Quantificazione della spina dendritica utilizzando un software di ricostruzione automatica dei neuroni tridimensionali

Le spine dendritiche sono sporgenze di dendriti che spesso comprendono il sito post-sinaptico delle sinapsi glutammatergiche ^1,2. Le spine dendritiche sono di particolare interesse nel campo della plasticità sinaptica. Le spine sono spesso alterate quando la forza sinaptica cambia, diventando più grandi e più forti nel potenziamento sinaptico a lungo termine o più piccole e più deboli nella depressione sinaptica a lungo termine 3,4,5,6,7. Oltre alla plasticità sinaptica, il profilo delle spine dendritiche cambia nel corso della vita. All'inizio dello sviluppo, c'è un periodo di formazione e crescita della spina dendritica, seguito da potatura della spina dendritica fino a raggiungere uno stato stazionario ^8,9,10. Nell'invecchiamento del cervello, la perdita della colonna vertebrale accompagna il restringimento cerebrale e il declino cognitivo¹¹. Inoltre, molti disturbi neurologici, neurodegenerativi e psichiatrici sono caratterizzati da spine dendritiche aberranti. Più regioni cerebrali in individui affetti da schizofrenia hanno meno spine dendritiche, probabilmente a causa di un'alterata potatura sinaptica¹². I disturbi dello spettro autistico sono caratterizzati anche da patologie della colonna vertebrale dendritica¹³. La perdita della spina dendritica è un segno distintivo sia del morbo di Alzheimer che del morbo di Parkinson^14,15. Data l'ampia gamma di argomenti di ricerca che comprendono le indagini sulle proprietà della colonna vertebrale dendritica, le tecniche per un'accurata quantificazione della colonna vertebrale sono di fondamentale importanza.

La colorazione, cioè il metodo Golgi, o la marcatura dei neuroni tramite riempimento di colorante o l'espressione di proteine fluorescenti sono metodi comuni per la visualizzazione della colonna vertebrale dendritica 16,17,18. Una volta visualizzate, le spine possono essere analizzate con una varietà di client software gratuiti e disponibili in commercio. L'output desiderato dell'analisi è un fattore importante per determinare quale software sarà più utile. Fiji è una valida opzione software per domande incentrate sulla densità della colonna vertebrale dendritica. Tuttavia, questa tecnica si basa in gran parte sul conteggio manuale che richiede molto tempo e che può introdurre il potenziale di distorsione. Nuovi plug-in come SpineJ consentono la quantificazione automatica, consentendo inoltre un'analisi più accurata del collo della colonna vertebrale¹⁹. Uno svantaggio di questi approcci è la perdita di un'analisi tridimensionale per determinare il volume della colonna vertebrale, poiché SpineJ è limitato a pile di immagini bidimensionali. Inoltre, ottenere informazioni sul sottotipo di colonna vertebrale diventa difficile attraverso questi processi. I quattro sottotipi predominanti di spina, sottile, a fungo, tozza e filopodia, connotano tutti funzioni individuali e sono in gran parte classificati attraverso la morfologia²⁰. Le spine sottili sono caratterizzate da un collo allungato e da una testa definita²¹. Le spine dei funghi hanno una testa della spina molto più grande e pronunciata²². Le spine tozze sono corte e hanno poca varianza tra la testa e il collo²³. I filopodi sono spine immature con un collo lungo e sottile e nessuna testa²⁴ chiaramente osservabile. Sebbene la classificazione fornisca informazioni preziose, le spine esistono su un continuum di dimensioni. La classificazione in categorie si basa su intervalli di misure morfologiche ^25,26. La misurazione manuale delle spine per la classificazione aggrava l'onere logistico per i ricercatori in questo approccio.

Altre opzioni software che si concentrano specificamente sull'analisi tridimensionale della colonna vertebrale dendritica sono più adatte per le indagini sul volume della colonna vertebrale e sulle proprietà del sottotipo 27,28,29,30,31. Nonostante le difficoltà presentate dall'analisi tridimensionale, come la scarsa risoluzione del piano z e lo striscio, queste opzioni software consentono una ricostruzione tridimensionale affidabile di dendriti e spine dendritiche in modo semi-automatizzato guidato dall'utente. La classificazione automatica delle spine identificate nei loro sottotipi è anche una caratteristica presente in alcuni di questi pacchetti software per l'analisi della colonna vertebrale. Ciò può migliorare le preoccupazioni relative al potenziale carico di lavoro e ai pregiudizi sperimentali. Neurolucida 360 è un software disponibile in commercio che consente l'identificazione e la classificazione tridimensionale della spina dendritica³² in modo affidabile e riproducibile. Qui, presentiamo un protocollo completo per preparare efficacemente il tessuto fissato, acquisire immagini e, infine, quantificare e classificare le spine dendritiche utilizzando questo software.

Tutte le procedure sugli animali hanno seguito le linee guida del National Institutes of Health degli Stati Uniti sull'uso degli animali nella ricerca intramurale e sono state approvate dal National Institute of Mental Health Animal Care and Use Committee.

1. Preparazione di fette fisse di ippocampo

1. Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di Ketamina/Xilazina (Ketamina: 100 mg/kg; Xilazina: 8 mg/kg). Convalidare l'anestesia tramite pizzicamento della coda e fissare il mouse alla piastra di perfusione.
2. Utilizzando grandi forbici chirurgiche, rimuovere la pelle e il pelo dal torace, consentendo una più facile visualizzazione della gabbia toracica sottostante.
3. Fai un taglio orizzontale al di sotto della larghezza della gabbia toracica, evitando il fegato e il diaframma. Usando una pinza fine, tira verso l'alto il processo xifoideo e taglia ogni lato laterale della gabbia toracica. Capovolgere la gabbia toracica fino alla regione del collo e fissarla in posizione usando una pinza per emostatico.
4. Inserire un ago a farfalla da 21 G nel ventricolo sinistro del cuore e iniziare a perfondere a temperatura ambiente 1x PBS a circa 5 ml/min. Fai un piccolo taglio nell'atrio destro con piccole forbici chirurgiche. Fondere con PBS fino a quando la soluzione che esce dall'atrio non diventa limpida.
5. Spegnere la pompa di perfusione per assicurarsi che non entrino bolle nel tubo. Posizionare il tubo dal PBS in paraformaldeide (PFA) ghiacciata al 4% in PBS. Perfondere con PFA a una velocità di 5 mL/min fino a quando l'animale non è completamente irrigidito, circa 25 mL.
   NOTA: Assicurarsi che il PFA sia fresco (non più di 1 settimana se il brodo viene conservato a 4° C) per un fissaggio ottimale.
6. Rimuovere la pelle dalla superficie del cranio con piccole forbici chirurgiche. Fai un taglio mediosagittale con piccole forbici chirurgiche lungo la fessura centrale del cranio. Eseguire tagli laterali rostrali rispetto al bulbo olfattivo e sopra il cervelletto.
7. Apri il cranio con una pinza sottile per esporre il cervello. Usando una spatola, estrai delicatamente il cervello dai bulbi olfattivi e mettilo nel 4% di PFA nel PBS durante la notte.
   NOTA: Per un protocollo più completo della perfusione dei roditori, fare riferimento a Gage et ^al.33.
8. Crioproteggere il cervello fisso sostituendo il 4% di PFA con il 15% di saccarosio in PBS per 1 giorno. Successivamente, sostituire il saccarosio al 15% con il saccarosio al 30% nella soluzione PBS per 1 giorno fino a quando il cervello non affonda nella soluzione.
9. Togliete il cervello dalla soluzione di saccarosio e mettetelo in una capsula di Petri con PBS. Taglia il cervelletto e il bulbo olfattivo usando una lama di bisturi.
10. Posizionare una piccola quantità, di 1-2 cm di diametro, di composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) sulla superficie del portacampioni. Montare il cervello coronalmente al portacampioni con la superficie di taglio caudale nell'OCT. Congelare rapidamente il cervello posizionando il portacampioni in ghiaccio secco polverizzato fino a quando non si congela visibilmente, circa 5-7 minuti.
11. Assicurarsi che l'angolo della lama del criostato sia impostato tra 0° e 5° per produrre sezioni uniformi. Regolare l'angolo della piastra del rullo per un appiattimento ottimale delle fette. Fare riferimento al manuale dell'apparecchiatura per istruzioni specifiche.
12. Posizionare il portacampioni nel criostato con la superficie ventrale del cervello più vicina alla lama. Tagliare il cervello in sezioni dell'ippocampo dorsale di 30 μm, scartando tutte le fette rostrali all'ippocampo.
    NOTA: Questa parte del protocollo può essere adattata a qualsiasi regione cerebrale desiderata. I passaggi 1.9-1.12 cambiano a seconda della regione di interesse.
13. Trasferire le fette dell'ippocampo dorsale al PBS. Usando un pennello, montare delicatamente le sezioni dell'ippocampo su un vetrino da microscopio. Rimuovere la soluzione in eccesso con tamponi di cotone o salviette delicate.
14. Applicare 100 μl di terreno di montaggio rigido sul vetrino del microscopio coprendo tutte le fette di cervello. Per evitare la formazione di bolle, abbassare lentamente il vetrino coprioggetti con una pinza sul mezzo di montaggio. Se si formano delle bolle, picchiettare delicatamente il vetrino coprioggetti con una pinza per consentirne la fuoriuscita. Lasciare che i vetrini si solidifichino per una notte prima di eseguire l'imaging.

2. Imaging confocale ad alta risoluzione

1. Utilizzare oculari a basso ingrandimento per identificare le celle fluorescenti. Passa a un obiettivo 63x (NA = 1,4) o superiore, applicando un mezzo di immersione adeguato all'obiettivo.
   NOTA: Per ottenere i migliori risultati, utilizzare un microscopio confocale a scansione laser con un obiettivo 63x o superiore.
2. Identifica segmenti dendritici ben marcati con sovrapposizione limitata per l'acquisizione delle immagini. Impostare la potenza e il guadagno del laser per garantire che i dendriti fluorescenti non siano saturi. Inoltre, la riduzione della velocità di scansione può fornire una migliore risoluzione dell'immagine.
3. Acquisisci z-stack che comprendono l'intero segmento dendritico per analisi future. Gli stack Z più grandi di 10 μm sono indesiderabili a causa del potenziale aggiunto di sovrapposizione dendritica nel piano z.
   NOTA: Utilizzare la dimensione z-step più piccola disponibile (0,2-0,7 μm) e 1 unità ariosa. La dimensione del passo più piccola si traduce in un maggior numero di immagini nello z-stack, compensando la limitata risoluzione Z di molti microscopi.
4. Opzionale: se disponibile, utilizzare la rispettiva funzionalità del software di deconvoluzione del microscopio per deconvoluzione delle immagini. Ciò consentirà di ottenere immagini a risoluzione più elevata.

3. Quantificazione della spina dendritica

1. Apri Neurolucida 360 (v2022.1.1 o successiva). Aprire il file immagine nel software di analisi del dorso (File > Apri > immagine). Assicurarsi che il file immagine sia visibile nella finestra principale e nell'ambiente 3D. Se la finestra dell'ambiente 3D non viene visualizzata, fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Ambiente 3D nella barra degli strumenti superiore della finestra principale nella scheda Traccia (Figura 1 supplementare)
   NOTA: Questa sezione del protocollo può essere adattata per qualsiasi immagine dendritica, non esclusivamente dendriti da tessuto di topo.
2. Nella scheda Modifica visualizzazione immagine della finestra Ambiente 3D, assicurarsi che l'immagine sia visualizzata come volume 3D nella casella Visualizza immagine come . Nella casella Impostazioni stack di immagini della scheda Immagine , selezionare Proiezione massima nel menu a discesa Mostra superficie come . (Figura supplementare 2)
3. Identificare un segmento dendritico adatto per il tracciamento.
   1. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sullo strumento Sposta punto di rotazione nella barra degli strumenti superiore della finestra Ambiente 3D . Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul dendrite desiderato per impostare un nuovo punto di rotazione. Questo cambierà l'orientamento per consentire uno zoom avanti efficace.
   2. Ristabilire l'orientamento originale facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sull'icona Reimposta orientamento . Dopo aver impostato il punto di rotazione, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sullo strumento Sposta punto di rotazione per iniziare a tracciare il dendrite. (Figura supplementare 2).
      NOTA: Il dendrite ideale è quello con una sovrapposizione limitata con altri dendriti in uno qualsiasi dei piani di coordinate e non si interseca con un altro dendrite o superficiale con un altro sottostante. Anche i dendriti in bassa vicinanza ad altri nel piano XY sono preferibili per prevenire l'assegnazione inappropriata di spine vicine al dendrite tracciato. Va anche notato che i dendriti di diversi spessori, ordini e distanze dal soma hanno diverse densità di spine dendritiche^34,35. Questo deve essere preso in considerazione nel disegno sperimentale. I dendriti di ordine secondario di <1,5 μm di spessore sono i candidati ideali per il tracciamento (Figura 1).
4. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sulla scheda Struttura della finestra Ambiente 3D . Fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Guidato dall'utente per la modalità di traccia e su Kernel direzionali come metodo in Opzioni di analisi guidata dall'utente.
5. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul dendrite quando appare un kernel circolare per iniziare il tracciamento. Spostare il cursore lungo il segmento dendritico. Questo popolerà automaticamente i kernel. Se i kernel non vengono popolati automaticamente, vedere il passaggio 3.51.
   1. Muovi delicatamente il cursore avanti e indietro sul dendrite fino a quando i chicchi non si popolano. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse per conservare i kernel rilevati esistenti. Se i kernel smettono di popolarsi, fare clic con il pulsante sinistro del mouse quando un kernel si popola più in basso nel dendrite per posizionarne uno manualmente. Fare clic con il pulsante destro del mouse per terminare il tracciamento. Assicurarsi che il dendrite tracciato abbia una lunghezza minima di 7 μm (Figura supplementare 3).
6. Verificare l'accuratezza del tracciamento dendritico utilizzando tutte e tre le direzioni dell'ambiente 3D, beccheggio, imbardata e rollio, facendo clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinando la finestra Ambiente 3D . Identificare i punti in cui il tracciato dendritico si trova al di fuori della posizione appropriata sul dendrite. Ci possono essere casi in cui sembra tracciato con precisione dall'alto verso il basso, ma nella dimensione z, i punti non sono sul dendrite (Figura 2).
7. Per correggere i segmenti dendritici tracciati in modo errato, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sulla scheda Modifica all'interno del menu Albero . Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul dendrite di interesse, quindi fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Punti.
8. Sposta i punti posizionati in modo errato sul segmento dendritico facendo clic e trascinando. Eliminare i punti estranei facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sul punto e facendo clic sul pulsante Elimina . Modificare la dimensione dei punti se il dendrite non è adeguatamente riempito. Per modificare le dimensioni del punto, fare clic con il pulsante sinistro del mouse su un punto e regolare il cursore dello spessore per modificare le dimensioni (Figura 4 supplementare).
   NOTA: I dendriti riempiti in modo inadeguato possono portare all'identificazione di false spine che sono componenti del segmento dendritico. Al contrario, il riempimento eccessivo dei dendriti può oscurare le vere spine.
9. Ripetere i passaggi 3.3-3.8 per più dendriti nell'immagine prima di procedere all'identificazione della colonna vertebrale nel passaggio 3.10.
10. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sulla scheda Dorso nella finestra Ambiente 3D. Imposta le impostazioni di rilevamento per la portata esterna, l'altezza minima e il numero minimo di voxel. A seconda della preparazione, potrebbe essere necessario modificare i valori preimpostati in caso di giustificazione chiara e specifica delle modifiche. Le condizioni preimpostate sono : Intervallo esterno: 2,5 μm, Altezza minima: 0,3 μm, Numero minimo di voxel: 10 Voxel.
    NOTA: Preparazioni diverse, come colture cellulari rispetto a tessuti acuti, così come diversi punti temporali dello sviluppo richiederanno criteri diversi che devono essere derivati dalla letteratura esistente. È inoltre fondamentale notare che la modifica delle impostazioni di rilevamento può alterare in modo significativo i risultati. Ad esempio, un'altezza minima più alta può escludere spine corte. Le impostazioni di rilevamento devono rimanere coerenti per l'intero corso dell'esperimento.
11. Impostare la sensibilità del rivelatore su 70 % e fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Rileva tutto. Questo popolerà le spine identificate da questa sensibilità del rivelatore su tutti i dendriti. Se si desidera selezionare le spine in modo specifico per i dendriti, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sulla casella Fare clic sull'immagine per rilevare tutto sul ramo più vicino e fare clic con il pulsante sinistro del mouse su ciascun dendrite manualmente con diverse sensibilità del rivelatore.
    NOTA: In questa fase è normale che non tutte le spine dendritiche si popolino. Allo stesso modo, le non spine possono popolarsi in modo improprio. Anche la sensibilità iniziale del 70% è flessibile; Questo può cambiare a seconda della preparazione.
12. Esaminare le spine selezionate da questa sensibilità del rivelatore facendo clic e trascinando il dendrite in tutte e tre le direzioni. Se la maggior parte delle spine rilevate non è completamente riempita, procedere al passaggio 3.12.1. Se le spine rilevate sono troppo piene, procedere al passaggio 3.12.2. Se le spine rilevate sembrano essere adeguatamente riempite, procedere al passaggio 3.13.
    1. Aumentare la sensibilità del rivelatore del 5%-10% e fare nuovamente clic con il pulsante sinistro del mouse su Rileva tutto . Questo sostituirà tutte le spine rilevate in precedenza con quelle nuove a una sensibilità più elevata. Ripetere se necessario fino a quando le spine rilevate non sono adeguatamente riempite.
    2. Diminuire la sensibilità del rivelatore del 5%-10% e fare nuovamente clic con il pulsante sinistro del mouse su Rileva tutto . Questo sostituirà tutte le spine rilevate in precedenza con quelle nuove a sensibilità inferiore. Ripetere se necessario fino a quando le spine rilevate non sono adeguatamente riempite.
13. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Mantieni spine esistenti nella scheda Spine dell'ambiente 3D. Se è stata selezionata l'opzione Fai clic sull'immagine per rilevare tutto nel ramo più vicino , deselezionarla.
    NOTA: Selezionando Mantieni spine esistenti, si garantisce che le spine dendritiche appena identificate manualmente non sovrascriveranno le spine precedentemente identificate. Assicurati che questa casella sia selezionata prima di procedere in modo da non sovrascrivere il lavoro precedente.
14. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Sposta punto di rotazione e fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul dendrite che richiede un ulteriore rilevamento della spina dorsale per impostare il punto di rotazione.
    1. Deselezionate Sposta punto di rotazione. Identificare una spina dendritica non riempita. Aumentare la sensibilità del rivelatore del 10%-20% rispetto al rilevamento precedente e fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul dorso. Se la spina dorsale rilevata è troppo bassa o eccessiva, procedere al passaggio 3.14.3 o 3.14.4. Se il dorso non viene popolato, verrà visualizzato il messaggio Impossibile rilevare un dorso nella posizione selezionata . In questo caso, procedere al passaggio 3.14.2.
    2. Aumentare la sensibilità del rivelatore in modo incrementale, possibilmente oltre il 100%, fino a quando la colonna vertebrale non è stata rilevata e riempita adeguatamente. Se la colonna vertebrale viene rilevata ma riempita in modo inadeguato, procedere al passaggio 3.14.3. Se il dorso è troppo pieno, procedere al passaggio 3.14.4 (Figura 3).
    3. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sulla scheda Modifica e fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul dorso non riempito. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Rimuovi. Deselezionate la scheda Modifica . Aumenta la sensibilità del 5%-10% e fai clic con il pulsante sinistro del mouse sul dorso. Ripetere questo passaggio se la colonna vertebrale è ancora poco riempita.
    4. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sulla scheda Modifica e fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul dorso troppo pieno. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Rimuovi. Deselezionate la scheda Modifica . Diminuire la sensibilità del 5%-10% e fare clic sul dorso. Ripetere questo passaggio se la colonna vertebrale è ancora troppo piena.
15. Ripetere i passaggi 3.14-3.14.4 fino a quando non sono state rilevate tutte le spine identificate dall'identificazione visiva. Ricontrolla il dendrite per eventuali spine appartenenti a dendriti vicini, false spine corrispondenti a nessun segnale vero o potenziali segmenti di dendrite erroneamente etichettati come spine. Elimina questi falsi dorsi con la funzione Rimuovi .
16. Esaminare le spine identificate sul dendrite. In alcuni casi, più spine possono apparire come una spina del conglomerato. Se un dorso sembra comprenderne due, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sulla scheda Modifica . Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul dorso e fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Nascondi selezione. Dopo aver confermato un dorso di conglomerato, nella scheda Modifica , fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Mostra selezione e selezionare Dividi. Se in un conglomerato sono presenti più di due spine, potrebbe essere necessario ripetere questo passaggio (Figura 4).
    NOTA: Se la spina del conglomerato non si spacca dopo il passaggio 3.16, rimuovere la spina dorsale. Quindi selezionare la spina dorsale più intensa del conglomerato a una sensibilità inferiore. Una volta riempita la colonna vertebrale più intensa, aumentare la sensibilità per selezionare l'altra colonna vertebrale non riempita. In alternativa, l'eliminazione della spina del conglomerato e quindi l'aumento della sensibilità possono consentire una corretta scissione.
17. Dopo aver rilevato e riempito in modo appropriato tutte le spine visivamente identificabili, nella scheda Spine fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Classifica tutto per classificare le spine in quattro sottotipi: sottile, a fungo, tozza e filopodia (Figura 5).
    NOTA: I parametri di classificazione del dorso possono essere modificati nella finestra Impostazioni della casella Classificazione nella scheda Dorso. Come per le impostazioni del rivelatore, è fortemente incoraggiata una chiara motivazione per la modifica dei parametri esistenti. I valori preimpostati sono rapporto testa-collo: 1,1, rapporto lunghezza-testa: 2,5, dimensione della testa a fungo: 0,35 μm, lunghezza Filopodium - 3 μm.
18. Nella barra degli strumenti superiore della finestra Ambiente 3D, selezionare Salva e visualizza in Neurolucida Explorer. Neurolucida Explorer è il luogo in cui vengono raccolti i dati dai tracciati. L'opera verrà salvata come file .dat contenente tutti i tracciati e i dorsi.
19. Nella finestra Esplora risorse nella scheda Visualizza , fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Seleziona tutto per evidenziare tutti i dendriti e le spine.
20. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sulla scheda Analizza nella barra degli strumenti superiore. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul menu a discesa Struttura . Fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Analisi struttura ramificata.
21. A seconda delle variabili di interesse, è possibile selezionare una qualsiasi delle analisi. I due più utili per le domande incentrate sulla densità della colonna vertebrale e sul volume medio della colonna vertebrale sono Ogni albero > ogni dendrite e Spine > Dettagli della colonna vertebrale. Seleziona OK e i dati verranno visualizzati in due finestre separate.
22. Copia i dati in un foglio di calcolo per un'ulteriore compilazione e analisi.
    NOTA: Il singolo albero sarà separato da dendrite, ma il volume della colonna vertebrale non lo sarà. Utilizzando la funzione di ordinamento nel foglio di calcolo, i dettagli del dorso possono essere filtrati in base alle funzioni.

L'utilizzo efficace di questo metodo di analisi inizia con la selezione dei segmenti dendritici per il tracciamento. Come descritto nella Figura 1, i dendriti ideali per il tracciamento non sono in prossimità di altri dendriti. I dendriti che corrono in parallelo possono portare all'identificazione impropria delle spine di un dendrite vicino. I dendriti che si intersecano direttamente o corrono perpendicolarmente in un diverso piano z aggiungono anche una notevole difficoltà per un tracciamento dendritico accurato. È anche importante notare le differenze nello spessore dei dendriti. Come riportato in precedenza, ci sono differenze chiave nella densità della colonna vertebrale con dendriti di spessore variabile36. Ci possono anche essere differenze nello stesso dendrite con una maggiore distanza dal punto di diramazione37. Tracciare dendriti dello stesso ordine e spessore, idealmente con origini simili nei punti di diramazione, può controllare l'eterogeneità esistente della densità delle spine dendritiche. Identificare il punto di ramificazione in alcune preparazioni può rivelarsi irrealizzabile, ma lo spessore del dendrite dovrebbe sempre essere un fattore controllabile nel tracciamento dei dendriti. Il tracciamento accurato dei segmenti dendritici è fondamentale per ottenere risultati accurati da questa analisi. È necessario assicurarsi che tutti i punti del dendrite tracciato siano veramente all'interno del dendrite. La visualizzazione del dendrite tridimensionale da diverse direzioni può aiutare in questo processo. Come dimostrato nella Figura 2A, B, la vista dall'alto verso il basso mostra quello che sembra essere un dendrite correttamente tracciato. Nella vista laterale; Tuttavia, numerosi punti non si trovano sul dendrite stesso. Questi problemi non sono presenti nella vista laterale della Figura 2C. È inoltre fondamentale assicurarsi che i dendriti siano riempiti correttamente durante il tracciamento. Un dendrite che è riempito in modo insufficiente può far sì che pezzi di dendriti vengano identificati in modo inappropriato come spine. Un dendrite troppo pieno può impedire l'identificazione delle vere spine a causa della soglia di altezza minima. Questa valutazione manuale del tracciato guidato dall'utente è fondamentale per consentire un'analisi accurata della colonna vertebrale dendritica.

L'identificazione delle spine dendritiche richiede anche un approccio guidato dall'utente. L'utilizzo della funzione "Rileva tutto" per impostare la soglia di sensibilità uniforme del rivelatore è inadeguato per numerosi motivi. L'utilizzo della funzione "Rileva tutto" è utile per identificare le spine più evidenti, ma il riempimento di queste spine deve essere controllato per verificare. Le spine identificate con l'iniziale "Rileva tutto" potrebbero essere poco riempite. Per correggere questo problema, la spina dorsale identificata deve essere eliminata individualmente e quindi reidentificata manualmente a una sensibilità del rivelatore più elevata (Figura 3A-C). Ciò garantisce che la colonna vertebrale sia adeguatamente riempita. C'è una sostanziale eterogeneità nella sensibilità del rivelatore richiesta per le spine che deve essere contabilizzata manualmente. L'aumento della sensibilità del rivelatore per rilevare tutti può causare spine eccessivamente piene, che richiedono anche una correzione manuale (Figura 3D). Un ulteriore problema con una sensibilità impropria del rivelatore è la creazione inappropriata di una spina conglomerata, una spina dendritica piena che comprende più spine. Due spine in stretta vicinanza l'una all'altra possono essere fuse in modo improprio in un'unica spina conglomerata (Figura 4A, B). Il software di rilevamento della colonna vertebrale dispone di una funzione "Split", che può essere utilizzata per separare le spine che sono state unite da un riempimento eccessivo. La funzione "Split" consente di generare facilmente le singole spine dalla spina del conglomerato (Figura 4C). L'accurato tracciamento dei dendriti e il riempimento della spina dendritica consentono una classificazione accurata in sottotipi di colonna vertebrale. La classificazione delle spine si basa sulla morfologia delle spine riempite e sulla distanza dai dendriti, quindi ogni fase del processo gioca un ruolo nella classificazione morfologica (Figura 5).

A causa della necessità di selezione e soglia manuali, è fondamentale seguire uno standard uniforme per tutte le analisi. Ciò è particolarmente pertinente se più utenti contribuiscono all'analisi dei dati. Per garantire che tutti gli sperimentatori che eseguono l'analisi seguano lo stesso standard, gli investigatori dovrebbero confrontare i dati degli stessi dendriti tracciati. Ciò può ridurre il potenziale di distorsione dello sperimentatore, garantendo che ogni ricercatore identifichi le spine in base a criteri condivisi e uniformi in modo cieco. C'è anche la possibilità di distorsioni da parte di un singolo ricercatore tra un giorno e l'altro o addirittura nello stesso giorno a causa della stanchezza. Questo dovrebbe essere monitorato durante tutto il processo di analisi dei dati. Per garantire ulteriormente la validità dell'analisi, il confronto dei risultati iniziali con quelli pubblicati in letteratura garantisce che il protocollo venga seguito in modo efficace. È fondamentale notare che questo confronto sarà efficace solo se la preparazione e i parametri sono condivisi. Le differenze nella colorazione, nell'acquisizione di segnali fluorescenti, nell'ordine e nello spessore dei dendriti o nella regione del cervello possono contribuire a risultati diversi 8,36. Nel caso di risultati pubblicati mancanti, l'utilizzo di più ricercatori per convalidare l'identificazione della colonna vertebrale consente una maggiore fiducia nell'affidabilità e nella riproducibilità dell'analisi. In questo manoscritto è stata inclusa una cartella di analisi supplementare. Questa cartella contiene file di immagini campione di segmenti dendritici, dendriti tracciati, dendriti tracciati con spine identificate e classificate e output di dati (Tabella supplementare 1, File supplementare 1, File supplementare 2, File supplementare 3 e File supplementare 4). I nuovi utenti possono eseguire la formazione su questo set di dati per mettere in pratica le procedure descritte in questo documento. I risultati generati dall'utente entro il 10% del set di dati campione fornito sono considerati accettabili per riprodurre lo standard di analisi. A causa dei criteri potenzialmente soggettivi di una colonna vertebrale completamente riempita e della necessità di un esame manuale delle spine rilevate automaticamente, la varianza tra e all'interno dei ricercatori è una parte normale dell'analisi. Nel caso in cui i risultati generati superino tale soglia; Tuttavia, è necessario condurre un confronto fianco a fianco per determinare le istanze di diversi volumi della colonna vertebrale, nonché le spine incluse o escluse in modo improprio. Il set di dati di esempio può quindi essere rianalizzato fino al raggiungimento della soglia accettabile.

Figura 1: Selezione dei dendriti per l'analisi della colonna vertebrale dendritica. (A) Visualizzazione del volume 3D di immagini confocali z-stack prelevate da dendriti prossimali CA1 nella linea di topi transgenici THY1-YFP. Si noti l'eterogeneità dell'ordine dei dendriti con dendriti primari più spessi negli ovali blu e dendriti secondari e terziari più sottili negli ovali rosa. (B) I candidati ideali per il tracciamento dei dendriti sono indicati da ovali verdi. Notare lo spessore e le intersezioni limitate, le sovrapposizioni e la vicinanza ad altri dendriti. L'ovale rosso denota segmenti dendritici da evitare per il tracciamento dendritico a causa delle alte intersezioni, sovrapposizioni e vicinanza ad altri dendriti. Anche i dendriti primari più spessi non sono candidati adatti per il tracciamento. Barra della scala = 25 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Tracciamento accurato dei segmenti dendritici. (A) Visualizzazione del volume 3D di immagini confocali z-stack prelevate da dendriti prossimali CA1 nella linea di topi transgenici THY1-YFP da tracciare tramite il metodo del kernel direzionale guidato dall'utente. Barra della scala = 10 μm. (B) Esempio di scarso tracciamento dei dendriti. Il dendrite sembra essere tracciato correttamente nella vista dall'alto verso il basso. La vista laterale mostra che il dendrite è riempito in modo improprio con punti che si discostano dal dendrite. (C) Esempio di un corretto tracciamento dei dendriti. La vista dall'alto verso il basso sembra simile a quella di B, ma la vista laterale differisce notevolmente. Il dendrite in C è tracciato correttamente, come indicato dal fatto di essere completamente riempito senza deviazioni dal dendrite. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Riempimento accurato delle spine dendritiche utilizzando la selezione manuale. (A) Visualizzazione del volume 3D di immagini confocali z-stack prelevate da dendriti prossimali CA1 nella linea di topi transgenici THY1-YFP di una spina dorsale in attesa di rilevamento manuale. Barra della scala = 0,5 μm. (B) Esempio di spina dendritica non riempita. C'è un segnale fluorescente sostanziale ancora visibile a causa del riempimento incompleto. (C) Esempio di spina dendritica correttamente riempita. La presenza di una "corona" di segnale appena visibile intorno all'esterno del riempimento è lo standard per riempire accuratamente le spine dendritiche. (D) Esempio di spina dendritica troppo piena. La sensibilità del rivelatore è troppo alta, con conseguente riempimento eccessivo della colonna vertebrale. L'otturazione ha superato i bordi della fluorescenza e presenta una corona quasi impercettibile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Divisione delle spine dendritiche del conglomerato. (A) Visualizzazione del volume 3D di immagini confocali z-stack prese da dendriti prossimali CA1 nella linea di topi transgenici THY1-YFP con due spine nelle immediate vicinanze. Barra della scala = 0,15 μm. (B) Un esempio di due spine indipendenti riempite in modo improprio come una spina dendritica conglomerata. (C) Dopo l'uso della funzione "Split", la spina del conglomerato viene divisa in due spine dendritiche distinte correttamente riempite. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Identificazione e classificazione della spina dendritica in sottotipi. (A) Visualizzazione del volume 3D di immagini confocali z-stack prelevate da dendriti prossimali CA1 nella linea di topo transgenico THY1-YFP di un segmento dendritico tracciato isolato per la quantificazione e la classificazione della spina dendritica. Barra della scala = 5 μm. (B) Segmento dendritico tracciato con tutte le spine dendritiche identificate ed esaminate per garantire un corretto riempimento e divisione. In questo passaggio, il software assegna arbitrariamente i colori ai dorsi identificati. (C) Classificazione di tutte le spine dendritiche identificate in sottotipi utilizzando parametri definiti nel software. Blu = fungo, giallo = sottile e verde = tozzo. I filopodi non sono presenti a causa dell'età di questo tessuto. (D) Immagini rappresentative di spine a fungo, sottili e tozze non riempite (in alto) e riempite (in basso). Barra della scala = 0,3 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Accesso all'ambiente 3D. Z-stack di immagini confocali visualizzate nell'interfaccia del software. La navigazione dell'ambiente 3D dalla scheda Traccia nel visualizzatore principale è stata evidenziata in giallo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 2 supplementare: Parametri dell'immagine e impostazioni di orientamento per l'ambiente 3D. Visualizzatore di ambienti 3D per immagini z-stack confocali. I parametri nella scheda Cambia visualizzazione immagine evidenziata indicata da frecce gialle sono impostati su Visualizza immagine come: Volume 3D e Mostra superficie come: Proiezione massima. Sposta punto di rotazione e Ripristina orientamento sono identificati da frecce gialle. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 3 supplementare: Tracciamento del segmento dendritico. (A) Volume 3D di immagini confocali z-stack per il tracciamento dei dendriti. Con la scheda dell'albero, i kernel guidati dall'utente e direzionali selezionati, il tracciamento inizia posizionando il kernel iniziale sul dendrite con un clic sinistro. (B) Propagazione dei chicchi direzionali lungo il dendrite in seguito al movimento del cursore. (C) Facendo clic con il pulsante sinistro del mouse più in basso sul dendrite si riempiono i chicchi direzionali. (D) Esempio di kernel direzionali che non popolano i dendriti. Invece, un kernel solitario è presente più in basso nel segmento. (E) Facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sul kernel solitario si riempie il dendrite tra i due punti. Facendo clic con il pulsante destro del mouse si termina il tracciamento. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 4: Punti di regolazione nei dendriti tracciati. (A) Segmento di dendrite tracciato in attesa di regolazione del punto. La modifica dei dendriti richiede la selezione della scheda "Albero" e della scheda "Modifica". Entrambi sono evidenziati in giallo. Dendrite è stato selezionato per la modifica con un clic sinistro. (B) Selezionando la scheda dei punti, evidenziata in giallo, è possibile selezionare i singoli punti sul segmento dendritico. Il punto verde ha uno spessore di 1,2 μm. (C) Punto regolato per riempire il dendrite in modo più accurato. Il nuovo valore di spessore del punto verde è 0,6 μm. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 1: Esempio di risultati dell'analisi delle immagini. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 1: Esempi di tracce di immagini con dendriti e spines.dat Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Tracce di esempio con dendrites.dat Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: Esempio di file di immagine del dendrite.czi Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 4: Esempio di file di immagine del dendrite.jpx Fare clic qui per scaricare questo file.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.