Purificazione per affinità di una proteina marcata 6X-His-Tagged utilizzando un sistema di cromatografia liquida proteica veloce

Sommario

Questo articolo fornisce una procedura per la purificazione per affinità di una proteina ricombinante umana, l'endonucleasi del lembo 1 (FEN1), che è stata marcata con un tag 6X-istidina. Il protocollo prevede l'utilizzo di due distinte colonne ioniche metalliche immobilizzate per la purificazione della proteina marcata.

Abstract

La caratterizzazione funzionale delle proteine richiede che esse siano espresse e purificate in quantità sostanziali con elevata purezza per eseguire saggi biochimici. Il sistema di cromatografia liquida rapida delle proteine (FPLC) consente la separazione ad alta risoluzione di miscele proteiche complesse. Regolando vari parametri in FPLC, come la selezione della matrice di purificazione appropriata, la regolazione della temperatura del campione proteico e la gestione della velocità di flusso del campione sulla matrice e della velocità di eluizione, è possibile garantire la stabilità e la funzionalità della proteina. In questo protocollo, dimostreremo la versatilità del sistema FPLC per purificare la proteina endonucleasi 1 (FEN1) del lembo marcata 6X-His, prodotta in colture batteriche. Per migliorare l'efficienza della purificazione delle proteine, ci concentreremo su molteplici considerazioni, tra cui il corretto imballaggio e preparazione della colonna, l'iniezione del campione utilizzando un circuito di campionamento, la velocità di flusso dell'applicazione del campione alla colonna e i parametri di eluizione del campione. Infine, il cromatogramma sarà analizzato per identificare le frazioni contenenti alte rese di proteine e considerazioni per una corretta conservazione a lungo termine delle proteine ricombinanti. L'ottimizzazione dei metodi di purificazione delle proteine è fondamentale per migliorare la precisione e l'affidabilità dell'analisi delle proteine.

Introduzione

Sono disponibili numerose strategie per comprendere la biologia cellulare. Un approccio prevede una strategia top-down, in cui le mutazioni genetiche vengono introdotte in un gene, seguite dalla valutazione dei cambiamenti fenotipici risultanti in un organismo modello. Al contrario, un approccio riduzionista comporta la delucidazione iniziale dei meccanismi molecolari e delle funzioni enzimatiche di una particolare proteina, accompagnata dalla caratterizzazione delle sue interazioni con altri componenti cellulari. Successivamente, viene valutato l'impatto di questa proteina su un percorso biologico. Sebbene ogni approccio di ricerca possieda i suoi vantaggi e limiti intrinseci, il raggiungimento di una comprensione completa di un percorso biologico richiede indagini interdisciplinari.

Poiché il DNA è il modello genetico della vita, la comprensione dei meccanismi di duplicazione del DNA e del mantenimento del genoma è stata un'area di interesse attivo per oltre sette decenni. Gli studi nel campo della replicazione del DNA hanno prodotto numerosi dati riguardanti le singole strutture e funzioni di numerose proteine di replicazione. Queste indagini, che comprendono aspetti meccanicistici e saggi di attività biochimica, sono state rese possibili attraverso la purificazione di queste proteine, consentendo il loro esame meticoloso in un ambiente in vitro . Di conseguenza, la purificazione delle proteine emerge come una tecnica indispensabile e onnipresente nella maggior parte degli sforzi di ricerca volti a svelare intuizioni meccanicistiche sulla replicazione del DNA.

Questo articolo presenta una metodologia per isolare una proteina di replicazione del DNA marcata con 6X-istidina, che è stata sovraespressa nelle cellule batteriche. La proteina di interesse è l'endonucleasi 1 del lembo umano (FEN1), una nucleasi struttura-specifica che svolge un ruolo fondamentale nella replicazione del filamento ritardato ed è anche un partecipante critico nei percorsi di riparazione del DNA come la riparazione per escissione di basi (BER)^1,2,3. La funzione principale di FEN1 è quella di scindere alla base di una struttura di lembo spostata di 5', un intermedio che si verifica durante la replicazione del DNA o BER. Inizialmente, le indagini biochimiche che valutavano l'attività enzimatica di FEN1 suggerivano un meccanismo di "tracciamento", in cui la nucleasi riconosceva l'estremità libera del 5'-fosfato di una struttura di lembo e poi seguiva lungo il lembo fino alla sua base prima di scinderlo⁴. Ricerche successive hanno rivelato che FEN1 funziona tramite un meccanismo di "filettatura", in cui prima si lega alla base del lembo e poi infila l'estremità libera 5' attraverso il suo sito attivo prima della scissione (Figura 1)⁵. La capacità di sovraesprimere e isolare FEN1 ricombinante ha facilitato queste scoperte, consentendo ai ricercatori di impiegarlo in indagini biochimiche e strutturali.

La cromatografia di affinità è un metodo di separazione comunemente usato per purificare il DNA. Questa tecnica utilizza l'affinità di legame reversibile delle proteine bersaglio verso i ligandi immobilizzati su una resina per intrappolare specificamente la proteina di interesse. Una delle bio-affinità più utilizzate è la robusta interazione tra l'amminoacido, l'istidina e gli ioni metallici come il nichel e il cobalto e, quindi, può essere catturata su una resina caricata con Ni²⁺ o Co²⁺.

La sequenza di DNA che codifica una stringa di 6-9 residui di istidina (His) è spesso incorporata nel costrutto plasmidico che codifica la proteina di interesse (sia all'N-terminale che al C-terminale), marcando la proteina con un tag 6X-His-S o un tag poly-His. La proteina marcata con His-taged può quindi essere facilmente purificata mediante cromatografia di affinità con metalli immobilizzati (IMAC), un sottotipo di cromatografia di affinità in cui gli ioni metallici sulla resina catturano le proteine con un tag di affinità, che possono essere successivamente eluite utilizzando agenti di eluizione appropriati. Gli ioni dei metalli di transizione come Ni²⁺ e Co²⁺ possono essere immobilizzati su matrici di agarosio o gel di silice derivate dai gruppi⁶ di N,N,N,N'-tris-(carbossimetil)-etilendiammina o acido nitrilotriacetico (NTA).

I leganti metallici sono noti per essere robusti contro la degradazione da fattori fisici, chimici e biologici e mantengono questo vantaggio rispetto ad altri tipi di leganti ^6,7. Inoltre, l'His-tag è un tag relativamente piccolo e non influisce in modo significativo sulla struttura o sulla funzione delle proteine⁷. Tuttavia, in un sistema di espressione batterica, molte proteine espresse cromosomicamente hanno un'affinità verso gli ioni metallici e possono co-purificarsi con la proteina bersaglio. Il nichel e il cobalto sono gli ioni metallici tipici utilizzati nelle matrici IMAC. La resina Ni-NTA e la resina a base di cobalto TALON sono comunemente utilizzate per la purificazione delle proteine marcate con His.

Ni-NTA contro TALON
I rispettivi ioni metallici di Ni-NTA e TALON sono immobilizzati sulla resina attraverso leganti NTA. Si ritiene che il Ni-NTA abbia una maggiore capacità di legame, legando fino a 100 mg/mL di proteine. Ciò può comportare una maggiore resa proteica, con l'avvertenza che le proteine contaminanti possono essere co-purificate. Al contrario, la resina ha una maggiore specificità di legame verso le proteine marcate con His-taged e potrebbe essere in grado di produrre frazioni di purezza superiore. In questo studio, miriamo a confrontare l'efficienza di purificazione di entrambe le resine utilizzando il sistema automatizzato di cromatografia liquida di proteine veloci di riferimento, il sistema NGC (vedi la Tabella dei materiali).

Buffer e compatibilità
I tamponi sono necessari durante la purificazione delle proteine per la lisi cellulare, la preparazione del campione, l'equilibrio della resina e l'eluizione della proteina catturata dalla resina. I tamponi Tris, MOPS e HEPES fino a una concentrazione di 100 mM sono i tamponi compatibili noti per la resina Ni-NTA. I tamponi spesso includono agenti riducenti per prevenire l'ossidazione delle proteine e l'aggregazione proteica. Tuttavia, al di sopra di un limite di soglia, gli agenti riducenti potrebbero privare la resina degli ioni metallici. La concentrazione raccomandata di agenti riducenti come il beta-mercaptoetanolo (BME) o il ditiotreitolo (DTT) è inferiore a 1 mM per le resine a base di nichel e cobalto sopra menzionate.

I tamponi per la purificazione di hFEN1 sono tamponi Tris contenenti NaCl, BME, fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), EDTA e glicerolo. NaCl mantiene la proteina in forma solubile e interrompe le interazioni molecolari come il legame con il DNA. Il BME riduce le proteine ossidate e quindi previene l'aggregazione proteica. PMSF) è un inibitore della proteasi che previene la degradazione mediata dalla proteasi della proteina bersaglio. L'EDTA elimina i cationi bivalenti dal campione, impedendone l'accesso a nucleasi e proteasi. Il glicerolo migliora la stabilità della proteina in forma acquosa. Inoltre, il tampone di lisi contiene compresse complete di inibitori della proteasi per garantire la massima protezione della proteina bersaglio dalla degradazione delle proteasi durante la lisi cellulare. I tamponi di equilibratura ed eluizione contengono imidazolo, mentre il tampone di eluizione contiene quantità maggiori per l'imidazolo per spostare la proteina legata dalla resina durante l'eluizione.

Sistema di cromatografia di nuova generazione (NGC)
Questo sistema automatizzato di cromatografia a media pressione progettato per la cromatografia liquida di proteine a flusso rapido (FPLC) utilizza due pompe per pompare contemporaneamente due diversi tamponi ed è in grado di iniettare un'ampia gamma di volumi di campione da 250 μl a 100 mL. Il sample loop (noto come Dynaloop in questo sistema), consente di iniettare volumi di campione maggiori. Il sistema può essere utilizzato utilizzando il software Chromlab, che facilita la creazione di metodi personalizzati, la manipolazione di cicli di purificazione e l'analisi dei picchi UV e delle frazioni proteiche.

Protocollo

1. Preparazione del campione

1. Per purificare il FEN1 ricombinante, esprimere il costrutto (pET-FCH-FEN1) nelle cellule BL21(DE3) come precedentemente descritto da Ononye et ^al.8.
   1. Inoculare il terreno LB (Tabella 1) con l'1% di coltura notturna e far crescere le cellule a 37 °C fino a quando l'OD raggiunge 0,6.
   2. Indurre con 0,4 M di isopropil-beta-D-tiogalattoside (IPTG) e far crescere la coltura per altre 3 ore.
   3. Raccogliere le cellule centrifugando la coltura a 5.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Conservare il pellet in un congelatore a -80°C.
   4. Il giorno della purificazione, rimuovere il pellet di cella dal congelatore a -80 °C, lasciarlo scongelare con ghiaccio e risospendere il pellet in 100 mL di tampone di lisi (Tabella 1).
      NOTA: Il lisato cellulare deve essere sempre posto su ghiaccio durante la manipolazione per prevenire la proteolisi. Una volta scongelato, l'intero processo di purificazione deve essere completato lo stesso giorno. Il lisato cellulare non deve essere conservato in frigorifero durante la notte.
2. Trasferire la sospensione in un becher da 250 mL e sonicare sul ghiaccio con 30 s ON e 30 s OFF al 35% di ampiezza per 15 min.
   NOTA: Consultare le impostazioni del produttore per identificare l'ampiezza.
3. Trasferire il campione sonicato in una provetta da centrifuga e centrifugare a 27.000 × g per 30 minuti a 4 °C per ottenere un lisato limpido. Mettere il lisato cellulare sul ghiaccio in frigorifero a 4 °C fino all'iniezione del campione.

2. Preparazione delle colonne di affinità

1. Montare le colonne (una per la resina Ni-NTA e una per la resina a base di cobalto) su un supporto di bloccaggio in modo che le colonne siano tenute il più dritte possibile, evitando qualsiasi inclinazione delle colonne. Assicurarsi che il fondo delle colonne sia collegato con un tappo e aggiungere 1-2 ml di tampone iniziale sul fondo di ciascuna colonna per evitare la formazione di bolle d'aria durante l'impaccamento della colonna.
2. Agita delicatamente i flaconi di resina fino a quando la resina non è completamente risospesa. Aprire la parte superiore delle colonne e versare 10 mL di ogni impasto in modo continuo per evitare l'inclusione di bolle d'aria. Versare la resina contro una spatola di metallo o un'asta di vetro tenuta sul bordo della colonna per evitare bolle d'aria nella colonna.

3. Impaccamento della colonna utilizzando un adattatore di flusso

1. Scollegare il tappo dalla colonna e collegare la parte inferiore a un'estremità del tubo. Collegare l'altra estremità del tubo alla porta UV del sistema FPLC.
2. Assicurarsi che l'alloggiamento del supporto del letto sia stato inserito nel corpo dell'adattatore di flusso e far scorrere il corpo dell'adattatore di flusso sulla parte superiore della colonna (Figura 2A). Con il fermo a camma in posizione 1, abbassare l'adattatore di flusso facendo attenzione a non inserirlo nel buffer (Figura 2B). Portare il fermo della camma in posizione 2 (Figura 2B). Collegare il tubo al sistema e avviare il flusso del buffer di avviamento per 1-2 minuti per liberare il tubo dall'aria ed evitare bolle d'aria durante l'imballaggio.
3. Riportare il fermo in posizione 1 e abbassare l'adattatore di flusso nel buffer con un movimento fluido, evitando l'inclusione di bolle d'aria, e riportare il fermo in posizione 2. In questo modo è possibile inserire un po' di buffer nell'adattatore di flusso e rimuovere eventuali bolle rimanenti.
4. Portare il fermo in posizione 3 e serrare la base della camma e l'anello di bloccaggio (Figura 2B).
5. Avviare il flusso di tampone a 10 mL/min per impacchettare la colonna. Continua questo passaggio per 3 minuti o fino a quando la resina non è stata ben imballata.

4. Adescamento del circuito di campionamento del sistema FPLC

1. Collegare il tubo dalla parte superiore del loop di campionamento al loop E del sistema FPLC (Figura 3).
2. Collegare il tubo dalla parte inferiore del circuito di campionamento al rifiuto 2 del sistema FPLC.
3. Inserire un'estremità del tubo nella porta della colonna del sistema FPLC e posizionare l'altra estremità nel flacone di scarico.
4. Inserire il tubo della pompa A in acqua distillata doppia filtrata (ddH₂O).
5. Fare doppio clic sulle impostazioni della pompa utilizzando il software (Figura 4A, etichettato 2) e selezionare il circuito di iniezione della pompa del sistema (Figura 4C).
6. Fare clic sulle impostazioni della velocità di flusso (Figura 4A, etichettata 1) e modificare la velocità di flusso a 10 ml/min. Immettere 0% nella casella %B (Figura 4B).
7. Avviare il flusso per lavare il circuito del campione con acqua, che spingerà la guarnizione scorrevole verso il basso.
8. Una volta che la guarnizione scorrevole raggiunge la parte inferiore del circuito del campione, arrestare il flusso. Commutare la pompa A da ddH₂O al buffer di avviamento. Collegare il tubo dalla parte superiore del circuito del campione al rifiuto 2 e quello dal basso al circuito E. Lasciare il tubo dalla porta della colonna nel reperto.
9. Avviare il flusso a 10 ml/min. Una volta che la guarnizione scorrevole spinta verso l'alto dal buffer di partenza in ingresso raggiunge la parte superiore del circuito del campione, arrestare il flusso. Il circuito di campionamento è ora pronto per l'iniezione del campione.

5. Iniezione del campione

1. Fare doppio clic sulle impostazioni della pompa e selezionare Ciclo di carico manuale (Figura 4C).
2. Svitare il tubo dall'anello E e riporlo nel contenitore dei rifiuti.
3. Collegare il tubo dalla porta della colonna al tubo sulla parte superiore dell'adattatore di flusso.
4. Prelevare il campione utilizzando una siringa da 30 mL; Quindi, collegare la siringa all'adattatore della porta di iniezione.
5. Avvitare la siringa nella porta di iniezione e iniettare il campione, assicurandosi che sia visibilmente iniettato nel circuito del campione. Conservare 100 μl del campione ( lisato di input dell'etichetta) in una provetta da microcentrifuga a -20 °C per l'analisi SDS-PAGE
   NOTA: A seconda del volume totale del campione, potrebbero essere necessarie 2-3 iniezioni.
6. Tappare la porta di iniezione con il tappo della colonna.
7. Ricollegare il tubo dalla parte inferiore del sample loop alla porta Loop E.
8. Posizionare il tubo della pompa B nel tampone di eluizione.

6. Creazione e analisi del metodo utilizzando il software FPLC system-linked

1. Passare alla scheda Home e selezionare Nuovo metodo.
2. Selezionare la scheda Impostazioni metodo nella colonna di sinistra, passare al menu a discesa Tipo di colonna e selezionare Personalizzato (Figura 5).
3. Inserire il volume della colonna (5 mL).
4. Immettere la velocità di flusso richiesta per la seduta (1 mL/min).
5. Passare a Selezione unità e selezionare CV (volumi colonna) come unità di base del metodo.
6. Assicurarsi che l'ingresso A sia impostato su Buffer A e che l'ingresso B sia impostato su Buffer B (impostazione predefinita).
7. Seleziona la scheda Struttura metodo nel menu a sinistra. Aggiungere le fasi della purificazione nel seguente ordine: equilibratura, applicazione del campione, lavaggio della colonna ed eluizione.
   1. In condizioni di equilibratura, impostare il volume di equilibratura su 10 CV. Assicurarsi che l'impostazione del buffer sia mantenuta allo 0% B.
   2. Nella scheda dell'applicazione del campione , impostare il volume del campione osservando il ciclo del campione. La posizione della guarnizione scorrevole indica il volume del campione.
   3. Sotto il lavaggio a colonna, impostare il volume di lavaggio su 5 CV. Disabilitare la raccolta delle frazioni per questo passaggio; Raccogli il bucato nel suo insieme in un bicchiere durante la corsa, piuttosto che raccoglierlo in frazioni.
   4. Per l'eluizione, impostare il volume del gradiente su 14 CV a partire dallo 0% del buffer B al 100% del buffer B.
8. Salvare il metodo e avviare l'esecuzione.
9. Assicurarsi che il raccoglitore di frazioni inizi dalla posizione della prima frazione.
10. Immettere il nome dell'esecuzione e fare clic su Avvia.
11. Durante la fase di equilibratura, monitorare la curva UV in tempo reale. Assicurarsi che tutti i collegamenti siano sicuri e privi di perdite; Confermare un circuito completo cercando il tampone che scorre nel contenitore dei rifiuti. Se la curva UV non si è stabilizzata durante gli ultimi minuti di equilibrio, estendere la fase di equilibratura fino a raggiungere la stabilizzazione (Figura 6) .
12. Al momento dell'applicazione del campione, trasferire le provette che vanno nel contenitore dei rifiuti in un becher pulito. Durante questa fase, raccogliere le proteine non legate che fuoriescono dalle provette di scarto durante il flusso (etichettare come FT).
13. Aspettatevi un forte aumento della curva UV che probabilmente raggiunga la lettura massima possibile di 3.000 mU (Figura 6).
    NOTA: Una curva tipica si stabilizza a 3.000 mU durante la maggior parte della fase di applicazione del campione.
14. Durante il lavaggio della colonna, poiché le proteine residue non legate vengono lavate via con solo le proteine legate rimaste sulla resina, cercare un forte calo della curva UV (Figura 6). Se la curva UV non è diminuita entro la fine della fase di lavaggio, estendere la fase facendo clic su Mantieni passaggio fino a quando l'UV non è sceso a sufficienza. All'inizio di questa fase, trasferire i tubi di scarico dal becher FT a un altro becher pulito etichettato Wash.
15. Quando inizia la fase di eluizione, assicurarsi che il collettore di frazioni si muova in posizione e inizi a raccogliere le frazioni. Visualizzare l'eluizione delle proteine cercando i picchi nella curva UV (Figura 6).
16. Al termine dell'esecuzione, passare alla scheda Home e selezionare Apri esecuzione. Aprire la seduta per visualizzare il cromatogramma e selezionare Integrazione picchi nel menu in alto per contrassegnare i picchi ottenuti durante la seduta.
17. Selezionare la scheda Frazioni per visualizzare le frazioni contenenti proteine eluite.

7. Analisi SDS PAGE

1. Mescolare 15 μl di ciascuna frazione contenente proteine con 5 μl di tampone di caricamento del campione SDS (Tabella 1). Riscaldare i campioni a 95 °C per 5 minuti.
2. Caricare i campioni in gel prefabbricati e farli funzionare a 160 V per 45 minuti insieme al marcatore proteico prestainato.
3. Colorare i gel nella soluzione colorante blu brillante Coomassie per 30 minuti (Tabella 1).
4. Lavare il gel in gg₂O (ripetere 3 volte).
5. Sfumare il gel nella soluzione decolorante per 1 ora (Tabella 1).
6. Osservare le bande proteiche; rilevare FEN1 alla soglia dei 42 kDa.
7. Frazioni della piscina contenenti FEN1 e concentrare la piscina utilizzando un filtro centrifugo da 10 kDa. Aliquotare e conservare in congelatore a -80° °C.

Risultati

I lisati cellulari BL21 (DE3) che esprimono hFEN1 sono stati fatti passare attraverso resine Ni-NTA e TALON equilibrate. La resina Ni-NTA è caricata con ioni Ni²⁺ e ha un'elevata capacità legante. I risultati mostrano che la resina Ni-NTA produce una quantità maggiore di FEN1 rispetto alla resina TALON (Figura 7). La resina Ni-NTA è anche nota per legarsi in modo non specifico ad altre proteine espresse cromosomicamente. Il lisato cellulare passato attraverso la resina a base di cobalto, è stato purificato con elevata purezza ma una resa inferiore, rispetto al Ni-NTA. Come molte altre proteine leganti il DNA, FEN1 è stato ulteriormente fatto passare attraverso la resina di esclusione dimensionale per rimuovere le impurità. hFEN1 può essere identificato al segno di 43 kDa.

Figura 1: Meccanismo di scissione del lembo di hFEN1: tracciamento contro filettatura. Inizialmente si pensava che FEN1 (raffigurato in giallo) si legasse all'estremità 5' della struttura del lembo e la attraversasse fino alla base del lembo (a sinistra). Studi successivi hanno rivelato che FEN1 si lega prima alla base del lembo e infila il lembo 5' attraverso il suo sito attivo (a destra). Abbreviazione: hFEN1 = endonucleasi 1 del lembo umano. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Adattatore di flusso. (A) Componenti dell'adattatore di flusso utilizzati per il processo di impaccamento e purificazione della colonna; (B) le tre posizioni del fermo a camma utilizzate per serrare/allentare l'O-ring e fissare l'adattatore in posizione. L'immagine ingrandita mostra lo stato dell'O-ring (allentato/stretto) nelle posizioni 1, 2 e 3 dall'alto verso il basso. Le immagini sono state scattate con il permesso di ⁹. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Modulo di iniezione del sistema di cromatografia liquida a proteine veloci. Le varie porte del modulo di iniezione collegano il sistema di cromatografia liquida veloce delle proteine alla colonna, al loop del campione e ai rifiuti. L'immagine è stata scattata con il permesso di ¹⁰. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Controllo del sistema. (A) Scheda di controllo del sistema in cui è possibile manipolare le impostazioni del flusso e visualizzare il percorso del flusso; (B) finestra di impostazione della portata; (C) finestra delle impostazioni della pompa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Finestra delle impostazioni del metodo. Una finestra per immettere i dettagli di purificazione, ad esempio il tipo di colonna, il volume della colonna, l'unità di base del metodo e la velocità di flusso per l'esecuzione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Schema della curva UV durante FPLC: La curva UV sale e scende in base alla fase di purificazione. All'inizio dell'equilibratura, la curva UV può deformarsi a causa della presenza di bolle d'aria o contaminanti nel tubo. Man mano che l'equilibrio continua, la curva dovrebbe stabilizzarsi come una linea piatta; Durante l'iniezione del campione, quando le proteine non legate alla resina fuoriescono dalla resina, la curva UV aumenta fino a raggiungere una soglia massima. La fase di lavaggio, che elimina le proteine residue non legate, mostra una graduale diminuzione delle misurazioni UV. Infine, durante la fase di eluizione, quando la proteina bersaglio viene eluita, si osserva un picco nella curva UV. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Immagine del gel SDS PAGE. Lane 1-Marcatore di peso molecolare; Corsia 2-1% Ni-NTA Input (lisato cellulare); Corsia 3-1% di flusso dalla resina Ni-NTA; Lane 4-hFEN1 purificato dalla resina Ni-NTA; Corsia 5-1% Input (lisato cellulare); Corsia 6-1% di flusso dalla resina a base di cobalto; Lane 7-hFEN1 purificato da resina a base di cobalto; la freccia nera rappresenta FEN1 a 42,5 kDa. Abbreviazioni: SDS-PAGE = sodio dodecil solfato; MW = peso molecolare; hFEN1 = endonucleasi 1 del lembo umano; NTA = acido nitrilotriacetico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Buffer e soluzioni	Componenti
Tampone di lisi	50 mM di Tris-HCl [pH 8,0]
	500 mM di NaCl
	1 mM di beta mercaptoetanolo (BME)
	1 mM di fenil-metilsulfonilfluoruro (PMSF)
	1 mM EDTA
	1 compressa di inibitore completo della proteasi
	10 mM di imidazolo
	10% di glicerolo
Tampone di equilibratura/lavaggio	50 mM di Tris-HCl [pH 8,0]
	500 mM di NaCl
	1 mM BME
	1 mM PMSF
	10 mM di imidazolo
	10% di glicerolo
Tampone di eluizione	50 mM di Tris-HCl [pH 8,0]
	500 mM di NaCl
	1 mM BME
	1 mM PMSF
	1 M imidazolo
	10% di glicerolo
Buffer di caricamento del campione SDS	900 μL 4x tampone per campioni Laemmli
	100 μL di BME
Soluzione colorante blu brillante Coomassie	50% ddH2O
	40% Metanolo
	10% Acido acetico
	0,1% Blu brillante Coomassie R-250
Soluzione decolorante	50% ddH2O
	40% Metanolo
	10% Acido acetico

Tabella 1: Composizione del tampone.

Discussione

La cromatografia di affinità è una tecnica ampiamente utilizzata per purificare le proteine leganti il DNA. La cromatografia di affinità con metalli immobilizzati (IMAC) è un tipo specifico di cromatografia di affinità che utilizza ioni metallici per catturare i residui di istidina di una sequenza peptidica. Questo è il motivo per cui il "tag 6X-Hi" o "tag poly-Hi" è attaccato all'N-terminale o al C-terminale delle proteine da purificare. Il nichel e il cobalto sono gli ioni metallici più comunemente usati e variano nella loro compatibilità con reagenti come BME e DTT normalmente utilizzati in purificazione. Sebbene le purificazioni siano state effettuate a concentrazioni di 1 mM di BME o DTT, l'uso di questi reagenti può ancora essere inaffidabile. L'incompatibilità può essere osservata durante l'equilibrio. Se il tampone che scorre attraverso la resina appare di colore marrone, indica l'ossidazione degli ioni metallici e può strappare gli ioni metallici dalla resina. Ciò potrebbe ridurre drasticamente la capacità legante della resina.

Per garantire un'elevata purezza e resa delle proteine, le interazioni di affinità tra gli ioni metallici e l'His-tag dovrebbero essere favorite rispetto ad altre possibili interazioni basate sulla carica. Ciò garantirà che tutta la proteina venga eluita in una sola volta invece di eluire nelle diverse fasi dell'eluizione. Per raggiungere questo obiettivo, la proteina dovrebbe avere una carica molto bassa durante la purificazione. Se i valori di pH dei tamponi sono più vicini al punto isoelettrico della proteina bersaglio, la carica della proteina può essere mantenuta bassa. Poiché il punto isoelettrico di FEN1 è di circa 8,8, i nostri tamponi vengono mantenuti a pH 8.

Si ritiene che la resina Ni-NTA, caricata con ioni Ni, abbia una maggiore capacità di legare le proteine e si prevede che produca una quantità maggiore di proteine rispetto alla resina a base di cobalto TALON. Ciò significa anche che esiste un maggiore potenziale per il legame di proteine non specifiche e quindi una minore purezza. La minore capacità di legame di TALON è completata da un legame specifico più elevato e dalla resa di proteine di elevata purezza. Ciò è coerente con i nostri risultati che mostrano una maggiore resa di proteine purificate da Ni-NTA rispetto al TALON.

Indipendentemente dalla resina, la purezza e la resa sono influenzate in modo significativo dall'impaccamento della colonna. L'impaccamento efficiente può essere ottenuto utilizzando l'adattatore di flusso collegato al sistema cromatografico automatizzato NGC⁹. A portate sufficientemente elevate, l'adattatore di flusso può impacchettare efficacemente la resina e prevenire l'accumulo di tampone nella colonna. L'adattatore di flusso insieme all'NGC consente il confronto accurato di entrambe le resine grazie alla regolazione della portata, della pressione e del gradiente di eluizione, nonché alla raccolta efficiente delle frazioni proteiche.

Attraverso il software Chromlab, le condizioni di funzionamento possono essere monitorate in tempo reale¹⁰. La portata può essere modificata in qualsiasi momento durante la corsa. Durante l'applicazione del campione, la pressione del sistema può superare la soglia (600 psi). In questo caso, l'abbassamento della portata durante la fase di applicazione del campione può ridurre la pressione. Il software dispone anche di una funzione Hold step attraverso la quale è possibile estendere qualsiasi passo secondo necessità. Questa funzione è particolarmente utile durante le fasi di lavaggio della colonna e di eluizione. Durante il lavaggio della colonna, si prevede che il grafico UV scenda verso il basso e raggiunga quasi lo 0: ciò significa che la maggior parte delle proteine non legate sono state lavate via dalla resina. Nel caso in cui la linea UV continui a salire o non riesca a scendere, la fase di lavaggio può essere estesa fino a visualizzare il grafico previsto. Allo stesso modo, durante l'eluizione, l'eluizione della proteina bersaglio può essere visualizzata attraverso i picchi nel grafico UV. Se inaspettatamente non sono visibili picchi, la fase di eluizione può essere estesa fino a quando non si osservano i picchi previsti.

Suggerimenti e trucchi
Durante la fase di equilibratura, il tampone deve essere iniettato nella colonna e il tampone di scarto deve essere rilasciato continuamente nella bottiglia di scarto; Ciò garantisce che tutti i collegamenti siano stretti e a tenuta stagna. In caso di perdite da qualsiasi sito dell'NGC, è necessario controllare tutte le porte che circondano l'area, poiché l'origine della perdita può essere diversa da quella in cui si nota la perdita. Se il flusso è stato avviato ma nessun buffer entra nella colonna, è probabile che l'aria sia intrappolata all'interno del tubo. Spurgare il sistema prima di continuare.

Durante l'iniezione del campione, se la contropressione del sistema resiste all'iniezione, il tubo deve essere svitato dall'anello E e posto nel flacone di scarto per tutta la durata dell'iniezione. È importante riavvitarlo nel Loop E prima di avviare il programma. Nel caso in cui il tampone di equilibratura o il campione si accumulino nella colonna durante la seduta, la seduta deve essere messa in pausa e l'adattatore di flusso deve essere rimosso. Il tubo deve essere svitato dal fondo della colonna e il tampone o il campione devono essere lasciati fluire. Se il campione passa attraverso, assicurarsi di raccoglierlo come flusso.

Se le frazioni eseguite sul gel SDS PAGE mostrano alti livelli di proteine contaminanti, le frazioni potrebbero essere eseguite su entrambi i lati dei picchi osservati nel cromatogramma. Spesso, per le proteine a bassa espressione, le frazioni pure non mostrano picchi significativi nell'UV.

La comprensione delle differenze tra le proprietà della resina a base di nichel e quella della resina a base di cobalto consente di selezionare la resina più adatta per le future applicazioni della proteina purificata. Ad esempio, ci si aspetta che le proteine utilizzate nei saggi biochimici in vitro siano della massima purezza possibile, una situazione in cui la resina a base di cobalto è adatta. Tuttavia, se la proteina viene utilizzata per la produzione di anticorpi, è necessaria una resa significativa di proteine purificate per il processo. La resina Ni-NTA potrebbe essere un'opzione migliore in questo caso. Questo articolo mirava a far emergere le differenze in queste resine attraverso la purificazione di FEN1.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
4x tampone per campioni Laemmli	BioRad	1610747
Acido acetico	Merck	UN2789
Beta-mercaptoetanolo (BME)	Sigma	M-6250
Chromlab versione software 6.1.27.0	BioRad		gestisce il sistema NGC
Compressa completa MINI inibitore della proteasi	Roche	11836153001
Coomassie Brilliant Blue R Sigma		B0149
Ditiotreitolo (DTT)	Dot Scientific	DSD11000
Econo-Column in vetro	BioRad	7371512
Acido etilendiammina tetraacetico (EDTA)	Dot Scientific	DSE57020
Adattatore di flusso	BioRad	7380014
Glicerolo	Dot Scientific
Imidazole	Dot Scientific	DSI52000
Metanolo	Fisher Scientific	A412
Mini PROTEAN TGX gel	BioRad	4561084
NGC Sistema	cromatografia liquida automatizzato	BioRad
Ni-NTA Agarosio	Qiagen	1018244
Fenil-metil-sulfonilfluoruro	Dot Scientific	DSP20270
PreScission Plus Protein Dual Color Standards	BioRad	1610374
Cloruro di sodio	Dot Scientific	DSS23020
TALON resina di affinità per metalli	Takara	635502
Tris Base		DST60040

DSG22020 di