Articolo metodologico

Modelli tridimensionali di coltura cellulare per studiare la barriera epiteliale nell'esofagite eosinofila

1.8K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/66503

⸱

10 maggio 2024

 , 
1Department of Biomedicine, University of Basel, 2Department of Gastroenterology and Hepatology, University Digestive Healthcare Center, Clarunis

In questo articolo

Sommario

Qui viene fornito un protocollo per la coltura di organoidi esofagei umani e la coltura dell'interfaccia aria-liquido. La coltura dell'interfaccia aria-liquido degli organoidi esofagei può essere utilizzata per studiare l'impatto delle citochine sulla barriera epiteliale esofagea.

Abstract

L'epitelio squamoso dell'esofago è esposto direttamente all'ambiente, affrontando continuamente antigeni estranei, inclusi antigeni alimentari e microbi. Mantenere l'integrità della barriera epiteliale è fondamentale per prevenire le infezioni ed evitare l'infiammazione causata da antigeni innocui di origine alimentare. Questo articolo fornisce protocolli semplificati per la generazione di organoidi esofagei umani e colture di interfaccia aria-liquido da biopsie di pazienti per studiare il compartimento epiteliale dell'esofago nel contesto dell'omeostasi e della malattia tissutale. Questi protocolli sono stati pietre miliari scientifiche significative nell'ultimo decennio, descrivendo strutture tridimensionali simili a organi da cellule primarie derivate da pazienti, organoidi e colture di interfaccia aria-liquido. Offrono la possibilità di studiare la funzione di specifiche citochine, fattori di crescita e vie di segnalazione nell'epitelio esofageo all'interno di un quadro tridimensionale, mantenendo le proprietà fenotipiche e genetiche del donatore. Gli organoidi forniscono informazioni sulla microarchitettura tissutale valutando il trascrittoma e il proteoma dopo la stimolazione delle citochine. Al contrario, le colture di interfaccia aria-liquido consentono di valutare l'integrità della barriera epiteliale attraverso misure di resistenza transepiteliale (TEER) o di flusso di macromolecole. La combinazione di questi organoidi e colture di interfaccia aria-liquido è uno strumento potente per far progredire la ricerca in condizioni di barriera epiteliale esofagea compromessa.

Introduzione

L'infiammazione esofagea compromette l'integrità della barriera epiteliale 1,2,3,4,5, come osservato nell'esofagite eosinofila (EoE), una malattia infiammatoria cronica dell'esofago6-dominata da Th2. L'EoE è stata descritta per la prima volta negli anni '90 7,8 ed è prevalentemente indotta dagli antigeni alimentari 9,10,11,12,13. I sintomi più frequenti dell'EoE nella popolazione adulta sono la disfagia e l'occlusione alimentare14. Nei bambini, l'EoE si manifesta tipicamente con ritardo della crescita, rifiuto del cibo, vomito e dolore addominale15. Gli studi di associazione genomica-wide (GWAS) hanno identificato i geni di rischio EoE coinvolti nell'integrità della barriera epiteliale, spostando l'epitelio al centro della ricerca EoE 16,17,18. La trascrittomica EoE ha inoltre rivelato che un processo di differenziazione alterato e un'iperplasia reattiva della zona basale causano la compromissione della funzione di barriera dell'epitelio esofageo 3,5,19,20,21,22. La comprensione precoce del fatto che l'EoE è una malattia mediata da Th26 ha portato alla scoperta dell'IL-13 come mediatore guida disturbando l'integrità epiteliale 3,4,21,23. I sistemi sperimentali che consentono di dissecare gli effetti mediati dalle citochine sull'integrità epiteliale da compromissione intrinseca della barriera attraverso la predisposizione genetica forniscono la possibilità di studiare la complessa interazione tra le cellule immunitarie e l'epitelio nell'EoE. Gli organoidi esofagei umani e le colture di interfaccia aria-liquido (ALI) sono stati proposti come strumenti validi per analizzare le conseguenze della stimolazione delle citochine sull'integrità epiteliale5.

Il primo protocollo per la generazione di organoidi esofagei derivati da cellule staminali tessuto-specifiche (ASC) adulte è stato stabilito cinque anni dopo i primi rapporti pubblicati di organoidi intestinali nel 2009 utilizzando ASC intestinali Lgr5+ che ricapitolano il compartimento epiteliale dell'intestino tenue24. DeWard et al. sono stati i pionieri della generazione di organoidi da cellule epiteliali esofagee murine25. Nel 2018, Kasagi et al. hanno generato organoidi esofagei umani dalla linea cellulare di epitelio squamoso esofageo umano immortalizzato EPC2-hTERT e da cellule primarie derivate da pazienti26. Nello stesso anno, Zhang et al. hanno generato con successo organoidi esofagei derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Hanno delineato il significato dell'inibizione del TGFβ e della proteina morfogenetica ossea (BMP) per lo sviluppo delle cellule progenitrici esofagee (EPC) e il ruolo cruciale della segnalazione di Notch nella differenziazione dell'epitelio squamoso stratificato26,27. Trisno e colleghi hanno integrato questi risultati identificando Sox2 come un inibitore di Wnt che dirige il destino dello sviluppo verso la differenziazione esofagea28. I successivi perfezionamenti dei protocolli, della composizione del terreno e delle condizioni di coltura hanno aumentato il tasso di formazione degli organoidi e hanno reso possibile la subcoltura e il recupero degli organoidi dopo la crioconservazione 26,29,30,31,32. Sebbene questi organoidi siano potenti strumenti per studiare l'architettura tissutale e l'espressione di potenziali geni bersaglio dopo la stimolazione con citochine, gli organoidi esofagei non offrono la possibilità di misurare la resistenza transepiteliale (TEER) o il flusso di macromolecole come misure dirette per l'integrità della barriera. Come precedentemente descritto da Sherrill e colleghi22, le colture ALI che modellano la differenziazione epiteliale4 consentono valutazioni dirette dell'integrità epiteliale. La combinazione di organoidi derivati da pazienti e colture di ALI è un potente strumento per studiare l'architettura dei tessuti e l'integrità della barriera epiteliale nell'EoE.

Di seguito sono riportate le procedure con le istruzioni per isolare le cellule vitali dalle biopsie esofagee e stabilire colture di organoidi esofagei e ALI che possono essere ulteriormente utilizzate per studiare gli effetti delle citochine sull'integrità della barriera.

Protocollo

Le procedure sono state approvate dalla commissione d'etica della Svizzera nordoccidentale e centrale (EKNZ; ID progetto 2019-00273). Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato scritto per l'uso sperimentale delle biopsie prima dell'esame endoscopico. I reagenti e le attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Isolamento cellulare per organoidi esofagei derivati da pazienti

NOTA: Un elenco dei costituenti del terreno per la coltura di organoidi esofagei umani è fornito nella Tabella 1.

  1. Ottenere le biopsie.
    NOTA: Nel presente studio, due biopsie da un segmento dell'esofago sono state ottenute durante l'esofagogastroduodenoscopia con pinza per biopsia utilizzando un gastroscopio con un canale di lavoro da 2,8 mm.
  2. Trasferire le biopsie in un terreno privo di siero per cheratinociti disponibile in commercio (KSFM; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).
    NOTA: Le biopsie possono essere conservate su ghiaccio per diverse ore fino all'uso.
  3. Sostituire il terreno KSFM con 1 mL di Dispase I (10 U/mL) e incubare le biopsie per 10 minuti a temperatura ambiente.
  4. Centrifugare le biopsie a temperatura ambiente a 300 x g per 2 min.
  5. Aspirare la Dispase utilizzando una pipetta da 1000 μL senza toccare le biopsie e il pellet di detriti cellulari.
  6. Sciacquare le biopsie con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS).
  7. Centrifugare le biopsie a temperatura ambiente a 300 x g per 2 min.
  8. Aspirare il surnatante utilizzando una pipetta da 1000 μl.
  9. Incubare le biopsie con 500 μl di tripsina-EDTA (0,05%) a 37 °C per 10 minuti agitando a 800 giri/min.
  10. Eseguire l'interruzione meccanica mediante pipettaggio ripetuto su e giù fino a ottenere una sospensione a cellula singola.
  11. Filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare da 70 μm utilizzando la testa dello stantuffo in gomma di una siringa di tubercolina.
  12. Lavare il colino con 2-4 ml di inibitore della tripsina di soia (250 μg/mL).
  13. Filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare da 35 μm con tappo a scatto su una provetta di polistirene a fondo tondo da 5 mL.
  14. Trasferire la soluzione monocellulare in una provetta conica da 15 mL.
  15. Centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 °C.
  16. Aspirare il surnatante utilizzando una pipetta da 1000 μl.
  17. Risospendere le cellule in 100 μL di terreno KSFM.
  18. Miscelare 10 μl di blu di tripano con 10 μl di sospensione cellulare.
  19. Conta le celle utilizzando un contatore di celle automatizzato.

2. Coltura di organoidi derivati da pazienti

  1. Aggiungere 1-2 mL di KSFM alla sospensione cellulare dopo il conteggio.
  2. Centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 °C.
  3. Aspirare il surnatante con una pipetta da 1000 μl senza disturbare il pellet cellulare.
  4. Risospendere il pellet cellulare nella matrice di idrogel di estratto di membrana basale (BME) (40 μL di BME per 20.000 cellule).
    NOTA: Dopo aver aggiunto il BME, mantenere le celle sul ghiaccio per evitare la solidificazione prematura del BME.
  5. Tagliare un puntale per pipetta da 200 μl per aspirare la miscela viscosa di sospensione di cellule BME.
  6. Formare goccioline da 40 μl in una piastra di coltura cellulare in sospensione preriscaldata (37 °C).
  7. Incubare la piastra senza terreno per 20-30 minuti a 37 °C per garantire la solidificazione delle goccioline di BME.
  8. Aggiungere un terreno KSFM-C preriscaldato integrato con 10 μM di Y27632 (inibitore di ROCK) per i primi due giorni di coltura.
  9. Sostituire il terreno con un nuovo terreno KSFM-C (senza Y27632 e +/- citochine di interesse) a giorni alterni.
  10. Aspirare il terreno e grattare via le goccioline con la punta della pipetta, aggiungendo continuamente 1 mL di Dispase II (1,5 U/mL) al pozzetto.
  11. Trasferire la miscela BME-dispasi in una provetta da centrifuga da 15 mL e incubarla per 20 minuti a 37 °C in un bagno d'acqua agitante per digerire il BME.
  12. Centrifugare a 250 x g per 3 min a 4 °C e aspirare la Dispase II.
  13. Procedere secondo il protocollo di lettura dell'interesse (ad esempio, isolamento dell'RNA, isolamento delle proteine o fissazione con PFA al 4% per l'istologia).

3. Isolamento cellulare per colture di interfaccia aria-liquido (ALI) derivate da pazienti

  1. Ottenere le biopsie. Durante l'esofagogastroduodenoscopia con un gastroscopio con un canale di lavoro da 2,8 mm, vengono prelevate due biopsie da un segmento di esofago con pinza per biopsia.
  2. Posizionare le biopsie in un terreno privo di siero per cheratinociti disponibile in commercio (KSFM; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) e conservare in ghiaccio per diverse ore fino all'uso.
  3. Sostituire KSFM con 1 mL di Dispase (10 U/mL). Successivamente, incubare le biopsie per 10 minuti a temperatura ambiente.
  4. Centrifugare le biopsie a temperatura ambiente a 300 x g per 2 min.
  5. Rimuovere la Dispasi utilizzando una pipetta da 1000 μL senza toccare le biopsie e il pellet di detriti cellulari.
  6. Lavare le biopsie con 1 mL di DPBS.
  7. A temperatura ambiente, centrifugare le biopsie a 300 x g per 2 minuti.
  8. Aspirare il surnatante con una pipetta da 1000 μl.
  9. Incubare le biopsie in 500 μL di tripsina-EDTA (0,05%) a 37 °C per 10 minuti e mescolare continuamente a 800 giri/min durante l'incubazione.
  10. Interrompere meccanicamente le biopsie con pipettaggio ripetuto su e giù fino a ottenere una sospensione a cellula singola.
  11. Passare le cellule dissociate attraverso un filtro cellulare da 70 μm con una testa di stantuffo in gomma da una siringa di tubercolina e raccogliere le cellule in una provetta conica da 50 mL.
  12. Lavare il colino con 2-4 ml di inibitore della tripsina di soia (250 μg/mL) per rimuovere le cellule rimanenti dal colino.
  13. Filtrare le cellule con un tappo a scatto per filtro cellulare da 35 μm in una provetta di polistirene a fondo tondo da 5 mL.
  14. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL.
  15. Centrifugare a 300 x g a 4 °C per 5 min.
  16. Rimuovere il surnatante con una pipetta da 1.000 μl.
  17. Risospendere il pellet cellulare in 4 mL di terreno KSFM (Ca2+ 0,09 mM), di cui 10 μM Y27632.
  18. Trasferire le cellule in un pallone per colture cellulari T25.
  19. Per espandere i cheratinociti primari, coltivare le cellule fino al 60%-80% di confluenza per circa 1 settimana.
    NOTA: Il passaggio (P)0 forma conglomerati cellulari simili a isole e non è un monostrato. I cheratinociti primari formano monostrati a partire da P1.
  20. Passaggio al 60%-80% di confluenza e risemina di P1 in 2-3 fiasche per colture cellulari T25 o 1-2 T75.
  21. Passaggio P1 di nuovo quando i cheratinociti formano un monostrato con confluenza del 60%-80%.

4. Coltura di interfaccia aria-liquido (ALI) derivata dal paziente

  1. Seminare i cheratinociti primari P2 su inserti transwell per la coltura ALI.
    NOTA: Seminare 400.000 cellule in 12 inserti a pozzetti (200.000 cheratinociti per 0,6 cm2) in 500 μL di KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).
    1. Semina di 150.000 cellule in 24 inserti di pozzetti (155.000 cheratinociti per 0,5 cm2) in 100 μL di KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).
    2. In alternativa, congelare nel terreno KSFM (Ca2+ 0,09 mM + 10% DMSO) a -80 °C per 24 ore e quindi trasferire le celle congelate in azoto liquido per un uso successivo.
      NOTA: Quando si utilizzano fiale congelate, passare ancora una volta dopo lo scongelamento prima di utilizzare le cellule per la coltura ALI.
  2. Aggiungere il terreno nel pozzetto inferiore sotto l'inserto della piastra di coltura del pozzetto.
    NOTA: Per piastre a 12 pozzetti: 1,5 mL di KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE). Per piastre a 24 pozzetti: 600 μL di KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).
  3. Sostituire il KSFM di calcio medio-alto (Ca2+ 1,8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) dopo 2 giorni.
  4. Cambiare il terreno KSFM ad alto contenuto di calcio ogni due giorni fino al giorno 7.
  5. Eseguire il trasporto aereo il giorno 7 aspirando il terreno dalla camera superiore e sostituendo il terreno nella camera inferiore con KSFM ad alto contenuto di calcio (Ca2+ 1,8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) contenente 10 ng/mL KGF (=FGF7), 75 μg/mL di acido ascorbico (AA).
    1. Facoltativo: aggiungere al terreno la citochina di interesse alla concentrazione desiderata.
  6. Cambia il mezzo ogni due giorni fino al giorno 14.

5. Misurazione della resistenza elettrica transepiteliale (TEER)

  1. Sterilizzare l'elettrodo del misuratore TEER immergendolo in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con ipoclorito di sodio al 5% per 10-15 minuti.
  2. Lavare via l'ipoclorito di sodio al 5% immergendo l'elettrodo in 4 pozzetti successivi con ddH2O sterile e lasciando asciugare l'elettrodo all'aria.
  3. Impostare il bianco posizionando un elettrodo nel pozzetto e il secondo elettrodo nell'inserto del pozzetto, riempiendolo di PBS e misurando il TEER.
    NOTA: Volumi consigliati per le misurazioni TEER: Per piastra da 12 pozzetti (1900 μl nel pozzetto e 900 μl nell'inserto). Per piastra a 24 pozzetti (750-1000 μl nel pozzetto e 250 μl nell'inserto).
  4. Sostituire il terreno delle colture ALI con PBS sterile a temperatura ambiente.
    NOTA: Rimuovere il fluido dal pozzetto inferiore e, in una seconda fase, dall'inserto del pozzetto trans. Allo stesso modo, aggiungere PBS prima all'inserto e poi al pozzetto inferiore per evitare il distacco della coltura di ALI dalla membrana del pozzetto.
  5. Posizionare gli elettrodi del misuratore TEER nei pozzetti sperimentali con colture ALI ed eseguire la misurazione TEER1.
    NOTA: Eseguire le misurazioni TEER ogni due giorni prima di cambiare il fluido.

6. Flusso macromolecolare

  1. Diluire la soluzione madre di FITC-destrano (3-5 kDa) a una concentrazione di lavoro di 1 mg/mL.
    NOTA: Proteggere sempre il FITC-destrano dall'esposizione alla luce.
  2. Preparare una riga di diluizione con una concentrazione FITC decrescente (da 1000 μg/mL a 0,25 μg/mL) come standard per la lettura.
  3. Aggiungere 500 μL di soluzione di FITC-destrano (1 mg/mL) nella camera superiore del pozzetto e 1,5 mL di terreno (+/- citochina di interesse) nel compartimento inferiore e posizionare la piastra nell'incubatore.
  4. Raccogliere 120 μl di terreno dallo scomparto inferiore nei rispettivi punti temporali (ad esempio, 0 min, 15 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min e 180 min).
  5. La pipetta duplica (50 μL/pozzetto) di ciascun punto temporale in una piastra nera a fondo piatto trasparente a 96 pozzetti.
  6. Eccitare il destrano FITC a 490 nm e leggere l'emissione a una lunghezza d'onda di 520 nm utilizzando un lettore di piastre.
  7. Calcolare la quantità di flusso macromolecolare secondo lo standard.

Risultati

Gli organoidi esofagei cresceranno da cellule primarie estratte da biopsie di pazienti secondo le istruzioni del protocollo fornito, come documentato con un microscopio a campo chiaro invertito (Figura 1). Le ASC epiteliali iniziano a formare cluster cellulari in modo auto-organizzante entro i primi due giorni di coltura dopo aver seminato le cellule isolate nell'estratto della membrana basale, fungendo da impalcatura. La dimensione e il numero di cluster cellulari, evidenti con un microscopio a campo chiaro invertito, aumentano continuamente entro la prima settimana (Figura 2). Tuttavia, a questo punto, i cluster cellulari mancano della struttura a cipolla caratteristica dell'epitelio squamoso multistrato di un organoide esofageo derivato da ASC. Il nono giorno di coltura, la struttura multistrato simile a una cipolla e un nucleo cheratinizzato in crescita al centro dell'organoide diventano evidenti (Figura 2A). La coltura di organoidi può essere sostenuta per un massimo di 21 giorni26. Tuttavia, è stato dimostrato che gli organoidi raggiungono la piena maturazione e la dimensione massima tra l'11° e il 14° giorno. Dall'11° giorno, il processo di coltura è prevalentemente caratterizzato dall'avanzamento della cheratinizzazione e dalla riduzione delle cellule vitali metabolicamente attive 5,26. Pertanto, il momento ottimale per recuperare gli organoidi per la sperimentazione dipende dalla fase di differenziazione desiderata ed è compreso tra 5 e 11 giorni.

Sono possibili fino a 3 passaggi prima che gli organoidi smettano di crescere perché l'aumento del nucleo di cheratina riduce il numero di cellule vitali. Gli organoidi possono essere raccolti per l'isolamento di RNA o proteine nei giorni desiderati per analizzare l'espressione genica/proteica o per l'istologia e la biobanca.

Le fasi iniziali di isolamento cellulare per l'ALI e la coltura di organoidi sono identiche. Prima che la coltura ALI possa essere stabilita, le cellule primarie appena isolate devono essere espanse in contrasto con il protocollo degli organoidi. Dopo il secondo passaggio, i cheratinociti primari vengono seminati su inserti transwell e coltivati in un terreno con bassa concentrazione di calcio per indurre la formazione di monostrati e prevenire la differenziazione prematura dei cheratinociti primari isolati. Dopo 48 ore, quando si forma un monostrato confluente, la concentrazione di calcio del terreno viene aumentata a 1,8 mM, inducendo la differenziazione e la stratificazione dello strato epiteliale. Dopo 7 giorni, il ponte aereo espone il lato apicale dell'epitelio multistrato all'aria per causare la cheratinizzazione. Le colture ALI possono solitamente essere mantenute per un massimo di 14 giorni (Figura 2B). Le misure TEER e gli esperimenti di flusso macromolecolare monitoreranno la funzionalità dell'epitelio. In questo caso, le misurazioni TEER sono state eseguite in colture di ALI da cheratinociti esofagei primari, in colture di ALI di cheratinociti primari con uno strato di alimentazione di fibroblasti NIH/3T3 sul fondo di ciascun pozzetto e in colture di ALI di cheratinociti primari con uno strato di alimentazione di fibroblasti NIH/3T3 su ciascun inserto (Figura 2C).

figure-results-1
Figura 1: Il processo di coltivazione di organoidi esofagei derivati da pazienti. Un diagramma che illustra la procedura di raccolta dei campioni, l'isolamento cellulare, la coltivazione degli organoidi e le potenziali applicazioni sperimentali degli organoidi esofagei derivati da pazienti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Formazione e differenziazione di organoidi esofagei derivati da pazienti. (A) Immagini rappresentative in campo chiaro di organoidi esofagei coltivati da cellule primarie derivate da biopsia del paziente. (B) Immagini rappresentative in campo chiaro di colture di ALI esofagee coltivate da cellule primarie derivate da biopsia al giorno 14. Barre di scala: 50μM. (C) Misurazioni della resistenza elettrica transepiteliale (TEER) ai giorni indicati in colture di interfaccia aria-liquido (ALI) da cheratinociti esofagei primari, ALI coltivate da cheratinociti primari con uno strato di alimentazione di fibroblasti NIH/3T3 sul fondo di ciascun pozzetto e ALI coltivate da cheratinociti primari con uno strato di alimentazione di fibroblasti NIH/3T3 su ciascun inserto sotto lo strato di cheratinociti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

MedioKSFMKSFM-C
Base mediaCheratinocita-SFMCheratinocita-SFM
IntegratoriPenicillina/Streptomicina1%1%
Estratto ipofisario bovino (BPE)50 μg/mL50 μg/mL
Fattore di crescita epidermico (EGF)1 ng/mL1 ng/mL
Cloruro di calcio (CaCl2)0,09 mM0,6 mM
Y-27632 (inibitore ROCK)-10 μM

Tabella 1: Terreni organoidi esofagei primari derivati da cellule. Elenco dei costituenti medi per la coltura di organoidi esofagei umani. SFM: terreno privo di siero.

Discussione

Le procedure fornite consentono la coltivazione di organoidi derivati da pazienti e colture di ALI con elevate prospettive di successo. Il protocollo degli organoidi è stato adattato dal primo protocollo pubblicato che riporta la generazione di organoidi esofagei umani26 e da un protocollo32 pubblicato di recente. Sherill e colleghi hanno descritto il modello ALI22. Gli organoidi e i modelli di coltura ALI si assistono a vicenda nello studio dell'impatto delle citochine e di altri mediatori sulla barriera epiteliale esofagea in contesti di malattie esofagee, come l'EoE 5,26.

Un vantaggio del protocollo organoide è la sua semplicità nel processo di coltura e nella composizione del terreno di coltura cellulare. A differenza di altri protocolli basati su ASC e PSC, che richiedono principalmente l'aggiunta di più integratori costosi e fattori di crescita 24,25,27,28,33, il terreno KSFM è relativamente economico. Richiede solo l'aggiunta di fattore di crescita epiteliale ricombinante umano (hEGF) ed estratto ipofisario bovino (BPE). KSFM è un terreno di base ottimizzato per la coltura di cheratinociti ed elimina la necessità di uno strato di alimentazione dei fibroblasti34. È necessario titolare la concentrazione di Ca2+ del KSFM da 0,09 mM a 0,6 mM utilizzando CaCl2 per ottenere il terreno KSFM-C utilizzato per la coltura di organoidi. Le colture di ALI richiedono una concentrazione di Ca2+ più elevata, pari a 1,8 mM, rispetto al modello di organoide. L'elevata concentrazione di Ca2+ è essenziale per avviare il differenziamento dei cheratinociti, facilitando successivamente la formazione della tipica configurazione a cipolla dell'epitelio squamoso multistrato presente all'interno degli organoidi esofagei 26,34,35 e la stratificazione epiteliale nelle colture di ALI 22.

Per prevenire la differenziazione prematura dei cheratinociti, gli organoidi e la generazione di colture di ALI è necessario evitare alte concentrazioni di Ca2+ durante l'isolamento cellulare. La differenziazione precoce diminuisce la formazione di colonie e impedisce la formazione auto-organizzante di organoidi e la formazione di un monostrato confluente di cheratinociti indifferenziati come fondamento delle colture di ALI. L'uso di terreni contenenti siero per fermare l'attività enzimatica della tripsina durante l'isolamento cellulare compromette la generazione di organoidi innescando una differenziazione prematura, in modo simile all'utilizzo di un terreno arricchito con Ca2+ durante l'isolamento cellulare36. Invece, si raccomanda un inibitore della tripsina di soia o qualsiasi altro inibitore della tripsina senza siero per fermare la reazione enzimatica dopo la digestione della biopsia con tripsina. Il terreno di coltura viene integrato con l'inibitore della Rho-chinasi (ROCK) Y27632 durante i primi due giorni di coltura per aumentare il tasso di formazione delle colonie. L'inibizione del ROCK ha effetti anti-apoptotici, previene la senescenza dei cheratinociti e quindi migliora il tasso di formazione degli organoidi37,38.

Si consiglia di seminare circa 20.000 cellule in una gocciolina di BME da 40 μL per garantire una coltura di organoidi fiorente e da 150.000 a 400.000 cellule per la coltura ALI. Un adeguato conteggio delle semine cellulari garantirà materiale sufficiente per la successiva trascrittomica, proteomica e istologia. Quando si utilizzano linee cellulari come la linea cellulare epiteliale esofagea umana EPC2-hTERT, la conta delle cellule di semina può essere ridotta a causa dell'elevato tasso di formazione di organoidi esibito da questa linea cellulare26. Questo fenomeno è probabilmente attribuito all'omogeneità e alla superiore sincronicità del ciclo cellulare dimostrate dalle linee cellulari rispetto alle cellule primarie derivate dalla biopsia. La linea cellulare immortalizzata EPC2-hTERT conserva anche la sua capacità proliferativa, consentendo il passaggio infinito di organoidi.

Al contrario, gli organoidi umani derivati da biopsie esofagee non possono essere mantenuti per la coltura a lungo termine26,28. Il declino delle cellule vitali in divisione all'interno di organoidi esofagei completamente sviluppati e un tasso decrescente di formazione di organoidi ad ogni passaggio26 indica che la perdita di capacità proliferativa negli organoidi derivati da cellule primarie è dovuta alla differenziazione terminale e alla cheratinizzazione delle cellule progenitrici. I precedenti tentativi di mantenere la capacità proliferativa integrando il terreno di coltura con Noggin, Wnt3a o A83-01 non hanno avuto successo 26,28,32. Pertanto, la biobanca a lungo termine di organoidi esofagei derivati da pazienti rimane una sfida che deve essere affrontata in studi futuri.

L'avvento della coltura degli organoidi ha portato nuove possibilità sperimentali che hanno notevolmente permesso la scoperta di mediatori infiammatori chiave e fattori ambientali responsabili delle alterazioni epiteliali in EoE 5,39,40,41,42. Tuttavia, è essenziale notare che gli organoidi esofagei derivati da ASC e PSC hanno dei limiti in quanto non ricapitolano perfettamente tutti i compartimenti cellulari dell'esofago. Gli organoidi derivati da ASC ricapitolano il compartimento epiteliale 24,26,27,33, mentre gli organoidi derivati da PSC ricapitolano i compartimenti epiteliale, endoteliale e mesenchimale 28,43,44. Tuttavia, tutti gli attuali modelli di organoidi mancano del microambiente immunologico. In un recente studio, organoidi esofagei umani e colture di ALI sono stati stimolati con citochine della famiglia delle citochine IL-20 per decifrare un nuovo aspetto della disfunzione della barriera epiteliale in EoE5. La combinazione di entrambi i modelli di coltura tridimensionali ha valutato le misure indirette e dirette dell'integrità della barriera epiteliale. Altre pubblicazioni probabilmente utilizzeranno organoidi esofagei in combinazione con colture di ALI per chiarire gli effetti di citochine definite sull'epitelio. Mentre questo approccio riduce la complessità del cross-talk tra il sistema immunitario e l'epitelio per rivelare la funzione di mediatori specifici sull'epitelio, trascura molti altri fattori potenzialmente coinvolti. La combinazione della tecnologia organoide e organo-on-a-chip può fornire una soluzione a questa limitazione. La tecnologia organ-on-a-chip basata sulla microfluidica è in grado di replicare il microambiente luminale e basolaterale degli organi tubulari, rendendo possibile l'ingresso e l'efflusso di cellule immunitarie e di altri componenti circolatori e luminali. Ciò consente lo studio delle interazioni tra l'epitelio e le cellule immunitarie nell'omeostasi e nella malattia45,46. La coltivazione di successo di organoidi di tubuli renali fisiologicamente polarizzati che presentano una barriera epiteliale intatta e un trasporto funzionale di ioni transepiteliali su una piattaforma organ-on-a-chip47 supporta l'uso esteso della tecnologia organoid-on-a-chip derivata dal paziente. Inoltre, un altro progresso nell'utilizzo della tecnologia organoid-on-a-chip è dimostrato attraverso la coltivazione estesa di organoidi originati da cellule primarie implementando un flusso luminale attraverso i canali microfluidici sul lato apicale degli organoidi tubulari per eliminare la perdita di cellule epiteliali46. Tali progressi evidenziano il potenziale di questa tecnologia di replicare ambienti in vivo in vitro.

La capacità di coltivare organoidi 3D che assomigliano a tutto, dal compartimento epiteliale a un mini-organo quasi completo con la maggior parte dei tipi di cellule, sollecita possibili applicazioni cliniche 5,26,46. Sebbene negli ultimi anni siano stati compiuti notevoli progressi, è necessario superare ulteriori ostacoli prima che gli organoidi possano essere utilizzati nella pratica clinica. Un ostacolo significativo per l'implementazione clinica degli organoidi è la presenza di proteine di origine animale nel terreno di coltura e nei prodotti ECM di impalcatura. Mentre i terreni privi di proteine animali per la coltura dei cheratinociti sono già disponibili e le varianti KSFM prive di BPE sono recentemente emerse, la produzione di alternative alla ECM prive di proteine animali con proprietà e risultati di coltura simili ai prodotti ECM tradizionali sembra più impegnativa. Recentemente, è stata segnalata un'alternativa potenzialmente promettente completamente sintetizzatachimica48. Ciononostante, attualmente non esiste un prodotto ECM privo di origine animale accessibile in commercio.

Gli organoidi esofagei e le colture di ALI sono strumenti vitali per lo studio dell'EoE. La coltura degli organoidi e le colture di ALI con i protocolli qui forniti sono servite come base per nuove rivelazioni riguardanti il coinvolgimento del compartimento epiteliale nell'esofagite eosinofila 5,26,39,41,42,49,50. La semplice implementazione di questi protocolli e il continuo progresso delle tecnologie di coltura cellulare tridimensionale facilitano l'approssimazione sperimentale all'ambiente in vivo, con conseguente maggiore traducibilità delle scoperte e possibilmente una graduale riduzione della sperimentazione animale.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

La sovvenzione del FNS 310030_219210 a J.H.N. ha sostenuto la pubblicazione di questo manoscritto senza restrizioni. La Figura 1 è stata creata con l'aiuto di BioRender.com.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1250 µ L Griptip - FiltroIntegra4445
300 &; micro; L Griptip - FiltroIntegra4435
70 µ Filtro cellulare MSarstedt83.3945.070
Acido ascorbicoSigma-Aldrich (Merck)A4544
Estratto ipofisario bovinoGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Cloruro di calcioSigma-Aldrich (Merck)21115
Piastre multipozzetto per colture cellulari CELLSTAR per colture in sospensioneGreiner Bio-One7.657 185
Estratto di membrana basale Cultrex (BME), tipo 2, PathclearR& D Systems (Bio-Techne)3532-010-02
Dimetil solfossido (DMSO), >99,5% BioScience GradeCarl RothA994
Dispase ICorning354235
Dispase IISigma-Aldrich (Merck)D4693
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline  (DPBS)Sigma-Aldrich (Merck)D8537
EVE Contatore di cellule automatizzatoNanoEntekEVE-MC
EVE Vetrino per conteggio celluleNanoEntekEVS-050
Falcon 5 mL Provetta in polistirene a fondo tondo, con filtro cellulare Tappo a scattoFalcon352235
Isotiocianato di fluorescina (FITC)-destranoSigma-Aldrich (Merck)FD4mol medio wt 3000-5000
Heraeus - Megafuge 40R Thermo Fisher Scientific75004518
Fattore di crescita epidermico ricombinante umanoGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Cheratinocita-SFMGibco (Thermo Fischer Scientific)17005042
Penicillina-StreptomicinaGibco (Thermo Fischer Scientific)15140122
Proteina umana ricombinante KGF/FGF-7R& D Systems (Bio-Techne)251-KG-010/CF
Provetta con tappo a vite, 15 mLSarstedt62.554.502
Canale singolo EVOLVE 100-1000 &; L Integra3018
Canale Singolo EVOLVE 20-200 µ L Integra3016
Siringa 1 mL1134950
ThermoMixer CEppendorf5382000015
Inibitore della tripsina da Glycine max (soia)Sigma-Aldrich (Merck)T9128
Trypsin-EDTASAFC Biosciences (Merck)59418C
Y27632 dicloridratoTocris (Bio-Techne)1254

Riferimenti

  1. Wu, L., et al. Filaggrin and tight junction proteins are crucial for IL-13-mediated esophageal barrier dysfunction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 315 (3), G341-G350 (2018).
  2. Davis, B. P., et al. Eosinophilic esophagitis-linked calpain 14 is an IL-13-induced protease that mediates esophageal epithelial barrier impairment. JCI Insight. 1 (4), e86355(2016).
  3. Blanchard, C., et al. Coordinate interaction between IL-13 and epithelial differentiation cluster genes in eosinophilic esophagitis. J Immunol. 184 (7), 4033-4041 (2010).
  4. Kc, K., Rothenberg, M. E., Sherrill, J. D. In vitro model for studying esophageal epithelial differentiation and allergic inflammatory responses identifies keratin involvement in eosinophilic esophagitis. PLoS One. 10 (6), e0127755(2015).
  5. Kaymak, T., et al. IL-20 subfamily cytokines impair the oesophageal epithelial barrier by diminishing filaggrin in eosinophilic oesophagitis. Gut. 72 (5), 821-833 (2023).
  6. Straumann, A., Bauer, M., Fischer, B., Blaser, K., Simon, H. U. Idiopathic eosinophilic esophagitis is associated with a T(H)2-type allergic inflammatory response. J Allergy Clin Immunol. 108 (6), 954-961 (2001).
  7. Straumann, A., Spichtin, H. P., Bernoulli, R., Loosli, J., Vogtlin, J. Idiopathic eosinophilic esophagitis: a frequently overlooked disease with typical clinical aspects and discrete endoscopic findings. Schweiz Med Wochenschr. 124 (33), 1419-1429 (1994).
  8. Attwood, S. E., Smyrk, T. C., Demeester, T. R., Jones, J. B. Esophageal eosinophilia with dysphagia. A distinct clinicopathologic syndrome. Dig Dis Sci. 38 (1), 109-116 (1993).
  9. Kelly, K. J., et al. Eosinophilic esophagitis attributed to gastroesophageal reflux: improvement with an amino acid-based formula. Gastroenterology. 109 (5), 1503-1512 (1995).
  10. Fogg, M. I., Ruchelli, E., Spergel, J. M. Pollen and eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 112 (4), 796-797 (2003).
  11. Wolf, W. A., Jerath, M. R., Dellon, E. S. De-novo onset of eosinophilic esophagitis after large volume allergen exposures. J Gastrointestin Liver Dis. 22 (2), 205-208 (2013).
  12. Moawad, F. J., et al. Correlation between eosinophilic oesophagitis and aeroallergens. Aliment Pharmacol Ther. 31 (4), 509-515 (2010).
  13. Woo, W., Aceves, S. S. The role of the allergist in the management of eosinophilic esophagitis. Curr Opin Gastroenterol. 37 (4), 390-396 (2021).
  14. Dellon, E. S., et al. Updated International Consensus diagnostic criteria for eosinophilic esophagitis: Proceedings of the AGREE conference. Gastroenterology. 155 (4), e1010 1022-1033 (2018).
  15. Liacouras, C. A., Spergel, J., Gober, L. M. Eosinophilic esophagitis: Clinical presentation in children. Gastroenterol Clin North Am. 43 (2), 219-229 (2014).
  16. Sleiman, P. M., et al. GWAS identifies four novel eosinophilic esophagitis loci. Nat Commun. 5, 5593(2014).
  17. Kottyan, L. C., et al. Genome-wide association analysis of eosinophilic esophagitis provides insight into the tissue specificity of this allergic disease. Nat Genet. 46 (8), 895-900 (2014).
  18. Kottyan, L. C., et al. Replication and meta-analyses nominate numerous eosinophilic esophagitis risk genes. J Allergy Clin Immunol. 147 (1), 255-266 (2021).
  19. Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes Immun. 15 (6), 361-369 (2014).
  20. Collins, M. H., et al. Newly developed and validated eosinophilic esophagitis histology scoring system and evidence that it outperforms peak eosinophil count for disease diagnosis and monitoring. Dis Esophagus. 30 (3), 1-8 (2017).
  21. Rochman, M., et al. Profound loss of esophageal tissue differentiation in patients with eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 140 (3), 738-749 (2017).
  22. Sherrill, J. D., et al. Desmoglein-1 regulates esophageal epithelial barrier function and immune responses in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunol. 7 (3), 718-729 (2014).
  23. Blanchard, C., et al. IL-13 involvement in eosinophilic esophagitis: transcriptome analysis and reversibility with glucocorticoids. J Allergy Clin Immunol. 120 (6), 1292-1300 (2007).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Rep. 9 (2), 701-711 (2014).
  26. Kasagi, Y., et al. The esophageal organoid system reveals functional interplay between Notch and cytokines in reactive epithelial changes. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (3), 333-352 (2018).
  27. Zhang, Y., et al. 3D modeling of esophageal development using human PSC-derived basal progenitors reveals a critical role for notch signaling. Cell Stem Cell. 23 (4), e515 516-529 (2018).
  28. Trisno, S. L., et al. Esophageal organoids from human pluripotent stem cells delineate sox2 functions during esophageal specification. Cell Stem Cell. 23 (4), e507 501-515 (2018).
  29. Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
  30. Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 53 (1), e109(2020).
  31. Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440(2021).
  32. Nakagawa, H., et al. Modeling epithelial homeostasis and reactive epithelial changes in human and murine three-dimensional esophageal organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 52 (1), e106(2020).
  33. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  34. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81, 1 Suppl 33-40 (1983).
  35. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Gonda, M. A., Saffiotti, U. Mouse epidermal keratinocytes. Clonal proliferation and response to hormones and growth factors in serum-free medium. Exp Cell Res. 155 (1), 64-80 (1984).
  36. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Camalier, R. F., Saffiotti, U. Effects of serum and serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (7), 423-428 (1986).
  37. Witkowski, T. A., et al. Y-27632 acts beyond ROCK inhibition to maintain epidermal stem-like cells in culture. J Cell Sci. 136 (17), jcs.260990 (2023).
  38. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
  39. Sasaki, M., et al. Lysyl oxidase regulates epithelial differentiation and barrier integrity in eosinophilic esophagitis. bioRxiv. , (2023).
  40. Doyle, A. D., et al. Detergent exposure induces epithelial barrier dysfunction and eosinophilic inflammation in the esophagus. Allergy. 78 (1), 192-201 (2023).
  41. Hara, T., et al. CD73(+) epithelial progenitor cells that contribute to homeostasis and renewal are depleted in eosinophilic esophagitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1449-1467 (2022).
  42. Kasagi, Y., et al. Fibrostenotic eosinophilic esophagitis might reflect epithelial lysyl oxidase induction by fibroblast-derived TNF-alpha. J Allergy Clin Immunol. 144 (1), 171-182 (2019).
  43. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  44. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  45. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  46. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
  47. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nat Biotechnol. 37 (3), 303-313 (2019).
  48. Sorrentino, G., et al. Mechano-modulatory synthetic niches for liver organoid derivation. Nat Commun. 11 (1), 3416(2020).
  49. Azouz, N. P., et al. The antiprotease SPINK7 serves as an inhibitory checkpoint for esophageal epithelial inflammatory responses. Sci Transl Med. 10 (444), 9736(2018).
  50. Azouz, N. P., et al. Functional role of kallikrein 5 and proteinase-activated receptor 2 in eosinophilic esophagitis. Sci Transl Med. 12 (545), 7773(2020).

Ristampe e permessi

Tag

Organoidi esofageiInterfaccia aria liquidoDifferenziamento epitelialeColtura di cheratinocitiResistenza transepitellialeStimolazione con citochineVia delle MAP chinasi
Modelli tridimensionali di coltura cellulare per studiare la barriera epiteliale nell'esofagite eosinofila
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.