Articolo metodologico

Caratterizzazione dei modulatori dei recettori attivati dalla proteasi con un saggio di mobilizzazione del calcio utilizzando un lettore di piastre

DOI:

10.3791/66507

⸱

24 maggio 2024

 , 
1Function Therapeutics, 2Department of Chemistry, Marquette University, 3School of Medicine, Washington University

In questo articolo

Sommario

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È stato sviluppato un protocollo migliorato per un saggio di mobilizzazione del calcio con cellule endoteliali, utilizzato per identificare ligandi di recettori attivati dalla proteasi (PAR). Il nuovo protocollo riduce il tempo totale di analisi di 90-120 minuti e produce curve concentrazione-risposta riproducibili.

Abstract

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Le variazioni della concentrazione di calcio nelle cellule vengono monitorate rapidamente e ad alto rendimento con l'uso di coloranti intracellulari, fluorescenti, leganti il calcio e strumenti di imaging in grado di misurare le emissioni fluorescenti da un massimo di 1.536 pozzetti contemporaneamente. Tuttavia, questi strumenti sono molto più costosi e possono essere difficili da mantenere rispetto ai lettori di piastre ampiamente disponibili che scansionano i pozzetti singolarmente. Di seguito viene descritto un saggio ottimizzato per l'uso con una linea cellulare endoteliale (EA.hy926) per misurare l'attivazione della segnalazione Gαq guidata dal recettore attivato dalla proteasi (PAR) e la successiva mobilizzazione del calcio utilizzando il colorante legante il calcio Fluo-4. Questo test è stato utilizzato per caratterizzare una serie di ligandi PAR, inclusi i ligandi allosterici anti-infiammatori "parmodulina" mirati a PAR1 identificati nel laboratorio di Dockendorff. Questo protocollo ovvia alla necessità di un gestore automatizzato di liquidi e consente lo screening a media produttività di ligandi PAR in piastre a 96 pozzetti e dovrebbe essere applicabile allo studio di altri recettori che avviano la mobilizzazione del calcio.

Introduzione

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I recettori attivati dalla proteasi (PAR)1,2,3 sono una sottofamiglia di recettori accoppiati a proteine G di classe A (GPCR) espressi in una varietà di tipi di cellule, tra cui piastrine e cellule endoteliali 4,5,6,7. A differenza della maggior parte dei GPCR, i PAR hanno una modalità di attivazione intramolecolare unica. La maggior parte dei GPCR sono attivati da ligandi solubili che interagiscono con una tasca di legame distinta, ma i PAR sono attivati dalla scissione proteolitica dell'N-terminale, che si traduce in un nuovo ligando legato che può interagire con il dominio extracellulare del loop 2 sulla superficie di una cellula 6,8,9. Questa interazione attiva il recettore e può avviare diverse vie di segnalazione, promuovendo effetti come l'infiammazione e l'attivazione piastrinica 4,10,11,12. Diverse proteasi possono attivare le PAR attraverso la scissione in siti unici sull'N-terminale, rivelando diversi ligandi legati (TL) che stabilizzano le conformazioni dei recettori, che avviano diverse vie di segnalazione 9,13,14,15. Ad esempio, nel membro più studiato della sottofamiglia, PAR1, la scissione da parte della trombina viene utilizzata per supportare numerosi processi biologici, tra cui l'attivazione piastrinica e il reclutamento dei leucociti nell'endotelio, ma può portare a effetti deleteri quando il recettore è sovraespresso o iperattivato 4,16,17,18,19,20,21 . Al contrario, la scissione da parte della proteina C attivata (aPC) può promuovere effetti antinfiammatori e il mantenimento delle barriere endoteliali 15,22,23,24,25,26,27,28,29. Le PAR possono anche essere attivate da analoghi peptidici delle TL in modo intermolecolare 13,30,31. Questi peptidi sono abitualmente utilizzati per misurare l'inibizione (modulazione) della PAR al posto delle proteasi che hanno come bersaglio la PAR, e sono utilizzati in questo protocollo.

Numerosi disturbi sono associati alla segnalazione patologica di PAR1, tra cui sepsi22,32, malattie cardiovascolari 33,34,35,36,37,38, malattie renali 39,40,41,42, anemia falciforme 43, fibrosi44, osteoporosi e osteoartrite45,46, neurodegenerazione 47,48,49,50,51 e cancro 52,53,54,55,56,57,58,59. Gli antagonisti di PAR1 sono stati studiati a partire dagli anni '90 come agenti antipiastrinici per le malattie cardiovascolari e la crescente lista di malattie associate al recettore richiede l'identificazione di nuovi ligandi da utilizzare come sonde biologiche (composti strumento) o come potenziali terapie. Attualmente, esiste un solo antagonista PAR1 approvato dalla FDA, vorapaxar, che viene utilizzato per trattare la malattia coronarica nei pazienti ad alto rischio 34,36,37,60. Un antagonista alternativo di PAR1, la pepducina PZ-128, ha completato con successo uno studio di fase II per prevenire la trombosi nei pazienti con cateterismo cardiaco38. Il gruppo di Dockendorff si è concentrato sulla chimica farmaceutica e sulla farmacologia di una classe separata di piccole molecole, i ligandi PAR1 noti come parmoduline61,62. A differenza degli antagonisti di PAR1 come vorapaxar, le parmoduline sono modulatori allosterici e distorti di PAR1 che bloccano selettivamente la via Gαq promuovendo effetti citoprotettivi simili all'aPC. A differenza dei potenti antagonisti ortosterici di PAR1 come il vorapaxar, anche le parmoduline pubblicate sono reversibili 63,64,65.

Inizialmente, le parmoduline sono state identificate da Flaumenhaft e collaboratori per la loro capacità di inibire l'espressione della P-selectina o la secrezione di granuli nelle piastrine61,66. Tuttavia, era necessario un metodo alternativo per studiare gli effetti delle parmoduline sulle cellule endoteliali. Un metodo comune per monitorare la segnalazione correlata ai GPCR consiste nel misurare la mobilizzazione intracellulare del Ca2+, un importante messaggero secondario che può essere misurato utilizzando un colorante intracellulare adatto che lega il calcio67,68. Sono state fornite prove sostanziali che dimostrano che la mobilizzazione del calcio indotta da PAR1 avviene attraverso l'attivazione di Gαq 69,70. Una volta attivato dal suo ligando legato (o da un ligando esogeno adatto), PAR1 subisce un cambiamento conformazionale che fa sì che la guanosina difosfato (GDP) legata alla subunità Gαq venga sostituita dalla guanosina trifosfato (GTP)68. La subunità Gαq attiva quindi la fosfolipasi Cβ (PLC-β), che catalizza l'idrolisi del fosfatidilinositolo 4,5 bisfosfato (PIP2), formando 1,4,5-inositolo trifosfato (IP3) e diacilglicerolo (DAG). Infine, l'IP3 si lega ai canali del Ca2+ sensibili all'IP3 nella membrana del reticolo endoplasmatico, consentendo al Ca2+ di essere rilasciato nel citoplasma, dove può legarsi a coloranti fluorescenti dipendenti dal Ca2+, come il Fluo-4, che vengono aggiunti alle cellule71. Questo processo avviene in pochi secondi e può aumentare la concentrazione di Ca2+ di 100 volte, portando a un drastico cambiamento nella quantità di colorante legato al calcio e a un robusto segnale di fluorescenza.

Nel 2018, il gruppo di Dockendorff ha rivelato un test di mobilizzazione del Ca2+ a medio rendimento che potrebbe essere utilizzato per identificare gli antagonisti della via Gαq di PAR172. Il test ha utilizzato EA.hy92673, una linea cellulare endoteliale umana ibrida, che può essere utilizzata per passaggi multipli senza un cambiamento evidente nell'espressione di PAR1 ed è stabilita per misurazioni in vitro degli effetti citoprotettivi.

Il protocollo originale utilizzava celle EA.hy926 in piastre a 96 pozzetti e caricate con colorante Fluo-4/AM, che è stato scelto per la sua intensa fluorescenza a 488 nm e l'elevata permeabilità cellulare. Una volta che il colorante è stato caricato nelle celle, sono state eseguite lunghe fasi di lavaggio con un gestore di liquidi automatizzato a 8 canali (metodi più veloci di manipolazione dei liquidi, come una lavatrice a 96 canali, erano inaccessibili). La riproducibilità di questo test è stata superiore a quella senza le modifiche robotiche dei terreni attente e automatizzate. Gli antagonisti sono stati quindi incubati con le cellule, PAR1 è stato attivato attraverso l'aggiunta sequenziale di un agonista selettivo (16 pozzetti alla volta) e sono stati misurati i cambiamenti nella fluorescenza derivanti dalla mobilizzazione del calcio e dal legame con il colorante per determinare l'attività.

Sebbene questo protocollo consenta la misurazione della mobilizzazione del calcio mediata da PAR1, è limitato dal tempo necessario per analizzare ciascuna piastra a 96 pozzetti. I lunghi tempi di sperimentazione sono problematici non solo perché il numero di composti che possono essere sottoposti a screening ogni giorno è limitato, ma anche perché l'efflusso di colorante si verifica nel tempo, restringendo la finestra del saggio aumentando la fluorescenza basale. Un fattore che ha contribuito alla lunga durata dell'esperimento è l'uso di un gestore di liquidi a 8 canali per il lavaggio delle lastre, che aggiunge oltre 30 minuti a ciascun esperimento. Anche le mance richieste sono diventate difficili da ottenere a causa di problemi della catena di approvvigionamento. Qui viene riportato un protocollo aggiornato per il saggio di mobilizzazione del calcio mediato da PAR che non richiede un gestore di liquidi e quindi può essere eseguito in una produttività più elevata. Questo protocollo dovrebbe essere adatto anche per misurare la segnalazione con altri GPCR che portano alla mobilizzazione intracellulare del calcio. Questo protocollo di lettura di piastre aggiornato è ideale per i laboratori accademici e industriali di piccole dimensioni che non dispongono delle risorse per costosi strumenti di imaging cellulare, ma hanno la necessità di eseguire rapidamente lo screening di numerosi composti. Per un esempio di un saggio di mobilizzazione del calcio utilizzando un imager su piastra, vedere Caers et al.74.

Protocollo

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Tutti gli scambi/aggiunte di terreni effettuati nelle fasi 1 e 2 del seguente protocollo vengono eseguiti in una cappa sterile. Salvo diversa indicazione, tutti gli articoli in plastica utilizzati nella cappa sterile devono essere acquistati sterilizzati e sigillati o sterilizzati in modo appropriato tramite autoclave.

1. Avvio della linea cellulare EA.hy926

  1. Acquisisci le celle EA.hy926.
  2. Conservare il flaconcino o i flaconcini di cellule in fase vapore di un serbatoio di azoto liquido.
  3. Preparare il terreno completo di DMEM riscaldando prima DMEM, FBS e penna/strep (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli specifici) in un bagno d'acqua a 37 °C per 15-30 minuti. Aggiungere 50 ml di FBS e 1 ml di penna/streptococco a 500 ml di DMEM. Mescolare delicatamente la soluzione per inversione.
    NOTA: Mescolare troppo energicamente provoca una quantità eccessiva di bolle.
  4. Togliere una fiala di cellule dall'azoto liquido e scaldarle a bagnomaria a 37 °C per 5 minuti.
  5. Sterilizzare la fiala di cellule e il flacone di DMEM completo spruzzando con alcol, quindi passare alla cappa sterile.
  6. Utilizzare una pipetta da 1.000 μl per trasferire con cura le cellule in una provetta da centrifuga sterile da 15 mL. Aggiungere 1 mL di DMEM al flaconcino per risciacquare e aggiungere alla provetta da centrifuga.
  7. Formare un pellet di celle utilizzando una centrifuga (150 × g, 5 min, 22 °C). Rimuovere il fluido dalla provetta da centrifuga mediante aspirazione; Fare attenzione a non disturbare il pellet della cella.
  8. Aggiungere 3 mL di terreno completo DMEM alla provetta da centrifuga e rompere delicatamente il pellet mescolando la sospensione cellulare con una pipetta da 1.000 μL.
    NOTA: Evitare di causare bolle mescolando troppo energicamente in quanto ciò potrebbe attivare o danneggiare le cellule.
  9. Miscelare 10 μl della sospensione cellulare con 10 μl di blu di tripano in una provetta per microcentrifuga utilizzando una pipetta con puntali da 20 μl o 200 μl. Aggiungere 10 μl della miscela di sospensione cellulare/blu di tripano a un emocitometro e contare le cellule.
    NOTA: L'uso di puntali per pipette da 0,1-10 μL può tagliare le cellule. Punte di queste dimensioni non devono essere utilizzate durante la manipolazione della sospensione cellulare.
  10. Aggiungere il terreno completo DMEM alla sospensione cellulare per ottenere una densità di 66.000 cellule/mL utilizzando una pipetta sierologica da 10 o 25 mL. Pipettare 15 mL della sospensione cellulare in un pallone o in un pallone di coltura T-75. Garantire un'equa dispersione della sospensione cellulare spostando il pallone da nord a sud e da est a ovest.
  11. Incubare le cellule fino a quando non raggiungono la confluenza (in genere dopo 4-6 giorni), come stimato mediante esame al microscopio. A questo punto, utilizzare le cellule dell'esperimento (a partire dalla sezione 2) o seminarle in nuovi flaconi per l'espansione per preparare brodi congelati (a una densità di semina raccomandata di 1.000.000 di cellule in 15 mL di terreno completo per matraccio T-75).
    NOTA: Le cellule possono essere coltivate nei flaconi di coltura per un massimo di 3 settimane senza una notevole differenza di forma, salute o prestazioni nel saggio. Il terreno completo deve essere sostituito ogni 3-4 giorni.

2. Aggiunta di celle EA.hy926 a piastre a 96 pozzetti

NOTA: Le cellule di un pallone di coltura T-75 confluente possono essere utilizzate per preparare due o tre piastre di saggio o, facoltativamente, espanse in un massimo di 15 matracci T-75 freschi. Almeno cinque piastre di analisi possono essere sottoposte a screening utilizzando il protocollo nelle sezioni 4 e 5 in una normale giornata lavorativa. Le seguenti istruzioni descrivono la preparazione e l'analisi di una piastra di analisi, ma è possibile preparare piastre aggiuntive ripetendo i passaggi 2.2, 2.7, 2.12 e 3.2 per preparare il numero desiderato di piastre di analisi. Più comunemente, vengono preparate quattro piastre di saggio al giorno per misurare le risposte di concentrazione con un massimo di 16 composti, il che richiede due fiasche T-75 con cellule confluenti.

  1. Scaldare il fluido completo DMEM a bagnomaria a 37 °C per 15-30 minuti. Sterilizzare il flacone di DMEM completo spruzzandolo con alcol, quindi spostarlo nella cappa sterile.
  2. Aggiungere 100 μl di una soluzione di gelatina sterilizzata allo 0,4% a tutti i pozzetti di una piastra a parete nera, a 96 pozzetti, a fondo trasparente con coperchio. Incubare la piastra con la soluzione di gelatina in un incubatore (37 °C, 5% CO2) per 30 minuti.
  3. Confermare che le cellule in un pallone di coltura T-75 siano confluenti all'80-100% utilizzando un microscopio invertito. Rimuovere il DMEM completo dal pallone T-75 tramite aspirazione.
  4. Lavare le cellule nel matraccio con 10 mL di PBS e muovere delicatamente il pallone da nord a sud e da est a ovest. Rimuovere il PBS dal pallone tramite aspirazione.
  5. Aggiungere 5 mL di soluzione di dissociazione cellulare al pallone e incubare il pallone in un incubatore (37 °C, 5% CO2) per ~12 min. Picchiettare il pallone dopo 6 minuti per facilitare la dissociazione.
    NOTA: L'incubazione delle cellule per più di 15 minuti con l'agente di dissociazione cellulare di riferimento provoca l'inizio dell'aggregazione delle cellule, il che rende più difficile ottenere una conta cellulare accurata e può interferire con il saggio.
  6. Aggiungere 5 mL del terreno completo DMEM preriscaldato al matraccio e mescolare delicatamente nella soluzione di dissociazione cellulare/sospensione cellulare. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, aggiungere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga sterile da 50 mL. Formare un pellet di celle utilizzando una centrifuga (150 × g, 5 min, 22 °C).
  7. Durante la formazione del pellet, rimuovere la soluzione di gelatina dalla piastra a 96 pozzetti mediante aspirazione utilizzando una pipetta Pasteur collegata a un vuoto. Rimuovere il coperchio della piastra dal momento della rimozione della gelatina fino a quando la soluzione non è pronta per essere impiattata.
    NOTA: Opzionalmente è possibile utilizzare una pipetta multicanale o un collettore sterile collegato a un vuoto.
  8. Rimuovere il fluido dalla provetta da centrifuga mediante aspirazione utilizzando una pipetta Pasteur collegata a un vuoto o una pipetta sierologica; Fare attenzione a non disturbare il pellet della cella.
  9. Aggiungere il terreno completo di DMEM fresco alla provetta da centrifuga utilizzando una pipetta sierologica da 5 o 10 mL. Rompere delicatamente il pellet cellulare mescolando il terreno completo DMEM con una pipetta da 1.000 μl o una pipetta sierologica da 5 ml.
    NOTA: In genere vengono utilizzati otto millilitri di DMEM, ma è possibile aggiungere volumi più elevati per facilitare il conteggio delle cellule.
  10. Miscelare 10 μl della sospensione cellulare con 10 μl di blu di tripano in una provetta per microcentrifuga utilizzando una pipetta con puntali da 20 μl o 200 μl. Aggiungere 10 μl della miscela di sospensione cellulare/blu di tripano a un emocitometro e contare le cellule.
  11. Aggiungere il terreno completo DMEM alla sospensione cellulare per ottenere una densità di 600.000 cellule/mL utilizzando una pipetta sierologica da 10 o 25 mL. Ciò darà una densità finale di 60.000 cellule/pozzetto in una piastra da 96 pozzetti (determinata come la densità ottimale dalla sperimentazione).
    NOTA: Una normale coltura cellulare di successo produrrà tra 12.000.000 e 15.000.000 di cellule, che possono seminare da due a tre piastre da 96 pozzetti.
  12. Miscelare la sospensione cellulare capovolgendo delicatamente la provetta da centrifuga e aggiungerla a un serbatoio per pipette multicanale da 50 mL. Miscelando la sospensione nel serbatoio ogni 30 s facendo oscillare delicatamente il serbatoio da un lato all'altro, aggiungere 100 μl di sospensione cellulare a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale. Riposizionare il coperchio trasparente della piastra e scuotere delicatamente la piastra facendola scorrere sulla superficie della cappa sterile da nord a sud e da est a ovest per garantire una distribuzione uniforme delle cellule. Incubare la piastra nell'incubatore (37 °C, 5% CO2) per 16-24 ore.
    NOTA: È possibile utilizzare una sospensione cellulare aggiuntiva per preparare piastre aggiuntive, oppure è possibile ripetere i passaggi 1.10-1.11 per continuare la linea cellulare.

3. Preparazione del saggio di mobilizzazione del calcio

  1. Preparare i reagenti del test.
    1. Preparare la soluzione di probenecid (250 mM, acquosa) aggiungendo 36 mg di probenecid a una provetta da microcentrifuga e sciogliendola in 0,6 M NaOH (500 μL). Vortex la soluzione.
      NOTA: Il probenecid migliora la ritenzione del colorante nella cellula inibendo i trasportatori di ioni organici 75,76,77.
    2. Per preparare il tampone per il dosaggio HBSS-HEPES, aggiungere HEPES (1,19 g) a un flacone da 500 mL di HBSS privo di rosso Ca/Mg/fenolo (per ottenere una soluzione da 10 mM di HEPES). Integrare il tampone con MgCl2 (soluzione acquosa 1 M, 500 μL) e CaCl2 (soluzione acquosa 1 M, 500 μL). Mescolare la soluzione e conservare in frigorifero a 5 °C quando non viene utilizzata.
      1. Per ogni piastra da 96 pozzetti, aggiungere 50 mL del tampone del saggio HBSS-HEPES a una provetta da centrifuga da 50 mL, integrare con 500 μL della soluzione di probenecid e mescolare bene. Riscaldare il tampone a temperatura ambiente prima dell'uso.
    3. Preparare una soluzione di Pluronic F-127 al 10% in DMSO aggiungendo Pluronic F-127 (20 mg) a una provetta per microcentrifuga o a una fiala per HPLC e sciogliendola con 200 μL di DMSO.
      NOTA: Questa soluzione può essere conservata a temperatura ambiente ed è sufficiente per circa 30 piatti. Pluronic F-127 si dissolve molto lentamente a temperatura ambiente e deve essere riscaldato delicatamente per facilitare la dissoluzione.
    4. Preparare il tampone di caricamento del colorante aggiungendo prima 24 μl di DMSO a una fiala di Fluo-4/AM (50 μg) per sciogliere il colorante. In una provetta da centrifuga da 15 mL avvolta in un foglio di alluminio, aggiungere 6 mL di tampone per il saggio HBSS-HEPES e integrare con 6 μL di Pluronic F-127 al 10% e 6 μL di soluzione Fluo-4/AM. Agitare brevemente la soluzione e lasciarla riposare a temperatura ambiente, al riparo dalla luce, per 10 minuti.
      NOTA: Per prevenire il fotosbiancamento di Fluo-4, tenere il colorante al riparo dalla luce avvolgendo un foglio di alluminio attorno alla provetta da centrifuga contenente la soluzione colorante e il coperchio della piastra di analisi.
  2. Preparare le piastre di analisi.
    1. Rimuovere la piastra di analisi dall'incubatore e confermare la confluenza utilizzando un microscopio invertito. Rimuovere manualmente il supporto completo DMEM infilandolo in un lavandino e tamponando la parte superiore della piastra con un tovagliolo di carta.
      NOTA: Il mezzo viene rimosso a sufficienza tenendo la piastra orizzontalmente e muovendo, quindi ruotando la piastra di 180° e ripetendo.
    2. Aggiungere il tampone per il test HBSS-HEPES e la soluzione di probenecid a un serbatoio di solvente per pipetta multicanale da 50 mL.
      NOTA: Questa soluzione verrà utilizzata per le fasi di lavaggio successive e deve essere messa da parte e coperta con un foglio di alluminio fino al momento del bisogno.
    3. Aggiungere 100 μl del tampone del saggio HBSS-HEPES più la soluzione di probenecid a ciascun pozzetto con una pipetta multicanale e lasciare riposare le cellule in presenza di probenecid per 5 minuti. Rimuovere il tampone per il test HBSS-HEPES scorrendolo nel lavandino nello stesso modo del passaggio 3.2.1.
    4. Aggiungere il tampone di caricamento del colorante a un serbatoio di solvente per pipette multicanale separato da 50 mL. Aggiungere 50 μl del tampone di caricamento del colorante a ciascun pozzetto della piastra del saggio utilizzando una pipetta multicanale. Incubare la piastra per 45 minuti (37 °C, 5% CO2).
    5. Mentre la piastra è nell'incubatrice, preparare le soluzioni agonista/antagonista.
      1. Le soluzioni antagoniste sono conservate come soluzioni da 31,6 mM in DMSO. In una provetta per PCR, diluire 2 μl della soluzione madre con 38 μl di BSA allo 0,1%/acqua per ottenere una soluzione da 1,58 mM. 2 μl di questa soluzione daranno una concentrazione finale di 31,6 μM nella piastra di analisi. Diluire 4 μl della soluzione di antagonista 1,58 mM con 36 μl di DMSO/acqua al 5% (senza aggiunta di BSA) e preparare le concentrazioni rimanenti attraverso diluizioni seriali.
      2. Preparare una soluzione da 108,3 μM (16,7x) di TFLLRN-NH2 in tampone per saggio HBSS-HEPES, che darà una concentrazione finale di 6,5 μM quando 6 μL vengono aggiunti a ciascun pozzetto della piastra di saggio. Ad esempio, sciogliere un'aliquota di 2 mg di TFLLRN-NH2 con 5,244 mL di tampone per il saggio HBSS-HEPES per ottenere una soluzione madre da 0,5 mM. Miscelare 1,083 mL di questa soluzione con 3,917 mL di tampone per saggi HBSS-HEPES per ottenere una soluzione da 108,3 μM.
        NOTA: Le soluzioni TFLLRN-NH2 devono essere conservate in un congelatore a -20 °C quando non vengono utilizzate.
    6. Rimuovere la piastra dall'incubatore e garantire l'assorbimento del colorante utilizzando un microscopio a fluorescenza con un'impostazione adeguata (in genere per le proteine fluorescenti verdi, vedere la Figura 1 per un esempio di Fluo-4 caricato con successo nelle cellule). Rimuovere il tampone di caricamento del colorante muovendo la piastra nello stesso modo del passaggio 3.2.1.
    7. Lavare le cellule 2 volte con 50 μl del tampone del saggio HBSS-HEPES più la soluzione di probenecid (dal passaggio 3.2.3) in ciascun pozzetto (rimuoverle agitando il terreno nel lavandino).
    8. Aggiungere 92 μl di tampone per il saggio HBSS-HEPES a ciascun pozzetto e visualizzare nuovamente le cellule con un microscopio a fluorescenza per assicurarsi che il colorante in eccesso sia stato completamente rimosso e che le cellule rimangano aderenti.
    9. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 2 μl delle soluzioni antagoniste e del veicolo ai pozzetti appropriati (vedere la Tabella 1 per una mappa rappresentativa delle piastre).

4. Esecuzione del saggio di mobilizzazione del calcio

  1. Impostare il lettore di piastre come segue: temperatura: 37 °C; lunghezza d'onda di eccitazione: 485 nm; lunghezza d'onda di emissione: 525 nm; Altezza di misurazione: 7,8 mm (ottimizzata); numero di lampeggi: 100; Numero di ripetizioni: 20.
  2. Incubare la piastra per 15 minuti nel lettore di piastre a 37 °C. Misurare la fluorescenza di fondo nelle colonne 1 e 2 (cinque scansioni per pozzetto).
  3. Espellere la piastra dal lettore di piastre e aggiungere rapidamente 6 μL di soluzione agonista a ciascun pozzetto nelle colonne 1 e 2 da una striscia PCR da 8 provette utilizzando una pipetta multicanale.
    NOTA: Per questa fase, utilizziamo una pipetta elettronica a 8 canali con puntali per pipette da 0,1-10 μl.
  4. Misurare la variazione della fluorescenza quando si verifica la mobilizzazione del calcio nelle cellule. Eseguire 20 scansioni di ciascun pozzetto in base alle impostazioni di cui sopra.
    NOTA: La scansione di ciascun pozzetto in due colonne 20x ciascuna richiede circa 5 minuti (ovvero ~15 s tra le scansioni di ciascun pozzetto).
  5. Ripetere i passaggi 4.2-4.4 per le colonne 3-12 con incrementi di due colonne.

5. Analisi dei dati

  1. Esporta i dati dal test come fogli di calcolo separati per ogni gruppo a due colonne.
  2. Trova la media delle letture della fluorescenza basale utilizzando la funzione AVG(prima scansione: ultima scansione). Fallo per ogni pozzetto in entrambe le colonne.
  3. Trova la fluorescenza massima dopo l'aggiunta dell'agonista utilizzando la funzione MAX (prima scansione: ultima scansione).
  4. Calcola la variazione della fluorescenza sottraendo la fluorescenza basale dalla fluorescenza massima.
  5. Sottrarre la variazione di fluorescenza calcolata per il controllo negativo (aggiunta di veicolo senza agonista) da ciascun pozzetto nella stessa colonna.
  6. Trova la variazione relativa (normalizzata) della fluorescenza dividendo la variazione della fluorescenza in ciascun pozzetto per la variazione della fluorescenza nel veicolo (0,1% DMSO/acqua) + 6,5 μM TFLLRN-NH2 pozzetti.
  7. Copiare i valori non di controllo, in percentuale, in un programma software di statistiche e grafici. Se si utilizza il software di riferimento, scegliere l'opzione Tabella XY, con i Numeri scelti come asse X e replicare i valori in sottocolonne affiancate come asse Y.
  8. Utilizzare il programma per tracciare le curve concentrazione-risposta (CRC) dai dati. Se si utilizza il software di riferimento, scegliere l'opzione log(inibitore) vs. risposta - Pendenza variabile (quattro parametri).

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo scopo di questo test è generalmente quello di produrre curve concentrazione-risposta (CRC) per tre o quattro nuove parmoduline. Su ogni piastra di analisi, viene spesso generato un CRC aggiuntivo per un composto noto, come NRD-21, che funge da controllo di qualità per l'esperimento grazie al suo noto IC50. Per generare CRC, è necessario pianificare una mappa delle placche come quella illustrata nella Tabella 1 . Se invece si desiderano risposte di concentrazione a punto singolo, i composti a concentrazioni finali di 10 μM (o altre concentrazioni preferite) devono essere aggiunti ad almeno tre pozzetti.

Quando si esegue il test, dovrebbe esserci un rapido aumento della fluorescenza (l'aumento dovrebbe iniziare entro le prime 3-4 scansioni) visualizzato dal lettore di piastre (vedere la Figura 2A per un output di esempio rispetto all'output fallito nella Figura 2B). È importante notare che l'agonista deve essere aggiunto rapidamente (entro 15 s) affinché il lettore di piastre sia in grado di catturare con precisione l'aumento della fluorescenza. In un esperimento di lavoro, il segnale di fluorescenza per il pozzetto del veicolo dovrebbe rimanere piatto, mentre il segnale di fluorescenza nei pozzetti di controllo positivo (veicolo + 6,5 μM TFLLRN-NH2) dovrebbe iniziare ad aumentare dopo tre o quattro scansioni. Una volta raggiunto il valore massimo (dopo ~10 scansioni), il segnale di fluorescenza dovrebbe iniziare a diminuire lentamente. Negli esperimenti con antagonisti altamente efficaci, i pozzetti con le più alte concentrazioni di antagonisti dovrebbero avere un segnale che rimane relativamente piatto, simile al controllo negativo. Ci dovrebbe essere anche poca differenza tra il segnale dei pozzetti di controllo positivi e quelli con basse concentrazioni dell'antagonista (Figura 2C). Se le concentrazioni più basse di antagonista continuano a inibire la mobilizzazione del calcio, le concentrazioni sottoposte a screening devono essere aggiustate per includere concentrazioni più basse. I CRC generati devono avere almeno un punto dati ~100% per mostrare completamente la natura sigmoidale della curva.

Il segno più comune che un esperimento non ha funzionato è se il pozzetto di controllo positivo (veicolo + 6,5 μM TFLLRN-NH2) non mostra un grande aumento della fluorescenza (Figura 2B). Ciò potrebbe accadere per una serie di motivi: la conta cellulare potrebbe essere bassa (se la confluenza non è stata confermata), la soluzione agonista potrebbe essere compromessa o le quantità inadeguate di colorante potrebbero essere state assunte dalle cellule. È anche possibile erroneamente non aggiungere l'agonista a certi pozzetti.

Con un metodo programmato, i dati vengono emessi come sei fogli di calcolo separati, ciascuno contenente dati per due colonne. Le cinque scansioni della fluorescenza basale sono in una riga separata, con le 20 scansioni effettuate dopo l'aggiunta dell'agonista nella riga immediatamente sottostante (vedere la Figura 3 per l'output rappresentativo). Per un esempio di calcolo, verrà utilizzata una colonna di un esperimento che utilizza NRD-21. Nel file esportato (Figura 3), la fluorescenza basale di ciascun pozzetto viene emessa nelle colonne da C a G e i dati successivi all'aggiunta dell'agonista (le successive 20 scansioni) vengono emessi nelle colonne da C a V nella riga successiva. Le righe 14-17 del file contengono il controllo positivo di due colonne separate. La media della fila basale per uno dei pozzetti di controllo positivi è stata calcolata utilizzando il comando "=AVERAGE(C16:G16)", che ha dato un valore di 1.039,8. Questo comando è stato ripetuto per le misurazioni basali aggiuntive in ciascun pozzetto. Il massimo delle scansioni sperimentali è stato calcolato utilizzando il comando "=MAX(C16:V16)", che ha dato un valore di 2.629. Ancora una volta, il comando fu ripetuto per tutti i pozzi. La fluorescenza basale per ogni pozzetto è stata quindi sottratta dal valore massimo. In questo esperimento, i dati sono stati normalizzati sottraendo la variazione della fluorescenza nel controllo negativo da ciascun pozzetto (che era 142,6 nella colonna di esempio). Questi valori sono stati poi divisi per il valore calcolato in modo simile del controllo positivo. In questa colonna, il valore massimo era 2.629, la misura basale media era 1.039,8 e il valore sottratto per il bianco era 142,6. Il valore del controllo positivo rettificato è quindi 1.446,6 (calcolato dall'equazione). Questa equazione viene ripetuta per ogni pozzetto nella colonna e i valori calcolati vengono divisi per 1.446,6 per ottenere la loro variazione relativa in fluorescenza. I rapporti sono stati poi convertiti in percentuali e sono stati copiati nel software analitico. Questo processo è stato ripetuto per le altre 11 colonne.

Per elaborare i dati utilizzando il software di riferimento, è necessario selezionare una tabella XY con l'opzione di avere tre misurazioni ripetute in colonne affiancate. I valori -log di ciascuna concentrazione devono essere inseriti nei valori x e le percentuali calcolate devono essere aggiunte ai valori y. Sui dati deve essere eseguita un'analisi di regressione non lineare, che provoca la produzione di quattro curve concentrazione-risposta. Il programma produce anche valori IC50 , statistiche di errore quantificate e statistiche sulla bontà dell'adattamento.

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Figura 1: Fluo-4/AM caricato nelle celle EA.hy926. Fluo-4 caricato selettivamente in celle EA.hy926, dopo l'incubazione del colorante e le fasi di lavaggio. Tutta la fluorescenza avviene all'interno delle cellule, senza perdite di colorante. Immagine ottenuta utilizzando l'impostazione GTP su un imager a celle EVOS e ingrandimento 20x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Output potenziale del saggio. (A) Output rappresentativo del lettore di piastre di un test funzionante. La riga A è il controllo negativo e non ha alcun cambiamento nella fluorescenza. La riga B è il controllo positivo e mostra un rapido aumento della fluorescenza. Le file C-H sono i pozzetti sperimentali, con le concentrazioni più elevate di parmodulina più basse nella piastra. (B) Esempio di output di un esperimento fallito. Non si osserva alcun aumento della fluorescenza nella riga B, che è il controllo positivo. (C) Variazione della fluorescenza nel tempo indotta dall'agonista PAR1 TFLLRN-NH2. La scansione di due colonne di una piastra a 96 pozzetti utilizzando le impostazioni fornite richiede ~5 minuti sul lettore di piastre PerkinElmer EnSpire (ovvero, ~15 s tra le scansioni di ciascun pozzetto). Diverse soluzioni di NRD-21 sono come indicato, "Agonista" è 6,5 μM TFLLRN-NH2, n = 1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Esempio di output Excel per un saggio funzionante. La fluorescenza basale viene emessa in righe pari a partire dalla riga 10 e il risultato delle prime 10 scansioni dopo l'aggiunta dell'agonista viene mostrato nelle successive righe dispari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Manipolazione robotica dei liquidi rispetto al "flicking". Il prerivestimento delle piastre di analisi con gelatina e l'esecuzione manuale della sostituzione dei terreni mediante scorrimento della piastra e tamponamento a secco producono curve concentrazione-risposta con minore variabilità. (A) Curve concentrazione-risposta delle parmoduline ML161 e NRD-21 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (manipolazione automatizzata dei liquidi). (B) Curve concentrazione-risposta delle parmoduline ML161 e NRD-21 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (piastre rivestite di gelatina, sfogliate). I dati sono mezzi ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Studi sulla temperatura. L'esecuzione del test a 37 °C genera dati più riproducibili rispetto a temperatura ambiente. (A) Curve concentrazione-risposta di ML161 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (temperatura ambiente). (B) Curve concentrazione-risposta di ML161 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (37 °C). I dati sono mezzi ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-6
Figura 6: Studi sulla densità cellulare. La densità cellulare ottimale è di 60.000 cellule/pozzetto quando si semina 16-24 ore prima dell'inizio di un saggio. (A) Curve concentrazione-risposta di TFLLRN-NH2 a diverse densità cellulari, n = 3. (B) Curva concentrazione-risposta di TFLLRN-NH2 alla densità cellulare ottimale di 60.000 cellule/pozzetto. I dati sono mezzi ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Volume del saggio. L'utilizzo di un volume di saggio di 100 μl genera curve concentrazione-risposta più riproducibili rispetto ai saggi che utilizzano un volume finale di 200 μl. (A) Curve concentrazione-risposta di ML161 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (volume finale di 200 μl). (B) Curve concentrazione-risposta di ML161 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (100 μL di volume finale). I dati sono mezzi ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Generazione dei fattori Z' per determinare la capacità del saggio di rilevare un composto colpito. Risposte di mobilizzazione del calcio con 6,5 μM TFLLRN-NH2 (colonna B) più antagonisti PAR1 opzionali 10 μM NRD-21 (colonna C) o 0,316 μM vorapaxar (colonna D). (A) Saggio completato 16 ore dopo la semina cellulare. (B) Saggio completato 24 ore dopo la semina cellulare. (C) Tabella dei fattori Z' calcolati utilizzando la seguente equazione: figure-results-9, doveσ p è la deviazione standard del controllo positivo, σn è la deviazione standard del controllo negativo o del campione, μp è la media del controllo positivo e μn è la media del controllo negativo o del campione. Ogni valore viene calcolato designando il veicolo + 6,5 μM TFLLRN-NH2 come controllo positivo e confrontandolo con la condizione indicata come controllo negativo (veicolo) o campione (NRD-21 e vorapaxar). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 9: Mobilizzazione del calcio da un agonista PAR2. Variazione della fluorescenza nel tempo indotta da 10 μM SLIGKV-NH2, n = 4. I dati sono mezzi ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Esempio di mappa su piastra a 96 pozzetti per lo screening dei composti. Ogni concentrazione è misurata in triplice copia. La riga A contiene controlli negativi (nessun antagonista, nessun agonista) e la riga B contiene controlli positivi (nessun antagonista, agonista). Le colonne da 1 a 3 contengono sei concentrazioni di mezzo log della parmodulina NRD-21 che possono essere utilizzate opzionalmente per il controllo di qualità. PM-A, PM-B, PM-C sono parmoduline senza nome. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Confronto tra il protocollo pubblicato in precedenza e il nuovo protocollo ottimizzato. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

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Mentre il protocollo72 precedentemente riportato era generalmente affidabile e ci ha permesso di identificare una nuova parmodulina di piombo, NRD-21,62 era un protocollo più efficiente. Il test è stato ulteriormente compromesso durante la carenza di approvvigionamento causata dalla pandemia di COVID-19. L'acquisizione di punte per il manipolatore automatico di liquidi è diventata difficile e il tentativo di lavare, sterilizzare e riutilizzare le punte ha prodotto CRC con una variazione significativa. Ciò ha facilitato una serie urgente di esperimenti progettati per semplificare un test di mobilizzazione del calcio guidato da PAR.

Identificare una valida alternativa all'uso del manipolatore automatico di liquidi per le fasi di lavaggio è stata la priorità principale di questo studio. Durante lo sviluppo di saggi precedenti, l'uso del manipolatore robotico di liquidi ha ridotto gli errori causati dalla sostituzione manuale dei terreni. Tuttavia, questo ha aggiunto molto tempo al saggio, poiché gli scambi di terreni con il gestore di liquidi a 8 canali hanno aumentato il tempo totale di ciascuna piastra di analisi di 30-45 minuti. Sebbene in precedenza fosse stato provato un metodo di scambio di terreni "flicking", questi esperimenti sono stati eseguiti senza rivestire le piastre di saggio con gelatina prima della semina cellulare. Pretrattando le piastre con gelatina, è stato garantito che le celle rimanessero in posizione indipendentemente dalla forza utilizzata per rimuovere manualmente i terreni. I CRC generati in un test utilizzando piastre rivestite di gelatina avevano punteggi di bontà di adattamento migliori e barre di errore più piccole in più punti dati rispetto alle curve in cui è stato utilizzato il gestore automatico di liquidi (Figura 4). I valori di errore quadratico medio (RMSE) per la piastra che utilizzava il gestore automatico di liquidi erano 9,687 per la curva ML161 e 10,690 per la curva NRD-21, mentre i valori RMSE per la piastra che utilizzava gelatina e un cambio manuale del fluido erano 7,658 per la curva ML161 e 6,408 per la curva NRD-21. Valori RMSE più bassi indicano una curva che si adatta meglio ai dati dati. Questa modifica riduce notevolmente anche il tempo totale di analisi. In alternativa, è possibile utilizzare una lavapiatti automatizzata multicanale.

Il metodo di aggiunta dell'agonista è stato un ulteriore fattore che è stato studiato. Questo è stato fatto per determinare se l'agonista poteva essere aggiunto a tutti i pozzetti della piastra contemporaneamente, seguito da una scansione dell'intera piastra contemporaneamente; Ciò eliminerebbe la necessità per i ricercatori di rimanere vicino al lettore di piastre per tutta la durata del test sensibile al tempo per numerose aggiunte di agonisti separati, il che potrebbe aumentare significativamente la produttività. Sfortunatamente, l'aggiunta di agonista a tutti i pozzetti e la scansione dell'intera piastra erano problematici, perché la risposta era troppo rapida per misurare in modo affidabile la concentrazione massima transitoria di calcio in ogni pozzetto, fornendo CRC altamente variabili. La riduzione del numero di colonne scansionate da 12 a 6 ha leggermente migliorato i risultati, ma i migliori risultati sono stati generati dalla scansione di due sole colonne (16 pozzetti) alla volta. Si potrebbe ipotizzare che la riduzione della temperatura del test da 37 °C a temperatura ambiente potrebbe rallentare la variazione della concentrazione di calcio abbastanza da consentire misurazioni affidabili. Sebbene siano stati convalidati più protocolli di mobilizzazione del calcio con diversi coloranti o linee cellulari a temperatura ambiente78,79, in questo specifico test si osservano risultati migliori a 37 °C. Le curve concentrazione-risposta degli antagonisti misurate a temperatura ambiente (~23°C) non erano uniformi come a 37 °C (Figura 5A rispetto alla Figura 5B). Sulla base di questi risultati, è stato stabilito che la scansione di due colonne alla volta a 37 °C è ottimale.

Un'altra variabile che è stata esaminata per ridurre il tempo di analisi è stato il tempo di incubazione dell'antagonista. Nel protocollo precedente, gli antagonisti venivano incubati per 40 minuti prima dell'aggiunta dell'agonista, ma qui è stato determinato che 15 minuti è un tempo sufficiente per le parmoduline per interagire con PAR1. Questo è stato testato aggiungendo soluzioni di parmodulina a più colonne contemporaneamente, seguite dall'aggiunta di agonista in diversi punti temporali (l'agonista è stato aggiunto a t = 15 min, 30 min e 45 min). L'attività delle parmoduline è stata mantenuta, ma non migliorata, incubando gli antagonisti più a lungo. Come risultato di questa scoperta, nel nuovo protocollo, le soluzioni antagoniste vengono aggiunte all'intera piastra in una sola volta e le soluzioni agoniste vengono aggiunte alle prime colonne dopo un'incubazione di 15 minuti. Questa modifica riduce ulteriormente il tempo totale dell'esperimento di 30 minuti. Va notato che gli antagonisti con cinetica di legame lenta, come il vorapaxar, possono richiedere tempi di incubazione più lunghi80,81.

Sebbene la riduzione del tempo di analisi e l'eliminazione della dipendenza dal gestore di liquidi siano stati i fattori principali che hanno reso necessario un aggiornamento del protocollo di analisi, è stato testato anche un metodo alternativo di coltura cellulare. In precedenza, le piastre venivano seminate con cellule provenienti direttamente da ceppi congelati e lasciate crescere nelle piastre per 40-48 ore dopo la semina. Tuttavia, il tempo prolungato tra le piastre di semina e l'esecuzione dei saggi limitava il numero di esperimenti che potevano essere eseguiti ogni settimana. L'utilizzo di cellule coltivate in fiasche di coltura riduce drasticamente questo tempo. Le cellule sono state coltivate in fiasche T-75 trattate con colture tissutali e sono state rimosse dalla superficie della fiaschetta utilizzando un agente di dissociazione cellulare non enzimatico. Questo può essere importante per evitare di danneggiare alcuni recettori della superficie cellulare, in particolare PAR2, con la tripsina. Una volta aggiunte alla piastra di analisi, le cellule hanno bisogno di un tempo adeguato per depositarsi e aderire alla gelatina. Poiché il metodo di rimozione dei terreni può anche spostare le cellule, è necessario un tempo sufficiente per consentire alle cellule di essere incorporate nella gelatina. Un esperimento che ha permesso alle cellule di depositarsi per due ore ha causato una significativa perdita di cellule, risultando in un test inutilizzabile (dati non mostrati). I tempi di decantazione compresi tra 2 ore e 12 ore limitano il numero di piastre che possono essere analizzate in un solo giorno, quindi è preferibile un'incubazione notturna più lunga. Si è scoperto che l'incubazione delle cellule appena coltivate tra le 16 e le 24 ore ha permesso alle cellule di aderire completamente alla gelatina e si possono ottenere dati riproducibili.

Il passaggio da cellule congelate a cellule coltivate in fiaschetta di coltura ha anche modificato la densità di semina cellulare ottimale. Prevedibilmente, i pozzetti di semina alla densità di 25.000 cellule/pozzetto che era standard nel protocollo precedente non hanno permesso alle cellule di raggiungere la confluenza con un tempo di incubazione più breve. I CRC agonisti sono stati generati con otto densità cellulari separate per determinare le condizioni ottimali (Figura 6). In precedenza, TFLLRN-NH2 era stato utilizzato come agonista PAR1 a 5 μM, in quanto ciò consentiva un ragionevole antagonismo con parmoduline a bassa solubilità. Non c'è una differenza significativa nel segnale di fondo o massimo quando si semina con 45.000-65.000 cellule/pozzetto, ma c'è una diminuzione della variabilità con 5 μM TFLLRN-NH2 quando si aggiungono 60.000 cellule/pozzetto. È interessante notare che non vi è un aumento significativo della fluorescenza massima con un numero maggiore di cellule, quindi 60.000 cellule/pozzetto è stata scelta come densità ottimale a causa della ridotta variabilità. I CRC agonisti hanno anche prodotto un EC50 di 6,5 μM per TFLLRN-NH2, quindi questa è stata scelta come nuova concentrazione standard dell'agonista.

Un altro fattore che è stato analizzato sono stati i volumi utilizzati nel test. Nel protocollo precedente, 2 μl di agonista sono stati aggiunti a ciascun pozzetto per ottenere un volume finale di saggio di 200 μl. È stato ipotizzato che l'aggiunta di volumi più elevati di soluzione agonista, ma mantenendo costante la concentrazione finale, potesse aiutare a mescolare, causando un segnale più veloce e affidabile. Per testare questa ipotesi, è stata confrontata l'aggiunta di 2 μL, 6 μL e 10 μL TFLLRN-NH2 in 100 μL o 200 μL di HEPES-HBSS in una piastra di saggio contenente diverse concentrazioni di NRD-21. I CRC di NRD-21 per ciascuna condizione sono stati generati per determinare quale combinazione di volume dell'agonista e volume finale del saggio ha fornito i dati più coerenti. Mentre entrambe le aggiunte di 2 μL e 6 μL hanno portato a CRC generati con poca variabilità, lo stesso non si può dire delle curve prodotte dall'aggiunta di 10 μL TFLLRN-NH2 (dati non mostrati); gli aumenti della fluorescenza non erano coerenti in questi pozzi né in grandezza né in tempistica, il che produce CRC che dovrebbero essere identici ma sono invece drasticamente diversi. Sebbene le aggiunte di 2 μL e 6 μL abbiano prodotto risultati simili, la variazione della fluorescenza si è verificata molto più rapidamente con l'aggiunta di 6 μL di TFLLRN-NH2, che ha permesso di dimezzare il numero totale di scansioni in ciascun pozzetto, da 40 scansioni a 20 scansioni. È stato inoltre determinato che l'utilizzo di un volume finale di 100 μl produce CRC più uniformi rispetto a quelli generati con un volume finale di 200 μl (Figura 7).

Per determinare se il nuovo protocollo è adatto a saggi a rendimento più elevato, sono stati calcolati i fattori Z' per il test (Figura 8). Il fattore Z' è un metodo statistico che misura la qualità di un test di screening e determina se un test differenzia in modo affidabile i composti attivi e inattivi82. I fattori Z' sono stati calcolati per saggi eseguiti tra 16 e 24 ore dopo la semina delle piastre e in diversi passaggi cellulari. In tutti i casi, sia per le modalità solo agonista che per quelle agonista più antagonista, i fattori Z' calcolati erano maggiori di 0,5, indicativi di un eccellente saggio82. Anche i fattori Z' calcolati erano simili a quelli calcolati per il test precedente, indicando che le modifiche apportate al protocollo per produrre un test più veloce non hanno avuto un impatto negativo sulla qualità.

Il protocollo per la mobilizzazione del calcio guidata da PAR è stato aggiornato attraverso esperimenti che hanno generato valori IC50 da CRC, ma il test può essere utilizzato anche per misurare l'efficacia degli antagonisti PAR1 a singole concentrazioni. Il test può essere utilizzato anche per misurare l'attività dei ligandi PAR2; ad esempio, l'agonista PAR2 SLIGKV-NH2 può sostituire TFLLRN-NH2 nel protocollo aggiornato (Figura 9); il protocollo precedente è stato utilizzato anche con agonisti e antagonisti PAR283. Sebbene non sia stato esplicitamente testato qui, questo protocollo dovrebbe essere applicabile anche alle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC), che sono state utilizzate con il protocollo precedente, e potenzialmente ad altre linee cellulari aderenti. Una limitazione all'uso di un lettore di lastre a scansione con protocolli come questo è che non sono adatti a studiare risposte rapide (inferiori al secondo), almeno non in parallelo come è possibile con un imager a lastre.

In conclusione, qui riportato è un protocollo più rapido e semplice per il test di mobilizzazione del calcio guidato da PAR endoteliale utilizzando un lettore di piastre. Eliminando la necessità di un gestore automatico di liquidi, riducendo il tempo di incubazione dell'antagonista e diminuendo il numero di scansioni per ciascun pozzetto, il tempo totale del saggio è stato ridotto di almeno 90-120 minuti e i costi del saggio sono stati ridotti (per un confronto tra i protocolli precedentemente riportati e quelli attuali, vedere la Tabella 2). Ciò non solo consentirà lo screening di più composti ogni giorno, ma eliminerà anche il rischio di una riduzione della finestra di analisi dovuta all'efflusso del colorante, che potrebbe portare a risultati inaffidabili. Il test, recentemente ottimizzato, consente uno screening più rapido nelle cellule endoteliali di ligandi PAR1 o PAR2, o potenzialmente di altri ligandi GPCR che attivano la mobilizzazione intracellulare del calcio, in laboratori limitati all'uso di lettori di piastre.

Dichiarazioni

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C.D. è l'inventore di brevetti che coinvolgono le parmoduline ed è il fondatore e azionista di Function Therapeutics, Inc., che sta sviluppando parmoduline per uso clinico.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Irene Hernandez, Trudy Holyst, il Dr. Hartmut Weiler (Versiti Blood Research Institute) e il Dr. Leggy Arnold (University of Wisconsin-Milwaukee) per aver fornito spazio e supporto indiretto a questo progetto, e il Dr. John McCorvy (Medical College of Wisconsin) per i consigli pertinenti. Ringraziamo il National Heart, Lung, and Blood Institute (R15HL127636), il Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti (W81XWH22101) e la National Science Foundation (2223225) per il sostegno alle sovvenzioni.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagenti per colture cellulari
Cellule aderenti EA.hy926ATCCCRL-2922
CellStripper Reagente di dissociazione cellulareCorning25-056-CILa tripsina può essere utilizzata opzionalmente, ma dovrebbe essere assolutamente evitata con i saggi PAR2.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con rosso fenoloCorning10-013-CV
Siero fetale bovino (FBS)Avantor97068-091
Gelatina da pelle suinaMilliporeSigmaG2500Utilizzare per preparare una soluzione acquosa allo 0,4% (p/v) con acqua deionizzata. Autoclave prima dell'uso per sterilizzare.
Pen/Streptococco (100X)Corning30-002-CI
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Corning21-040-CV
Trypan Blue (0,4% p/v)Corning25-900-C
>strongCalcium Mobilization Reagents
4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosulfonico (HEPES)Thermo172571000
Albumina sierica bovina (BSA)Avantor97061-420
Cloruro di calcio diidratoThermo42352-0250
Dimetil solfossidoThermoJ66650-AD
Fluo-4/AMInvitrogenF14201
Soluzione salina bilanciata di Hank (Ca/Mg/fenolo-rosso libero)Corning21-022-CV
Cloruro di magnesio esaidratoMilliporeSigmaM2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)Spectrum ChemicalP1166
ProbenecidTCI AmericaP1975
Idrossido di sodioVWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2 (sale TFA)Preparato da Trudy Holyst presso il Versiti Blood Istituto di ricerca
Materiali
96 pozzetti trattata con coltura, pareti nere, fondo trasparente PiastraCorning3603con coperchi trasparenti
Provetta da centrifuga, 15 mLAvantor89039-664
Provetta da centrifuga, 50 mLAvantor89039-656
Pallone di coltura, T-75Corning353136coltura tissutale trattata
Serbatoio di reagenti monouso, 50 mLCorningRES-V-50-S
Lettore di piastre EnspirePerkin ElmerFuori produzione
Provetta per microcentrifuga, 1,5 mLAvantor20170-038
Pipetta Pasteur, 9"Fisher13-678-6Bdeve essere sterilizzata
Striscia di provette PCR con piatto separato strisce per tappiAvantor76318-802
Puntali per pipette, 20 &; micro; LBiotix63300042puntali sterili e filtrati
Puntali per pipette, 200 & micro; LBiotix63300044puntali sterili filtrati
Puntali per pipette, 1250 &; LBiotix63300047puntali sterili e filtrati
PrismGraphPadvolume 6 pipetta
sierologica usata, 5 mLTradewinds Direct  07-5005
Pipetta sierologica, 10 mLTradewinds Direct  07-5010
Pipetta sierologica, 25 mLTradewinds Direct  07-5025

Riferimenti

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