Articolo metodologico

Ibridazione in situ a fluorescenza infrarossa fototermica ottica (OPTIR-FISH)

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DOI:

10.3791/66562

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23 febbraio 2024

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1Department of Biomedical Engineering, Boston University, 2Neuroscience Research Institute, Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of California Santa Barbara, 3Photothermal Spectroscopy Corp., 4School of Biological Sciences, University of Southampton, 5Department of Electrical & Computer Engineering, Photonics Center, Boston University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo che utilizza l'ibridazione in situ a fluorescenza fototermica ottica a infrarossi (OPTIR-FISH), nota anche come FISH fototermica nel medio infrarosso (MIP-FISH), per identificare le singole cellule e comprenderne il metabolismo. Questa metodologia può essere ampiamente applicata per diverse applicazioni, tra cui la mappatura del metabolismo cellulare con la risoluzione di una singola cellula.

Abstract

Comprendere le attività metaboliche delle singole cellule all'interno di comunità complesse è fondamentale per svelare il loro ruolo nelle malattie umane. Qui, presentiamo un protocollo completo per l'identificazione cellulare simultanea e l'analisi metabolica con la piattaforma OPTIR-FISH combinando sonde FISH marcate con rRNA e substrati marcati con isotopi. L'imaging a fluorescenza fornisce l'identificazione cellulare mediante il legame specifico di sonde FISH marcate con rRNA, mentre l'imaging OPTIR fornisce attività metaboliche all'interno di singole cellule mediante spostamento verso il rosso indotto da isotopi sugli spettri OPTIR. Utilizzando batteri coltivati con 13C-glucosio come banco di prova, il protocollo delinea la coltura microbica con marcatura isotopica, ibridazione in situ a fluorescenza (FISH), preparazione del campione, ottimizzazione della configurazione di imaging OPTIR-FISH e acquisizione dei dati. Dimostriamo anche come eseguire l'analisi delle immagini e interpretare i dati spettrali a livello di singola cella con un'elevata produttività. La natura standardizzata e dettagliata di questo protocollo faciliterà notevolmente la sua adozione da parte di ricercatori provenienti da diversi background e discipline all'interno dell'ampia comunità di ricerca sul metabolismo a singola cellula.

Introduzione

Il metabolismo cellulare è un pilastro fondamentale della biologia cellulare, che guida molti processi che determinano la salute, la funzione e l'interazione delle cellule con l'ambiente. L'analisi del metabolismo a livello di singola cellula, in particolare all'interno degli ambienti nativi, fornisce informazioni preziose per rivelare le attività eterogenee e complesse nei sistemi biologici1. Ciò è particolarmente cruciale nello studio dei microrganismi, poiché molti microbi mostrano requisiti di crescita unici o dipendenze ambientali che sfidano i metodi di coltivazione tradizionali2. Ad esempio, alcune specie possono richiedere composizioni nutritive specifiche o relazioni simbiotiche non facilmente replicabili in un ambiente di laboratorio, rendendole così non coltivabili con le tecniche standard3. Inoltre, i lunghi periodi necessari per la coltivazione di alcune specie pongono sfide significative per la ricerca microbiologica, che spesso si estendono oltre i tempi pratici per lo studio e l'analisi. Per aggirare queste limitazioni, metodi alternativi come la reazione a catena della polimerasi e l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) consentono l'identificazione di specie microbiche senza la necessità di coltivarle4, il che può ottenere una visione più accurata e olistica degli ecosistemi microbici. Tuttavia, queste tecnologie analitiche non hanno la capacità di chiarire il metabolismo cellulare. Questa lacuna evidenzia le sfide in corso nel campo della microbiologia: il compito concomitante di differenziare l'identità cellulare e chiarire il metabolismo a livello di singola cellula. I progressi in tecniche come la spettrometria di massa per immagini (IMS) accoppiata con isotopi stabili sono emersi come potenti strumenti per l'analisi metabolica a singola cellula5. In questi esperimenti, le cellule sono state incubate con substrati contenenti isotopi come 13C o 15N. Le biomolecole appena anabolizzate trasportano questi isotopi, rendendoli distinguibili sugli spettri m/z. Tuttavia, l'IMS soffre di strumentazione costosa, preparazione del campione complicata, produttività relativamente bassa e competenze necessarie per l'analisi degli spettri m/z. In combinazione con l'imaging a fluorescenza specifico per marcatore molecolare, sono stati compiuti progressi nel chiarire il metabolismo cellulare con una maggiore specificità6. Ciononostante, persistono sfide nel collegare queste due modalità. La differenza di risoluzione tra l'IMS e l'imaging a fluorescenza, combinata con diverse configurazioni operative, rende difficile allineare e correlare i risultati7.

L'integrazione dell'imaging spettroscopico vibrazionale con la marcatura di isotopi stabili offre una nuova soluzione per lo studio del metabolismo di una singola cellula. L'incorporazione di isotopi più pesanti rallenta la vibrazione dei legami chimici, portando a picchi spostati verso il rosso negli spettri vibrazionali8. In particolare, l'imaging vibrazionale fornisce una risoluzione spaziale paragonabile all'imaging a fluorescenza e sia la quantificazione metabolica che l'identificazione cellulare possono essere eseguite in un'unica configurazione, semplificando la registrazione e la correlazione delle immagini. Il nostro recente lavoro ha dimostrato la combinazione di una piattaforma avanzata di imaging vibrazionale: l'infrarosso fototermico ottico (OPTIR) con l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) per sondare il metabolismo del glucosio nelle comunità batteriche9 (Figura 1). OPTIR è un sistema di microscopia spettroscopica vibrazionale che sfrutta l'effetto fototermico dell'assorbimento del medio infrarosso rilevando il cambiamento della luce visibile, che fornisce una risoluzione sub-micrometrica come nella microscopia ottica ma con le informazioni spettroscopiche vibrazionali aggiuntive originate dall'assorbimento del medio infrarosso. La FISH è una tecnica comunemente usata per determinare l'identità del microrganismo a livello di singola cellula. La sequenza di oligonucleotidi potrebbe essere progettata per colpire specifiche sequenze 16S di diversi taxa e potrebbero essere attaccati diversi fluorofori. L'ibridazione specifica delle sonde oligonucleotidiche progettate con l'rRNA bersaglio porta a forti segnali di fluorescenza delle specie bersaglio all'interno delle singole cellule e l'imaging a fluorescenza multicanale potrebbe essere eseguito per identificare più specie all'interno della popolazione. Poiché sia l'OPTIR che l'imaging a fluorescenza si basano sul rilevamento ottico, la combinazione di fluorescenza OPTIR e FISH è semplice da implementare. Le due modalità condividono la stessa risoluzione ottica per l'analisi di singole cellule e possono essere commutate comodamente senza richiedere ulteriori allineamenti o co-registrazioni.

Questo protocollo presenta una guida dettagliata all'utilizzo della piattaforma OPTIR-FISH per l'analisi avanzata della funzione e della struttura di una singola cellula. Abbiamo utilizzato i campioni batterici cresciuti in terreni contenenti 13C-glucosio come banco di prova e quantificato la sintesi proteica de novo dal 13C-glucosio. Al fine di dimostrare la capacità della piattaforma di identificare le cellule, abbiamo utilizzato miscele batteriche in cui ogni specie è stata marcata utilizzando sonde FISH mirate all'rRNA. Questo approccio ha facilitato l'identificazione precisa di ceppi batterici specifici, come Escherichia coli (E. coli) e Bacteroides thetaiotaomicron (B. theta), e il loro metabolismo. Questo protocollo offre ai ricercatori un potente strumento per la profilazione metabolica simultanea e l'identificazione delle specie a livello di singola cellula, promettendo di far progredire la nostra comprensione delle interazioni cellulari, della fisiologia e dei loro ruoli in ambienti complessi.

Protocollo

L'uso di campioni batterici in questo studio è conforme alle linee guida dell'Institutional Review Board (IRB) della Boston University e del National Institute of Health.

NOTA: Il flusso di lavoro generale seguito in questo protocollo è riassunto nella Figura 2.

1. Coltura batterica e marcatura isotopica (Figura 2A)

NOTA: L'esempio qui fornito è per l'etichettatura di una coltura batterica pura. Se si applica questo protocollo alle comunità polimicrobiche, il mezzo e il tempo di marcatura devono essere regolati in base alla comunità e alla fisiologia degli organismi di interesse.

  1. Inoculare il ceppo batterico di interesse da una singola colonia e precoltura in un terreno ricco di sostanze nutritive come il brodo di soia triptico (TSB) o il brodo di Luria-Bertani (LB) per 3 ore per raggiungere la fase di crescita esponenziale (log). Coli BW25113 viene utilizzato come ceppo di esempio in questo protocollo.
    NOTA: Il tempo per raggiungere la fase di log varierà in base al ceppo in uso. Questo tempo deve essere adattato per ogni varietà.
  2. Misurare la densità ottica a 600 nm per stimare la concentrazione batterica.
  3. Preparare un terreno di coltura minimo integrato con substrati marcati isotopicamente. Per E . coli BW25113, integrare il terreno minimo M9 con 13C-glucosio a una concentrazione finale dello 0,2% (p/v).
    NOTA: Il 13C-glucosio utilizzato (D-glucosio U-13C6, 99%) è stato universalmente marcato, dove tutti gli atomi di carbonio sono stati sostituiti con 13atomi di C. La scelta del terreno di crescita minimo dipenderà dal ceppo batterico. La scelta del substrato isotopico dipenderà dallo specifico processo metabolico di interesse. L'obiettivo generale è che il substrato isotopico serva come principale fonte di nutrimento rispetto alle loro controparti non marcate.
  4. Diluire i batteri nel terreno di coltura minimo contenente il substrato marcato isotopicamente a una concentrazione finale di 5 × 105 CFU/mL.
    NOTA: Di solito, viene utilizzato un rapporto di diluizione elevato come 1:100 e la nutrizione non etichettata dal terreno ricco diventa trascurabile. In alternativa, per garantire la completa rimozione del terreno ricco di sostanze nutritive, è possibile eseguire un lavaggio con soluzione salina tamponata con 1 fosfato (PBS) mediante centrifugazione a 14.000 x g per 10 minuti a 4 °C e risospensione in PBS seguita da una seconda centrifugazione e risospensione finale nel terreno di crescita minimo.
  5. Coltiva campioni batterici in un incubatore a scuotimento orbitale in condizioni di crescita ottimali. In generale, impostare l'incubatore con agitazione orbitale a una velocità di 220 giri/min e una temperatura di 37 °C e posizionare le provette di coltura inclinate con un tappo allentato per l'incubazione aerobica. Per E. coli, 24 ore di incubazione aerobica a 37 °C sono solitamente sufficienti per raggiungere la marcatura massima di 13C.
    NOTA: Il tempo di incubazione dipende dal processo metabolico di interesse. Un tempo di incubazione più lungo generalmente porta a una maggiore marcatura isotopica. Una misurazione della curva di crescita nelle stesse condizioni con un substrato non etichettato potrebbe fornire informazioni per determinare i punti di tempo di raccolta appropriati.
  6. Raccogliere le cellule batteriche nei punti temporali desiderati mediante centrifugazione a 14.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
  7. Rimuovere il surnatante e risospendere in un volume uguale di paraformaldeide (PFA) al 4% in PBS. Fissare le celle in soluzione di PFA per 10 minuti a temperatura ambiente (RT) o 2 ore a 4 °C. Per la conservazione a lungo termine, lavare le cellule due volte con PBS, risospendere le cellule in 1 mL di PBS al 50% (v/v) ed etanolo al 96% e conservare a -20 °C fino a nuovo utilizzo.

2. Ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) (Figura 2B)

  1. Ibridare le cellule di E. coli con la sonda oligonucleotidica Gam42a10 marcata con un fluoroforo cianina5 (Cy5) (Gam42a-Cy5) e le cellule B. theta con la sonda oligonucleotidica Bac30311 marcata con un fluoroforo cianine3 (Cy3) (Bac303-Cy3), seguendo un protocollo FISH standard.
    NOTA: Fondamenti di rRNA-FISH per l'identificazione: le molecole di rRNA sono bersagli ideali di FISH in quanto sono distribuite in modo ubiquitario e naturalmente amplificate all'interno delle cellule microbiche. L'rRNA contiene anche regioni di sequenza sia conservate che variabili in modo che la profondità filogenetica del gruppo bersaglio possa essere determinata dal grado di conservazione della sonda oligonucleotidica. Legando in modo specifico la sonda progettata alla sequenza bersaglio, il fluoroforo marcato mostra segnali fluorescenti per le singole cellule.
  2. Fare riferimento alla letteratura precedentemente pubblicata 12,13,14 per il protocollo dettagliato per l'ibridazione in situ a fluorescenza. I passaggi seguenti descrivono brevemente il protocollo standard per le cellule microbiche.
    1. Disidratazione:
      1. Centrifugare le celle fisse (100 μl) a 14.000 x g per 10 minuti in pellet, risospendere in 100 μl di etanolo di grado analitico al 96% e incubare per 1 minuto a RT.
      2. Successivamente, centrifugare nuovamente le celle a 14.000 x g per 5 minuti, rimuovere l'etanolo e lasciare asciugare il pellet di cella all'aria.
    2. Ibridazione: Ibridare le cellule in soluzione (100 μL) per 3 ore a 46 °C.
      NOTA: Il tampone di ibridazione è costituito da 900 mM di NaCl, 20 mM di Tris-(idrossimetil)-amminometano HCl, 1 mM di acido etilendiammine tetraacetico, dodecilsolfato di sodio allo 0,01%, 100 ng del rispettivo oligonucleotide marcato in fluorescenza e concentrazione di formammide richiesta per ottenere condizioni rigorose.
    3. Centrifuga: Subito dopo l'ibridazione, trasferire i campioni in una centrifuga con rotore preriscaldato a 46 °C e centrifugare a 14.000 x g per 15 minuti alla temperatura massima consentita (solitamente 40 °C).
    4. Lavare e conservare:
      1. Lavare i campioni in un tampone di adeguato rigore per 15 minuti a 48 °C. Quindi, centrifugare le celle a 14.000 x g per 15 minuti alla temperatura massima consentita in una centrifuga con rotore preriscaldato a 46 °C.
      2. Infine, lavare le cellule con 500 μL di PBS ghiacciato, risospenderle in 20 μL di 1x PBS e conservarle a 4 °C fino a nuovo utilizzo.
        NOTA: Il legame specifico della sonda è assicurato dal corretto rigore di ibridazione. Un'elevata rigorosità potrebbe essere ottenuta aumentando la temperatura di ibridazione, diminuendo la concentrazione di sale o aggiungendo la formammide denaturante. Interferenza della formammide con i legami idrogeno che stabilizzano i duplex degli acidi nucleici. Qui, la temperatura e la concentrazione di sale non vengono modificate nell'ibridazione durante la regolazione della concentrazione di formammide. La concentrazione ottimale di formamide per le sonde di nuova concezione viene determinata sperimentalmente utilizzando le curve di dissociazione della formammide10. La concentrazione di formammide richiesta per le sonde pubblicate può essere trovata in probeBase15 o mediante una ricerca bibliografica. In alternativa, le concentrazioni previste di formamide possono essere ottenute dall'analisi in silico utilizzando mathFISH16. Nella fase di lavaggio, una temperatura leggermente più alta porta a una condizione leggermente più rigorosa, che porta a una maggiore specificità di legame.

3. Preparazione del campione (Figura 2C)

  1. Pulizia e rivestimento dei vetrini:
    1. Utilizzare vetrini CaF2 standardizzati (10 mm di diametro e 350 μm di spessore per la compatibilità con il portacampioni dello strumento). Immergere il CaF2 in etanolo al 70% per 15 minuti e risciacquare due volte con acqua deionizzata .
    2. Trasferire i vetrini puliti in una soluzione di poli-L-lisina allo 0,1% e incubare per una notte a 4 °C. Sciacquare una volta i vetrini con acqua deionizzata e asciugarli all'aria.
  2. Scongelare i campioni di cellule preparati in RT al riparo dalla luce.
  3. Per evitare l'eccessiva formazione di cristalli di sale da PBS durante l'essiccazione del campione, seguire i passaggi 3.3.1-3.3.2.
    1. Lavare le celle due volte con acqua deionizzata (DI). Centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti e rimuovere il surnatante.
    2. Aggiungere nuovamente il volume originale di acqua deionizzata e agitare delicatamente. Ripetere la centrifugazione e aggiungere nuovamente l'acqua deionizzata di lavaggio.
  4. (Facoltativo) Per i campioni di miscela, trasferire lo stesso volume da ciascun campione e miscelare in un'unica provetta da centrifuga.
  5. Concentrare i campioni di cellule batteriche mediante centrifugazione a 14.000 x g per 10 minuti e rimuovere il surnatante.
  6. Agitare delicatamente la soluzione rimanente per ~30 s e aggiungere 1-2 μL di soluzione sul vetrino CaF2 preparato. Asciugare il campione all'aria per 30 minuti al riparo dalla luce.
    NOTA: Un piccolo punto rotondo dovrebbe apparire sul vetrino dopo l'asciugatura all'aria. A causa dell'effetto "anello di caffè", i bordi del punto avrebbero una maggiore densità di cellule batteriche. Questa fase della centrifuga consiste nel raggiungere una densità appropriata per un efficiente imaging batterico a singola cellula. La concentrazione ideale dovrebbe portare a uno strato uniforme e denso di singole cellule batteriche al microscopio. Se c'è un pellet chiaro che può essere visto ad occhio nudo dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante in modo che dopo il vortice, la soluzione appaia quasi limpida. Un test rapido potrebbe essere eseguito sul campione di controllo per stimare il volume di rimozione del surnatante. Una serie di goccioline con diverse quantità di surnatante rimanente potrebbe essere depositata sul vetrino del microscopio per esaminare il volume di diluizione ottimale al microscopio a campo chiaro. Se dopo la centrifugazione non è presente alcun pellet visibile, rimuovere la maggior parte del surnatante per concentrare al massimo i campioni. Il trucco consiste nel posizionare la provetta da centrifuga con la cerniera all'esterno in un rotore ad angolo fisso in modo che il pellet appaia sullo stesso lato della cerniera della provetta. Inoltre, è possibile ridurre le dimensioni delle pipette (P1000, P200, P10) per una maggiore precisione durante la rimozione del surnatante per mantenere intatto il pellet.
  7. Montare il vetrino in un portacampioni in dotazione e utilizzare piccoli punti di nastro di poliestere per fissare il vetrino durante la misurazione.

4. Imaging OPTIR-FISH

NOTA: L'imaging a fluorescenza e l'imaging OPTIR verranno eseguiti sul sistema OPTIR.

  1. Geometria del sistema:
    1. Utilizzare la contropropagazione della pompa a medio infrarosso e della sonda visibile, il rilevamento all'indietro (epi) della luce visibile con questo protocollo.
    2. Per focalizzare la luce visibile e raccogliere la luce visibile riflessa e diffusa, utilizzare un obiettivo ad aria (50x 0,8NA). Per focalizzare la luce nel medio infrarosso, utilizzare un obiettivo Cassegrain (40x 0,78NA).
    3. Assicurarsi che il sistema sia dotato anche di un modulo di epifluorescenza a campo largo con più set di filtri a fluorescenza. Per i fluorofori utilizzati in questo protocollo, selezionare il set di filtri per proteine fluorescenti verdi (GFP) per il rilevamento di Cy3 e il set di filtri Alexa Fluor 647 per il rilevamento di Cy5.
  2. Preparati per le misurazioni:
    1. Accendere il sistema e aprire il software di controllo dello strumento. Dopo l'inizializzazione, spostare il cursore Controprop e fluorescenza sulla posizione on.
    2. Imposta l'obiettivo su 50x, quindi esegui lo sfondo automatico per acquisire lo spettro di potenza IR. Utilizzare lo spettro di potenza per normalizzare gli spettri dei campioni acquisiti o normalizzare le immagini OPTIR a diversi numeri d'onda. Ciò escluderà l'effetto delle differenze di potenza del laser nel medio infrarosso sull'analisi e la quantificazione dei dati.
      NOTA: L'acquisizione degli spettri di potenza IR per la normalizzazione è fondamentale per l'analisi quantitativa a valle, poiché l'intensità misurata è linearmente correlata alla potenza IR. Dopo aver eseguito lo sfondo automatico, il software normalizzerà automaticamente gli spettri OPTIR e le immagini OPTIR negli spettri di potenza IR per gli utenti. Lo spurgo del sistema con N2 può ridurre al minimo l'influenza del vapore acqueo e aumentare la riproducibilità tra gli esperimenti.
  3. Per caricare il campione, utilizzare il pulsante Unload per spostare la fase del campione verso l'esterno. Utilizzare un obiettivo a basso ingrandimento, ad esempio 10x, per individuare l'area del campione e navigare verso la regione con la densità ottimale del campione. Focalizzare il campione regolando l'altezza dell'obiettivo nel software di controllo. Cambia la selezione dell'obiettivo a 50x.
  4. Acquisizione delle immagini
    NOTA: I campioni utilizzati sono: i) E. coli (13C-glucosio incubato); ii) E. coli (12C-glucosio incubato); iii) B. theta (12C-glucosio incubato); iv) miscela di E. coli (13C-glucosio incubato) e B. theta (12C-glucosio incubato).
    1. Immagini in campo chiaro (Figura 2D): Metti a fuoco il campione osservando le immagini in campo chiaro.
    2. Immagini a fluorescenza (Figura 2E): Modificare il set di filtri facendo clic sul pulsante del nome del filtro (GFP per Cy3 e Alexa Fluor 647 per Cy5) per rilevare i fluorofori associati alle sonde FISH progettate e acquisire l'imaging a fluorescenza in sequenza utilizzando il modulo di fluorescenza nel software. Regolare l'intensità della luce e il tempo di esposizione per ottenere un contrasto del segnale adeguato prima di sbiancare i fluorofori.
      NOTA: Poiché la sonda utilizzata nelle misurazioni OPTIR può fotosbiancare i fluorofori, acquisire sempre immagini a fluorescenza prima delle immagini OPTIR. Per dubbi sull'effetto dei marcatori fluorescenti sulla rilevazione di OPTIR, fare riferimento a un lavoro pubblicato in precedenza che ha dimostrato che la FISH con fluoroforo Cy5 non influisce sulla seguente quantificazione basata sulle immagini OPTIR poiché Cy5 è di piccole dimensioni e bassa abbondanza rispetto alla proteina batterica bersaglio9.
    3. Immagini OPTIR (Figura 2F):
      1. Determinare il picco normale e la posizione del picco spostato verso il rosso indotta dagli isotopi. Nel caso della sintesi proteica da 13C-glucosio, il picco normale dell'ammide I è rilevato a circa 1656 cm-1 e il picco spostato verso il rosso è a circa 1612 cm-1 (Figura 3A).
        NOTA: La normale posizione del picco dipende dalla componente biochimica e/o dal prodotto metabolico di interesse. La posizione del picco spostata dipende anche dall'isotopo utilizzato per la marcatura. Questi due numeri d'onda potrebbero anche essere determinati sperimentalmente misurando gli spettri completi di celle non marcate e marcate al massimo (vedi passaggio 4.5)
      2. Sintonizzare la lunghezza d'onda della pompa IR su 1656 cm-1 utilizzando il software. Modificare di conseguenza la potenza della sonda e il guadagno del rivelatore per evitare la saturazione del segnale CC (8 V). Regola con precisione l'altezza dell'obiettivo Cassegrain inferiore per massimizzare il segnale CA.
        NOTA: La potenza IR tipica del campione è di circa 5 mW e la potenza della sonda sul campione è di circa 3-15 mW, a seconda del campione. Sia l'IR che la potenza della sonda possono essere regolati utilizzando il software di controllo per ottimizzare il livello di potenza e garantire un elevato contrasto dell'immagine evitando di danneggiare le celle.
      3. Impostare le immagini OPTIR in modo che contengano 200 x 200 pixel e impostare la velocità di scansione su 100 μm/s. Impostare la dimensione del passo nelle direzioni X e Y su 150 nm in modo che la dimensione dell'immagine sia di circa 30 x 30 μm2.
      4. Acquisisci l'immagine.
      5. Sintonizzare la lunghezza d'onda della pompa IR su 1612 cm-1 e acquisire un'immagine dallo stesso campo visivo a questo numero d'onda.
      6. Per ogni campione, visualizzare almeno tre campi visivi per l'analisi statistica.
  5. (Facoltativo) Misurazione spettrale: dopo l'acquisizione dell'immagine, se viene individuata una caratteristica spaziale di interesse, eseguire la misurazione spettrale.
    1. Seleziona posizioni: scegli un singolo punto o specifica una serie di punti per l'analisi nel modulo Spectral del software.
    2. Imposta il parametro di scansione spettrale. Selezionare l'intervallo di copertura del numero d'onda, la velocità di scansione e la spaziatura dell'uscita dei dati in base ai requisiti.
      NOTA: se la velocità di scansione e la spaziatura di uscita dei dati sono diverse rispetto a quelle utilizzate nella fase di acquisizione in background (passaggio 4.2), è necessario un nuovo sfondo basato sui parametri di scansione spettrale correnti per una corretta normalizzazione.
    3. Impostare il numero di co-media e avviare la misurazione spettrale. L'aumento della co-media aumenta anche il rapporto segnale/rumore degli spettri, ma richiede tempi di acquisizione più lunghi.
      NOTA: Se si osserva una fluttuazione significativa durante la co-media, ciò può indicare un'instabilità del campione indotta dal riscaldamento laser. Questo problema può spesso essere risolto riducendo la potenza IR e/o la potenza visibile della sonda.

5. Elaborazione e analisi dei dati a livello di singola cella

  1. Quantificare la sintesi metabolica da substrati isotopici (Figura 2G)
    NOTA: La seguente quantificazione dell'incorporazione metabolica da substrati isotopici si basa su immagini OPTIR a due numeri d'onda corrispondenti ai picchi normali e spostati delle macromolecole bersaglio. Rispetto a uno stack iperspettrale completo, l'imaging a due numeri d'onda potrebbe ridurre notevolmente il tempo richiesto per ciascun FOV e migliorare la produttività, recuperando completamente l'effetto isotopico critico per la quantificazione del metabolismo.
    1. Sottrarre l'immagine OPTIR del picco spostato dall'immagine OPTIR del picco normale genera una mappa visiva delle attività di sintesi dai substrati isotopici. A dimostrazione (Figura 3C), per E. coli coltivato con 13C-glucosio, i pixel positivi nell'immagine (1656 cm-1-1612 cm-1) indicano l'incorporazione attiva di 13C nelle proteine, quindi un livello di sintesi proteica più elevato.
      NOTA: La sottrazione può essere eseguita utilizzando la funzione ImageJ Image Calculator. In alternativa, la sottrazione può essere facilmente eseguita in qualsiasi linguaggio di programmazione preferito per l'elaborazione batch.
    2. Quantificazione dell'attività metabolica delle singole cellule
      1. Ottenere coefficienti (rappresentati da h nella Figura 2G) da campioni di riferimento non marcati e completamente etichettati. Poiché il picco spostato verso il rosso indotto dall'isotopo si sovrapporrebbe parzialmente al picco normale, sia i campioni non marcati che quelli marcati (appena sintetizzati dal substrato marcato isotopicamente) contribuiranno ai segnali OPTIR al picco normale e spostato. Quantificare questi diversi contributi utilizzando l'intensità del segnale OPTIR normalizzato al picco normale e spostato da campioni di riferimento non etichettati e completamente etichettati.
        NOTA: Per i campioni di riferimento, i campioni di riferimento non marcati vengono coltivati (o incubati) senza alcun substrato marcato isotopicamente. I campioni di riferimento completamente marcati vengono solitamente coltivati con la più alta concentrazione di substrato marcato isotopicamente con il tempo di coltivazione più lungo.
      2. Per l'analisi di singole cellule, ottenere maschere a singola cellula in base alle immagini in campo chiaro.
        NOTA: Varie tecniche di elaborazione delle immagini potrebbero essere applicate qui per generare questa maschera, tra cui diversi rilevamenti di particelle come l'analisi dei blob e metodi di segmentazione cellulare come il bacino idrografico.
      3. Misurare l'intensità del segnale OPTIR dalle singole cellule. Applicare la maschera a cella singola acquisita alle due immagini OPTIR (a picco normale e picco spostato) e, per ogni singola cella, calcolare la media dei valori dei pixel nella regione della maschera a cella singola. Il valore medio delle singole celle sarà utilizzato nella quantificazione.
      4. Per ogni cella, calcolare il contributo relativo dei biocomponenti non marcati ed etichettati in base ai coefficienti del passaggio 5.1.2.1 e dei segnali del passaggio 5.1.2.3.
        NOTA: Un rapporto di sostituzione isotopica è definito come il contributo relativo dei biocomponenti marcati rispetto alla somma dei biocomponenti marcati e non marcati (Figura 2G). Questo rapporto dovrebbe essere compreso tra 0 e 1. Il rapporto di sostituzione isotopica è linearmente proporzionale al rapporto tra 13C-glucosio e 12C-glucosio (con una quantità fissa di glucosio totale)9. È stata dimostrata un'elevata sensibilità di rilevamento del 5% di C-glucosioper le cellule di E. coli .
  2. Identificazione delle specie batteriche da immagini a fluorescenza multicanale (Figura 2H)
    1. Unisci i canali di fluorescenza multicolore per creare una guida visiva per diverse specie batteriche utilizzando ImageJ (Image > Color > Merge Channels).
    2. Per l'analisi di singole cellule, per ogni canale di fluorescenza, generare un insieme di regioni di interesse (ROI) per le singole cellule.
      NOTA: Varie tecniche di elaborazione delle immagini possono essere applicate qui per generare la maschera, inclusi diversi metodi di auto-thresholding e metodi di segmentazione cellulare.
  3. Correlare le identità dei FISH e le attività metaboliche degli OPTIR (Figura 2I)
    1. Collegare le identità batteriche a livello di singola cellula dalle immagini di fluorescenza FISH direttamente alle attività metaboliche dalle immagini OPTIR correlando le posizioni delle ROI.
    2. Eseguire analisi statistiche per confrontare le attività metaboliche di diverse specie.
      NOTA: Le maschere vengono generate separatamente dalle immagini di fluorescenza e dalle immagini OPTIR perché le attività metaboliche potrebbero essere analizzate per tutte le cellule dalle immagini OPTIR, mentre le cellule sconosciute non apparirebbero su nessuno dei canali di fluorescenza. Ciò garantisce che tutte le cellule possano essere incluse nell'analisi metabolica. Se c'è un gran numero di cellule non identificate, potrebbe essere necessario prendere in considerazione diverse sonde FISH che hanno come bersaglio l'rRNA di diversi taxa di interesse.

Risultati

Il flusso di lavoro generale per l'analisi metabolica microbica a singola cellula con identificazione genetica mediante OPTIR-FISH è riassunto in Figura 2. I risultati rappresentativi che dimostrano la capacità di imaging metabolico a singola cellula di OPTIR sono mostrati in Figura 3. Questo esempio ha utilizzato cellule di E. coli incubate con 12C- o 13C-glucosio per 24 ore. L'incorporazione di 13È stato dimostrato che C in proteine causa un significativo spostamento verso il rosso delle ammidi proteiche I e II (Figura 3A)17,18. Pertanto, questi due numeri d'onda chiave che rappresentano il 12Proteina C (1656 cm-1, banda normale dell'ammide I) e 13Proteina C (1612 cm-1, ammide spostata I) e sono state acquisite immagini OPTIR a questi due numeri d'onda. Le corrispondenti immagini in campo chiaro sono anche mostrate per dimostrare la morfologia delle cellule (Figura 3B,E). I batteri a forma di bastoncino possono essere chiaramente risolti a livello di singola cellula sia in campo chiaro che nelle immagini OPTIR, confermando l'elevata risoluzione spaziale della tecnica OPTIR (Figura 3B-G). Per le cellule incubate con 12C-glucosio (Figura 3B-D), un'intensità maggiore a 1656 cm-1 è stato osservato, mentre un più alto 1612 cm-1 l'intensità è stata osservata per le cellule incubate con 13C-glucosio (Figura 3E-G). Questo spostamento del picco indica l'incorporazione di isotopi di carbonio più pesanti nella massa proteica17. La valutazione è stata estesa per valutare la capacità di OPTIR-FISH di discriminare i taxa batterici e le loro attività metaboliche in campioni multi-specie. Abbiamo mescolato artificialmente due specie batteriche prevalenti nel microbioma intestinale umano: E. coli e B. thetaiotaomicron (B. theta). E. coli cellule incubate con 13Il C-glucosio è stato ibridato con una sonda Gam42a-Cy5, mirata all'rRNA 23S dei gammaproteobatteri10. B. theta cellule incubate con 12Il C-glucosio è stato ibridato con la sonda Bac303-Cy3, mirando all'rRNA 16S della maggior parte delle specie di Bacteroidaceae11. È molto difficile differenziare le due specie in base alle immagini in campo chiaro poiché sono entrambe a forma di bastoncino (Figura 4A). Pertanto, l'imaging a fluorescenza multicolore di sonde ibridate è stato essenziale per assegnare un'identità tassonomica a ciascuna cellula batterica analizzata (Figura 4B). Sottraendo le immagini OPTIR acquisite a 1612 cm-1 da quello di 1656 cm-1, abbiamo notato che un segmento di cellule in questo campione di bi-specie mostrava valori di sottrazione positivi (Figura 4C), indicando l'incorporazione di 13Isotopi C. Sulla base delle condizioni di coltura, abbiamo assegnato le cellule con valore di sottrazione positivo da E. colie il valore di sottrazione negativo deve essere B. theta. L'assegnazione delle specie batteriche è confermata dai risultati dell'imaging a fluorescenza: le cellule che producono valori di sottrazione positivi producono un contrasto Cy5, che è specifico per E. colie le celle che producono valori di sottrazione negativi producono B. thetaContrasti Cy3 -specifici. Quindi, è stato calcolato il rapporto di sostituzione isotopica, in questo caso, di nuova sintesi 13Proteina C da 13C-glucosio (Figura 4D). Come previsto, una differenza significativa nel rapporto di sostituzione isotopica tra le due specie batteriche (t-test a coppie, p = 9,74 x 10-33). Questo set di dati sottolinea la fattibilità dell'applicazione della piattaforma OPTIR-FISH per studiare il metabolismo in un ambiente complesso in cui sono presenti più specie di campioni.

Analisi microbica; ibridazione a fluorescenza, marcatura isotopica, imaging OPTIR, fenotipo genotipico.
Figura 1: Schema per la piattaforma OPTIR-FISH per l'identificazione simultanea delle specie e l'analisi del metabolismo. Diversi membri della comunità microbica possono essere identificati mediante il legame specifico delle sonde di RNA ribosomiale microbico attraverso l'ibridazione in situ a fluorescenza e rilevati mediante imaging a fluorescenza dei fluorofori allegati. L'attività metabolica può essere analizzata mediante coltura con substrati isotopici e rilevata mediante imaging OPTIR. L'imaging OPTIR rileva la variazione di scattering indotta dall'assorbimento IR e OPTIR è intrinsecamente compatibile con gli strumenti fluorescenti ampiamente utilizzati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Diagramma del processo di marcatura isotopica: FISH microbico, analisi OPTIR, determinazione dell'identità, rapporti.
Figura 2: Flusso di lavoro generale per l'analisi dell'attività metabolica su singola cellula con identificazione genetica mediante OPTIR-FISH. (A) Le cellule batteriche sono state coltivate con substrati marcati isotopicamente. (B) È stata quindi eseguita l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH). (C) Preparazione del campione su vetrino IR trasparente. (D) Le immagini in campo chiaro identificano le regioni con densità cellulare ottimale. (E,H) L'imaging a fluorescenza multicolore di diversi fluorofori FISH rivela l'identità genetica delle singole cellule, come specificato dalle sonde FISH o rimane sconosciuta. (F,G) La successiva imaging OPTIR multispettrale al picco normale e spostato rivela l'incorporazione isotopica nella biomassa microbica. Facendo riferimento agli spettri OPTIR per campioni non marcati e completamente marcati (coefficiente h), è stato possibile quantificare il contributo relativo dei componenti bio regolari (cr) e isotopici (ci). La sintesi proteica da substrati metabolizzati marcati isotopicamente è stata quantificata utilizzando il "rapporto di sostituzione isotopica". (I) Con OPTIR-FISH, è possibile ottenere un'analisi ad alto rendimento dell'attività metabolica di specie microbiche in una popolazione complessa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Spettroscopia di E. coli utilizzando 12C/13C-glucosio; spettri OPTRIR; immagini in campo chiaro e OPTIR.
Figura 3: Spettri OPTIR rappresentativi e risultati dell'imaging. (A) Spettri OPTIR per cellule di E. coli coltivate con 12C-glucosio (ciano) e 13C-glucosio (arancione) che coprono la regione dell'ammide I e dell'ammide II. Un chiaro picco di ammide I spostato verso il rosso (da 1656 cm-1 a 1612 cm-1) è stato osservato per 13cellule in coltura di C-glucosio. Immagini rappresentative in campo chiaro e OPTIR di cellule di E. coli in condizioni di coltura di ammide I normale e ammide I spostata in condizioni di coltura di (B-D) 12C-glucosio e (E-G) 13C-glucosio. Barre di scala: 10 μm. Questa figura è stata modificata con il permesso di Bai et al.9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Immagini al microscopio in campo chiaro e FISH con sottrazione OPTIR, grafico di quantificazione di E. coli e B. theta.
Figura 4: Immagini rappresentative e risultati di quantificazione da miscele batteriche. Le cellule di E. coli sono state incubate con 13C-glucosio, seguite da ibridazione con sonda oligonucleotidica Gam42a-Cy5. Le cellule di B. theta sono state incubate con 12C-glucosio, seguite da ibridazione con sonda oligonucleotidica Bac303-Cy3. (A) L'immagine in campo chiaro mostra la morfologia della miscela cellulare. (B) L'immagine a fluorescenza a due colori mostra la distribuzione di E. coli (rosso) e B. theta (verde). (C) Il risultato della sottrazione di OPTIR (1612 cm-1-1656 cm-1) mostra il metabolismo proteico delle cellule batteriche. (D) Quantificazione del rapporto di sostituzione isotopica che rappresenta la proteina C 13di nuova sintesi dal 13C-glucosio. (Test t a coppie: p = 9,74 x 10-33). Barre di scala: 10 μm. Questa figura è stata modificata con il permesso di Bai et al.9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Qui, abbiamo descritto un protocollo dettagliato per l'applicazione della piattaforma OPTIR-FISH per l'identificazione simultanea di specie microbiche e la quantificazione delle attività metaboliche alla risoluzione di una singola cellula. Le fasi critiche includono la coltura con marcatura di isotopi stabili per lo studio di specifiche attività metaboliche e l'ibridazione in situ a fluorescenza per l'identificazione di specie microbiche bersaglio. L'imaging a fluorescenza multicanale e l'imaging OPTIR a numeri d'onda selezionati possono essere eseguiti in sequenza sullo stesso microscopio. Abbiamo mostrato come analizzare quantitativamente queste immagini per rivelare i livelli di attività metabolica di diverse specie all'interno della complessa comunità. Il protocollo potrebbe essere particolarmente interessante per lo studio metabolico di diverse specie all'interno della complessa comunità nel loro ambiente nativo.

Abbiamo usato i batteri come esempio, ma questo protocollo può essere adattato ad altri organismi, come funghi e cellule di mammifero. Un punto chiave è quello di aggiungere le sonde vibrazionali del processo metabolico target nel terreno di coltura privo della controparte normale. Ad esempio, se si studia il metabolismo dei lipidi dagli acidi grassi, gli acidi grassi marcati con azido dovrebbero essere integrati nel loro terreno di coltura standard composto da siero fetale bovino delipidico (FBS) poiché gli acidi grassi provengono originariamente da FBS. Inoltre, il tempo di incubazione deve corrispondere al tasso di crescita di diversi funghi o cellule di mammifero. Ciò garantisce la normale crescita delle cellule, massimizzando al contempo l'efficienza di marcatura delle sonde vibrazionali nelle macromolecole bersaglio.

Il protocollo qui descritto può anche essere adattato per studiare altri processi metabolici oltre alla sintesi proteica del glucosio. Tutte le principali biomolecole, comprese proteine, lipidi, acidi nucleici e carboidrati, potrebbero essere visualizzate da OPTIR19,20. Inoltre, esiste una vasta selezione di strategie di marcatura, tra cui la marcatura isotopica come 13C, 15N, 18O e 2H, e l'aggiunta di tag vibrazionali come C≡C e C≡N a piccole molecole21. A causa delle piccole dimensioni dell'etichetta e dell'elevata biocompatibilità, è un metodo preferito per lo studio del metabolismo rispetto agli analoghi della fluorescenza. Per studiare altri processi metabolici utilizzando diverse sonde vibrazionali, questo protocollo può essere modificato, comprese le fasi di coltura cellulare e marcatura metabolica, nonché la selezione del numero d'onda basata su diverse sonde e prodotti metabolici, che possono essere trovati nei corrispondenti riferimenti 21,22,23. Alcuni degli esempi includono la mappatura dei lipidi di nuova sintesi dall'acido azide-palmitico in sistemi di coltura bidimensionali (2D) e tridimensionali (3D) di derivazione umana24, l'imaging di proteine di nuova sintesi da azidoomoalanina in cellule macrofagiche23, l'imaging del metabolismo del glucosio con deuterio-glucosio in cellule PC325 e l'analisi dell'incorporazione del deuterio dall'acqua pesante come marcatore di attività nel microbioma intestinale umano26.

Una potenziale limitazione del protocollo è il limite di rilevamento di 13C nelle comunità complesse. Abbiamo dimostrato che per la coltura pura utilizzata qui, il limite di rilevamento è del 5% di 13C nel carbonio9 totale. Dimostriamo anche che mescolando completamente 13cellule di E. coli marcate con C con campioni di microbioma intestinale complesso umano non marcato, possiamo differenziare con sicurezza l'E. coli in base ai profili metabolici nonostante la potenziale variazione spettrale associata a diverse composizioni chimiche cellulari originate da varie specie di microbioma intestinale non marcato9. Tuttavia, le comunità microbiche complesse, influenzate dalle fisiologie uniche delle specie microbiche presenti, possono mostrare tassi di assimilazione incoerenti di 13C. In questi casi, vale la pena testare ulteriormente la capacità di differenziazione metabolica di 13cellule marcate con C e 12cellule marcate con C di OPTIR-FISH nel contesto di una comunità complessa. Le prestazioni della piattaforma possono essere ulteriormente migliorate. Ad esempio, combinando la configurazione OPTIR a campo largo, la velocità di imaging può essere notevolmente aumentata27. Metodi avanzati di denoising basati sull'apprendimento automatico possono essere incorporati nella piattaforma per aumentare ulteriormente la velocità di imaging28,29. Per visualizzare meglio la distribuzione dettagliata dei metaboliti nelle cellule microbiche, è possibile adottare le tecnologie di super-risoluzione recentemente sviluppate30,31.

I passaggi critici di questo protocollo includono l'ottimizzazione dell'efficienza della marcatura FISH per i microbi bersaglio, che potrebbe essere ottenuta attraverso la progettazione razionale della sonda oligonucleotidica, l'ottimizzazione della concentrazione di formammide e un attento controllo dell'ambiente di ibridazione. La preparazione di campioni con una densità di singola cella appropriata per l'analisi ad alta produttività è importante per ottenere un'elevata produttività nella pratica. È inoltre fondamentale ottimizzare il sistema per ottenere un segnale adeguato per la quantificazione. Questa operazione viene eseguita automaticamente nel software di controllo dello strumento durante la fase di sfondo automatico. Se si verifica una deviazione nella preparazione del campione, ad esempio utilizzando un tipo diverso di vetrino invece del vetrino CaF2 standard, è possibile eseguire l'ottimizzazione manuale nel software. Durante la fase di ottimizzazione manuale, la sovrapposizione tra l'infrarosso medio e la luce visibile viene ottimizzata scansionando una serie di posizioni dell'infrarosso medio. Le sfide principali includono la scelta dei substrati vibrazionali più adatti e dei corrispondenti numeri d'onda OPTIR per quantificare le attività metaboliche di interesse.

In conclusione, questo studio dimostra come l'attività metabolica e l'identificazione microbica possano essere raggiunte contemporaneamente a livello di singola cellula dalla piattaforma OPTIR-FISH. Riteniamo che questo protocollo dettagliato fornirà una guida utile per promuovere l'adozione diffusa di questa nuova piattaforma di imaging vibrazionale con un'elevata compatibilità con strumenti di fluorescenza ampiamente utilizzati, consentendo applicazioni in diversi campi delle scienze della vita e della medicina e sbloccando opportunità per nuove scoperte.

Dichiarazioni

Y.B. è un consulente part-time per Photothermal Spectroscopy Corp.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health R35GM136223, R01AI141439 a J.X.C.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
96% EtanoloThermoScientificT032021000
Fluoruro di calcioCrystranCAFP10-0.35
D-(+)-glucosioSigma-AldrichG7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)Cambridge Isotopic LaboratoriesCLM-1396-1
Acido etilendiamminotetraaceticoSigma-AldrichE9884-100G
formamideThermoScientific17899
Luria-Bertani brodo Sigma-AldrichL3522-250G
M9 Sali minimi 5xSIGMAM6030-1KG
Strumento OPTIRSpettroscopia fototermica Corp.mIRage LS
Soluzione di paraforaldeide, 4% in PBSThermoScientificJ19943-K2
soluzione di poli-L-lisina 0,1% (p/v) Sigma-AldrichP8920-500ML
Cloruro di sodioSigma-AldrichS9888-25G
Sodio dodecil solfatoSigma-AldrichL3771-25G
Tris(idrossimetil)amminometano cloridrato, 99+%ThermoScientificA11379.18
Brodo di soia TrypicSigma-Aldrich22092-500G

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