Modelli di ferita nel topo e preparazione di sospensioni a cellula singola

Sommario

Questo studio presenta due tecniche sperimentali cruciali: la costruzione di un modello di ferita murina per valutare la chiusura della ferita e la preparazione di sospensioni unicellulari dalla pelle murina per preservare la vitalità cellulare.

Abstract

La gestione delle lesioni cutanee acute a tutto spessore rappresenta una sfida considerevole nella pratica clinica. La complessità della guarigione delle ferite, che coinvolge diverse popolazioni cellulari e l'intricato microambiente della ferita, complica la valutazione degli effetti del trattamento e delle loro interazioni utilizzando approcci sperimentali tradizionali. La tecnologia di sequenziamento del trascrittoma a singola cellula ha rivoluzionato la comprensione delle funzioni e dei meccanismi cellulari durante la guarigione delle ferite. Tuttavia, la variabilità delle metodologie per la creazione di modelli di ferite murine introduce fattori confondenti che possono influire sui risultati sperimentali. Inoltre, il processo di dissociazione dei tessuti cutanei di topo presenta notevoli ostacoli tecnici, evidenziando la necessità critica di sospensioni di singole cellule di alta qualità per un sequenziamento accurato del trascrittoma. Pertanto, questo studio mira a ottimizzare la costruzione di modelli murini di ferite per valutare accuratamente i cambiamenti nella chiusura della ferita, eliminando le variabili che potrebbero influenzare il successivo risultato del sequenziamento. Inoltre, la preparazione di sospensioni a singola cellula è stata eseguita utilizzando sia protocolli di preparazione enzimatica che protocolli di kit di test per ottimizzare i costi e l'efficacia.

Introduzione

Il topo è un modello animale ampiamente riconosciuto nella ricerca per la sua sequenza genetica altamente omologa agli esseri umani, la riproduzione rapida, l'economicità e le dimensioni gestibili¹. Tuttavia, esistono differenze nella struttura della pelle tra topi e esseri umani. I topi hanno uno strato distinto della membrana cutanea che contribuisce alla contrazione della pelle, svolgendo un ruolo cruciale nella guarigione delle ferite in questa specie. Al contrario, la guarigione delle ferite umane comporta principalmente la riepitelizzazione e la formazione di tessuto di granulazione¹.

Nonostante queste differenze interspecie nella struttura della pelle, il modello murino rimane la scelta preferita nella ricerca sulla riparazione delle ferite e mantiene un'importanza significativa rispetto ad altri modelli animali^2,3. Quando si utilizza la pelle di topo per imitare i processi di guarigione delle ferite umane, è essenziale considerare attentamente i vari fattori di influenza. Questi fattori includono la selezione di siti appropriati per le procedure chirurgiche, la contabilizzazione del ciclo del follicolo pilifero del topo e la comprensione degli effetti della contrazione della membrana cutanea^4,5. L'attuazione di misure corrispondenti è fondamentale per ottimizzare le condizioni sperimentali e migliorare l'accuratezza dei risultati osservativi.

Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) sequenzia le cellule a un livello molto più raffinato rispetto al sequenziamento convenzionale dell'RNA e ha un requisito molto più elevato per la qualità del campione con differenze minime all'interno del gruppo. Sono stati condotti diversi esperimenti per perfezionare un modello stabile di difetto cutaneo acuto a tutto spessore nel topo. Questi esperimenti hanno utilizzato una combinazione di metodi consolidati dalla letteratura e approcci innovativi per valutare la guarigione delle ferite in modo completo^2,5. Per sviluppare il modello di guarigione delle ferite, è stata utilizzata l'escissione cutanea a tutto spessore di topo per replicare il processo fisiologico di riparazione e rigenerazione delle ferite. Il suo obiettivo era quello di valutare le potenziali alterazioni indotte da vari trattamenti utilizzando scRNA-seq. La dissociazione del tessuto cutaneo dai topi pone sfide, tra cui una bassa vitalità cellulare e alti tassi di aggregazione, durante la preparazione di sospensioni a singola cellula⁶. Queste difficoltà possono causare problemi come l'intasamento degli strumenti e la cattura anomala delle celle, che possono compromettere la qualità dei dati. Dato il costo considerevole del sequenziamento di singole cellule, la conduzione di più esperimenti preliminari è fondamentale per garantire la stabilità e l'affidabilità della sospensione a singola cellula. Questo studio ha valutato l'efficacia della dissociazione enzimatica mista e del metodo di dissociazione del kit tissutale per identificare l'approccio ottimale per la dissociazione tissutale^6,7. Questo studio stabilisce una solida base per ulteriori indagini approfondite.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico del settimo Centro Medico dell'Ospedale Generale del PLA Cinese, Cina. Sono stati utilizzati topi maschi C57/BL6 di 6 settimane.

1. Modello di guarigione delle ferite nel topo

1. Raggruppamento di animali
   1. Assegna in modo casuale i topi ai gruppi sperimentali e di controllo (6 ciascuno). Domestico i topi in una struttura per animali specifica priva di agenti patogeni (SPF), con una temperatura mantenuta a 23-25 °C, umidità al 50%-60% e un ciclo luce-buio di 12 ore.
   2. Fornisci ai topi un accesso illimitato al cibo standard e all'acqua del rubinetto sterilizzata in autoclave.
2. Preparazione preoperatoria
   1. Trattenere delicatamente il mouse utilizzando un sistema di ritenuta o tenendolo saldamente in posizione prona. Caricare la siringa con pentobarbital sodico all'1% riportato a temperatura ambiente, somministrato alla dose di 0,1 ml/20 g di peso corporeo.
      NOTA: La soluzione di pentobarbital sodico all'1% deve essere conservata in un ambiente buio a 4 °C.
   2. Pulisci l'addome del topo con tamponi di cotone imbevuti di alcol. Inserire la siringa con una leggera angolazione nell'addome. Aspirare prima dell'iniezione per evitare la somministrazione involontaria nella vescica o nell'intestino. Attendere 10 minuti.
   3. Dopo che il topo ha smesso di contrarsi e non risponde più agli stimoli, applicare il petrolato bianco su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza. Usa un rasoio per tagliare il pelo dorsale più lungo.
   4. Applicare la crema depilatoria sulla schiena, attendere 2 minuti e strofinare delicatamente con una garza umida per evitare di danneggiare la pelle del topo. Assicurarsi che la crema depilatoria non venga lasciata in posa per un periodo prolungato.
   5. Disinfettare delicatamente la pelle circostante con tre tamponi alternati di betadina e alcol al 70%.
   6. Punzone per biopsia cutanea in autoclave, forbici, pinze e altri strumenti per la sterilizzazione. Mantenere uno spazio di lavoro sterile. Eseguire l'intervento chirurgico successivo su un panno chirurgico fresco.
3. Escissione cutanea a tutto spessore
   NOTA: Il modello della stecca della ferita è stato utilizzato per valutare l'efficacia del trattamento per la guarigione delle ferite.
   1. Usando un pennarello indelebile, segna l'area centrale superiore della regione dorsale del topo con un cerchio di 8 mm di diametro.
   2. Sollevare la pelle dorsale con una pinza pulita ed eseguire il primo taglio con le forbici chirurgiche sottili. Dopo il primo taglio, afferrare l'area cutanea parzialmente rimossa con una pinza e ritagliare con cura i cerchi contrassegnati.
   3. Utilizzare un anello in acciaio inossidabile progettato su misura (diametro interno 15 mm, diametro esterno 18 mm). Sutura l'anello metallico alla periferia del sito di incisione con 5-0 suture non assorbibili, prevenendo la contrazione della pelle del sito di incisione (Figura 1A). Utilizzare l'acciaio inossidabile come materiale dell'anello per evitare ruggine e deformazioni.
   4. Somministrare una singola iniezione sottocutanea da 0,1 ml di diluizione di buprenorfina cloridrato al 10% vicino alla ferita per trattare il dolore post-chirurgico.
   5. Reintrodurre il mouse per pulire le singole gabbie. Posizionare il mouse in posizione prona. Non lasciare il mouse incustodito prima che il topo riprenda conoscenza.
   6. Osservare e fotografare la ferita del topo ogni 2 giorni per misurare le dimensioni della ferita dopo l'anestesia come descritto al punto 1.2.
4. Marcatura del timbro della ferita per ottenere il tessuto bioptico
   1. Prepararsi per l'esperimento come descritto nei passaggi 1.1 e 1.2.
   2. Crea timbri personalizzati per la marcatura delle avvolte del mouse con un diametro del cerchio di 8 mm e una lunghezza del lato quadrato di 10 mm (Figura 1B).
   3. Posizionare il mouse in una postura prona e disinfettare la pelle dorsale con tamponi di cotone imbevuti di alcol. Immergi il timbro nell'inchiostro. Fai un segno sulla parte centrale superiore della parte posteriore del mouse con il timbro.
   4. Asportare con cura l'intero strato cutaneo della schiena lungo il segno circolare utilizzando le forbici chirurgiche, esponendo completamente lo strato muscolare. Lasciare la ferita aperta senza medicazione per evitare di interferire con lo stato della ferita. Mantenere la sterilità della ferita posizionando il topo in un ambiente pulito e disinfettato e lasciando che la ferita formi naturalmente una crosta.
   5. Somministrare una singola iniezione sottocutanea da 0,1 ml di diluizione di buprenorfina cloridrato al 10% vicino alla ferita per trattare il dolore post-chirurgico.
   6. Reintrodurre il mouse per pulire le singole gabbie. Posizionare il mouse in posizione prona. Non lasciare il mouse incustodito prima che il topo riprenda conoscenza.
   7. Osservare e fotografare la ferita del topo ogni 2 giorni per misurare le dimensioni della ferita dopo l'anestesia come descritto al punto 1.2.
   8. Eseguire la somministrazione del trattamento come descritto al punto 1.4
5. Somministrazione del trattamento
   1. A 4 ore dalla ripresa di conoscenza del topo, eseguire l'anestesia come descritto nei passaggi 1.2.2-1.2.3.
   2. Iniettare per via sottocutanea il trattamento desiderato, qui 100 μg di esosoma derivato da cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale umano (hucMSC-Exo) disciolto in 200 μL di PBS attorno al sito di incisione per il gruppo di trattamento.
   3. Iniettare per via sottocutanea 200 μL di PBS intorno al sito di incisione per il gruppo di controllo.
   4. Ripetere i passaggi 1.5.2 e 1.5.3 ogni due giorni per un massimo di 14 giorni. Ispezionare il sito di iniezione per eventuali gonfiori, arrossamenti o segni di infezione.

2. Preparazione per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula

1. Raccolta e preparazione dei tessuti
   1. Eseguire l'anestesia come descritto nei passaggi 1.2.2-1.2.3.
   2. Sollevare la pelle dorsale con una pinza pulita e rimuovere le croste. Tagliare circa 2 cm² di pelle vicino alla ferita, tagliando il tessuto adiposo e i grandi vasi sanguigni.
   3. Trasferire la biopsia cutanea con pinza sterile in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti riempita con 4 mL di PBS pre-raffreddati.
   4. Lavare con PBS trasferendo in sequenza la biopsia in nuovi pozzetti (piastra a 6 pozzetti) riempiti con 4 mL di PBS fino a quando non è presente sangue visibile.
   5. Tagliare la pelle con un bisturi in pezzi di circa 2 mm, lavando ulteriormente in DPBS contenente lo 0,04% di BSA e rimuovendo eventuali detriti.
2. Dissociazione enzimatica (Figura 2)
   1. Combinare 1 mL di Collagenasi I (10 mg/mL), 1 mL di Collagenasi IV (5 mg/mL), 1 mL di Collagenasi D + Dispasi II (15 mg/mL), 1 mL di DNasi I (5 mg/mL) e 6 mL di DPBS in una provetta conica sterile per preparare la soluzione digestiva. Mescolare accuratamente i componenti per garantire l'omogeneità.
   2. Mettere il tubo conico in un bagnomaria a 37 °C per 10 minuti per preriscaldare la soluzione digestiva.
   3. Aggiungere 2,5 ml di soluzione digestiva al tessuto e digerire a 37 °C per 70 minuti, girando la provetta ogni 10 minuti per una miscelazione accurata.
   4. Pre-bagnare un filtro da 70 μm con tampone di lavaggio (0,2% BSA in PBS). Trasferire la miscela di reazione, comprese le cellule dissociate e i frammenti di tessuto residui, utilizzando un puntale per pipetta a foro largo da 1 ml sul filtro.
   5. Filtrare questa miscela attraverso il filtro cellulare pre-umido da 70 μm in una provetta da centrifuga da 15 mL.
   6. Centrifugare la miscela di reazione con il tessuto digerito a 300 x g, temperatura ambiente per 5 minuti. Scartare il surnatante e conservare il pellet (cellule) per la successiva fase di dissociazione.
3. Lisi dei globuli rossi
   1. Diluire la soluzione di lisi dei globuli rossi (10x) in rapporto 1:10 con acqua bidistillata. Diluire le cellule con 1 soluzione di lisi dei globuli rossi in rapporto 1:10 in una provetta conica.
   2. Agitare la miscela per 5 s, incubare a temperatura ambiente per 2 minuti e poi centrifugare a 300 x g per 5 minuti. Aspirare il surnatante, risospendere le cellule in DPBS di uguale volume e conservarle in ghiaccio.
4. filtrazione
   1. Recuperare la sospensione cellulare e filtrarla attraverso un filtro da 40 μm in un nuovo tubo conico.
   2. Sciacquare la provetta 2 volte con 4,5 mL di RPMI (10% FCS) per garantire la raccolta di eventuali cellule rimanenti.
   3. Procedere alla centrifugazione della sospensione cellulare a 300 x g a temperatura ambiente per 5 minuti.
   4. Scartare il surnatante, muovere delicatamente il pellet e risospendere le cellule con punte a foro largo in 50 μl di BSA PBS allo 0,04%. Mantenere le cellule sul ghiaccio durante questo processo.
5. Rimozione delle cellule morte
   1. Miscelare il kit per la rimozione delle cellule morte 20x con acqua priva di nucleasi in un rapporto 1:20 per ottenere un tampone di legame 1x.
   2. Centrifugare il campione a 300 x g, rimuovere il surnatante e aggiungere 10 μl di microsfere per la rimozione delle cellule morte per 60 mg di campione cutaneo.
   3. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere il tampone madre fino a raggiungere i 500 μl. Caricare il campione nella colonna preparata nel kit e collegarlo al dissociatore.
   4. Eseguire il programma dissociatore per separare le cellule vive. Al termine del programma, filtrare la sospensione attraverso un filtro da 30 μm e diluirla con un volume uguale di D-PBS.
      NOTA: Se la velocità di gocciolamento rallenta notevolmente, sostituire prontamente la colonna per evitare che le impurità ostruiscano i pori e influenzino il recupero cellulare.
   5. Eseguire la colorazione con arancio acridino/ioduro di propidio (AO/PI) e il conteggio delle cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Utilizzare i seguenti criteri di accettazione: vitalità cellulare ≥ 85%, tasso di aggregazione cellulare < 20% e nessun globulo rosso visibile o frammenti di cellule.
6. Procedura di dissociazione per il kit di dissociazione multitessuto (Alternativa)
   1. Miscelare 2,5 mL di RPMI 1640, 100 μL di enzima D, 50 μL di enzima R e 12,5 μL di enzima A1 in una provetta delicata MACS C (componenti del Multi Tissue Dissociation Kit).
   2. Trasferire il fazzoletto nella delicata provetta MACS C contenente la miscela enzimatica e chiuderla ermeticamente.
   3. Posizionare la provetta a 37 °C in un bagno d'acqua per 90 minuti con una leggera inversione ogni 10 minuti per garantire un'adeguata esposizione dei tessuti alla soluzione di dissociazione.
   4. Scartare la soluzione di dissociazione e lavare i fazzoletti con DPBS.
   5. Far passare in sequenza le sospensioni a singola cella attraverso filtri cellulari da 70 μm e 40 μm e centrifugare a 4 °C per 10 minuti a 300 x g.
   6. Lisi i globuli rossi utilizzando il reagente di lisi dei globuli rossi seguendo la stessa procedura descritta al punto 2.3.
   7. Rimuovere le celle morte utilizzando il kit di rimozione delle celle morte seguendo la stessa procedura del passaggio 2.5⁸.
   8. Eseguite la colorazione AO/PI e il conteggio delle cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Utilizzare i seguenti criteri di accettazione: vitalità cellulare ≥ 85%, tasso di aggregazione cellulare < 20% e nessun globulo rosso visibile o frammenti di cellule.

Risultati

Sono state esplorate diverse varianti della procedura. I protocolli di stampaggio sono stati preferiti poiché comportano un minimo interferenza con il processo di guarigione della ferita e mantengono l'integrità della ferita da influenze come il graffio o i punti di sutura. Questo per evitare l'introduzione di rumore a livello singola-cellula per il successivo sequenziamento. Posizionare le ferite su entrambi i lati di un topo ha comportato differenze evidenti nell'area della ferita a causa dell'elasticità intrinseca del...

Discussione

Diversi passaggi cruciali sono stati essenziali per il successo del protocollo. Questi passaggi includevano una preparazione precisa dell'area della ferita mediante rasatura e pulizia accurata, la creazione di ferite standardizzate di dimensioni e profondità specifiche e una diligente cura post-ferita per monitorare le infezioni e somministrare trattamenti appropriati. La standardizzazione di queste procedure ha garantito la coerenza tra le condizioni sperimentali, migliorando così l'affidabilità e la riproducibilità dei...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
75% Alcolchol	Liuhe	JIUJING500ML
C57 / BL6J topi	Charles River Laboratories
Collagenasi D + Dispase II	Roche	11088858001
Collagenasi I	Roche	5349907103
Collagenasi IV	Roche	5267439001
Cotton Swabs	Haishi	MIANQIAN
Kit di rimozione delle cellule morte	Miltenyi Biotec	130-090-10
DNase I	Roche	10104159001
dissociatore gentleMAC	Miltenyi Biotec	130-093-235
Filo di nylon medico	Jinlong	HM507
Kit di dissociazione multitissutale 1	Miltenyi Biotec	130-110-201
ago per biopsia	Integra Miltex
soluzione di lisi dei globuli rossi	Miltenyi Biotec	130-094-183
Forbice chirurgica	Jinglu	JIANDAO Petrolato
bianco	Shangyuan	BAIFANSHILIN

punzone