Articolo metodologico

Produzione di lotti vettoriali adeno-associati ad alto rendimento utilizzando celle di sospensione HEK293

DOI:

10.3791/66532

⸱

26 aprile 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Regeneration of Sensorimotor Systems, Netherlands Institute for Neuroscience, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), 2Centre for Neurogenomics and Cognitive Research, Amsterdam Neuroscience, Vrije Universiteit Amsterdam

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, viene presentato un protocollo di produzione AAV basato su celle HEK293 in sospensione, con conseguente riduzione del tempo e della manodopera necessari per la produzione di vettori utilizzando componenti disponibili per scopi di ricerca da fornitori commerciali.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I vettori virali adeno-associati (AAV) sono uno strumento straordinario per lo studio del sistema nervoso centrale (SNC). Capsidi innovativi, come l'AAV. PHP.eB, dimostrano un'ampia trasduzione del SNC mediante iniezione endovenosa nei topi. Per ottenere una trasduzione comparabile, è necessario un titolo 100 volte superiore (almeno 1 x 1011 copie del genoma/topo) rispetto all'iniezione diretta nel parenchima del SNC. Nel nostro gruppo, la produzione di AAV, tra cui AAV. PHP.eB si basa su cellule HEK293T aderenti e sul metodo della tripla trasfezione. Ottenere rese elevate di AAV con cellule aderenti comporta un processo ad alta intensità di manodopera e materiale. Questo vincolo ha portato allo sviluppo di un protocollo per la coltura cellulare in sospensione in provette coniche. Gli AAV generati nelle cellule aderenti sono stati confrontati con il metodo di produzione della sospensione. Sono state confrontate colture in sospensione utilizzando reagenti di trasfezione polietilenimmina o TransIt. I vettori AAV sono stati purificati mediante ultracentrifugazione a gradiente di iodixanolo seguita da scambio di tamponi e concentrazione utilizzando un filtro centrifugo. Con il metodo aderente, abbiamo ottenuto una media di 2,6 x 1012 copie del genoma (GC) totali, mentre il metodo della sospensione e la polietilenimmina hanno prodotto 7,7 x 1012 GC in totale e TransIt ha prodotto 2,4 x 1013 GC in totale. Non vi è alcuna differenza nell'efficienza di trasduzione in vivo tra i vettori prodotti con aderente rispetto al sistema di celle in sospensione. In sintesi, viene introdotto un protocollo di produzione AAV basato su celle HEK293 in sospensione, che consente di ridurre il tempo e la manodopera necessari per la produzione di vettori e di ottenere rendimenti da 3 a 9 volte superiori utilizzando componenti disponibili presso i fornitori commerciali per scopi di ricerca.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il virus adeno-associato (AAV) è stato scoperto nel 1965 e da allora è stato utilizzato in una miriade di applicazioni1. Gli AAV sono stati applicati nella ricerca neuroscientifica per studiare la funzione genica e neuronale, mappare i neurocircuiti o produrre modelli animali per la malattia2. Tradizionalmente, questo viene fatto iniettando direttamente nel sito di interesse, poiché la maggior parte dei sierotipi naturali non attraversa la barriera emato-encefalica o ha bisogno di una dose elevata per farlo 1,2,3.

Con la scoperta dell'AAV. PHP.B4 e capsidi di nuova generazione come AAV. PHP.eB5 e AAV. CAP-B106, è possibile colpire il sistema nervoso centrale (SNC) utilizzando una semplice iniezione sistemica. La mappatura spaziale rivela le cellule bersaglio dell'AAV. PHP.eB a livello cellulare 6,7. In combinazione con specifici promotori/potenziatori, questi capsidi offrono ampie opportunità ai neuroscienziati di studiare i geni e la funzione cerebrale mediante somministrazione non invasiva di AAV 4,8.

Mentre per l'AAV è necessaria una dose più bassa. PHP.eB (tipicamente da 1 a 5 x 1011 copie del genoma (GC)/topo) rispetto ad AAV9 (4 x 1012 GC/topo)7, è ancora necessario produrre più vettori rispetto alle strategie di iniezione diretta (tipicamente 1 x 109 GC/μL di iniezione). La maggior parte dei sierotipi naturali può essere prodotta utilizzando il classico sistema di coltura cellulare aderente in combinazione con la purificazione con iodixanolo 9,10,11,12. Per AAV. PHP.eB questo comporta un processo laborioso per la coltura e la trasfettazione delle cellule per ottenere vettori sufficienti per un esperimento8. Pertanto, è stata sviluppata la produzione di AAV in colture cellulari in sospensione in provette coniche. Le provette coniche, con una capacità fino a 300 ml, sono compatte, risparmiando spazio nell'incubatore e plastica. Le cellule in sospensione sono molto più facili da coltivare e maneggiare in grandi quantità rispetto alle cellule aderenti su piastre da 15 cm. I componenti di trasfezione del protocollo rimangono gli stessi. Pertanto, i plasmidi precedentemente utilizzati con il sistema aderente possono essere facilmente utilizzati in questo protocollo basato sulla produzione in cellule in sospensione. Il protocollo è stato trasferito con successo ad altri ricercatori in laboratorio e utilizzato con successo per vari capsidi e costrutti.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Accademia Reale Olandese delle Scienze (KNAW) ed erano conformi alla legge olandese sulla sperimentazione animale con il numero di progetto AVD8010020199126. Nella Figura 1 viene fornita una panoramica schematica del protocollo completo. Dalla semina delle cellule alla purificazione dell'AAV, il protocollo richiede 6 giorni per essere completato.

1. Preparazione dei reagenti

  1. Purificazione dei plasmidi
    1. Eseguire l'estrazione dei plasmidi come descritto dal produttore con alcune regolazioni per garantire la sterilità dei plasmidi.
    2. Preparare l'etanolo al 70% utilizzando acqua distillata sterile ed etanolo assoluto.
    3. Dopo la fase di centrifugazione dell'isopropanolo, essiccare i plasmidi nella cappa dell'armadio di flusso e aggiungere etanolo sterile al 70% alle provette. Dopo la precipitazione dell'etanolo, asciugare i plasmidi nella cappa dell'armadio di flusso e risospendere il plasmide in acqua distillata sterile. Fare attenzione a utilizzare provette per microcentrifuga sterilizzate.
    4. Prelevare un'aliquota per la quantificazione, l'analisi delle restrizioni e, se necessario, il sequenziamento. Si consiglia di verificare l'integrità delle ripetizioni terminali invertite (ITR) poiché le mutazioni possono avere un impatto negativo sulla resa. Regolare la concentrazione del campione a 1 μg/μL.
  2. Preparazione di 10x tampone di lisi Tween
    1. Sciogliere 30,3 g di tampone Tris e 2,033 g di MgCl2,6H 2O in 400 mL di acqua distillata sterile, impostare il pH a 8,0 e aumentare il volume totale a 450 mL.
    2. Mantenere Tween 20 sterile, aggiungere 50 mL di Tween 20 alla soluzione tampone nella cappa e sterilizzare con filtro utilizzando un filtro sottovuoto da 0,2 μM.
  3. Diluizioni di iodixanolo
    1. La soluzione di iodixanolo viene fornita al 60% di concentrazione. Usa la soluzione di partenza per creare soluzioni al 15%, 25% e 40%.
    2. Per una soluzione al 15%, diluire 60 mL di soluzione al 60% con 48 mL di NaCl 5 M e 48 mL di PBS-MK (5x PBS con 5 mM di MgCl2 e 12,5 mM di KCl) e aggiungere acqua distillata fino a 240 mL.
    3. Per una soluzione al 25%, diluire 67 mL di soluzione al 60% e 32 mL di PBS-MK. Aggiungere acqua distillata fino a 160 ml. Mescolare bene e aggiungere 1,6 mL di soluzione di rosso fenolo.
    4. Per una soluzione al 40%, diluire 160 mL di soluzione al 60% con 48 mL di PBS-MK e aggiungere acqua distillata fino a 240 mL. Per una soluzione al 60%, aggiungere 1 mL di rosso fenolo a 100 mL di soluzione al 60%.
  4. PBS 5% soluzione di saccarosio
    1. Aggiungere 25 g di saccarosio a un flacone da 500 ml di DPBS senza calcio o magnesio. Agitare bene e filtrare con un filtro sottovuoto per bottiglie da 0,2 μM.
  5. Soluzione di polietilenglicole (PEG) 8000
    1. Sciogliere 400 g di PEG 8000 e 24 g di NaCl in acqua distillata sterile e portare a un volume finale di 1000 mL. Mescolare riscaldando fino a completo scioglimento. Regolare il pH a 7,4 utilizzando la carta per pH.
    2. Filtrare con un filtro sottovuoto per bottiglie da 0,2 μM per ottenere una soluzione di PEG 8000 al 40%. Si noti che la filtrazione richiederà un po' di tempo a causa della viscosità della soluzione immagazzinata a 4 °C.

2. Coltura di cellule in sospensione HEK293

  1. Utilizzare salviette imbevute di etanolo al 70% per la pulizia. Pulisci la cappa di biosicurezza, prepara e pulisci tutti i materiali necessari per la coltura delle cellule.
  2. Preriscaldare 30 mL di terreno cellulare in sospensione a 37 °C in una provetta di coltura conica da 50 mL. Recupera le cellule di produzione virale dall'azoto liquido. Scongelare rapidamente le cellule in un bagno d'acqua a 37 °C. Poco prima che il flaconcino sia completamente scongelato, pulirlo con una salvietta imbevuta di etanolo al 70% e trasferire il flaconcino nella cappa di biosicurezza.
    NOTA: I dettagli delle cellule di produzione virale qui utilizzate sono forniti nella Tabella dei materiali.
  3. Trasferisci rapidamente le cellule nella provetta di coltura conica da 50 mL preriscaldata. Cellule di coltura in un incubatore con agitazione a 37 °C, 80% di umidità, 8% di CO2, 200 giri al minuto (RPM) e un diametro di agitazione di 50 mm. Cellule di passaggio, una volta che la vitalità è superiore al 90% e la densità cellulare è superiore a 1-3 x 106 cellule/mL.
    NOTA: L'incubatrice utilizzata ha un diametro di scuotimento di 50 mm; Le condizioni di coltura devono essere regolate per un diverso diametro di agitazione.
  4. Cellule di passaggio 3-4 giorni dopo lo scongelamento. Controllare la/e provetta/e di coltura per assicurarsi che non vi siano segni di contaminazione; Ad esempio, il fungo apparirà come un anello scolorito (nero o verde).
  5. Preparare 400 μL di soluzione di tripano blu allo 0,4% per campione utilizzando uno stripette da 1 mL.
  6. Recupera rapidamente le cellule in sospensione dall'incubatrice. Estrarre immediatamente 500 μL dalla provetta utilizzando una striscia da 1 mL. Pipegare delicatamente su e giù.
  7. Aggiungere 100 μL di sospensione cellulare alla provetta blu di tripano preparata. Capovolgere delicatamente il tubo per mescolare; Non pipettare per mescolare, poiché ciò porterebbe alla morte cellulare. Rimettere le cellule nell'incubatrice.
  8. Prelevare 50 μL di sospensione cellulare trattata con blu di tripano e applicarla sul vetrino dell'emocitometro. Contare il totale delle cellule vitali e calcolare la quantità di sospensione cellulare e di terreno necessari per il passaggio o la trasfezione il giorno successivo.
  9. Caldo medio nell'incubatrice per 10-15 min. Aggiungere la sospensione cellulare al terreno riscaldato e rimettere nell'incubatrice. Per il passaggio di cellule per 3 giorni (cioè lunedì-giovedì), impostare su 0,5 x 106 cellule/mL; per il passaggio delle cellule per 4 giorni (cioè giovedì-lunedì), impostare su 0,3 x 106 cellule/mL.
    NOTA: Secondo il produttore, le cellule di produzione virale raddoppiano ogni 26 ore e dovrebbero essere comprese tra 3,5 x 106 e 5,5 x 106 prima del passaggio. Le celle possono essere conservate fino al passaggio 20.

3. Trasfezione

  1. Giorno 1
    1. A 24 ore prima della trasfezione, coltivare 1 x 106 cellule per mL in 300 mL di terreno.
  2. Giorno 2
    1. Terreno caldo, plasmidi e reagente di trasfezione a temperatura ambiente. Per gli importi da preparare, si veda la tabella 1.
    2. Brevemente plasmidi e reagenti a vortice. Aggiungere plasmidi al mezzo preparato, vortice. Aggiungere brevemente il reagente di trasfezione e il vortice. Non agitare la miscela dopo questo passaggio. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
    3. Nel frattempo, conta le cellule preparate il giorno 1. Le cellule devono essere comprese tra 2 e 2,5 x 106 cellule per mL e > vitali al 95%.
    4. Dopo l'incubazione, goccia a goccia, aggiungere la miscela di trasfezione alle cellule facendo roteare delicatamente la provetta. Incubare per 72-96 ore.

4. Raccolta delle cellule

  1. Giorno 5
    1. Aggiungere 33 mL di tampone di lisi cellulare 10x (500 mM Tris pH 8, 10% Tween 20, 20 mM MgCl2), mescolare agitando delicatamente e incubare a 37 °C per 1,5 h con agitazione.
    2. Centrifugare a 3428 x g a 4 °C per 60 min. Filtrare attraverso un filtro sottovuoto PES da 0,45 μM per chiarificare il lisato cellulare, lasciando il lisato chiarificato nel contenitore del filtro.
      NOTA: Facoltativo dopo la filtrazione: prelevare 50 μL di campione per la PCR quantitativa (Q-PCR).
    3. Aggiungere 90 mL di soluzione di PEG 8000 al 40% a 360 mL di lisato cellulare filtrato.
    4. Pulire l'ancoretta con etanolo al 70% e aggiungerla al campione. Mescolare con ghiaccio o in cella frigorifera a 300 giri/min per 1 ora. Incubare a 4 °C senza agitare per tutta la notte.
      NOTA: Sono stati testati tempi di incubazione da 1 a 72 ore. Tempi di incubazione più lunghi hanno un effetto negativo sulla precipitazione complessiva delle proteine.

5. Purificazione dello iodixanolo

  1. Giorno 6
    1. Trasferire l'intero campione di volume di coltura precipitato PEG in una provetta conica grande e pulita e centrifugare a 2820 x g e 4°C per 15 minuti.
    2. Scartare il surnatante e risospendere il pellet di PEG in 15 mL di DPBS con calcio e magnesio. Il pellet è difficile da risospendere; Prenditi il tempo necessario per farlo con attenzione.
    3. Trasferire la parte risospesa in una provetta pulita da 50 ml. Il PEG rimarrà sui lati del tubo del bioreattore. Aggiungere altri 10 ml, avendo cura di raccogliere tutto il precipitato di PEG. Trasferire il tutto in un contenitore da 50 ml per un volume totale di 25-30 ml.
    4. Aggiungere 40 μL di DNaseI (10 U/μL). Porre nell'incubatrice per 1 h a 37°C.
      NOTA: Facoltativo dopo l'incubazione della DNasi: prelevare 50 μL di campione per la Q-PCR.
    5. Pulire bene le barre di agitazione utilizzate per la precipitazione del PEG con una soluzione di cloruro seguita da etanolo al 70%. Lasciare le barrette in etanolo al 70% per il prossimo esperimento.
    6. Riempire una provetta di poliallomero di 25 mm x 89 mm utilizzando una pipetta Pasteur in vetro con 15,5 mL di lisato cellulare concentrato in ciascuna provetta. Dopo aver aggiunto il lisato cellulare, sostituire la pipetta Pasteur in vetro con una nuova.
    7. Aggiungere le soluzioni di iodixanolo dal 15% al 60%: infondere delicatamente 9 mL della soluzione di iodixanolo al 15% sotto il lisato cellulare. Successivamente, aggiungere 5 mL delle soluzioni di iodixanolo al 25% e al 40% e, infine, aggiungere 5 mL della soluzione di iodixanolo al 60%.
    8. Rabboccare il tubo utilizzando una siringa con DPBS +/+ per rimuovere la maggior parte delle bolle d'aria, facendo attenzione a non disturbare gli strati di iodixanolo. Sigillare il tubo utilizzando un copritubo elettrico.
    9. Centrifugare in un rotore non oscillante per 1 ora e 10 minuti a 490.000 x g a 16 °C in un'ultracentrifuga. Rimuovere dall'ultracentrifuga, assemblare le provette in una chiusura metallica e preparare le provette di raccolta. Aprire il rotore nella cappa in caso di fuoriuscite durante la centrifuga.
    10. Preparare una provetta da 50 mL (per scartare la provetta del rotore), una provetta da 15 mL (per raccogliere il virus), una siringa da 5 mL e un ago da 30G e 19G per gradiente.
    11. Praticare un foro nella parte superiore del tubo con un ago da 30 G. Lasci l'ago in posizione. Posizionare un ago da 19G sulla siringa.
    12. Forare con cautela il tubo appena sotto l'interfaccia 40%/60%, che può essere vista dall'indicatore rosso fenolo. Assicurati che lo smusso dell'ago sia rivolto verso lo strato del 40%.
    13. Rimuovere l'ago da 30 G dalla parte superiore del tubo utilizzando la mano non dominante. Con l'ago smussato verso l'alto, estrarre lentamente il virus/iodixanolo. L'obiettivo è quello di estrarre tra i 3 mL e i 4,5 mL. Circa a metà e ben oltre lo strato al 40%/trasparente, ruotare l'ago per lo smusso rivolto verso il basso e continuare a estrarre per evitare la raccolta dallo strato proteico.
    14. Preparare la provetta da 50 mL con la mano non dominante, estrarre con cautela l'ago mentre si posiziona la provetta nella provetta da 50 mL ed eliminarla. Diluire la sospensione di AAV/iodixanolo 5 volte in DPBS riempiendo fino a 15 mL.
    15. Trasferire in una provetta filtrante centrifuga e centrifugare a 3428 x g, 4 °C per 10 min. Scartare il flusso continuo; Rimuovere delicatamente il supporto del filtro e capovolgere il contenitore inferiore in una bottiglia di scarto. Aggiungere 15 mL di PBS-5% di saccarosio per filtrare e risospendere.
    16. Centrifugare a 3428 x g a 4 °C per 20 min. Ripetere lo scambio del buffer almeno 3 volte. Conservare il virus (~150-250 μL) a 4 °C (PHP. B per un massimo di 3 mesi) o aliquota in aliquote da 50 μL e conservare a -80 °C per lungo periodo.
      NOTA: PHP. Le varianti del capside B sono sensibili al gelo/scongelamento, quindi questo dovrebbe essere evitato.
    17. Eseguire la titolazione come descritto in un protocollo precedente10.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La maggior parte dei laboratori accademici utilizza cellule HEK293T aderenti per la produzione di AAV 8,9. Mentre questo funziona relativamente bene quando sono necessarie piccole quantità di AAV per l'iniezione diretta, è necessario un titolo 100 volte superiore (almeno 1 x 1011 GC/topo) per ottenere una trasduzione simile con capsidi sistemici come AAV. PHP.eB.

In questo protocollo, è stata stabilita la produzione di AAV utilizzando cellule HEK293 in sospensione coltivate in provette coniche. Le colture su piccola scala possono essere eseguite in provette da 50 mL e su larga scala in provette da 600 mL. Per agitatori specifici (vedi Tabella dei materiali), è possibile utilizzare un rack in cui è possibile coltivare contemporaneamente fino a 16 provette di grandi dimensioni. Questo rack viene utilizzato in combinazione con inserti speciali per provette da 50 mL (Figura 2A). Questo sistema offre un notevole guadagno di tempo per il segmento di coltura e trasfezione di questo protocollo. L'impostazione iniziale della produzione è stata fatta con costrutti reporter per la luciferasi e la proteina fluorescente verde (GFP)10,11. Parallelamente, il costrutto GFP è stato prodotto in piastre da 12, 15 cm2 come descritto in un protocollo12 precedentemente pubblicato. In media, è stata ottenuta una resa di 7,7 x 1012 GC totali utilizzando la polietilenimmina (PEI) e di 2,4 x 1013 GC utilizzando TransIt (Figura 2B). Per PEI, si tratta di un miglioramento di quasi 3 volte; per TransIt, si tratta di un miglioramento di 9,2 volte rispetto ai titoli ottenuti con coltura aderente (2,6 x 1012). Se utilizzato per trasfettare le celle in sospensione, TransIt offre un miglioramento di circa 3 volte della resa rispetto al PEI (Figura 2B).

Successivamente, le prestazioni dei vettori AAV sono state testate in vivo. I vettori GFP sono stati prodotti con PEI e TransIt e confrontati con i vettori GFP prodotti con il classico sistema aderente. A 4 settimane dall'iniezione, i topi (topi femmina C57BL/6 di 6 settimane del peso di 20-25 g) sono stati sacrificati e l'espressione di GFP nel cervello del topo è stata valutata mediante istologia (Figura 3A). L'analisi comparativa è stata condotta su sezioni cerebrali sagittali. Non è stata osservata alcuna differenza nel modello di trasduzione del virus prodotto utilizzando questi metodi di produzione (Figura 3B). È stata inoltre valutata l'attività luciferasica dei vettori prodotti utilizzando entrambi i metodi. La trasduzione è stata misurata in vivo per 3 settimane; il modello di espressione nel tempo è simile, indipendentemente dal reagente di trasfezione utilizzato (Figura 4).

Successivamente, il protocollo è stato testato e implementato da altri membri del team (Tabella 2). La produzione di altri capsidi con PEI ha avuto successo, producendo una resa media di 3,5 x 1012 vettori GC. Per la produzione di capside B10, è possibile ottenere un miglioramento di 3 volte utilizzando TransIt rispetto a PEI. Per un altro progetto, diversi costrutti confezionati in AAv.PHP.eB hanno dato una resa media di 3,7 x 1012, che è sufficiente per iniettare 7 topi per via endovenosa alla dose di 5 x 1011 GC per topo. Questi risultati illustrano che il protocollo può essere utilizzato con successo da diversi ricercatori per varie combinazioni di capsidi e costrutti.

figure-results-1
Figura 1: Panoramica schematica della produzione. Il giorno 1 (D1), le cellule vengono coltivate in provette da 300 ml. Il giorno 2 (D2), le cellule vengono trasfettate con i plasmidi pertinenti. Il giorno 5 (D5), le cellule vengono raccolte e lisate utilizzando un tampone di lisi interpolante 10x. Dopo la lisi, i detriti cellulari vengono rimossi mediante centrifugazione. Successivamente, il lisato cellulare viene filtrato per rimuovere le proteine di grandi dimensioni e il virus AAV viene precipitato utilizzando il glicole polietilenico (PEG) 8000. Il giorno 6 (D6), vengono eseguite la purificazione e la concentrazione di iodiosanolo. Il concentrato di PEG del giorno precedente viene trattato con DNasi e successivamente posto attraverso un gradiente di iodixanolo. I vettori purificati vengono successivamente dissalati e concentrati utilizzando un filtro centrifugo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Configurazione dell'incubatore e resa AAV. (A) Le cellule di produzione virale vengono coltivate in un incubatore con agitazione con un diametro di agitazione di 50 cm. Questo incubatore è dotato di una piastra adattatrice per provette da 600 mL e di inserti speciali per provette da 50 mL prodotti dal reparto meccatronica. (B) A seguito della configurazione iniziale, i costrutti reporter utilizzano la polietilenimmina (PEI; 7,7 x 1012 GC totali, n=5) o TransIt (2,4 x 1013 GC totali, n=5) come metodo di trasfezione e confrontati con le rese ottenute con il metodo classico aderente (2,6 x 1012 GC totali, n=5) come descritto in Verhaagen et al.12. I dati sono presentati come media ± deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Pattern di espressione della GFP dopo la valutazione in vivo . (A) Rappresentazione schematica di un tipico costrutto vettoriale AAV contenente il promotore ubiquitario CMV enhancer immediato-precoce, il promotore dell'β-actina di pollo e il sito accettore di splicing (CAG) della β-globina di coniglio seguito dalla proteina fluorescente verde (GFP), l'elemento regolatore posttrascrizionale (WPRE) del virus dell'epatite della marmotta (WHV) e una coda di poliadenilazione (pA)13. Qui, topi femmina di 6 settimane (n = 3) hanno ricevuto un'iniezione di vena caudale contenente 5 x 1011 copie genomiche totali (gc)/topo. A 4 settimane dall'iniezione, i topi sono stati sacrificati e i cervelli sono stati analizzati mediante istologia. (B) Rappresentazione rappresentativa del pattern di trasduzione in sezioni sagittali, utilizzando cellule HEK293T aderenti e cellule in sospensione con polietilenimmina (PEI) o reagente di trasfezione TransIt, si osserva un pattern di trasduzione simile indipendentemente dal metodo di produzione utilizzato. Barra della scala = 1000 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Attività simile della luciferasi indipendentemente dal metodo di trasfezione. (A) Rappresentazione schematica del costrutto utilizzato contenente il promotore ubiquitario CMV potenziatore immediato-precoce, il promotore dell'β-actina di pollo e la luciferasi (LUC) del sito accettore di splicing (CAG) di β-Globin di coniglio con un tag V5 e una coda di poliadenilazione dell'ormone della crescita bovino (BGHpA), 5 x10 11 GC totali/topo (n=3) sono stati iniettati attraverso la vena caudale, attività luciferasica nell'area cranica (cerchiata in rosso, nell'immagine di esempio) poiché l'immagine bioluminescente è stata misurata settimanalmente. (B) L'attività bioluminescente è stata misurata come unità di luminescenza relativa (RLU) rappresentate come una barra blu per la produzione di PEI e una barra marrone per TransIt. Non è stata osservata alcuna differenza significativa nell'attività della luciferasi nell'area cerebrale selezionata tra i gruppi. I dati sono presentati come media ± deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Parametri di trasfezione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Rendimenti del protocollo implementato. Protocollo di sospensione utilizzato da altri ricercatori per produrre AAV. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La somministrazione sistemica di AAV è un potente strumento per il trasferimento genico al sistema nervoso centrale; tuttavia, la produzione di AAV è un processo costoso e laborioso. Utilizzando le cellule in sospensione, la manodopera e la plastica sono ridotte rispetto alla coltura aderente di HEK293T su piastre da 15 cm2 . Inoltre, i tubi conici qui implementati sono facili da maneggiare e massimizzano l'uso dello spazio del laboratorio. Il protocollo è stato messo a punto da due ricercatori e successivamente applicato da altri in laboratorio. Una serie di produzioni da parte di tre ricercatori indipendenti ha prodotto, in media, abbastanza vettori per lotto per iniettare 6-7 topi.

L'uso di celle in sospensione HEK293 è stato descritto in precedenza13,14. Tuttavia, la linea cellulare in sospensione descritta non è liberamente disponibile a scopo di ricerca. Questo è un collo di bottiglia per i ricercatori accademici quando applicano i metodi descritti. La linea cellulare in sospensione descritta in questo protocollo è liberamente disponibile per scopi di ricerca. La coltura delle cellule in sospensione è stata eseguita in provette coniche invece di quelle di Erlenmeyer per risparmiare spazio e tempo. Con Erlenmeyer's, è possibile coltivare fino a 4 produzioni contemporaneamente, rispetto alle 12 produzioni che utilizzano tubi conici. Le provette coniche possono essere trasferite direttamente alla centrifuga per la raccolta.

Una possibilità alternativa per un sistema di coltura cellulare in sospensione è il sistema baculovirale. Un vantaggio del sistema baculo è che queste cellule e terreni sono disponibili al pubblico e possono essere facilmente applicati. Per gli accademici, sono disponibili repository come Addgene, contenenti un'ampia libreria di plasmidi di trasferimento AAV pronti all'uso12. Sebbene questi possano anche avere delle avvertenze, come ITR difettosi, fungono da buona fonte per esperimenti plug-and-play. La scelta è stata fatta per mantenere un sistema di produzione basato su HEK293 in quanto i plasmidi disponibili possono essere utilizzati direttamente per la produzione senza il trasferimento del costrutto al baculovirus.

Per la trasfezione, la polietilenimmina è relativamente economica ed è, quindi, il reagente di trasfezione preferito. In alternativa, è stato valutato un nuovo metodo di trasfezione (TransIt) per aumentare la resa dei vettori. È stato osservato un miglioramento di tre volte utilizzando la metà della quantità di plasmidi. Ciò rende TransIt un interessante reagente alternativo di trasfezione quando sono necessarie scorte più grandi. Un limite di questo è il costo, che lo rende meno interessante per piccoli lotti.

In sintesi, qui viene presentato un protocollo che può essere utilizzato per produrre AAV ad alto rendimento in celle in sospensione in un ambiente di laboratorio accademico. Vengono descritti strumenti che possono essere utilizzati in un laboratorio accademico per produrre AAV ad alto rendimento.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un campione gratuito di TransIT è stato fornito da Mirus per i test iniziali, dopodiché il reagente è stato acquistato per un ulteriore utilizzo. Gli autori non hanno altri interessi finanziari concorrenti da segnalare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del fondo di ricerca dell'Accademia Reale Olandese delle Arti e delle Scienze (KNAW) e da una sovvenzione di Start2Cure (0-TI-01). Ringraziamo Leisha Kopp per il suo contributo e i suoi consigli nella configurazione del protocollo. Le figure sono state create utilizzando Biorender.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
39 mL, Provetta in polipropilene tondo a tenuta rapida, 25 x 89 mm - 50PkAdattatore per coltro Beckman342414
Provette coniche da 600 mL, per rotore S-4x1000, eppendorf5920701002
Adapter Plate si adatta a 16 bioreattori da 600 mlInfors HT/ TPP587633
Tappi a tenuta di aerosol, per secchi rotondi da 750 mLeppendorf5820747005
Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotore S-4x1000, secchi rotondi e adattatore 15 mL/50 mL provette conicheeppendorf5948000315
Acqua distillataGibco
DNasi I ricombinante, senza RNasiRoche4716728001
DNasi I ricombinante, senza RNasiRoche4716728001
DPBS, calcio, magnesioGibco14040091
DPBS, senza calcio, senza magnesioGibco14190144
Fisherbrand Unità filtranti monouso in PES 0,2Fisher
Fisherbrand Unità filtranti monouso in PES 0,45FisherFB12566505
Supporto per provette da 50 ml adatto anche per provetta FalconInfors HT/ TPP31362
Supporto per provetta per coltura cellulare da 600 mlInfors HT/ TPP66129
Incubatore Minitron 50 mmInfors HT500043
LV-MAX Production MediumGibco
N-Tray UniversalInfors HT / TPP31321
OptiPrep - IodixanolSerumwerk bernburg1893
PEI MAX - Polietilenimmina lineare cloridrato di trasfezione (MW 40.000)Poly-sciences24765-100
Soluzione di rosso fenolo Sigma-Aldrich72420100
Poli(glicole etilenico) 8000Sigma-Aldrich89510
TransIT-VirusGENMirusMir 6706
Soluzione di tripano blu, 0,4%Gibco5250061
TubeSpin Bioreactors-50mlTTP87050
TubeSpin Bioreactors-600mlTTP87600
Cellule di produzione viraleGibcoA35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000Cytvia28932363
15230147FB12566504A3583401

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914(2022).">Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914(2022).
  2. PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration. Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483(2021).">Pietersz, K. L., et al. PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration. Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483(2021).
  3. Several rAAV vectors efficiently cross the blood–brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).">Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood–brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).
  4. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).">Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).
  5. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).">Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).
  6. AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset. Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).">Goertsen, D., et al. AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset. Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).
  7. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).">Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).
  8. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).">Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).
  9. purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. J Vis Exp. (143), e58960(2019).">Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. J Vis Exp. (143), e58960(2019).
  10. A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons. Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).">Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons. Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).
  11. Retinal gene therapy, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).">Verhaagen, J., et al. Retinal gene therapy, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).
  12. Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data. Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).">Nasse, J. S., et al. Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data. Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).
  13. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).">Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
  14. Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).">Blessing, D., Déglon, N., Schneider, B. L. Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Produzione di AAVVettori Adeno AssociatiAAV ad Alta ResaTripla TrasfezioneGradiente di IodixanoloTrasfezione con PolietilenimminaFiltrazione CentrifugaSistema Nervoso CentralePurificazione di Vettori Virali

Articoli correlati