Qui, viene presentato un protocollo di produzione AAV basato su celle HEK293 in sospensione, con conseguente riduzione del tempo e della manodopera necessari per la produzione di vettori utilizzando componenti disponibili per scopi di ricerca da fornitori commerciali.
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Articolo metodologico
Produzione di lotti vettoriali adeno-associati ad alto rendimento utilizzando celle di sospensione HEK293
In questo articolo
Sommario
Abstract
I vettori virali adeno-associati (AAV) sono uno strumento straordinario per lo studio del sistema nervoso centrale (SNC). Capsidi innovativi, come l'AAV. PHP.eB, dimostrano un'ampia trasduzione del SNC mediante iniezione endovenosa nei topi. Per ottenere una trasduzione comparabile, è necessario un titolo 100 volte superiore (almeno 1 x 1011 copie del genoma/topo) rispetto all'iniezione diretta nel parenchima del SNC. Nel nostro gruppo, la produzione di AAV, tra cui AAV. PHP.eB si basa su cellule HEK293T aderenti e sul metodo della tripla trasfezione. Ottenere rese elevate di AAV con cellule aderenti comporta un processo ad alta intensità di manodopera e materiale. Questo vincolo ha portato allo sviluppo di un protocollo per la coltura cellulare in sospensione in provette coniche. Gli AAV generati nelle cellule aderenti sono stati confrontati con il metodo di produzione della sospensione. Sono state confrontate colture in sospensione utilizzando reagenti di trasfezione polietilenimmina o TransIt. I vettori AAV sono stati purificati mediante ultracentrifugazione a gradiente di iodixanolo seguita da scambio di tamponi e concentrazione utilizzando un filtro centrifugo. Con il metodo aderente, abbiamo ottenuto una media di 2,6 x 1012 copie del genoma (GC) totali, mentre il metodo della sospensione e la polietilenimmina hanno prodotto 7,7 x 1012 GC in totale e TransIt ha prodotto 2,4 x 1013 GC in totale. Non vi è alcuna differenza nell'efficienza di trasduzione in vivo tra i vettori prodotti con aderente rispetto al sistema di celle in sospensione. In sintesi, viene introdotto un protocollo di produzione AAV basato su celle HEK293 in sospensione, che consente di ridurre il tempo e la manodopera necessari per la produzione di vettori e di ottenere rendimenti da 3 a 9 volte superiori utilizzando componenti disponibili presso i fornitori commerciali per scopi di ricerca.
Introduzione
Il virus adeno-associato (AAV) è stato scoperto nel 1965 e da allora è stato utilizzato in una miriade di applicazioni1. Gli AAV sono stati applicati nella ricerca neuroscientifica per studiare la funzione genica e neuronale, mappare i neurocircuiti o produrre modelli animali per la malattia2. Tradizionalmente, questo viene fatto iniettando direttamente nel sito di interesse, poiché la maggior parte dei sierotipi naturali non attraversa la barriera emato-encefalica o ha bisogno di una dose elevata per farlo 1,2,3.
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Accademia Reale Olandese delle Scienze (KNAW) ed erano conformi alla legge olandese sulla sperimentazione animale con il numero di progetto AVD8010020199126. Nella Figura 1 viene fornita una panoramica schematica del protocollo completo. Dalla semina delle cellule alla purificazione dell'AAV, il protocollo richiede 6 giorni per essere completato.
1. Preparazione dei reagenti
- Purificazione dei plasmidi
- Eseguire l'estrazione dei plasmidi come descritto dal produt....
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Risultati
La maggior parte dei laboratori accademici utilizza cellule HEK293T aderenti per la produzione di AAV 8,9. Mentre questo funziona relativamente bene quando sono necessarie piccole quantità di AAV per l'iniezione diretta, è necessario un titolo 100 volte superiore (almeno 1 x 1011 GC/topo) per ottenere una trasduzione simile con capsidi sistemici come AAV. PHP.eB.
In questo protocollo, è stata stabilita la produzione di AAV u.......
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Discussione
La somministrazione sistemica di AAV è un potente strumento per il trasferimento genico al sistema nervoso centrale; tuttavia, la produzione di AAV è un processo costoso e laborioso. Utilizzando le cellule in sospensione, la manodopera e la plastica sono ridotte rispetto alla coltura aderente di HEK293T su piastre da 15 cm2 . Inoltre, i tubi conici qui implementati sono facili da maneggiare e massimizzano l'uso dello spazio del laboratorio. Il protocollo è stato messo a punto da due ricercatori e successivamen.......
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Dichiarazioni
Un campione gratuito di TransIT è stato fornito da Mirus per i test iniziali, dopodiché il reagente è stato acquistato per un ulteriore utilizzo. Gli autori non hanno altri interessi finanziari concorrenti da segnalare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del fondo di ricerca dell'Accademia Reale Olandese delle Arti e delle Scienze (KNAW) e da una sovvenzione di Start2Cure (0-TI-01). Ringraziamo Leisha Kopp per il suo contributo e i suoi consigli nella configurazione del protocollo. Le figure sono state create utilizzando Biorender.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 39 mL, Provetta in polipropilene tondo a tenuta rapida, 25 x 89 mm - 50Pk | Adattatore per coltro Beckman | 342414 | |
| Provette coniche da 600 mL, per rotore S-4x1000, | eppendorf | 5920701002 | |
| Adapter Plate si adatta a 16 bioreattori da 600 ml | Infors HT/ TPP | 587633 | |
| Tappi a tenuta di aerosol, per secchi rotondi da 750 mL | eppendorf | 5820747005 | |
| Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotore S-4x1000, secchi rotondi e adattatore 15 mL/50 mL provette coniche | eppendorf | 5948000315 | |
| Acqua distillata | Gibco | ||
| DNasi I ricombinante, senza RNasi | Roche | 4716728001 | |
| DNasi I ricombinante, senza RNasi | Roche | 4716728001 | |
| DPBS, calcio, magnesio | Gibco | 14040091 | |
| DPBS, senza calcio, senza magnesio | Gibco | 14190144 | |
| Fisherbrand Unità filtranti monouso in PES 0,2 | Fisher | ||
| Fisherbrand Unità filtranti monouso in PES 0,45 | Fisher | FB12566505 | |
| Supporto per provette da 50 ml adatto anche per provetta Falcon | Infors HT/ TPP | 31362 | |
| Supporto per provetta per coltura cellulare da 600 ml | Infors HT/ TPP | 66129 | |
| Incubatore Minitron 50 mm | Infors HT | 500043 | |
| LV-MAX Production Medium | Gibco | ||
| N-Tray Universal | Infors HT / TPP | 31321 | |
| OptiPrep - Iodixanol | Serumwerk bernburg | 1893 | |
| PEI MAX - Polietilenimmina lineare cloridrato di trasfezione (MW 40.000) | Poly-sciences | 24765-100 | |
| Soluzione di rosso fenolo | Sigma-Aldrich | 72420100 | |
| Poli(glicole etilenico) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| TransIT-VirusGEN | Mirus | Mir 6706 | |
| Soluzione di tripano blu, 0,4% | Gibco | 5250061 | |
| TubeSpin Bioreactors-50ml | TTP | 87050 | |
| TubeSpin Bioreactors-600ml | TTP | 87600 | |
| Cellule di produzione virale | Gibco | A35347 | |
| Vivaspin 20 MWCO 100 000 | Cytvia | 28932363 |
Riferimenti
- Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914(2022).
- Pietersz, K. L., et al.
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Ristampe e permessi
