Qui, presentiamo un protocollo che utilizza l'ibridazione in situ a fluorescenza fototermica ottica a infrarossi (OPTIR-FISH), nota anche come FISH fototermica nel medio infrarosso (MIP-FISH), per identificare le singole cellule e comprenderne il metabolismo. Questa metodologia può essere ampiamente applicata per diverse applicazioni, tra cui la mappatura del metabolismo cellulare con la risoluzione di una singola cellula.
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Articolo metodologico
Ibridazione in situ a fluorescenza infrarossa fototermica ottica (OPTIR-FISH)
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Comprendere le attività metaboliche delle singole cellule all'interno di comunità complesse è fondamentale per svelare il loro ruolo nelle malattie umane. Qui, presentiamo un protocollo completo per l'identificazione cellulare simultanea e l'analisi metabolica con la piattaforma OPTIR-FISH combinando sonde FISH marcate con rRNA e substrati marcati con isotopi. L'imaging a fluorescenza fornisce l'identificazione cellulare mediante il legame specifico di sonde FISH marcate con rRNA, mentre l'imaging OPTIR fornisce attività metaboliche all'interno di singole cellule mediante spostamento verso il rosso indotto da isotopi sugli spettri OPTIR. Utilizzando batteri coltivati con 13C-glucosio come banco di prova, il protocollo delinea la coltura microbica con marcatura isotopica, ibridazione in situ a fluorescenza (FISH), preparazione del campione, ottimizzazione della configurazione di imaging OPTIR-FISH e acquisizione dei dati. Dimostriamo anche come eseguire l'analisi delle immagini e interpretare i dati spettrali a livello di singola cella con un'elevata produttività. La natura standardizzata e dettagliata di questo protocollo faciliterà notevolmente la sua adozione da parte di ricercatori provenienti da diversi background e discipline all'interno dell'ampia comunità di ricerca sul metabolismo a singola cellula.
Introduzione
Il metabolismo cellulare è un pilastro fondamentale della biologia cellulare, che guida molti processi che determinano la salute, la funzione e l'interazione delle cellule con l'ambiente. L'analisi del metabolismo a livello di singola cellula, in particolare all'interno degli ambienti nativi, fornisce informazioni preziose per rivelare le attività eterogenee e complesse nei sistemi biologici1. Ciò è particolarmente cruciale nello studio dei microrganismi, poiché molti microbi mostrano requisiti di crescita unici o dipendenze ambientali che sfidano i metodi di coltivazione tradizionali2. ....
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Protocollo
L'uso di campioni batterici in questo studio è conforme alle linee guida dell'Institutional Review Board (IRB) della Boston University e del National Institute of Health.
NOTA: Il flusso di lavoro generale seguito in questo protocollo è riassunto nella Figura 2.
1. Coltura batterica e marcatura isotopica (Figura 2A)
NOTA: L'esempio qui fornito è per l'etichettatura di una coltura batterica pura. Se si applica questo protocollo alle comunità polimicrobiche, il me....
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Risultati
Il flusso di lavoro generale per l'analisi metabolica microbica a singola cellula con identificazione genetica mediante OPTIR-FISH è riassunto in Figura 2. I risultati rappresentativi che dimostrano la capacità di imaging metabolico a singola cellula di OPTIR sono mostrati in Figura 3. Questo esempio ha utilizzato cellule di E. coli incubate con 12C- o 13C-glucosio per 24 ore. L'incorporazione di 13È stato dimostrato che C in pro.......
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Discussione
Qui, abbiamo descritto un protocollo dettagliato per l'applicazione della piattaforma OPTIR-FISH per l'identificazione simultanea di specie microbiche e la quantificazione delle attività metaboliche alla risoluzione di una singola cellula. Le fasi critiche includono la coltura con marcatura di isotopi stabili per lo studio di specifiche attività metaboliche e l'ibridazione in situ a fluorescenza per l'identificazione di specie microbiche bersaglio. L'imaging a fluorescenza multi.......
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Dichiarazioni
Y.B. è un consulente part-time per Photothermal Spectroscopy Corp.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health R35GM136223, R01AI141439 a J.X.C.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 96% Etanolo | ThermoScientific | T032021000 | |
| Fluoruro di calcio | Crystran | CAFP10-0.35 | |
| D-(+)-glucosio | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| D-Gluocose (U-13C6, 99%) | Cambridge Isotopic Laboratories | CLM-1396-1 | |
| Acido etilendiamminotetraacetico | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
| formamide | ThermoScientific | 17899 | |
| Luria-Bertani brodo | Sigma-Aldrich | L3522-250G | |
| M9 Sali minimi 5x | SIGMA | M6030-1KG | |
| Strumento OPTIR | Spettroscopia fototermica Corp. | mIRage LS | |
| Soluzione di paraforaldeide, 4% in PBS | ThermoScientific | J19943-K2 | |
| soluzione di poli-L-lisina 0,1% (p/v) | Sigma-Aldrich | P8920-500ML | |
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| Sodio dodecil solfato | Sigma-Aldrich | L3771-25G | |
| Tris(idrossimetil)amminometano cloridrato, 99+% | ThermoScientific | A11379.18 | |
| Brodo di soia Trypic | Sigma-Aldrich | 22092-500G |
Riferimenti
- Evers, T. M. J., et al. Deciphering metabolic heterogeneity by single-cell analysis. Anal Chem. 91 (21), 13314-13323 (2019).
- Overmann, J., Abt, B., Sikorski, J. Present and future of culturing bacteria. Annu Rev Microbiol. 71, 711-730 (2017).
- Epstein, S.
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Ristampe e permessi
