Questo protocollo delinea le fasi dettagliate della microscopia immunoelettronica pre-incorporamento, con particolare attenzione all'esplorazione dei circuiti sinaptici e della localizzazione delle proteine nella retina.
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Articolo metodologico
Studio dei circuiti retinici e della localizzazione molecolare mediante microscopia immunoelettronica pre-incorporata
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La retina comprende numerose cellule che formano diversi circuiti neuronali, che costituiscono il primo stadio del percorso visivo. Ogni circuito è caratterizzato da caratteristiche uniche e neurotrasmettitori distinti, che ne determinano il ruolo e il significato funzionale. Dati gli intricati tipi di cellule all'interno della sua struttura, la complessità dei circuiti neuronali nella retina pone sfide per l'esplorazione. Per studiare meglio i circuiti retinici e il cross-talk, come il legame tra le vie del cono e dei bastoncelli, e la precisa localizzazione molecolare (neurotrasmettitori o neuropeptidi), come la presenza di immunoreattività P-like nella retina del topo, abbiamo impiegato un metodo di microscopia immunoelettronica pre-incorporante (immuno-EM) per esplorare le connessioni sinaptiche e l'organizzazione. Questo approccio ci consente di individuare specifiche connessioni sinaptiche intercellulari e una precisa localizzazione molecolare e potrebbe svolgere un ruolo guida nell'esplorazione della sua funzione. Questo articolo descrive il protocollo, i reagenti utilizzati e i passaggi dettagliati, tra cui (1) preparazione della fissazione della retina, (2) immunocolorazione pre-inclusione e (3) post-fissazione e inclusione.
Introduzione
La complessità dei circuiti neuronali nella retina presenta sfide per l'esplorazione, considerando i diversi tipi di cellule all'interno della sua struttura 1,2. La fase iniziale prevede l'identificazione delle connessioni sinaptiche tra le diverse cellule e la determinazione della localizzazione cellulare di specifici neurotrasmettitori o neuropeptidi. Con l'avanzare della biologia molecolare che introduce nuove proteine, la localizzazione precisa nella retina diventa fondamentale per comprendere le loro funzioni e analizzare i circuiti retinici e le connessioni sinaptiche
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Protocollo
La cura e la gestione degli animali sono state approvate dal regolamento del Comitato etico dell'Università di medicina di Wenzhou in conformità con le linee guida ARVO. In questa ricerca sono stati utilizzati topi adulti (C57BL/6J, maschio e femmina, da 8 a 12 settimane di età). L'attrezzatura e i reagenti necessari per lo studio sono elencati nella tabella dei materiali.
1. Preparazione per la fissazione della retina
- Assembla i seguenti materiali e strumenti: un microscopio da dissezione, due pinze con punte molto sottili, forbici, un ago per siringa da 1 ml (mi....
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Risultati
La Figura 1 mostra esempi di esperimenti di controllo senza l'incubazione di anticorpi primari contro la proteina chinasi C alfa (PKCα) o SP, in cui non è stata trovata alcuna immunoreattività (IR).
La Figura 2 illustra la PKCα-IR nella retina del topo. PKCα funge da marcatore per tutte le cellule bipolari dei bastoncelli (RBC) nella retina18. A livello di microscopia elettronica (EM), i globuli rossi possono e.......
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Discussione
Questo articolo ha descritto tre passaggi critici per il successo dell'osservazione dei circuiti sinaptici e della localizzazione delle proteine: (1) fissazione rapida e debole, (2) immunocolorazione pre-inclusione e (3) post-fissazione e inclusione.
Proponiamo che la fissazione sia il passo chiave per un approccio immuno-EM pre-incorporamento di successo. Pertanto, qui viene sottolineata l'importanza del fissativo fresco e della fissazione rapida, denominando.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno divulgazioni.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni del National Key Research and Development Program of China (2022YFA1105503), dello State Key Laboratory of Neuroscience (SKLN-202103), della Zhejiang Natural Science Foundation of China (Y21H120019).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 mL ago per siringa | kangdelai | ||
| 1% OsO4 | Microscopia elettronica | Scienza 19100 | |
| 2,2,2-Tribromoetanolo | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 8% Glucotaldeide | Microscopia elettronica | Scienza 16020 | |
| 8% Paraformaldeide | Microscopia elettronica Scienza | 157-8 | |
| Acetone Microscopia Elettronica Scienza | 10000 | ||
| Anti-coniglio PKC | Sigma-Aldrich | P4334 | |
| Anti-Coniglio SP | Abcam | ab67006 | |
| DAB Kit substrato | MXB Biotecnologie | KIT-9701/9702/9703 | |
| Forbici per gomito | Suzhou66 vision company | 54010 | |
| Microscopio elettronico | Phillips | CM120 | |
| Resina Epon | Microscopia elettronica | Scienza 14910 | |
| pinza | Suzhou66 vision company | S101A | |
| Carta da filtro Millipore | Merck Millipore | ||
| Na2HPO4· 12H2O | Sigma | 71650 | Un componente del tampone fosfato |
| NaH2PO4· H2O | Sigma | 71507 | Un componente del tampone fosfato |
| Acido picrico | Microscopia elettronica Scienza | 19550 | |
| Boroidruro di sodio (NaBH4) | Sigma | 215511 | |
| Tris | Solarbio | 917R071 | |
| Ultramicrotomo | Leica | ||
| Uranile acetato | Microscopia elettronica Science | 22400 | |
| VACTASTAIN ABC kit, Perossidasi (IgG di coniglio) | Vector Laboratories | PK-4001 |
Riferimenti
- Chua, N. J., et al. A complete reconstruction of the early visual system of an adult insect. Curr Biol. 33 (21), 4611-4623.e4614 (2023).
- Ravi Chander, P., Hanson, L., Chundekkad, L., Awatramani, G. B. Neural circuits underlying multi-feature extraction in the retina. J....
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Ristampe e permessi
