Valutazione in tempo reale del Ca2+ assoluto, citosolico, libero e della corrispondente contrattilità in vasi linfatici isolati e pressurizzati

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per misurare simultaneamente il calcio libero [Ca²⁺]_i e il diametro dei vasi nei vasi linfatici in contrazione in tempo reale e quindi calcolare le concentrazioni assolute di Ca²⁺ e i parametri di contrattilità/ritmicità. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare il Ca²⁺ e la dinamica contrattile in una varietà di condizioni sperimentali.

Abstract

La vascolarizzazione linfatica, ora spesso indicata come "la terza circolazione", si trova in molti sistemi di organi vitali. Una delle principali funzioni meccaniche del sistema vascolare linfatico è quella di riportare il fluido dagli spazi extracellulari ai dotti venosi centrali. Il trasporto linfatico è mediato da contrazioni ritmiche spontanee dei vasi linfatici (LV). Le contrazioni del ventricolo sinistro sono in gran parte regolate dall'aumento e dalla diminuzione ciclico del calcio libero citosolico ([Ca²⁺]_i).

Questo articolo presenta un metodo per calcolare contemporaneamente le variazioni delle concentrazioni assolute di [Ca²⁺]_i e della contrattilità/ritmicità dei vasi in tempo reale in LV isolati e pressurizzati. Utilizzando LV mesenterici isolati di ratto, abbiamo studiato le variazioni di [Ca²⁺]_i e la contrattilità/ritmicità in risposta all'aggiunta di farmaci. I LV isolati sono stati caricati con l'indicatore raziometrico di rilevamento del Ca²⁺ Fura-2AM e la microscopia video abbinata al software di rilevamento dei bordi è stata utilizzata per acquisire [Ca²⁺]_i e le misurazioni del diametro in modo continuo in tempo reale.

Il segnale Fura-2AM da ciascun LV è stato calibrato al segnale minimo e massimo per ogni nave e utilizzato per calcolare il [Ca²⁺]_i assoluto. Le misure del diametro sono state utilizzate per calcolare i parametri contrattili (ampiezza, diametro telediastolico, diametro telesistolico, flusso calcolato) e la ritmicità (frequenza, tempo di contrazione, tempo di rilassamento) e correlati con le misure assolute [Ca²⁺]_i .

Introduzione

La vascolarizzazione linfatica si trova in molti sistemi di organi tra cui cervello, cuore, polmoni, reni e mesentere 1,2,3,4,5,6 e funziona spingendo il fluido (linfa) dagli spazi interstiziali ai dotti venosi centrali per mantenere l'omeostasi dei fluidi ^7,8,9,10. Inizia con capillari linfatici ciechi all'interno dei letti capillari vascolari che drenano nei vasi linfatici collettori (LV). I LV collettori sono costituiti da due strati di cellule: uno strato di cellule endoteliali racchiuso da uno strato di cellule muscolari linfatiche (LMC)^10,11. Il trasporto del fluido linfatico si ottiene sia attraverso forze estrinseche (ad es. nuova formazione di linfa, pulsazioni arteriose, fluttuazioni della pressione venosa centrale) che forze intrinseche¹².

La forza intrinseca per il trasporto linfatico è la contrazione ritmica spontanea della raccolta dei LV, che è al centro della maggior parte degli studi che indagano la funzione linfatica. Questa pompa linfatica intrinseca è regolata principalmente dall'ascesa e dalla caduta ciclica del Ca²⁺ libero citosolico ([Ca²⁺]_i). La depolarizzazione spontanea della membrana plasmatica nelle LMC attiva i canali Ca²⁺ (Ca_v1.x) voltaggio-dipendenti "tipo L" innescando l'afflusso di Ca²⁺ e la successiva contrazione ritmica del ventricolo sinistro ^8,9,10. Questo ruolo è stato dimostrato bloccando Ca_v1.x con agenti specifici, come la nifedipina, che ha inibito le contrazioni del ventricolo sinistro e causato la dilatazione dei vasi^13,14. L'aumento transitorio di [Ca²⁺]_i o "Ca²⁺ spike" nelle LMC mediato dai canali Ca_v1.x può anche mobilitare le riserve intracellulari di Ca²⁺ attivando i recettori dell'inositolo trifosfato (IP₃) e i recettori della rianodina (RyR) sul reticolo sarcoplasmatico (SR)15,16,17,18. Le prove attuali suggeriscono che i recettori IP₃ contribuiscono con più Ca²⁺ richiesto per le normali contrazioni del ventricolo sinistro rispetto ai RyR 15,16,19,20,21; tuttavia, i RyR possono svolgere un ruolo durante la patologia o in risposta all'intervento farmaceutico^17,18. Inoltre, l'attivazione dei canali K^{+ 22} attivati dal Ca²⁺ e dei canali^23,24 del potassio (K_ATP) sensibili all'ATP possono iperpolarizzare la membrana LMC e inibire l'attività contrattile spontanea.

Ci sono molti altri canali ionici e proteine che possono regolare la dinamica del Ca²⁺ nella raccolta dei LV. L'utilizzo di metodi per studiare i cambiamenti nel Ca²⁺ e nella contrattilità dei vasi in risposta agli agenti farmacologici in tempo reale è importante per comprendere questi potenziali regolatori. È stato descritto un metodo precedente che utilizzava Fura-2 per misurare le variazioni relative di LV [Ca²⁺]_i ²⁵. Poiché la costante di dissociazione per Fura-2 e Ca²⁺ è nota²⁶, è possibile calcolare le concentrazioni effettive di Ca²⁺, il che amplia l'applicazione di questo metodo e fornisce ulteriori informazioni sulla segnalazione di Ca²⁺ , sull'eccitabilità di membrana e sui meccanismi di contrattilità²⁷, oltre a consentire confronti di base tra gruppi sperimentali. Quest'ultimo approccio è stato utilizzato nei cardiomiociti²⁸ e, pertanto, può essere adattato ai LV. Questo articolo presenta un metodo migliorato che combina questi due approcci per misurare e calcolare le variazioni di [Ca²⁺]_i assoluto e di contrattilità/ritmicità dei vasi in modo continuo e in tempo reale in LV isolati e pressurizzati. Forniamo anche risultati rappresentativi per i ventricolari sinistro trattati con nifedipina.

Protocollo

I ratti maschi di Sprague-Dawley di età compresa tra nove e 13 settimane sono stati acquistati da un venditore commerciale. Dopo l'arrivo, tutti i ratti sono stati ospitati e mantenuti presso la Divisione di Medicina degli Animali da Laboratorio (DLAM) dell'Università dell'Arkansas per le Scienze Mediche (UAMS) con una dieta standard di laboratorio ed esposti a 12 ore di ciclo luce/buio a 25 ^°C. Tutte le procedure sono state eseguite secondo il protocollo approvato per l'uso degli animali #4127 dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) di UAMS.

1. Dissezione e incannulamento dei ventricolo sinistro mesenterico

NOTA: È importante allestire la camera di perfusione prima dell'isolamento dei LV mesenterici per assicurarsi che non vi siano interruzioni del flusso o perdite che potrebbero interrompere l'esperimento.

1. Preparazione del bagno di perfusione
   1. Acquistate micropipette in vetro borosilicato (diametro esterno di 1,2 mm, diametro interno di 0,68 mm e tirate fino a un diametro esterno della punta di 75-100 μm) da un rivenditore commerciale. Tagliare e lucidare le micropipette (note anche come cannule) a circa 1-2 cm di lunghezza per il montaggio nella camera di perfusione del vaso isolato.
   2. Collegare ogni cannula di vetro montata nella camera di perfusione del recipiente a trasduttori di pressione indipendenti situati in linea con regolatori di pressione indipendenti alimentati a gravità utilizzando tubi in polietilene.
      NOTA: Ciò consente la manipolazione indipendente delle pressioni di afflusso e deflusso a seconda del disegno dello studio. La Figura 1 mostra questa configurazione in dettaglio.
   3. Riempire la camera di perfusione (5 mL), le micropipette in vetro e il regolatore di pressione indipendente alimentato a gravità insieme al tubo in polietilene con soluzione salina fisiologica (PSS; 119 mM NaCl; 24 mM NaHCO₃; 1,17 mM NaH₂PO₄; 4,7 mM KCl; 1,17 mM MgSO₄; 5,5 mM C_{6H 12}O₆ (glucosio); 0,026 mM C₁₀H₁₆N₂O₈ (EDTA); e 1,6 mM CaCl₂) privo di bolle d'aria. Quindi, bloccare la pressione in modo che le cannule non siano pressurizzate.
      NOTA: Il pH di questa soluzione è ~7,5. Nel bagno di perfusione viene mantenuto un pH di 7,4 utilizzando il gorgogliamento di CO₂ per agire sul sistema tampone del bicarbonato all'interno del PSS come descritto nel passaggio 1.3.7. L'EDTA viene utilizzato qui per chelare gli ioni Ca²⁺ in eccesso.
2. Preparazione dei nodi
   1. Lega i doppi nodi a rovescio al microscopio usando un filo di sutura di seta intrecciato (misura 8-0). I passaggi chiave sono illustrati nella Figura 2.
      1. Separare un singolo filamento.
      2. Utilizzare due pinze Dumont #5 con punte microsmussate e utilizzare una pinza fare un doppio anello attorno alla punta delle altre pinze.
      3. Con la pinza ad anello, afferra l'estremità libera della sutura e tirala attraverso entrambi gli anelli assicurandoti di non chiudere completamente il nodo e lasciando una piccola apertura.
      4. Usa le forbici a molla Vanna per tagliare la sutura in eccesso da entrambi i lati. Usa questi nodi in seguito per fissare il LV sulle cannule.
         NOTA: Non utilizzare le stesse pinze con cui sezionerai o incannulerai perché c'è più pericolo di danneggiare le punte delle pinze durante la legatura dei nodi.
3. Isolamento e incannulamento dei ventrigli sinistro mesenterici
   1. Anestetizzare profondamente gli animali somministrando un isoflurano al 5% con sovradosaggio di 1,5 L/min di O₂ ed dissanguare per decapitazione.
   2. Isolare interi mesenteri per la dissezione dei ventrigli sinistro mesenterici praticando prima un taglio longitudinale lungo la linea mediana della parete addominale, esteriorizzando il mesentere e quindi tagliando la connessione appena sotto lo sfintere pilorico e ~2-3 cm sopra il cieco, nonché la connessione al retto.
   3. Lavare i mesenteri interi sezionati in 200 ml di PSS ghiacciato, quindi trasferirli e fissarli in una capsula di Petri (100 mm) rivestita di silicone (8-10 mm) contenente PSS ghiacciato.
   4. Sezionare i LV mesenterici di secondo ordine dal grasso circostante e dal tessuto connettivo utilizzando uno stereomicroscopio, una pinza fine Dumont #5 Inox e le forbici a molla Vanna. Per aiutare a identificare le estremità dei ventricoli sinistro una volta rimossi dal tessuto, lasciare un piccolo pezzo di grasso sull'estremità prossimale del ventricolo sinistro.
   5. Trasferire i ventricolati sezionati nella camera di perfusione del vaso per l'incannulamento su cannule di vetro.
   6. Utilizzare due pinze fini Dumont #5 Inox preaffilate, punta diritta (0,05 x 0,01 mm) per incannulare i ventricolati sinistro con l'estremità distale del ventricolo sinistro sulla cannula P1 (afflusso) e l'estremità prossimale del vaso sulla cannula P2 (deflusso) per imitare la direzione del flusso linfatico.
      NOTA: Le cannule P1 e P2 sono identiche e differiscono solo per l'estremità del ventricolo sinistro. È importante utilizzare pinze che si incontrino perfettamente sulla punta e senza danni per facilitare l'afferramento della sottile parete del vaso.
      1. Far scorrere un singolo nodo prelegato su ciascuna cannula di vetro per fissare successivamente il vaso sulle cannule.
      2. Usando il piccolo pezzo di grasso per aiutare a orientare la direzione del ventricolo sinistro, incannulare prima l'estremità distale su P1.
      3. Far scorrere il nodo lungo la cannula e stringere per fissare il ventricolo sinistro. Assicurarsi di non stringere eccessivamente e di non rompere la punta della cannula.
      4. Pressurizzare il ventricolo sinistro a 4-5 mm Hg nella camera di perfusione.
         NOTA: Per i nostri scopi, impostiamo la pressione P1 e P2 su un valore uguale; Tuttavia, a seconda delle condizioni sperimentali, la pressione può essere regolata in corrispondenza di ciascuna cannula per indurre uno sforzo di taglio o un riflusso.
      5. Ripetere i passaggi 1.3.6.1-1.3.6.4 per incannulare l'estremità prossimale del ventricolo sinistro su P2.
   7. Posizionare la pietra gorgogliante con il 7% di anidride carbonica (CO₂) e il 93% di ossigeno (O₂) nella camera del bagno per mantenere il pH fisiologico.
   8. Collegare la camera al regolatore di temperatura e impostarla a 37 ^oC per consentire ai ventricolati di equilibrarsi e sviluppare contrazioni stabili e spontanee (circa 30 min).
      NOTA: La Figura 1 mostra questa configurazione in dettaglio.

2. Misurazione delle concentrazioni assolute di [Ca²⁺]_i nei LV

1. Colorazione Fura-2AM di ventricolati ventricolari cannulati
   1. Dopo lo sviluppo di contrazioni spontanee (dal passaggio 1.3.8), incubare i LV con Fura-2-acetossimetilestere (Fura-2AM; 2 μM o 10 μL/5 mL) e acido pluronico (PA; 0,02% P/V o 5 μL/5 mL di PA al 20%) per 30 minuti al buio.
      NOTA: Dopo l'aggiunta di Fura-2AM, tutti i passaggi rimanenti devono essere eseguiti al buio.
   2. Dopo 30 minuti, sostituire la soluzione nella camera di perfusione 3 volte svuotando l'intero volume del bagno con un vuoto a pressione negativa, sostituendolo con PSS privo di reagenti a temperatura corrispondente (37 ^oC).
      NOTA: Questa operazione deve essere eseguita rapidamente per ridurre al minimo il tempo in cui il ventricolo sinistro rimane sospeso in aria. Utilizzare entrambe le mani, ad esempio la mano destra per il vuoto e la mano sinistra per la sostituzione del nuovo PSS privo di reagenti.
   3. Dopo il lavaggio, incubare i ventricolari ventricolari per 15 minuti al buio per rimuovere l'indicatore in eccesso e consentire la deesterificazione.
2. Cattura di Ca²⁺ Fluorescenza e diametro del vaso
   1. Trasferisci la camera sul tavolino del microscopio a fluorescenza invertita dotato di una sorgente luminosa a LED, un obiettivo Fluor S 20x, un adattatore per l'inquadratura cellulare e un veloce sistema di videocamere CMOS, che consente l'acquisizione della fluorescenza fotogramma per fotogramma a 15 Hz.
      NOTA: Uno schema di questa configurazione del flusso di lavoro è presentato nella Figura 3. Il segnale Ca²⁺ può essere catturato utilizzando una telecamera CCD con almeno 15 fps.
   2. Collegare il microscopio al computer dotato di software di imaging per registrare la fluorescenza e il rilevamento dei bordi.
      NOTA: Il software di riferimento consente anche la registrazione simultanea della pressione; Tuttavia, questo non è incluso qui.
   3. Accendi la sorgente luminosa a LED e l'interfaccia del sistema fluorescente.
      NOTA: Le istruzioni del software qui descritte si riferiscono al software di riferimento, ma è possibile utilizzare altri software per ottenere questi dati.
   4. Software aperto (IonWizard).
   5. Nella scheda File selezionare Nuovo.
   6. Nella scheda Raccogli selezionare Esperimento.
   7. Caricare il modello sperimentale desiderato e fare clic su OK.
      NOTA: Sarà necessario impostare un modello sperimentale con i parametri da misurare. Le istruzioni per l'impostazione del modello sono disponibili nel manuale del software²⁹.
   8. Regola le tracce sullo schermo per vedere il diametro del recipiente, il numeratore (segnale 340), il denominatore (segnale 380) e il rapporto in ordine decrescente.
   9. Regolare la scala dell'asse y in base alle esigenze per visualizzare le tracce.
      1. In Tracce, seleziona Modifica limiti utente. Assicurati che l'opzione Limiti automatici sia deselezionata.
      2. Selezionare il parametro che si desidera regolare, immettere i valori minimo e massimo per l'asse, quindi selezionare OK.
   10. Per iniziare l'esperimento, fai clic su INIZIA (nella parte inferiore dello schermo).
   11. Per misurare simultaneamente il diametro del ventricolo sinistro, utilizzare il software di rilevamento dei bordi incorporato nel sistema di imaging, che genera tracce contrattili di ventricolo sinistro a 3 Hz. Utilizzare queste misurazioni per analizzare i parametri contrattili e di ritmicità descritti nella sezione 3 e mostrati nella Figura 4.
       1. Assicurati di regolare l'illuminazione in modo che la parete LV appaia come linee scure.
       2. Seleziona un'area di interesse (ROI) priva di grasso e detriti. Una volta avviato l'esperimento, non spostare questo ROI.
       3. Assicurarsi che la soglia sia impostata in modo che il bordo della parete del recipiente venga rilevato durante l'intero ciclo di contrazione.
   12. Per le misure di fluorescenza, accendere il tubo fotomoltiplicatore (PMT).
   13. Eccita Fura-2, un indicatore raziometrico, alternando lunghezze d'onda di 340 e 380 nm in esposizioni di 50 ms utilizzando illuminatori a LED e cattura gli spettri di emissione a 510 nm a 15 Hz su tutto il campo di imaging.
       NOTA: È importante mantenere tutti i parametri ottici (impostazioni di eccitazione, filtri di emissione, lente dell'obiettivo e specchi dicroici) gli stessi per un'intera serie di esperimenti per ottenere misure di Ca²⁺ riproducibili.
   14. Misurare il rapporto segnale/sfondo ottenendo prima la fluorescenza 340 e 380 con il ventricolo sinistro al centro del campo visivo (segnale) e poi, utilizzando i manipolatori del tavolino per spostare il campo visivo sul bordo della vasca senza recipiente (facendo attenzione a evitare il bordo rivestito in silicone e/o rimuovendo eventuali detriti dalla vasca) per catturare lo sfondo.
       NOTA: È importante tornare ogni volta alla sezione originale del recipiente per le misurazioni del Ca²⁺ .
   15. Sostituire la soluzione del bagno con PSS privo di reagenti a temperatura corrispondente per rimuovere l'indicatore di eccesso nel bagno. Potrebbero essere necessari diversi scambi di bagno per rimuovere l'eccesso di Fura-2, quindi ripetere questo scambio fino a quando il rapporto segnale/sfondo è di circa 10:1.
   16. Registrare il segnale di fluorescenza Fura-2 al basale e le contrazioni spontanee per circa 30 minuti, seguite da una risposta cumulativa alla concentrazione di nifedipina (NIF; 0,1-100 nM), un antagonista Ca_v1.x voltaggio-dipendente. Ottenere misurazioni di base per ogni concentrazione di farmaco.
   17. Al termine di ogni esperimento, lavare i LV con PSS privo di Ca²⁺ abbinato alla temperatura per ottenere il segnale di fluorescenza Fura-2 minimo (R_min) e il diametro massimo dei LV in assenza di Ca²⁺. Assicurati di misurare lo sfondo.
       NOTA: Il PSS privo di Ca²⁺ ha la stessa composizione del PSS ma senza CaCl₂ e l'EDTA viene sostituito con 1 mM di EGTA (C₁₄H₂₄N₂O₁₀) (pH ~7,5).
   18. Sostituire la soluzione del bagno con PSS a temperatura corrispondente contenente 10 mM di Ca²⁺ e ionomicina (10 μM IONO), uno ionoforo di Ca²⁺ , per ottenere il segnale di fluorescenza Fura-2 massimo (R_max) e il diametro minimo dei LV in condizioni di saturazione di Ca²⁺. Assicurati di misurare lo sfondo.
3. La formula per misurare l'assoluto [Ca²⁺]_i
   1. Utilizzare R_min e R_max per calibrare il rapporto tra le lunghezze d'onda di 340 e 380 nm e calcolare la concentrazione assoluta di Ca²⁺ libero citosolico ([Ca²⁺]_i).
   2. Calcolare la concentrazione assoluta di Ca²⁺ libero citosolico ([Ca²⁺]_i) utilizzando l'equazione (1)²⁶:
      (1)
      Dove K_d = 225 nM (costante di dissociazione per Fura-2)²⁶, R = rapporto 340/380, R_min = rapporto 340/380 in assenza di Ca²⁺, R_max = rapporto 340/380 con condizioni di saturazione di Ca²⁺, S_libero = segnale 380 in assenza di Ca²⁺, S_legato = segnale 380 con condizioni di saturazione di Ca²⁺
      NOTA: Tutti i segnali fluorescenti sono stati corretti per la fluorescenza di fondo.
   3. La Figura 5 è un esempio di traccia Ca²⁺ che descrive in dettaglio quali parametri vengono registrati. Definisci il Ca²⁺ basale come il Ca²⁺ a riposo più basso prima del picco di Ca²⁺ e il picco Ca²⁺ come il Ca²⁺ più alto raggiunto durante il picco di Ca²⁺ . L'ampiezza è la differenza tra il picco e la linea di base Ca²⁺. Esporta tutti i parametri direttamente dal software di imaging, ad eccezione della frequenza del picco di Ca²⁺ che deve essere calcolata offline come numero di picchi di Ca²⁺ /s. Di seguito sono riportati i passaggi chiave all'interno del software di riferimento per ottenere questi parametri.
      NOTA: Intere tracce possono essere esportate in un file .txt e tutti i parametri possono essere analizzati o calcolati nel software di vostra scelta.
   4. Per R_min, evidenziare la sezione della traccia del numeratore che corrisponde allo sfondo durante il PSS senza Ca²⁺. Verrà visualizzata una finestra di dialogo in cui verranno forniti i valori per questa parte della traccia.
   5. In Operazioni, selezionare Coscostanti.
   6. Seleziona Sfondo numerico-calcico e inserisci i numeri di sfondo per il numeratore e il denominatore del passaggio precedente. Fare clic su OK.
   7. Evidenziare la sezione della traccia del rapporto che corrisponde al rapporto più basso durante il PSS senza Ca²⁺. Questo è R_min. Prendi nota anche del valore del denominatore per questa sezione; questo è_{S gratuito}.
   8. Ripetere i passaggi da 2.3.4 a 2.3.7 per R_max e S_legati con la sezione della traccia che corrisponde a un PSS libero di Ca²⁺ elevato e al rapporto più alto.
   9. In Operazioni, selezionare Coscostanti.
   10. Selezionare Calibrazione calcio-calcio e inserire i valori elencati nell'equazione 1. Fare clic su OK.
   11. Regolare una delle tracce sullo schermo come descritto nel passaggio 2.2.8 in modo da poter vedere il calcio sottratto numerico-calcico.
   12. Eseguire un'analisi transitoria monotona per acquisire i parametri rimanenti. Per istruzioni, consultare il manuale del software³⁰.
   13. In alternativa, in Esporta selezionare Traccia corrente.
   14. Selezionare la posizione in cui si desidera esportare il file .txt e fare clic su OK.
       NOTA: Assicurati di fare clic sulla singola traccia che desideri esportare. È possibile esportare l'intera traccia o sezioni selezionate della traccia.

3. Misura della contrattilità e della ritmicità del ventricolo sinistro

1. Il software di rilevamento dei bordi incorporato nel sistema di imaging genera tracce contrattili per le misure del diametro del ventricolo sinistro come descritto sopra. Utilizzare queste misurazioni per analizzare i parametri contrattili e di ritmicità. La Figura 4 è un esempio di traccia contrattile che descrive in dettaglio quali parametri contrattili devono essere registrati. Esporta tutti i parametri direttamente dal software di imaging utilizzando la funzione di analisi transitoria monotonica sulla traccia del diametro³⁰, ad eccezione della frequenza delle contrazioni, del flusso calcolato e dell'intervallo, che devono essere calcolati offline.
   NOTA: Intere tracce possono essere esportate in un file .txt e tutti i parametri possono essere analizzati o calcolati nel software di tua scelta utilizzando le equazioni seguenti.
2. EDD, ESD, ampiezza, frequenza e misure di flusso calcolate
   1. Misurare i diametri massimo e minimo (diametro telediastolico [EDD] e diametro telesistolico [ESD], rispettivamente) che i ventricolati sinistro possono raggiungere durante le loro contrazioni ritmiche e spontanee.
   2. Calcola l'ampiezza delle contrazioni (AMP) come differenza tra EDD ed ESD.
   3. Calcolare la frequenza come numero di contrazioni per periodo di misurazione (in s).
   4. Calcolare la portata calcolata per μm utilizzando l'equazione (2):
      Flusso calcolato = π/4(EDD²- ESD²)F (2)
      Dove EDD² = area della sezione trasversale del vaso durante lo stato di rilassamento, ESD² = misura dell'area della sezione trasversale del vaso durante la costrizione, F = frequenza delle contrazioni
3. Ritmicità: tempo di contrazione e rilassamento:
   1. Altre misure della ritmicità del ventricolo sinistro sono il tempo di contrazione e il tempo di rilassamento.
   2. Definisci il tempo di contrazione come il tempo impiegato dal ventricolo sinistro per raggiungere l'ESD ad ogni contrazione.
   3. Definire il tempo di rilassamento come il tempo impiegato dal ventricolo sinistro per raggiungere l'EDD per ogni rilassamento, che darà un'indicazione complessiva della ritmicità correlata con _[Ca²⁺]i assoluto entro un determinato intervallo di tempo.
   4. Calcola l'intervallo di tempo (ΔT) dall'equazione (3).
      Δt = t2 _(ESD2)-t1 _(ESD1) (3)

Risultati

La contrattilità dei LV e le corrispondenti alterazioni del Ca²⁺ libero citosolico ([Ca²⁺]_i) sono state valutate in LV mesenterici isolati di ratto dopo esposizione a concentrazioni variabili di nifedipina (NIF; 0,1-100 nM) (Figura 6). I parametri, tra cui l'ampiezza del picco di Ca²⁺, il Ca²⁺ al basale e il picco di Ca²⁺, hanno mostrato una riduzione dipendente dalla concentrazione con l'aggiunta incrementale di NIF alla camera di perfusione (Figura 7A). Allo stesso tempo, anche i parametri contrattili come l'ampiezza della contrazione e il flusso calcolato hanno dimostrato una diminuzione graduale (Figura 7B). C'è stato un piccolo aumento del diametro dell'EDD con NIF (Figura 7B). La frequenza di picco e la frequenza di contrazione di Ca²⁺ sembrano essere una risposta tutto o nessuno. Tuttavia, questo effetto si è verificato a 10 nM per un ventricolo sinistro, mentre tutti i ventricolati sinistro avevano cessato le contrazioni entro 100 nM. Pertanto, i dati combinati generano grafici che assomigliano a una risposta di concentrazione graduale. Questo effetto è coerente con le precedenti pubblicazioni che utilizzavano il NIF sui ventricolati sinistro in altre preparazioni (miografia a filo e a pressione^13,14). I grafici di Manhattan mostrano le risposte individuali del ventricolo sinistro per le misure di ritmicità, tra cui intervallo, tempo di contrazione e tempo di rilassamento (Figura 7C). Questo tipo di rappresentazione dei dati consente al ricercatore di individuare queste risposte tutte o nessuna o la variabilità dei ritmi di contrazione per fornire ulteriori informazioni sui meccanismi sottostanti. In definitiva, le diminuzioni dell'ampiezza e della frequenza di contrazione hanno comportato una riduzione del flusso calcolato attraverso questi LV isolati, che funge da indicatore surrogato della funzione in vivo. Nel complesso, il declino della contrattilità del ventricolo sinistro è correlato alla riduzione di [Ca²⁺]_i. I nostri risultati forniscono la prova diretta che entro l'intervallo di 100 nM, il NIF ha efficacemente fermato le contrazioni e le oscillazioni [Ca²⁺]_i nei LV antagonizzando i canali Ca_v1.x presenti nelle cellule del muscolo linfatico (LMC).

Figura 1: Immagine della configurazione della camera del recipiente isolato. Gli studi di perfusione dei vasi hanno utilizzato una camera dei vasi isolata dotata di un termoregolatore. La gravità è stata utilizzata per controllare la pressione tramite un serbatoio PSS. La pressione è stata monitorata da trasduttori collegati sia alle cannule di ingresso (P1) che di uscita (P2). Abbreviazione: PSS = soluzione salina fisiologica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Preparazione del nodo a colpo d'occhio. (A) Preparazione a doppio anello al microscopio di dissezione utilizzando un singolo filamento di filo di sutura di seta a 3 strati, (B) afferrando l'estremità libera e tirandola attraverso entrambi gli anelli, (C) tirando il nodo da entrambe le estremità per mantenere una piccola apertura e (D) tagliando il filamento in eccesso da entrambi i lati e la scatola blu che mostra un doppio nodo overhand completo pronto per l'uso. Barra della scala = 1,5 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Schema del flusso di lavoro sperimentale per l'acquisizione dei dati. Un ratto sano è stato anestetizzato con induzione di isoflurano al 5% ed è stata eseguita la decapitazione per rimuovere il sangue del tronco. È stata eseguita un'incisione sulla linea mediana per esporre e isolare il mesentere. Il mesentere isolato è stato steso in una soluzione di PSS ghiacciata e un LV è stato sezionato senza grasso per l'incannulamento in una camera di perfusione del vaso isolato. Il bagno è stato posizionato sul tavolino del microscopio invertito utilizzando una lente obiettivo 20x. La nave è stata eccitata alternativamente con luce di lunghezza d'onda di 340 e 380 nm e gli spettri fluorescenti di emissione sono stati raccolti utilizzando una telecamera CCD a 510 nm. Il computer collegato al microscopio ha generato le tracce contrattili e di Ca²⁺ utilizzando il software di acquisizione della fluorescenza e di imaging a rilevamento dei bordi. Barra della scala = 1 mm. Abbreviazioni: PSS = soluzione salina fisiologica; LV = vaso linfatico; CCD = dispositivo ad accoppiamento di carica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Traccia contrattile rappresentativa del ventricolo sinistro. (A) Esempio di registrazione delle variazioni di diametro dei ventricolati ventricolari cannulati caricati con l'indicatore di imaging Ca²⁺ Fura 2 AM in PSS e (B) una traccia ingrandita per mostrare tutti i parametri relativi alla contrattilità del vaso: EDD, ESD, AMP e frequenza. Questi valori sono stati utilizzati per calcolare la ritmicità e il flusso. Abbreviazioni: PSS = soluzione salina fisiologica; LV = vaso linfatico; EDD = diametro telediastolico; ESD = diametro telesistolico; AMP = ampiezza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Traccia rappresentativa dell'imaging del Ca²⁺ del ventricolo sinistro. (A) Esempio di registrazione delle variazioni di [Ca²⁺]_i assoluto nei ventricolari ventricolari cannulati caricati con Fura-2 in PSS e (B) una traccia ingrandita per mostrare tutti i parametri (picco, ampiezza e linea di base) relativi a [Ca²⁺]_i (non corretto in background). Abbreviazione: PSS = soluzione salina fisiologica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Contrattilità ventricolare sinistra e imaging del Ca²⁺ a colpo d'occhio. Tracce rappresentative corrispondenti a (A) diametro, (B) rapporto 340/380 e (C) assoluto [Ca²⁺]_i di PSS basale, nifedipina, un antagonista del canale Ca_v1.x (Ca²⁺), risposta alla concentrazione, inclusi R_min e R_max. Abbreviazioni: PSS = soluzione salina fisiologica; LV = vaso linfatico; NIF = nifedipina; R_min = segnale di fluorescenza Fura-2 minimo; R_max = segnale di fluorescenza Fura-2 massimo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Oscillazione del Ca²⁺ e corrispondente contrattilità bloccata dalla nifedipina nei LV. (A) I parametri del Ca²⁺ (n = 3) e (B) contrattile (n = 3) sono diminuiti in modo concentrazione-dipendente con l'aggiunta di nifedipina, un antagonista del canale Ca_v1.x (Ca²⁺) voltaggio-dipendente. (C) I grafici rappresentativi di Manhattan mostrano l'intervallo medio di tempo (Δt) tra le contrazioni e i tempi di contrazione e rilassamento. Dati presentati come media ± SEM. Abbreviazioni: PSS = soluzione salina fisiologica; LV = vaso linfatico; NIF = nifedipina; EDD = diametro telediastolico; AMP = ampiezza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

A causa della natura fragile e minuscola dei ventricolari, è imperativo prestare la massima attenzione durante i processi di dissezione e incannulamento. Anche un danno lieve al recipiente potrebbe portare allo sviluppo di un ventricolo sinistro non vitale o dare origine ad anomalie nei transitori [Ca²⁺]_i . La coerenza nelle impostazioni di eccitazione è altrettanto cruciale durante l'intera serie sperimentale per garantire la comparabilità nelle misure di [Ca²⁺]_i tra i gruppi di controllo e quelli trattati. Il mancato mantenimento di impostazioni uniformi comporta un rischio sostanziale di sovrastima o sottostima di [Ca²⁺]_i tra i recipienti all'interno di una serie sperimentale. Allo stesso modo, è altrettanto importante identificare e monitorare con precisione la stessa regione del vaso durante ogni esperimento.

L'uso dell'indicatore raziometrico Fura-2AM normalizza le variazioni di fluorescenza causate da uno spessore irregolare dei tessuti, dalla distribuzione/perdita di fluorofori o dal fotosbiancamento, problemi comuni con i coloranti a lunghezza d'onda singola. ³¹ Ciò consente il monitoraggio continuo descritto in questo protocollo. Tuttavia, poiché Fura-2 agisce chelando il Ca²⁺, è possibile sovraccaricare i LV e ridurre il [Ca²⁺]_i disponibile per la contrazione o la risposta al farmaco. In questi casi, si possono ancora osservare picchi di Ca²⁺ mentre le contrazioni ritmiche sono assenti. Anche la variazione della lunghezza del ventricolo sinistro può contribuire a questo fenomeno. Mentre queste misurazioni di Ca²⁺ potrebbero probabilmente essere ancora valide, potrebbe essere necessario ridurre la concentrazione di Fura-2AM in configurazioni replicate per ottenere con successo sia le misure di Ca²⁺ che quelle di diametro. I nostri risultati includono solo i LV per i quali erano presenti sia picchi di Ca²⁺ che contrazioni ritmiche al basale.

La misurazione di R_min e R_max sono passaggi critici nel calcolo dell'assoluto [Ca²⁺]_i. Poiché R_min dovrebbe essere il rapporto Fura-2 in assenza di Ca²⁺, un'alta concentrazione di EGTA è stata aggiunta al PSS libero da Ca²⁺ per garantire la chelazione di qualsiasi residuo di Ca²⁺. Gli studi iniziali sono stati condotti con EDTA nel PSS libero da Ca²⁺, e ciò ha portato a contrazioni sporadiche dei vasi con corrispondenti picchi di Ca²⁺ . Per R_max, un'alta concentrazione di Ca²⁺ è stata aggiunta al PSS insieme a uno ionoforo, la ionomicina, per massimizzare il segnale [Ca²⁺]_i . La soluzione ad alto contenuto di Ca²⁺ può precipitare, il che può richiedere la rimozione dell'EDTA dal PSS. È importante sottolineare che queste misurazioni aggiuntive di R_min e R_max offrono l'opportunità di valutare cambiamenti fisiologicamente rilevanti in [Ca²⁺]_i, che possono fornire informazioni sui meccanismi di eccitabilità e contrattilità^{della membrana 27} e consentire confronti di base tra i gruppi sperimentali rispetto ai protocolli che riportano solo un rapporto 340/380 per Fura-2. Il mancato raggiungimento di valori adeguati di R_min e R_max preclude la capacità di calcolare l'assoluto [Ca²⁺]_i.

A causa della natura contrattile dei LV, questo metodo può fornire solo una misura dei livelli globali di Ca²⁺ piuttosto che gli eventi di rilascio locale di Ca²⁺ che possono essere misurati nei vasi paralizzati³². Tuttavia, questo metodo è vantaggioso per correlare i cambiamenti nella dinamica assoluta [Ca²⁺]_i con la contrattilità rispetto ai metodi che utilizzano vasi paralizzati o singole cellule^28,32. Per questo approccio, si presume che la maggior parte del Ca²⁺ misurato provenga dalle cellule muscolari linfatiche. Tuttavia, le cellule endoteliali, che sono presenti anche in questi LV isolati, possono contribuire al segnale totale di Ca²⁺ osservato³³. Questo contributo potrebbe essere stimato utilizzando LV che sono stati denudati dell'endotelio³⁴. Le contrazioni del ventricolo sinistro possono anche causare uno spostamento leggero della parete del vaso verso l'interno e verso l'esterno durante il ciclo di contrazione. Pertanto, è importante utilizzare segmenti di vaso corti che possono essere tesi ma senza allungare il vaso.

Oltre alla sua applicazione nei LV, questo metodo potrebbe essere utilizzato per studiare vasi isolati da altri letti vascolari, comprese arteriole e vene, ed è promettente per un potenziale utilizzo in neurobiologia e in altre branche della biologia vascolare. Esplorare gli effetti di vari agonisti o antagonisti che prendono di mira diverse vie di trasduzione del segnale è un'altra strada per studiare la dinamica sottostante del Ca²⁺ . Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata anche per ricerche comparative che coinvolgono campioni di controllo e trattati dai rispettivi animali. Inoltre, questo approccio è adattabile per l'implementazione a livello cellulare, come nelle cellule muscolari linfatiche isolate, che richiedono regolazioni minime della camera di perfusione e degli obiettivi del microscopio. In sintesi, questo metodo fornisce informazioni fisiologicamente rilevanti sulla dinamica globale del Ca²⁺ in quanto è correlata alla contrattilità e alla ritmicità nei LV e fornisce una solida valutazione dei potenziali regolatori della dinamica del Ca²⁺ nella raccolta dei LV.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Obiettivo di fluorazione 20x S	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, Stati Uniti)	UPlanSApo
Micropipette in vetro borosilicato Living	Systems Instrumentation (Burlington, VT, Stati Uniti)	GCP-75-100
Cloruro di calcio (CaCl2)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Stati Uniti)	BP510-500
Anidride carbonica (CO2)	nexAir (Memphis, TN, Stati Uniti)	UN3156
Pinze per dissezione	Strumenti per la scienza fine (Foster City, CA, Stati Uniti)	11254-20
EDTA (C10H16N2O8)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Stati Uniti)	BP118-500
EGTA (C14H24N2O10)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Stati Uniti)	O2783-100
Fura-2AM	Invitrogen (Waltham, MA, Stati Uniti)	F1221
Glucosio (C6H12O6)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Stati Uniti)	D16-500
Regolatore di pressione alimentato a gravità	realizzato su misura in laboratorio
Unità di riscaldamento	Sistemi viventi Strumentazione (Burlington, VT, Stati Uniti)	TC-09S
Software di imaging	IonOptix (Westwood, MA, Stati Uniti)
Microscopio a fluorescenza invertita	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, Stati Uniti)	IX73
Ionomicina	Invitrogen (Waltham, MA, Stati Uniti)	I24222
IonOptix Cell Framing Adaptor	IonOptix (Westwood, MA, Stati Uniti)	665 DXR
Isoflurane	Piramal Critical Care (Telangana, India)	NDC 66794-017-10
Camera di perfusione del vaso isolato	Sistemi viventi Strumentazione (Burlington, VT, Stati Uniti)	CH-1
Pinze per la preparazione dei nodi	Strumenti di scienza fine (Foster City, CA, Stati Uniti)	11253-20
Sorgente luminosa a LED	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, Stati Uniti)	TL4
Solfato di magnesio (MgSO4)	Acros Organics (New Jersey, NJ, Stati Uniti)	213115000
Sistema video CMOS veloce MyoCam-S3	IonOptix (Westwood, MA, Stati Uniti)	MCS300
Nifedipina	Sigma (St. Louis, MO, Stati Uniti)	N7634
Suture
Ossigeno (O2)	nexAir (Memphis, TN, Stati Uniti)	UN1072
Acido pluronico	Sigma (St. Louis, MO, Stati Uniti)	P2443
Cloruro di potassio (KCl)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Stati Uniti	BP366-500
Sistema di monitoraggio della pressione	Strumentazione per sistemi viventi (Burlington, VT, Stati Uniti)	di pressione PM-4
	Strumentazione per sistemi viventi (Burlington, VT, Stati Uniti)	PT-F
Piastra di Petri rivestita in silicone	realizzata su misura in laboratorio
Bicarbonato di sodio (NaHCO3)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Stati Uniti	BP328-500
Cloruro di sodio (NaCl)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Stati Uniti	BP358-212
Fosfato di sodio (NaH2PO4)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Stati Uniti	BP329-500
Ratti Sprague-Dawley	Envigo RMS (Indianapolis, IN, USA)	Stereomicroscopio maschio	di 9-13 settimane
	Leica Microsystems (Wetzlar, Germania)	Forbici a molla S9D
Vannas	Fine Science Tools (Foster City, CA, Stati Uniti)	15000-03