesse dell'ospite che coinvolgono il sistema immunitario innato e adattativo ^1,2. In caso di infezione o riconoscimento di agenti infettivi, le cellule ospiti possono produrre una vasta gamma di chemio- e citochine, che sono piccole proteine note come comunicatori critici e modulatori del sistema immunitario³. Le citochine pro-infiammatorie vengono rilasciate precocemente dopo l'infezione per avviare la risposta immunitaria, seguite successivamente da citochine antinfiammatorie, che sono fondamentali per prevenire il danno tissutale e le successive malattie croniche o autoinfiammatorie. Questo equilibrio tra eliminazione della minaccia e protezione dei tessuti si manifesta in un ampio repertorio di citochine che esercitano funzioni diverse durante l'infezione, consentendo una regolazione fine della risposta ^4,5. All'interno di questa miscela, è possibile osservare firme uniche a seconda dell'agente patogeno e dei segnali che inducono, della posizione del tessuto e delle cellule immunitarie da cui provengono. Tuttavia, il rilascio di citochine sembra anche costituire un processo biologico multifunzionale unico per ogni popolazione cellulare, diverso nelle dinamiche di secrezione e nella risposta individuale. Questa eterogeneità è stata descritta in letteratura per molti anni, ad esempio, tra le sottopopolazioni di cellule T ^6,7, dove le indagini sulle malattie autoinfiammatorie e sulle infezioni gravi da COVID-19 hanno mostrato un'ampia diversità funzionale di marcatori infiammatori all'interno e tra i pazienti ^8,9. Recentemente, l'avvento del sequenziamento a singola cellula ha evidenziato l'elevata plasticità e crosstalk tra sottopopolazioni all'interno di microambienti immunitari che non erano precedentemente evidenti, indicando che sono necessari metodi a singola cellula per catturare questa eterogeneità^10,11. Sebbene siano in fase di sviluppo nuovi metodi per analizzare il trascrittoma, l'analisi fenotipica rimane impegnativa, in quanto richiede misurazioni simultanee, quantitative e risolte nel tempo della secrezione proteica a livello di singola cellula. Tali misurazioni ci permettono di studiare le identità, le dinamiche e i modelli di secrezione delle cellule secernenti (lento/veloce, precoce/tardivo, simultaneo/sequenziale) per un repertorio o un pannello di citochine. Consentendo lo studio delle dinamiche del rilascio di citochine durante una risposta immunitaria quantitativamente e con risoluzione temporale, le intuizioni risultanti potrebbero consentire una comprensione dell'insieme cellulare e della risposta indotta.

Nei protocolli standard, le citochine vengono solitamente rilevate nel surnatante delle sospensioni cellulari e del siero utilizzando il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), producendo quantità secrete in massa. Le misurazioni di massa non consentono la quantificazione delle quantità di citochine prodotte da ciascuna cellula, un problema particolarmente evidenziato nei campioni di cellule eterogenee. Metodi alternativi come la colorazione intracellulare delle citochine, il saggio ELISpot (Enzyme-linked Immunospot) o i saggi microincisi (ad esempio, Isoplexis) rilevano le citochine espresse dalle singole cellule, ma forniscono solo misurazioni del punto finale^12,13. Ciò significa che le dinamiche di secrezione e i cambiamenti che potrebbero verificarsi nel modello di secrezione cellulare durante il tempo di incubazione vengono ignorati. Inoltre, le misurazioni degli endpoint non sono in grado di distinguere tra secrezione simultanea e sequenziale di citochine, quindi la vera portata della polifunzionalità simultanea delle cellule immunitarie nella secrezione di citochine rimane poco chiara utilizzando questi metodi.

La risoluzione di singole cellule può essere ottenuta utilizzando la microfluidica a goccioline per generare ed elaborare compartimenti fisici delle dimensioni di un picoliter al fine di studiare le cellule immunitarie sui loro fenotipi unici di secrezione di citochine a livello di singola cellula^14,15. Questi compartimenti sono costituiti da emulsioni acqua-in-olio e possono essere generati utilizzando chip microfluidici^16,17. Infatti, i saggi microfluidici basati su goccioline hanno dimostrato un'estrema versatilità nel consentire l'analisi di diversi campioni e repertori biologici a livello di singola cellula e la loro integrazione con processi a monte (processamento di cellule e reagenti) e a valle (smistamento di singole cellule, proteomica o sequenziamento)18,19,20,21,22. In particolare, le configurazioni che consentono l'immobilizzazione delle goccioline consentono di misurare la funzionalità di una singola cellula nel tempo, il che è prezioso per l'analisi della secrezione proteica¹⁸. Inoltre, l'integrazione di saggi quantitativi multiplex facilita ulteriori indagini in dimensioni precedentemente inaccessibili, in processi come la co-secrezione e l'identificazione di cellule immunitarie polifunzionali^23,24.

In questo protocollo, descriviamo un flusso di lavoro a singola cellula basato su goccioline immobilizzate per rilevare, quantificare e misurare temporalmente la secrezione di un massimo di tre citochine in parallelo da singole cellule^17,23. La tecnologia offre la possibilità di monitorare le risposte delle citochine da oltre 20.000 cellule in parallelo.

Il flusso di lavoro presentato consiste nell'incapsulamento microfluidico di singole cellule immunitarie e nanoparticelle funzionalizzate in goccioline di acqua in olio da 60 pL. L'immobilizzazione di >100.000 goccioline in una camera di osservazione e la microscopia a fluorescenza risolta nel tempo consentono di misurare la dinamica della secrezione di citochine all'interno di ciascuna gocciolina e di ciascuna citochina (Figura 1A). Per ogni singola cellula all'interno di una gocciolina, la secrezione di citochine viene misurata mediante un test immunologico a sandwich, in cui le nanoparticelle magnetiche funzionalizzate con uno specifico anticorpo di cattura legano la citochina secreta, portando al successivo trasferimento e al legame di anticorpi di rilevamento marcati in fluorescenza (Figura 1B, C). Una linea di perline si forma allineando le nanoparticelle magnetiche, alle quali può essere quantificata la rilocazione della fluorescenza in presenza di citochine. Qui, la rilocazione della fluorescenza è definita come l'intensità media della fluorescenza trovata sulla linea di perlina divisa per l'intensità media della fluorescenza della gocciolina rimanente. Questo test può essere multiplexato per diverse citochine mescolando lotti di nanoparticelle diversamente funzionalizzati e rispettivi anticorpi di rilevamento marcati in diversi canali di fluorescenza²³, con conseguente rilocazione di fluorescenza specifica nei diversi canali. Con l'aiuto di uno script di analisi personalizzato, è possibile estrarre i valori di rilocazione della fluorescenza e convertire le immagini in profili dinamici di secrezione per ogni singola cellula e citochina. Pertanto, i set di dati risultanti producono numerose letture, come la misurazione quantitativa della secrezione nel tempo, l'identificazione di sottopopolazioni co-secernenti e la distribuzione delle cellule in base alle quantità, ai tassi e alle combinazioni di citochine secrete.

Figura 1: Flusso di lavoro e principio del saggio. (A) Panoramica del flusso di lavoro per l'analisi delle cellule secernenti citochine dopo la stimolazione. Le sospensioni a singola cellula e le nanoparticelle magnetiche vengono preparate e incapsulate in emulsioni olio/acqua (goccioline) da 60 pL in volume. Le goccioline vengono immobilizzate e le nanoparticelle allineate all'interno di un campo magnetico prima della misurazione per un massimo di 4 ore ogni 30 minuti. Infine, le immagini vengono analizzate e vengono estratti i parametri per ogni gocciolina, punto temporale e canale fluorescente. Questa cifra è stata modificata da¹⁷. (B) Principio del biotest del sandwich di goccioline. Le nanoparticelle funzionalizzate legano le citochine secrete, il che porta al successivo trasferimento degli anticorpi di rilevamento marcati in fluorescenza alle nanoparticelle. Questa ricollocazione della fluorescenza è quantificata e convalidata con esperimenti di calibrazione eseguiti con citochine ricombinanti. La miscelazione di diverse nanoparticelle funzionalizzate consente di effettuare misurazioni multiplex di un massimo di tre citochine contemporaneamente. (C) Negli esperimenti basati su cellule, le goccioline vengono seguite nel tempo di misurazione e le cellule secernenti vengono identificate da un aumento nel tempo del trasferimento della fluorescenza sulle nanoparticelle. Gli schemi non sono in scala. Figura creata con BioRender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti nell'ambito dell'accordo etico EK202-N-56 e approvati dalla commissione etica dell'ETH di Zurigo. La manipolazione di cellule umane è stata eseguita in una cappa a flusso laminare contenuta in un laboratorio di biosicurezza di livello 2.

NOTA: Le sezioni seguenti descrivono in dettaglio il protocollo per misurare la secrezione di citochine risolta nel tempo a livello di singola cellula. La procedura qui descritta viene applicata alla stimolazione di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) con lipopolisaccaride (LPS) e alla misurazione parallela delle citochine IL-6, TNFα e IL-1β. Tuttavia, se necessario, il protocollo può essere adattato ad altri tipi di cellule, stimolanti e citochine.

1. Fabbricazione della camera di osservazione

NOTA: Per evitare il movimento delle goccioline durante l'imaging, viene preparata una camera di osservazione con un'altezza inferiore di circa il 10% rispetto al diametro delle goccioline.

1. Preparazione del nastro biadesivo da taglio e del vetrino superiore
   1. Disegna o carica il disegno desiderato dell'intaglio della camera nella scheda Progettazione del software di taglio. Per le dimensioni specifiche utilizzate qui, vedere la Figura 2E.
   2. Fissare il nastro biadesivo di 32 μm di spessore al tappetino da taglio adesivo utilizzando del nastro adesivo e posizionare il tappetino da taglio nella macchina da taglio automatica.
   3. Taglia il design della camera dal nastro, prestando attenzione a tagliare i bordi lunghi della camera nella stessa direzione per un più facile distacco nel passaggio 1.3.
   4. Conservare i ritagli di nastro a temperatura ambiente per la conservazione a lungo termine. Per una conservazione a breve termine, conservarli a -20 °C e rimuoverli solo poco prima del passaggio 1.3. per una più facile manipolazione.
   5. Praticare due fori di circa 1 mm di diametro al centro di un vetrino da microscopio standard (76 mm x 26 mm x 1 mm), con una distanza tra i due fori di circa 3,5 cm.
2. Pulizia e attivazione al plasma di vetrini
   1. Pulisci un vetrino con fori e uno senza fori usando il sapone. Risciacquare bene con acqua distillata e asciugare con salviette di precisione prive di lanugine.
   2. Immergere i vetrini in un detergente al plasma e trattare al plasma le superfici superiori a 55 W per 10 minuti. Rimuovere i vetrini e procedere al passaggio 1.3.
3. Assemblaggio della camera
   1. Posizionare il vetrino con fori su una superficie pulita con il lato attivato dal plasma rivolto verso l'alto, senza toccare la superficie attivata.
   2. Rimuovere lo strato protettivo da un lato del nastro biadesivo, nella stessa direzione di taglio. Senza toccare, allineare l'apertura del nastro con i bordi della diapositiva di vetro e i fori praticati e mettere lentamente il nastro a contatto con la diapositiva di vetro partendo dal bordo corto.
      NOTA: Prestare attenzione a non generare allungamenti o pieghe nel nastro poiché ciò comporterebbe altezze della camera errate. Poiché questo passaggio è soggetto a errori e richiede una certa esperienza pratica, è consigliabile preparare diversi vetrini in parallelo.
   3. Rimuovere il secondo strato protettivo dal nastro, sempre nel senso di taglio, e posizionare il secondo vetrino senza fori con la superficie attivata rivolta verso il basso. Premere insieme l'intera superficie dei due vetrini posizionando sopra una tavola piatta e premendo verso il basso con forza della parte superiore del corpo per circa 10 s.
   4. Dopo aver assemblato i due vetrini, capovolgere la camera in modo che i due fori siano rivolti verso di sé. Incolla le nanoporte ai due fori inserendo una piccola quantità di colla polimerizzabile con raggi UV nell'anello sotto la porta e posizionando la porta sopra il foro nel vetrino. Aggiungi un anello di colla polimerizzabile UV attorno alla porta e polimerizza la colla con una lampada UV. La camera dovrebbe ora apparire come illustrato nella Figura 2E. Procedere immediatamente al passaggio 1.4.
      NOTA: La luce UV può danneggiare gli occhi e la pelle. Indossare dispositivi di protezione adeguati.
4. Rivestimento fluorofilo della superficie della camera
   NOTA: Questa fase deve essere eseguita entro 1 ora dal trattamento al plasma dei vetrini (fase 1.2.2) per garantire una buona efficienza del rivestimento.
   1. Preparare appena 1 mL di soluzione di fluorosilano all'1% (1H,1H,2H,2H-perfluorodeciltriclorosilano) in olio fluorurato (HFE-7500) e riempirlo in una siringa. Spingere la soluzione di rivestimento attraverso un filtro per siringa in PTFE e un ago da 27 G x 0,75 pollici collegato a un microtubo in PTFE da 0,3 mm x 0,76 mm, nella camera di osservazione.
   2. Dopo 1 minuto di incubazione, sciacquare la soluzione di rivestimento fuori dalla camera utilizzando la pressione di azoto sotto una cappa aspirante. Sciacquare la camera con olio fluorurato (solo HFE-7500) utilizzando un'altra siringa.
   3. Conservare la camera piena di olio fluorurato con ingressi chiusi a temperatura ambiente (RT). Dopo ogni esperimento, lavare direttamente le cellule e le goccioline per garantire una buona conservazione del rivestimento.
      NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui e le camere possono essere conservate e riutilizzate per diversi mesi.
5. Portacamera con magneti
   1. Per l'allineamento delle nanoparticelle magnetiche, applicare un campo magnetico statico alla camera di osservazione durante l'incapsulamento delle gocce e l'imaging. Per questo, posizionare la camera in un supporto per microscopia stampato in 3D personalizzato (vedi Figura 2D e il file trovato in Bounab et ^al.17 Supplementary Data 4) che contiene due magneti al neodimio lungo i lati lunghi della camera.

2. Funzionalizzazione di nanoparticelle

NOTA: Il processo per la funzionalizzazione delle nanoparticelle è simile per ogni citochina, l'unica differenza è l'aggiunta di anticorpi di cattura specifici per le citochine. La funzionalizzazione di ciascuna citochina viene eseguita in diverse provette di reazione individuali in parallelo. Prima di questo protocollo, l'anticorpo di cattura TNFα e l'anticorpo di rilevamento IL-1β erano marcati internamente rispettivamente con biotina e Alexa Fluor 647. La coniugazione è stata eseguita secondo il protocollo del produttore che si trova sul sito web del fornitore (vedere i link nella Tabella dei materiali) e gli anticorpi sono stati aliquotati e conservati a -20 °C.

1. Aggiungere 50 μL di nanoparticelle funzionalizzate con streptavidina (diametro (Ø) 300 nm) nella provetta destinata alla rilevazione del TNFα, 50 μL per IL-1β e 100 μL per IL-6. Diluire la soluzione di nanoparticelle 1:1 (v/v) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
2. Aggiungere a ciascuna provetta 1/20 (v/v) del rispettivo volume degli anticorpi di cattura biotinilati (concentrazioni stock a 0,5 mg/mL) e incubare per 30 minuti a RT.
   NOTA: Quando si aggiungono piccoli volumi alla soluzione di nanoparticelle, depositare il volume nella parte superiore del tubo e lavarlo più volte con la maggior parte della soluzione. Ciò garantisce una corretta miscelazione e previene la formazione di aggregati.
3. Aggiungere 1/100 (v/v) di 1 mM di soluzione di D-biotina nella provetta e incubare per 5 minuti a RT. Ciò si traduce in una concentrazione finale di biotina di 10 μM.
   NOTA: L'eccesso di biotina blocca i lati liberi di legame sulle nanoparticelle e riduce la formazione di aggregati indesiderati.
4. Raccogli le particelle tenendo un magnete al neodimio vicino al tubo. Attendere che il surnatante sia limpido e scartarlo.
   NOTA: I magneti utilizzati durante il test mostrano forze di attrazione molto forti, che possono causare danni fisici se due magneti si incastrano accidentalmente.
5. Per ridurre l'adsorbimento non specifico sulla superficie delle nanoparticelle, risospendere immediatamente le nanoparticelle in 0,5 volte il volume finale del passaggio 2.1 di Pluronic F-127 (10%) e 0,5 volte il volume PBS. Incubare la soluzione per 30 minuti a RT.
6. Raccogliere le particelle utilizzando il magnete, scartare il surnatante e risospendere in 1 volta il volume del tampone di conservazione (RPMI 1640, sostituzione del siero knockout al 5%, Pen/Streptococco all'1%, albumina sierica umana ricombinante all'1% (HSA), HEPES 25 mM, F-127 pluronico allo 0,1%). Incubare la soluzione per 30 minuti a RT.
   NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui e le particelle possono ora essere conservate per un massimo di 1 settimana a 4 °C.
7. Immediatamente prima dell'incapsulamento, risospendere le particelle mediante pipettaggio e mescolare le nanoparticelle coniugate a un rapporto di 2:1:1 (v/v) per IL-6:TNFα:IL-1β, rispettivamente.
   NOTA: I diversi rapporti delle nanoparticelle funzionalizzate dipendono dalla coppia di anticorpi utilizzata per ciascuna citochina e sono stati determinati sperimentalmente attraverso campioni di calibrazione per ottenere un intervallo dinamico ottimale.
8. Lavare con un supporto completo (RPMI 1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 25 mM HEPES) raccogliendo le particelle con il magnete, scartando il surnatante e risuspendando. Ripetere questo passaggio ma risospendere solo in 0,5 volte il volume del supporto completo dal passaggio 2.7.
9. Aggiungere alla soluzione gli anticorpi di rilevamento IL-6, TNFα e IL-1β marcati in modo diverso per raggiungere una concentrazione finale di 10 nM ciascuno. La soluzione è ora pronta per essere utilizzata per gli esperimenti sulle goccioline.

3. Preparazione delle cellule

NOTA: Le PBMC sono state isolate da un buffy coat ricevuto dalla banca del sangue di Zurigo. Le cellule sono state congelate e conservate in crioviali (1 x 10,⁷ cellule/fiala) in azoto liquido per diversi mesi.

1. Scongelamento delle celle
   1. A 1 ora prima di iniziare l'esperimento, lasciare riscaldare il terreno completo e il tampone MACS (2 mM EDTA, 0,5% BSA in DPBS, filtrato sterile) a RT. Preparare la provetta contenente le cellule aggiungendo 9 mL di terreno completo in una provetta da 15 mL e mantenendola nel bagno d'acqua a 37 °C.
   2. Recuperare un crioviale PBMC (contenente ~1 x 10⁷ cellule) dal suo stoccaggio in azoto liquido. Agitare la crioprovetta nel bagno d'acqua a 37 °C fino a quando non rimane solo una piccola quantità di ghiaccio.
   3. Pulire il tubo con EtOH al 70% e trasferirlo nella camera a flusso laminare. Aggiungere 1 mL di terreno completo preriscaldato al crioviale, mescolare delicatamente e trasferire tutte le cellule nella provetta contenente il terreno completo caldo. Il crioviale può essere lavato con 1 mL di terreno completo caldo per recuperare il numero massimo di cellule.
   4. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 minuti a RT, scartare il surnatante e risospendere delicatamente con una pipetta il pellet cellulare con 1 mL di terreno completo. Aggiungere 9 ml di terreno completo.
   5. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 minuti a RT. Scartare il surnatante e risospendere come in precedenza in 1 mL di terreno completo.
   6. Contare le celle utilizzando il contatore di celle disponibile. In questo caso, è stato utilizzato un contatore automatico di cellule. Le cellule sono state contate mescolando 10 μl di sospensione cellulare con 10 μl di blu di tripano e trasferendo 10 μl della miscela nel vetrino di conteggio delle cellule.
2. Colorazione e blocco FcR
   1. Calcolare il numero totale di cellule e il volume necessario per risospendere le cellule a 2 x 10⁶ cellule viventi/mL. Preparare la soluzione di colorazione cellulare (CellTrace Violet) diluendo il brodo (5mM) 1000x in PBS (concentrazione di lavoro di 5 μM).
   2. Far girare le cellule a 500 x g per 5 minuti a RT. Scartare il surnatante e risospendere le cellule nel volume calcolato di soluzione di colorazione cellulare preparata al punto 3.2.1. Incubare le cellule a 37 °C per 5 minuti.
   3. Al termine dell'incubazione, estinguere il colorante rimanente nella soluzione aggiungendo un terreno completo (almeno 2 volte il volume della soluzione colorante). Centrifugare le celle a 500 x g per 5 minuti a RT.
   4. Scartare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 60 μL di tampone MACS e aggiungere 20 μL di blocco FcR umano per 1 x 10⁷ cellule. Incubare le cellule per 10 minuti a RT.
   5. Riempire la provetta fino a 10 mL con il tampone MACS e centrifugare le cellule a 500 x g per 5 minuti a RT.
   6. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno completo Contare le cellule come descritto al punto 3.1.6.
3. Stimolazione cellulare con LPS
   1. Utilizzando la conta cellulare, diluire le cellule a 1 x 10⁶ cellule/mL e trasferire 2 mL di cellule in ciascun pozzetto in una piastra a 6 pozzetti a bassissimo legame.
   2. Diluire l'LPS in un terreno completo e aggiungerlo nel pozzetto contenente le cellule per ottenere una concentrazione finale di LPS di 1 μg/mL. Incubare le cellule per 6 ore a 37 °C.
4. Preparazione per l'incapsulamento
   1. Al termine del tempo di stimolazione, trasferire la sospensione cellulare in una nuova provetta da 15 mL.
   2. Aggiungere 1 mL di terreno completo nel pozzetto vuoto. Con un raschietto per cellule, staccare le celle rimanenti. Trasferire le cellule in una nuova provetta da 15 mL. Lavare il pozzetto con 1 mL di terreno completo e trasferirlo in un'altra provetta da 15 mL.
   3. Centrifugare le due provette a 500 x g per 5 minuti a RT e trasferire 1 mL della soluzione surnatante non diluita (dalla prima provetta contenente le cellule non lavate) in una nuova provetta per ulteriori analisi, se necessario (ad es. ELISA).
   4. Scartare il resto dei surnatanti.
   5. Risospendere i pellet in 0,5 mL di terreno completo, combinare le cellule dello stesso pozzetto e trasferirle in una provetta da centrifuga. Contare le celle come descritto nel passaggio 3.1.6.
   6. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 minuti a RT e scartare la maggior parte del surnatante (lasciando circa 100 μl). Senza risospendere il pellet, aggiungere con molta attenzione 200 μl di terreno completo.
   7. Scartare il surnatante. Risospendere le cellule in un terreno completo a una concentrazione compresa tra 6,6 e 13,3 x 10⁶ cellule/mL per ottenere un numero medio di cellule per gocciolina di λ = 0,2-0,4 per l'incapsulamento, come definito al punto 8.6.
      NOTA: I passaggi 3.4.6 e 3.4.7 devono essere eseguiti immediatamente prima dell'incapsulamento per evitare la secrezione di citochine nel surnatante. Il numero di cellule per gocciolina segue una distribuzione di Poisson: , dove P mostra la frazione di goccioline contenenti X cellule e λ è il numero medio di cellule per gocciolina.

4. Incapsulamento e produzione di goccioline

NOTA: L'incapsulamento delle cellule in goccioline è reso possibile da un chip generatore di goccioline microfluidico, per il quale la fabbricazione è descritta in dettaglio altrove¹⁷. Le alternative sono disponibili in commercio (vedi esempio nella Tabella dei materiali). Un design adatto del chip del generatore di gocce ha due ingressi per le fasi acquose, un ingresso per la fase oleosa e uno per le goccioline generate. Inoltre, un chip generatore di goccioline commerciale adatto dovrebbe consentire la produzione di acqua in goccioline di olio fluorurato di volume di 40-60 pL. Il protocollo qui descritto produce emulsioni acqua/olio (goccioline) con un diametro di 50 μm. L'utilizzo di varie opzioni per modificare il protocollo può portare a goccioline più grandi o più piccole.

1. Preparazione della pompa a siringa (Figura 2A)
   1. Riempire una siringa da 1 mL con 500 μL di fase continua costituita dal 2% di fluorotensioattivo 008 in olio fluorurato HFE-7500. Collegare un ago da 27 G x 0,75 pollici a un microtubo in PTFE da 0,30 mm x 0,76 mm e montare il gruppo sulla siringa e successivamente sulla pompa siringa.
      NOTA: Assicurarsi che non rimanga aria nella siringa o nella cannula in quanto ciò impedisce portate costanti.
   2. Preparare due connettori per puntali per pipette su misura per le fasi acquose (Figura 2B): Praticare un foro con un punzone per biopsia da Ø0,75 mm al centro di un ritaglio PDMS alto ~5 mm con Ø6 mm. Tirare ~3 cm di tubo in PTFE (diametro interno 0,56 mm, diametro esterno 1,07 mm) attraverso il foro nell'apertura PDMS e spingere il gruppo nella parte superiore di un puntale per pipette da 200 μl. Collegare l'altro lato del tubo a un ago da 23 Gx 1,25 pollici. Sigillare il connettore spalmando la colla polimerizzabile ai raggi UV sulla parte superiore della pipetta e polimerizzarla con luce UV.
      NOTA: Poiché la luce UV è dannosa per gli occhi, indossare occhiali che bloccano i raggi UV per proteggersi.
   3. Riempire due siringhe da 1 ml con 500 μl di olio minerale leggero, collegare due aghi da 23 G con gli attacchi personalizzati e montarli entrambi sulla pompa a siringa.
   4. Aspirare 30 μL di nanoparticelle e 30 μL di soluzione cellulare nei puntali delle pipette delle fasi acquose utilizzando il software di controllo della pompa a siringa.
   5. Preparare una camera di osservazione pulendo la superficie con acqua per rimuovere sporco e polvere e asciugarla con salviette di precisione. Fissare la camera nel supporto della camera stampato dotato di due magneti al neodimio.
      NOTA: Assicurati che i magneti puntino nella giusta direzione (attraendosi) per formare un aggregato allungato.
   6. Inclinare leggermente la camera (30°). Aprire entrambe le porte e inserire un tovagliolo di carta nella porta superiore per assorbire la fase esterna in eccesso durante il riempimento.
2. Produzione di gocce e riempimento della camera
   1. Collegare la fase continua tramite un tubo all'ingresso superiore del chip microfluidico (Figura 2A, C, F). Lavare il chip per circa 30 s in fase continua utilizzando una portata di 1800 μL/h.
   2. Collegare i puntali delle pipette delle soluzioni acquose ai due ingressi centrali (Figura 2A, C, F).
   3. Avviare il flusso della soluzione acquosa con 200 μL/h ciascuno e lasciare che i canali e l'uscita siano riempiti di liquido. Quando si utilizzano nanoparticelle magnetiche, una soluzione omogenea di colore marrone-rosso dovrebbe fuoriuscire dall'uscita del chip.
   4. Una volta che il liquido appare all'uscita, avviare il flusso in fase oleosa fluorurata a 800 μL/h e attendere che si stabilisca una produzione stabile di goccioline, confermata dal deflusso di una soluzione omogenea, grigia e lucida all'uscita.
   5. Una volta stabilita una produzione stabile di goccioline, raccogliere le goccioline prodotte collegando il microtubo in PTFE (0,3 mm di diametro interno x 0,76 mm di diametro esterno) alla porta di uscita e dirigerle in una camera di osservazione facendo passare il microtubo attraverso il modulo della ghiera di un raccordo monopezzo a serraggio manuale (Figura 2A).
   6. Se si verifica una corretta produzione di goccioline, un liquido omogeneo e lucido dovrebbe riempire la camera con un fronte dritto dal basso verso l'alto.
   7. Una volta riempita la camera, arrestare il flusso e chiudere le porte con i tappi delle porte esercitando una pressione serrata con le dita.
      NOTA: Prestare attenzione a non chiudere troppo strettamente la camera. L'intrappolamento o l'afflusso d'aria possono portare a movimenti delle goccioline e quindi compromettere l'inseguimento durante la misurazione.
   8. Dopo la produzione di goccioline, sciacquare il truciolo con olio fluorurato e soffiare via eventuali richiami di fluido con azoto per preservarne la funzione. I chip possono essere riutilizzati più volte e conservati per mesi, purché non siano intasati.

Figura 2: Panoramica della configurazione microfluidica. (A) Predisposizione per l'incapsulamento delle goccioline con la pompa a siringa, il chip di generazione delle goccioline, la camera di osservazione e il supporto del microscopio. (B) Immagine del tappo PDMS perforato (in alto) per formare un connettore per un puntale per pipette da 200 μl (in basso), come descritto nella fase 4.1.2 del protocollo. (C) Immagini del collegamento dei puntali dei tubi e delle pipette al chip di generazione delle gocce. (D) Immagine della camera posizionata all'interno del supporto per microscopio stampato in 3D personalizzato con due magneti in alto e in basso. (E) Foto della camera di osservazione (con nastro bianco per l'illustrazione). (F) Layout del chip microfluidico per la creazione di goccioline (barra di scala: 750 μm). Questa cifra è stata modificata da¹⁷. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Acquisizione e misurazione delle immagini

NOTA: L'acquisizione delle immagini viene eseguita su un microscopio a epifluorescenza invertito standard racchiuso in un incubatore, che consente misurazioni a 37 °C. Le impostazioni qui descritte sono specifiche per un microscopio Nikon Eclipse Ti2 funzionante con il software NIS Elements (V. 5.30.04) dotato di una fotocamera Orca Fusion, ma sono generalmente adattabili a qualsiasi altro microscopio e fotocamera a fluorescenza.

1. Impostazione dei parametri di misurazione
   1. Per impostare le dimensioni dell'immagine, selezionare una dimensione dell'array di immagini 10 x 10. Questo array conterrà circa 50.000-70.000 goccioline. Usa la sovrapposizione dell'1% e attiva la fusione per la cucitura delle immagini.
   2. Per impostare il numero di canali misurati, selezionare il canale DAPI per il rilevamento cellulare, i canali FITC, TRITC, Cy5 per il rilevamento di citochine (beadlines) e il canale BF per il rilevamento di goccioline. Usa il pixel binning 2 x 2 e 16 bit per la profondità di bit. Adattare le impostazioni della fotocamera per ottenere valori di pixel di intensità in goccioline che non raggiungono il massimo della fotocamera per ogni canale di fluorescenza.
      NOTA: I tempi di esposizione esatti e l'intensità della lampada per ogni canale dipendono dal modello e dai reagenti utilizzati e vengono stabiliti prima di generare le curve di calibrazione (passaggio 7). L'utilizzo delle stesse impostazioni di acquisizione nella calibrazione e nelle misure di celle è importante per una quantificazione accurata.
   3. Per impostare la misurazione risolta nel tempo, selezionare una misurazione ogni 30 minuti per un totale di 9 misurazioni.
      NOTA: I parametri di misurazione possono differire per le cellule utilizzate, gli stimolanti, i reagenti, le citochine misurate, la temperatura di incubazione e i modelli al microscopio.
2. Avvio della misurazione
   1. Montare il supporto della camera sul microscopio con un tavolino in formato piastra a pozzetti (Figura 2D) e passare al canale del campo chiaro (BF) utilizzando l'obiettivo 10x.
   2. Concentrati sulle goccioline immobilizzate in BF e assicurati che il gruppo sia montato su un piano perfetto facendo una panoramica e regolando se necessario. Spostarsi al centro della camera per i passaggi successivi.
   3. Attivare il sistema di messa a fuoco automatica (PFS) e impostarlo sul piano di misurazione ottimale sul canale BF in modo che i bordi delle goccioline appaiano come cerchi neri e nitidi che possono essere facilmente distinti dalla fase oleosa e dallo sfondo.
      NOTA: Le misurazioni sono possibili anche senza un sistema di messa a fuoco automatizzato, ma se il microscopio ne è dotato, si consiglia vivamente di utilizzarlo. Ciò migliora la qualità della misurazione per immagini di grandi dimensioni e molto unite.
   4. Passa attraverso tutti i canali di fluorescenza e imposta il piano di misurazione ottimale per ciascuno. Per le misure di riposizionamento sui canali FITC, TRITC e Cy5, assicurarsi che l'aggregato di nanoparticelle sia perfettamente a fuoco, per il canale DAPI, assicurarsi che le celle siano a fuoco.
      NOTA: I piani focali ottimali e i valori z potrebbero differire per tutti i canali misurati. Assicurati di salvare i singoli offset PFS per ogni canale.
   5. Prima di iniziare la misurazione, passare attraverso tutti i canali per ricontrollare i singoli focolai e attendere 5 minuti per equilibrarsi poiché inizialmente potrebbe verificarsi un movimento mentre le soluzioni si riscaldano.
   6. Avviare la misurazione. Dopo aver generato la prima immagine, verificare la presenza di eventuali irregolarità (messa a fuoco, goccioline in movimento, canali errati, ecc.). Riavviare l'acquisizione se necessario, o in caso di aria, riempire la camera (iniziare dal passaggio 4.1.4). Lasciare che l'assemblaggio immagini le goccioline duri 4 ore.

6. Analisi delle immagini

1. Installa il software di analisi delle immagini (DropMap Analyzer App v 4.023) in MatLab (https://github.com/ESPCI-LCMD/MiMB) e trasferisci il file .nd2 generato dall'esperimento a un computer di analisi.
2. Aprire l'applicazione. Selezionare le impostazioni specificate, altrimenti lasciare selezionato il valore predefinito: CH1: DAPI, WD (gocciolina intera); CH2: FITC, BL (beadline) selezionato; CH3: TRITC, BL selezionato; CH4: Cy5, BL selezionato; Diametro massimo di goccia (μm): 70; Rilevamento cadute: Pieno; Tracciamento: Sì. Premi il pulsante Start (icona a forma di frutta) per selezionare la posizione del file .nd2 e avviare l'analisi.
3. Dopo alcuni minuti, il programma mostrerà una sezione di esempio dell'immagine (Figura 3A). Premi la barra spaziatrice finché non ne trovi una adatta per il rilevamento delle goccioline, quindi premi Invio. Nella stessa sezione dell'immagine, disegna un rettangolo in un'area rappresentativa per trovare i parametri di soglia per rilevare le goccioline.
4. Dopo alcuni minuti, si aprirà un'altra finestra che mostra la distribuzione dell'intensità del canale DAPI. Trascina e rilascia il cursore per rilevare solo il segnale dalle celle colorate e fai clic su Fine nell'angolo in alto a destra.
5. Dopo aver segmentato l'immagine in singole goccioline con diametri inferiori al diametro massimo della goccia (μm), il programma eseguirà ora i seguenti passaggi per ogni gocciolina, punto temporale e canale di fluorescenza senza ulteriori input da parte dell'utente (vedere la Figura 3).
   1. Il software calcola i pixel spostati della gocciolina tra i punti temporali (le goccioline che si spostano più di 40 pixel vengono escluse automaticamente).
   2. Il software misura il valore medio di fluorescenza dell'intera gocciolina, rilevando e misurando l'intensità media della linea di perline trovando il pixel più luminoso su una linea orizzontale e calcolando la media di tutte le intensità dei pixel su una linea verticale dall'alto verso il basso della gocciolina. Questa operazione viene eseguita automaticamente e viene utilizzata per calcolare i valori medi di rilocazione della linea di perline (Figura 3B) secondo l'equazione:
      
   3. Il software calcola la percentuale di pixel totali nell'area delle gocce al di sopra della soglia impostata sul canale DAPI.
6. Il file .xslx risultante conterrà le seguenti colonne di interesse per ulteriori analisi: DropIdX (ID della goccia tracciata nel tempo), TrueCentroid_ t*2-1 e t+2 (coordinate x e y, rispettivamente, del centro della goccia per il punto temporale t), DiameterMicrons (diametro della goccia in μm), TrackingMove (numero di pixel spostati nell'intero tempo di misurazione), FluoChannel_BL_Ratio_t (valore di rilocazione per FluoChannel al punto temporale t), DAPI_WD_PosPxlCount_t (numero di pixel sopra la soglia nell'intera droplet nel canale DAPI al punto temporale t).

Figura 3: Analisi delle immagini eseguita dal software di analisi delle immagini. (A) Le goccioline vengono rilevate nel canale del campo chiaro (BF) utilizzando una trasformazione di Hough, contrassegnando ciascuna gocciolina con un cerchio rosso. Barre di scala: 200 μm. (B) All'interno di ogni gocciolina, la linea di perlina delle nanoparticelle è identificata attraverso i pixel più luminosi sul piano orizzontale e le intensità di fluorescenza sono mediate per tutti i pixel che si estendono dall'alto verso il basso della gocciolina. Inoltre, la cella viene identificata attraverso una percentuale di pixel >0 sopra la soglia per l'intera area delle goccioline. Barra di scala: 20 μm. (C) Il software dell'analizzatore confronta l'intensità della fluorescenza sulle nanoparticelle con il fondo di goccioline per i canali FITC, TRITC e Cy5 su tutti i punti temporali misurati per ogni singola gocciolina. Vengono mostrati i punti temporali 0, 4 (120 min) e 9 (240 min). Per verificare manualmente il corretto rilevamento di goccioline e cellule, vengono visualizzati anche i canali DAPI e BF. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

7. Calibrazione

NOTA: Per una lettura quantitativa, la calibrazione delle concentrazioni di citochine ai valori di rilocazione della fluorescenza deve essere eseguita una sola volta, poiché possono verificarsi differenze tra diverse configurazioni sperimentali. Tutti i passaggi necessari sono descritti in dettaglio nelle sezioni precedenti del protocollo, come riferimento.

1. Preparare le nanoparticelle come descritto nel passaggio 2.
2. Ricostituire le proteine umane ricombinanti IL-6, TNFα e IL-1β secondo le istruzioni del produttore.
   NOTA: Assicurarsi che le aliquote congelate vengano scongelate una sola volta e utilizzate tempestivamente.
3. Preparare una serie di diluizioni 2 volte per tutte e tre le proteine insieme utilizzando terreni completi (10% FBS, 1% Pen/Strep, 25 mM HEPES) con una concentrazione iniziale di 80 nM fino a 0,625 nM.
4. Eseguire l'incapsulamento come descritto nel passaggio 4 con nanoparticelle funzionalizzate nella prima e RPMI solo nella seconda fase acquosa. Questa misurazione funge da bianco e la deviazione standard misurata viene utilizzata per l'analisi dei dati in un secondo momento.
5. Attendere 5 minuti e acquisire l'immagine delle goccioline come descritto al punto 5. Scatta 3 immagini con una dimensione dell'array di 2 x 2 nei rispettivi canali di fluorescenza.
6. Ripetere i passaggi 7.4 e 7.5 con tutte le soluzioni di calibrazione preparate, iniziando dalla concentrazione più bassa e terminando con la concentrazione più alta.
7. Analizza le immagini come descritto nel passaggio 6. Non utilizzare l'opzione WD per il canale DAPI e impostare Tracking su No.
8. L'analisi produce valori di riposizionamento della fluorescenza per ogni gocciolina misurata in un'immagine. Estrarre la mediana e la deviazione standard per ogni canale di fluorescenza. Calcolare la media della mediana e della deviazione standard per ogni immagine misurata per concentrazione.
9. Genera una curva di calibrazione tracciando la rilocazione mediana media rispetto alle concentrazioni misurate di ciascuna proteina ricombinante.
10. Adattare le curve utilizzando un'associazione monofase: ,
    dove Y = rilocazione a x, Y₀ = rilocazione della misura in bianco e x la concentrazione utilizzata. La curva di calibrazione ottenuta viene utilizzata per quantificare i valori di rilocazione come descritto al punto 8.
    NOTA: Adattare solo i valori fino alla rilocazione misurata più alta ed escludere i valori da concentrazioni più elevate con una rilocazione misurata inferiore. Si prevede una diminuzione dei valori di rilocazione misurati a concentrazioni più elevate e si verifica a causa dell'effetto Hook e della limitata capacità di legame delle nanoparticelle.

8. Analisi dei dati

1. Escludi le goccioline con un valore TrackingMove superiore a 10, ovvero che si sono spostate di oltre 10 pixel nel corso della misurazione.
2. Identificare le goccioline contenenti cellule colorate (canale DAPI) nel primo punto temporale ordinando le goccioline con valori superiori a 0 nella colonna DAPI_WD_PosPxlPercent_1.
3. Identificare le goccioline contenenti cellule secernenti applicando i seguenti 3 criteri alla rilocazione della fluorescenza di ogni canale di fluorescenza (FluoChannel_BL_Ratio_t colonne).
   1. Identificazione delle goccioline con valori di rilocazione crescenti, ordinando una pendenza positiva nel tempo di misurazione.
   2. Identificazione di goccioline con valori di rilocazione che raggiungono il limite di rilevabilità (LOD). Una gocciolina viene selezionata quando la rilocazione massima della fluorescenza nel tempo di misurazione è superiore al LOD, calcolato come descritto altrove²⁵: , dove μ_{Rilocazione t0} è la mediana di tutti i valori di rilocazione al punto temporale 0 e σ_BLK la deviazione standard del bianco misurata durante la calibrazione, ciascuno è specifico per le citochine.
   3. Verificare che l'aumento del valore di rilocazione sia significativo controllando che la variazione tra la rilocazione di fluorescenza massima e minima misurata nel tempo di misurazione sia superiore a: .
4. Identificare le cellule co-secernenti soddisfacendo i criteri descritti al punto 8.3. per più di un canale di fluorescenza contemporaneamente.
5. Ripetere il passaggio 8.3. per tutte le goccioline che non contengono cellule (DAPI_WD_PosPxlPercent_1 = 0). Utilizzare queste goccioline per calcolare la percentuale di falsi positivi.
6. Determinare il valore λ accurato della misurazione selezionando casualmente 200 - 500 goccioline e ispezionandole con la funzione Verifica e ordinamento del software di analisi delle immagini. Conta il numero di cellule in queste goccioline e calcola:
   λ = numero di cellule contate / numero di goccioline analizzate
7. Calcolare il numero totale di celle incapsulate per la misurazione mediante:
   Conta totale delle cellule = λ × numero di goccioline analizzate
8. Calcola la percentuale di cellule secernenti utilizzando il conteggio delle cellule determinato. Inoltre, calcolare la percentuale di falsi positivi per ogni citochina (di solito inferiore al 3%-5% rispetto al numero di positivi reali per canale) e utilizzarli come controllo interno per la coerenza e la riproducibilità sperimentale.
9. Per calcolare le concentrazioni di citochine secrete, convertire i valori di rilocazione in concentrazione utilizzando le equazioni di calibrazione stabilite dal passaggio 7.10.
10. Calcolare il tasso di secrezione (SR) tra i punti temporali utilizzando l'equazione seguente.
    
11. Calcola il tasso medio di secrezione durante la misurazione facendo la media dei singoli tassi di secrezione tra i punti temporali. Se la rilocazione massima misurabile è stata raggiunta prima della fine della misurazione, impostare la concentrazione sulla concentrazione massima misurabile (questo valore è specifico per le citochine e corrisponde alla concentrazione massima misurata e utilizzata nella curva di calibrazione al punto 6.10) e non calcolare ulteriori concentrazioni. Calcola il tasso di secrezione e la media solo fino a questo punto temporale.
    NOTA: Se vengono rilevate meno di 50 cellule secernenti in un canale di fluorescenza, le goccioline devono essere esaminate visivamente attraverso la funzione di verifica e ordinamento e le goccioline con aggregati di fluorescenza o nanoparticelle possono essere escluse dall'analisi.
12. Per estrarre ulteriori parametri dalla curva di secrezione di ogni singola cellula, eseguire un adattamento dei minimi quadrati alla curva tempo-concentrazione per ogni cellula e citochina utilizzando uno script Python personalizzato (disponibile su richiesta). La funzione adattata è una curva sigmoidale che segue la formula descritta di seguito (gli accoppiamenti con R²<0,95 sono esclusi dai passaggi seguenti):
    
    dove C corrisponde al plateau di concentrazione [nM], t₅₀ allo spostamento del semimassimo [s] e m al pendio della collina [^min-1]. Da questi parametri vengono estratti i seguenti descrittori di curva come descritto di seguito.
    1. C_max [nM]: concentrazione massima misurata.
    2. : Tempo di inizio della secrezione, dove l'adattamento raggiunge il 10% di C.
    3. : tasso di secrezione come la pendenza lineare approssimata della curva tra il 10% e il 90% della curva tempo-concentrazione.

Risultati

La piattaforma funzionale a cella singola presentata ha permesso la misurazione di diversi parametri. Innanzitutto, e in modo simile alle tecniche standard, la frequenza di secernenza delle cellule viene illustrata alla fine della misurazione (Figura 4A). Dopo la stimolazione con 1 μg/mL di lipopolisaccaride (LPS) per 6 ore di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), il 5,81% delle cellule ha secreto IL-6 (n= 1270), il 4,55% TNFα (n= 995) e il 6,06% IL-1β (n= 1326).

Per quantificare la secrezione di citochine, sono state generate curve di calibrazione con concentrazioni note di citochine ricombinanti (Figura 4B). Queste curve di calibrazione consentono la quantificazione delle concentrazioni di citochine in gocciolina nel tempo. A titolo esemplificativo, la concentrazione media di IL-6 nelle goccioline ha raggiunto un plateau dopo 90 minuti per le PBMC stimolate con LPS, mentre la media nelle goccioline di IL-1β è aumentata più rapidamente da 90 minuti, mostrando la risoluzione dinamica della piattaforma e la possibilità di estrarre sottopopolazioni cellulari che secernono citochine specifiche (Figura 4C). Poiché la concentrazione cambia tra i punti di misurazione, è possibile calcolare i tassi di secrezione dinamica per citochina. Considerando il tasso medio di secrezione per ciascuna citochina (Figura 4D), le cellule secernenti IL-6 hanno mostrato una diminuzione costante del tasso medio di secrezione, mentre le cellule secernenti TNFα e IL-1β hanno entrambe mostrato un aumento del tasso di secrezione dopo 90 minuti di misurazione e una seconda diminuzione dopo 150 minuti.

Inoltre, è possibile raggruppare le cellule in sottopopolazioni a seconda delle citochine secrete e co-secrete (Figura 4E). Qui, IL-6 e TNFα sono a secrezione singola rispettivamente dal 30,2% e dal 26,4% delle cellule che secernono IL-6 o TNFα, mentre le cellule IL-1β a secernenza singola costituiscono il 68,8% di tutte le cellule secernenti IL-1β. Inoltre, gli effetti della co-secrezione sulle concentrazioni secrete e sui tassi di secrezione possono essere risolti (Figura 4F). Osservando le cellule che secernono IL-6, sono state secrete diverse quantità di IL-6 se le cellule producevano anche TNFα o IL-1β. Allo stesso modo, la distribuzione dei tassi medi di secrezione durante la misurazione differiva statisticamente tra le cellule che secernono solo IL-6 o IL-6 insieme a TNFα (tassi di secrezione più elevati) e IL-1β (tassi di secrezione IL-6 più bassi).

Figura 4: Risultati rappresentativi di IL-6, TNFα e IL-1β che secernono PBMC dopo 6 ore di stimolazione con 1 μg/mL di LPS. (A) Percentuale di PBMC che secerne IL-6, TNFα e IL-1β alla fine della misurazione di 4 ore. (B) Le curve di calibrazione delle citochine multiplexate sono generate con concentrazioni note di citochine ricombinanti. Ciò consente la quantificazione degli esperimenti cellulari calcolando dal valore di rilocazione la concentrazione di citochine all'interno della gocciolina. I punti sono stati adattati utilizzando un accoppiamento della curva di associazione monofase non lineare, r²=0,9926 (IL-6), 0,9901 (TNFα), 0,9990 (IL-1β). (C) Concentrazioni medie secrete di IL-6, TNFα e IL-1β rilasciate dalla secrezione di PBMC nel tempo di misurazione di 4 ore. (D) Tassi medi di secrezione di IL-6, TNFα e IL-1β nel tempo di misurazione di 4 ore. (E) Percentuale relativa di cellule co-secernenti che secernono IL-6, TNFα o IL-1β e loro combinazioni. Normalizzato a tutte le cellule secernenti rilevate per ciascuna citochina. (F) Concentrazioni medie di IL-6 nel tempo di misurazione e distribuzioni medie del tasso di secrezione (log) per le cellule secernenti IL-6 con risoluzione della co-secrezione (n=383 solo per IL-6, n=531 per IL-6 + TNFα, n= 213 per IL-6 + IL-1β e n=143 per IL-6+TNFα+IL-1β). Le differenze statistiche nelle distribuzioni del tasso di secrezione sono state valutate utilizzando test di Kolmogorov-Smirnov a due lati, non accoppiati, non parametrici con confidenza del 95%, il valore p è rappresentato. ** (p <0,002) e **** (p <0,0001). La linea completa rappresenta la mediana e la linea tratteggiata i quartili. n_{celle totali} = 21 866. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per estrarre ulteriori informazioni a livello di singola cellula, è possibile adattare una funzione sigmoidea ai punti di concentrazione-tempo di ciascuna cellula e citochina (Figura 5). Un set di dati esemplificativo sulla concentrazione nel tempo per una cella e il corrispondente adattamento sigmoidale sono illustrati nella Figura 5A. Qui, la procedura di adattamento dei minimi quadrati produce i seguenti parametri: C, corrispondente al valore di plateau superiore della curva, t₅₀ che quantifica lo spostamento temporale della curva da zero, e il pendio di Hill m, che descrive la pendenza della parte ascendente della curva sigmoidea con valori di concentrazione del 10% e del 90% raggiunti durante la misurazione. Da questi parametri di adattamento, è possibile estrarre alcuni descrittori di curva come spiegato nel passaggio 7.12. ottenendo C_max, il valore di concentrazione più alto dei dati, t_start, il tempo di inizio della secrezione, definito come il raggiungimento del 10% del valore di concentrazione del plateau superiore, e SR_lin, il tasso di secrezione durante la parte ascendente della curva.

Per classificare le sottopopolazioni cellulari, i descrittori della curva ottenuti da tutti gli adattamenti di singole cellule sono stati classificati in tre categorie ciascuno: i valori di C_max sono stati raggruppati in basso, medio e alto per t_inizio in precoce, medio e tardivo e SR_lin in secretori lenti, medi e veloci. Per illustrare questa classificazione, vengono mostrate quattro curve esemplari di secrezione di singole cellule e i corrispondenti descrittori della curva (Figura 5A-D), dove la curva A mostra le caratteristiche di un secretore basso precoce di media velocità, la curva B è un secretore precoce, lento e alto, la curva C un secernente alto veloce precoce e la curva D mostra una secrezione bassa tardiva. È importante notare che i limiti per questi criteri sono specifici per cellule, citochine e parametri del saggio e devono essere adattati per ogni domanda di ricerca. Inoltre, qui è stata considerata solo la secrezione di IL-6 di PBMC dopo stimolazione di LPS di 1 μg/mL per 6 ore, il che significa che la maggior parte delle cellule erano secernenti precoci e alti rispettivamente con l'80% e il 79% (Figura 5E-F). Per quanto riguarda il tasso di secrezione, è stata osservata una risposta bipolare con il 55% delle cellule secernenti IL-6 come secernenti lenti e il 39% come secernenze veloci (Figura 5G).

Per caratterizzare ulteriormente il comportamento della secrezione, i descrittori della curva per ciascuna cellula sono stati tracciati l'uno contro l'altro e sono stati estratti diversi cluster (Figura 5H-J). Non viene fornita una chiara correlazione tra_l'inizio del t e il C_max (Figura 5H): le due popolazioni più grandi erano secernenti bassi precoci e secernenti alti indipendenti dall'inizio della secrezione. Considerando la relazione tra t_start e SR_lin (Figura 5I), la maggior parte delle cellule erano secernenti lenti precoci con una chiara popolazione di secernori alti precoci e pochi secernori lenti/medio-tardivi. Per quanto riguarda le correlazioni tra SR_lin e C_max (Figura 5J), non erano presenti quasi secernenti veloci da bassi a medi, con solo una popolazione più ampia di secretori bassi veloci. Inoltre, c'era una grande popolazione di secernenti veloci che non dipendevano dalla concentrazione massima misurata, e due popolazioni di secernenti alti secernevano lentamente o velocemente. In sintesi, si può concludere che lo studio della relazione tra i descrittori della curva per le singole cellule produce un'analisi molto più dettagliata e può potenzialmente estrarre nuove scoperte biologiche dalle misurazioni della secrezione di singole cellule.

Con l'analisi introdotta sopra, abbiamo estratto la dinamica di secrezione delle cellule co-secernenti (Figura 6). Due curve di esempio mostrano diverse dinamiche di co-secrezione per IL-6 e TNFα da due singole cellule con un inizio simultaneo di entrambe le citochine (Figura 6A), o un inizio sequenziale della secrezione, con IL-6 che viene secreto per primo (Figura 6B). Per classificare tutte le cellule co-secernenti, è stato definito un ritardo di secrezione di 60 minuti, dove tutte le cellule che iniziano la secrezione all'interno di questo intervallo sono considerate secernenze simultanee e tutte le cellule con ritardi più lunghi sono considerate secernenze sequenziali. Questa analisi ha anche permesso di osservare quale citochina è stata secreta per prima. Per IL-6 e TNFα, è stata osservata principalmente una co-secrezione simultanea nel 76% delle cellule (Figura 6C), mentre per IL-6 e IL-1β, la co-secrezione sequenziale è stata osservata nell'86% delle cellule, con IL-6 che è stata la prima citochina ad essere secreta nella maggior parte dei casi (Figura 6D).

Osservando l'ora di inizio della secrezione per le diverse citochine per tutte le singole cellule co-secernenti, negli esperimenti eseguiti non è stata osservata una chiara correlazione tra i tempi di inizio della secrezione. Per la co-secrezione di IL-6 e TNFα (Figura 6E), era presente un cluster verticale più grande intorno a 0 minuti, corrispondente alle cellule co-secernenti che iniziavano prevalentemente con IL-6. Per la co-secrezione di IL-6 e IL-1β (Figura 6F), la maggior parte delle cellule ha iniziato a secernere IL-6 intorno all'inizio della misurazione, mentre IL-1β è stata secreta principalmente più tardi. In sintesi, l'analisi qui presentata ha permesso l'identificazione di diverse sottopopolazioni secretorie e complesse dinamiche di co-secrezione di citochine.

Figura 5: Analisi dettagliata di diversi pattern dinamici di secrezione per le curve delle singole cellule secernenti IL-6. (A) Dati rappresentativi della concentrazione di citochine a singola cellula nel tempo di misurazione con la curva sigmoidea adattata e i parametri estratti. (B-D) Tre curve di concentrazione di citochine a singola cellula esemplari per i diversi tipi di secernenti di citochine riscontrati per la secrezione di IL-6 dopo stimolazione con LPS. (E-G) Percentuali di cellule secernenti IL-6 classificate nei diversi tipi di secernenti con i seguenti criteri (n=633): E. C_max: bassa <5 nM, alta >19,5 nM, F. t_inizio: precoce <30 min, tardiva >120 min, G. SR_lin: lenta <250 molecole/s, veloce >750 molecole/s. (H-J) Relazione tra i tre descrittori della curva di secrezione C_max, t_start e_{SR lin} per ogni singola cella (n=633). L'ampia popolazione a C_max=20nM deriva dal raggiungimento del limite di rilevamento superiore del saggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Estrazione di pattern di co-secrezione da curve di concentrazione di singole cellule. (A-B) Curve di concentrazione rappresentative per singole cellule che co-secernono IL-6 e TNFα (A) simultaneamente e (B) rispettivamente, in sequenza. (C-D) Percentuale di cellule che mostrano co-secrezione simultanea e sequenziale di IL-6 e TNFα (n=249), o IL-6 e IL-1β (n=72), rispettivamente. La secrezione sequenziale è definita attraverso il ritardo tra gli inizi della secrezione di citochine di oltre 60 minuti. I colori indicano quale delle citochine ha iniziato per prima la secrezione. (E-F) Relazione tra i tempi di inizio della secrezione per le diverse citochine per ciascuna cellula secernente (n_IL6-TNFα=249, n_IL6-IL1β=72). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il rilascio e la secrezione di citochine sono frequentemente studiati in immunologia e medicina clinica³. Una secrezione squilibrata di citochine può portare a effetti dannosi per i pazienti che soffrono di infezioni, ma anche in malattie neurologiche, infiammazioni o cancro 26,27,28. Anche se la loro importanza per la salute e la malattia è ben consolidata, lo studio delle citochine e delle loro cellule secernenti rimane impegnativo poiché le attuali metodologie non sono in grado di rilevare e quantificare con precisione le citochine originate da una singola cellula in modo risolto nel tempo. Per il flusso di lavoro qui presentato, è stato utilizzato un protocollo di stimolazione stabilito con PBMC ed è stata misurata la loro secrezione di IL-6, TNF-α e IL-1β. La scelta di utilizzare le PBMC al posto di singole sottopopolazioni purificate è derivata dalla precedente applicazione per studiare le sindromi da rilascio di citochine (CRS)²³, una condizione caratterizzata da concentrazioni plasmatiche altamente elevate di citochine pro-infiammatorie, tra cui IL-6, TNF-α e IL-1β²⁹. Poiché la CRS di solito non è collegata a una sola popolazione, abbiamo utilizzato le PBMC in quanto sarebbero presenti in vivo. Tuttavia, le sottopopolazioni cellulari possono essere purificate e valutate individualmente, se la questione scientifica richiede questo passo. Il tempo di incubazione, le condizioni di stimolazione e gli intervalli di analisi dinamici sono stati ottimizzati per misurare la secrezione per le tre citochine di interesse. Il flusso di lavoro e i dati qui presentati dimostrano come impostare, calibrare, quantificare, misurare e analizzare la secrezione di più citochine di più citochine risolta nel tempo. Questo protocollo fornisce un modello su come l'analisi multifunzionale della secrezione di citochine potrebbe consentire l'ampia diversità funzionale e dinamica della citochina secreta nei pazienti.

Diversi aspetti cruciali del protocollo di analisi descritto consentono una lettura biologica unica. In primo luogo, l'incapsulamento di una singola cellula in goccioline microfluidiche ha permesso l'estrazione di dati per ogni singola cellula. Gli eventi di incapsulamento di più cellule possono essere rilevati e ordinati mediante analisi delle immagini, a seconda della domanda di ricerca. In secondo luogo, l'inclusione di diversi saggi immunologici fluorescenti in goccioline indipendenti e l'allineamento delle nanoparticelle funzionalizzate hanno permesso la misurazione quantitativa di un massimo di tre concentrazioni di citochine in parallelo. Questo multiplexing ha permesso l'analisi dei modelli di co-secrezione di citochine a livello di singola cellula. In terzo luogo, l'immobilizzazione delle goccioline ha permesso la misurazione nel tempo e la correlazione della secrezione di citochine per ciascuna cellula secernente e ha permesso di distinguere la secrezione co-occorrente da quella sequenziale. La risoluzione temporale ha fornito in modo univoco dati sui modelli di secrezione e sulle sottopopolazioni di diversi tipi di secretori. Infine, l'analisi parallela delle immagini ha consentito l'estrazione e il monitoraggio efficienti di grandi quantità di dati da misurazioni con oltre 20.000 singole cellule. L'estrazione da singole curve di secrezione ha inoltre permesso la scoperta di sottopopolazioni e funzionalità fenotipiche.

Oltre alla sua lettura unica, il test presenta anche vantaggi tecnici rispetto all'analisi standard delle citochine. Grazie alle dimensioni ridotte dei compartimenti di incapsulamento di circa 60 pL, le quantità assolute di citochine secrete possono essere rilevate direttamente dalla fonte biologica con limiti di rilevamento che si adattano alla secrezione cellulare. La miniaturizzazione del saggio utilizza anche quantità minori di costosi bioreagenti. Inoltre, l'allestimento richiede pochissime attrezzature specializzate, che spesso sono già disponibili nei laboratori di biologia e bioingegneria. I microscopi a fluorescenza sono ampiamente disponibili e le pompe a siringa sono spesso utilizzate nei laboratori di bioingegneria o possono essere acquistate a un costo relativamente basso. Se è presente una coltura cellulare, il costo per l'intera attrezzatura necessaria per eseguire gli esperimenti è di circa 148.000 euro, con la maggior parte del contributo del microscopio epifluorescente automatizzato (130.000 euro). Tuttavia, uno strumento del genere si trova spesso nei laboratori biologici e il resto del costo viene distribuito alla pompa a siringa (13.000 euro, ma sono disponibili alternative più economiche) e alle apparecchiature più piccole. La fabbricazione del chip di goccioline e della camera di osservazione è molto ben descritta¹⁷ e può essere eseguita al di fuori di un ambiente di camera bianca con le infrastrutture necessarie, come forni e pulitori al plasma presenti nella maggior parte dei laboratori di bioingegneria. In alternativa, sono disponibili diversi fornitori per fornire ai laboratori interessati chip generatori di gocce. A causa dei piccoli volumi necessari, il test è economico e semplice da configurare.

Per garantire il massimo grado di riproducibilità, abbiamo identificato alcuni passaggi critici per il successo del protocollo. Un problema comune per gli utenti alle prime armi è il movimento delle goccioline durante la misurazione. Mentre il software di analisi è in grado di tracciare le singole goccioline in una certa misura, un movimento eccessivo porta alla perdita di risoluzione delle singole cellule e a risultati imprecisi. I movimenti possono essere evitati utilizzando camere di misura adeguatamente ermetiche, dimensioni corrette delle gocce e della camera, un breve periodo di equilibrio prima di iniziare la misurazione e una corretta concentrazione di tensioattivo. Un altro passaggio critico è la messa a fuoco accurata prima di iniziare la misurazione. Una focalizzazione impropria porta a valori di riposizionamento della fluorescenza significativamente più bassi e alla sottostima della quantità di citochina secreta. Infine, a seconda della domanda e del protocollo in questione, la tempistica corretta tra le diverse fasi è della massima importanza per la riproducibilità. In particolare, il tempo di attesa tra il riempimento della camera e l'avvio della misurazione dovrebbe essere costante, altrimenti la finestra di misurazione delle citochine secrete potrebbe essere persa.

I limiti della tecnologia presentata includono la limitata capacità di manipolare ulteriormente le cellule dopo l'incapsulamento. Pertanto, al momento non è possibile aggiungere o rimuovere stimolanti, anticorpi o reagenti aggiuntivi. Inoltre, poiché le cellule sono incapsulate nel loro bioreattore isolato, durante la misurazione non possono verificarsi interazioni tra le cellule (segnalazione basata sul contatto o paracrina). Questa limitazione può essere parzialmente superata con incubazioni di massa in anticipo. Inoltre, sono possibili anche effetti autocrini potenziati dalle citochine secrete e questi effetti non possono essere quantificati o esclusi con certezza, poiché vengono misurate solo le citochine secrete rilevate dagli anticorpi. Quindi, la visione isolata sulla secrezione di citochine deve sempre essere descritta nel contesto della domanda e dell'applicazione corrispondenti. Tuttavia, questa limitazione potrebbe essere utilizzata anche per lo studio dettagliato di multipli incapsulati, doppietti e triplette, se di interesse. Ciò fornirebbe una configurazione interessante utile per indagare sul contatto cellula-cellula o su questioni basate sul sistema paracrino. Infine, anche il campo dinamico del test è limitato e necessita di adattamento all'applicazione specifica. Qui, abbiamo adattato l'intervallo dinamico del saggio alla quantità secernente prevista delle citochine misurate.

Per migliorare ulteriormente le capacità e l'applicabilità del test, in futuro potrebbero essere affrontati diversi sviluppi negli aspetti biologici, tecnici e di analisi dei dati. Dal punto di vista biologico, la misurazione di citochine aggiuntive, altre proteine secrete, marcatori metabolici o di superficie cellulare potrebbe essere integrata adattando il saggio. Inoltre, questo test potrebbe essere integrato in un flusso di lavoro insieme ad altri saggi basati su cellule per ampliare le letture (ad esempio, colorazione o sequenziamento con citometria a flusso). Inoltre, l'usabilità del test potrebbe essere semplificata, ad esempio creando un chip microfluidico integrato per la creazione e l'osservazione delle goccioline, consentendo così potenzialmente un'applicazione più ampia al di fuori dei laboratori di bioingegneria in un contesto clinico. Per quanto riguarda l'analisi dei dati, l'estrazione e il tracciamento delle informazioni dalle immagini potrebbero essere estesi migliorando l'automazione e utilizzando approcci di apprendimento automatico, ad esempio per rilevare la presenza e la posizione delle cellule e della linea di perline in ciascuna gocciolina senza marcatura fluorescente. In questo modo si aprirebbero ulteriori canali fluorescenti che potrebbero essere utilizzati per i saggi immunologici, con conseguente misurazione di un numero ancora maggiore di citochine in parallelo.

Il saggio presentato e i protocolli e le analisi associati possono essere applicati per diversi potenziali casi d'uso legati alla dinamica della secrezione di citochine. Più specificamente, il test potrebbe potenzialmente affrontare questioni immunologiche fondamentali come l'identificazione del tipo di cellula e dei profili di secrezione di citochine specifici per l'attivazione, la polifunzionalità delle cellule secernenti citochine o la temporalità e i meccanismi di mantenimento degli equilibri delle citochine. Inoltre, nelle applicazioni cliniche, la piattaforma potrebbe consentire di svelare il ruolo delle citochine durante le risposte infiammatorie attive o croniche, come osservato in COVID-19³⁰, o fornire uno strumento per stratificare i pazienti e personalizzare i trattamenti in base a firme uniche come nell'autoinfiammazione³¹. In conclusione, la valutazione quantitativa risolta nel tempo della secrezione di citochine da singole cellule è un metodo molto necessario in quanto chiarisce come un particolare farmaco, infezione, alterazione genetica o stimolazione ex vivo induca una particolare risposta.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
008-FluoroSurfactant	RAN Biotechnologies	008-FluoroSurfactant-10G
Creatore di gocce a focalizzazione del flusso a 2 flussi, 30 &; m ugello, trattamento superficiale idrofobico PFOS			Wunderli
Alexa Fluor 647 NHS Ester	ThermoFisher	A20006	https://www.thermofisher.com/ch/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/fluorescent-amine-reactive-alexa-fluor-dye-labeling-of-igm-antibodies.html
anti-umano IL-1β (Topo monoclonale), AF647 etichettato internamente	PeproTech	500-M01B
ARcare92524 nastro biadesivo	Adhesvies Reasearch	ARcare92524
Bio-Adembeads Streptavidin plus 300nm	Ademtech	Cat#03233
Biotinilato di capra Anti-Human IL-1β	PeproTech	500-P21BGBT
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059
Raschietto cellulare	TPP	99002
Kit di proliferazione cellulare viola CellTrace	Invitrogen	C34557	Soluzione di colorazione cellulare
Chromafil Xtra PTFE-45/25 filtri per siringa	Macherey-Nagel	729205
Costar a 6 pozzetti Clear Flat Parte inferiore Attacco ultra-basso	Corning	3471
Countess	Vetrini Invitrogen	C10283
D-Biotina	Fluorochem	M02926
DPBS, senza calcio, senza magnesio	Gibco	14196-094
epT.I.P.S. Standard 2-200 & micro; l	Eppendorf	30000889
Soluzione salina disodica di acido etilendiamminotetraacetico	Sigma-Aldrich	3690
EZ-LINK-NHS-PEG4-Biotina	ThermoFisher	A39259
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20217 Reagente bloccante FcR, umano	Miltenyi Biotec	130-059-901
Siero fetale bovino	Gibco	10270-106
Handy detersivo per piatti	Migros	5.01002E+11
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
HFE-7500 Oil 3M TM Novec	Fluorochem	B40045191
Idex F-120 Raccordo monopezzo a tenuta stagna, zigrinatura standard, PEEK naturale, tubo con diametro esterno 1/16", 10-32 anticorpo	Cole-Parmer	GZ-02014-15
IL-6 (MQ2-13A5 - ratto), FITC	ThermoFisher	11-7069-81
IL-6 anticorpo monoclonale (MQ2-39C3), biotina	ThermoFisher	13-7068-85
Siero di ricambio knockOut	ThermoFisher	10828-010
Loctite AA 3491 colla UV polimerizzabile	Henkel AG & Co	3491
Vetrini per microscopio (76x26x1mm, bianco trasparente)	Menzel Glä ser
Olio minerale luce	Sigma-Aldrich	330779
NanoPort Assembly senza testa, 10-32 Coned, per 1/16 "	OD Idex	N-333
Magnete a blocco al neodimio	K & J Magnetics	BZX082
Omnifix-F Spritze, 1 ml, LS	Braun	9161406V
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15140-122
Soluzione salina tamponata con fosfato	Sigma-Aldrich	P4417
Pluronic F-127, 0,2 µ m filtrato (10% di soluzione in acqua)	ThermoFisher	P6866
Salviette di precisione	Kimtech Science	5511
Microtubi in PTFE 0,30 & 0,76 mm	FisherScientific	1191-9445
Microtubi in PTFE 0,56 & 1,07 mm	FisherScientific	1192-9445
IL-1 umano ricombinanteβ	Peprotech	Cat#200-01B
IL-6 umano ricombinante	Peprotech	Cat#200-06
Albumina sierica umana ricombinante (HSA)	Sigma-Aldrich	A9731
TNF umano ricombinante-&alfa;	Peprotech	Cat#300-01A
Punzone per biopsia riutilizzabile diametro 0,75 mm e 6 mm	Stiefel	504529 e 504532
RPMI 1640 Medium, senza rosso fenolo	Gibco	11835-030
Standard LPS, E. coli K12	InvivoGen	tlrl-eklps
Aghi Sterican 23 G per microtubi di diametro 0,56 mm	FisherScientific	15351547
Aghi Sterican 27 G per microtubi di diametro 0,30 mm	FisherScientific	15341557
Anticorpo monoclonale TNF alfa (MAb11), anticorpo	ThermoFisher	12-7349-81
, biotinilato internamente	ThermoFisher	14-7348-85
Trypan Blue Stain (0,4%) per l'uso con i dispositivi Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	T10282
Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax	TPP	99500
Macchina da taglio automatica Cameo 4	Silhouette
Cetoni Base 120 + 3x NEMESYS Pompe siringa a bassa pressione Cetoni		NEM-B101-03 A
Countess II Contatore di cellule automatizzato	ThermoFisher
Microscopio a epifluorescenza invertita Ti2	Nikon	ECLIPSE Ti2-E, Ti2-E/B*1
OKO Gabbia da laboratorio Incubatrice, pannelli scuri	OKO Lab
ORCA-Fusion Fotocamera CMOS digitale	Hammatsu	C14440
SOLA Light Engine	Lumencor	sola 80-10247