Le spine dendritiche sono compartimenti post-sinaptici della maggior parte delle sinapsi eccitatorie. Le alterazioni della morfologia della colonna vertebrale dendritica si verificano durante lo sviluppo neurologico, l'invecchiamento, l'apprendimento e molti disturbi neurologici e psichiatrici, sottolineando l'importanza di un'analisi affidabile della colonna vertebrale dendritica. Questo protocollo descrive la quantificazione della morfologia della spina dendritica in modo accurato e riproducibile utilizzando un software di ricostruzione automatica dei neuroni tridimensionali.
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Articolo metodologico
Quantificazione della spina dendritica utilizzando un software di ricostruzione automatica dei neuroni tridimensionali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le connessioni sinaptiche consentono lo scambio e l'elaborazione di informazioni tra i neuroni. Il sito post-sinaptico delle sinapsi eccitatorie si forma spesso sulle spine dendritiche. Le spine dendritiche sono strutture di grande interesse nella ricerca incentrata sulla plasticità sinaptica, sul neurosviluppo e sui disturbi neurologici e psichiatrici. Le spine dendritiche subiscono modifiche strutturali durante la loro vita, con proprietà come il numero totale delle spine, le dimensioni delle spine dendritiche e il sottotipo morfologicamente definito che si alterano in risposta a diversi processi. La delineazione dei meccanismi molecolari che regolano queste alterazioni strutturali delle spine dendritiche si basa sulla misurazione morfologica. Ciò richiede un'analisi accurata e riproducibile della colonna vertebrale dendritica per fornire prove sperimentali. Il presente studio delinea un protocollo dettagliato per la quantificazione e la classificazione della spina dendritica utilizzando Neurolucida 360 (software automatico di ricostruzione tridimensionale dei neuroni). Questo protocollo consente di determinare le proprietà chiave della spina dendritica, come la densità totale della colonna vertebrale, il volume della testa della colonna vertebrale e la classificazione in sottotipi di colonna vertebrale, consentendo così un'analisi efficace dei fenotipi strutturali della colonna vertebrale dendritica.
Introduzione
Le spine dendritiche sono sporgenze di dendriti che spesso comprendono il sito post-sinaptico delle sinapsi glutammatergiche 1,2. Le spine dendritiche sono di particolare interesse nel campo della plasticità sinaptica. Le spine sono spesso alterate quando la forza sinaptica cambia, diventando più grandi e più forti nel potenziamento sinaptico a lungo termine o più piccole e più deboli nella depressione sinaptica a lungo termine 3,4,5,6,7.<....
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Protocollo
Tutte le procedure sugli animali hanno seguito le linee guida del National Institutes of Health degli Stati Uniti sull'uso degli animali nella ricerca intramurale e sono state approvate dal National Institute of Mental Health Animal Care and Use Committee.
1. Preparazione di fette fisse di ippocampo
- Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di Ketamina/Xilazina (Ketamina: 100 mg/kg; Xilazina: 8 mg/kg). Convalidare l'anestesia tramite pizzicamento della coda e fissare il mouse alla piastra di perfusione.
- Utilizzando grandi forbici chirurgiche, rimuovere la pe....
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Risultati
L'utilizzo efficace di questo metodo di analisi inizia con la selezione dei segmenti dendritici per il tracciamento. Come descritto nella Figura 1, i dendriti ideali per il tracciamento non sono in prossimità di altri dendriti. I dendriti che corrono in parallelo possono portare all'identificazione impropria delle spine di un dendrite vicino. I dendriti che si intersecano direttamente o corrono perpendicolarmente in un diverso piano z aggiungono anche una notevole difficoltà per un tracciame.......
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Discussione
Questo protocollo descrive in dettaglio le fasi specifiche della preparazione del campione, l'imaging e il processo di quantificazione e classificazione della spina dendritica utilizzando un software di ricostruzione tridimensionale. Questo software è un potente strumento in grado di produrre dati strutturali robusti che contribuiscono a una vasta gamma di indagini. Durante tutto il processo, ci sono alcuni passaggi critici che rendono questo protocollo meno gravoso dal punto di vista me.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Carolyn Smith, Sarah Williams Avram, Ted Usdin e il NIMH SNIR per l'assistenza tecnica. Vorremmo inoltre ringraziare il gruppo di studio sulla ricerca biomedica della Colgate University Bethesda. Questo lavoro è supportato dal programma intramurale NIMH (1ZIAMH002881 a Z.L.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 518F Olio da immersione | Zeiss | 444960-0000-000 | |
| Criostato | Leica | CM3050S | Per la preparazione di fette |
| Pinze fini | FST | 11150-10 | |
| Pinze emostatiche | FST | 13020-12 | |
| Forbici chirurgiche grandi | FST | 14002-16 | |
| LSM 880 Microscopio confocale | Zeiss | LSM 880 | |
| Vetro di copertura per microscopio | Fisherbrand | 12-541-035 | |
| Mini-pompa peristaltica II | Apparecchio Harvard | 70-2027 | Per perfusioni |
| Neurolucida 360 | MBF Bioscience | v2022.1.1 | Software per l'analisi della colonna vertebrale |
| Neurolucida Explorer | MBF Bioscience | v2022.1.1 | Software per l'analisi della colonna vertebrale |
| OCT Compound | Sakura Finetek | 4583 | Per il sezionamento del criostato |
| Paraformaldeide (37%) | Fisherbrand | F79-1 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.40 Olio DIC | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| Lama per bisturi | FST | 10022-00 | |
| Piccole forbici chirurgiche | FST | 14060-09 | |
| Spatola | FST | 10091-12 | |
| Saccarosio | FIsherbrand | S5-500 | |
| Superfrost Plus Microslides | Diagger | ES4951+ | |
| Vectashield HardSet Montaggio Medio | Vettoriale Laboratori | H-1400-10 |
Riferimenti
- Gray, E. G. Electron microscopy of synaptic contacts on dendrite spines of the cerebral cortex. Nature. 183, 1592-1593 (1959).
- Ramón Y Cajal, S. Sobre la fibras nerviosas de la capa molecular del cerebelo. Rev Trim Histol Norm. 1, 33-49 (1888).....
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Ristampe e permessi
