Articolo metodologico

Microscopia intravitale a due fotoni del polmone di topo trapiantato

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DOI:

10.3791/66566

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19 aprile 2024

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1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University in St. Louis, 2Division of Thoracic Surgery, University of Maryland, 3Division of Infectious Diseases, Washington University in St. Louis

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per l'imaging intravitale del polmone sinistro del topo trapiantato utilizzando la microscopia a due fotoni. Questo rappresenta uno strumento prezioso per studiare le dinamiche e le interazioni cellulari in tempo reale dopo il trapianto di polmone murino.

Abstract

Le complicanze dopo il trapianto di polmone sono in gran parte correlate alla risposta del sistema immunitario dell'ospite al trapianto. Tali risposte immunitarie sono regolate dal crosstalk tra le cellule donatrici e riceventi. Una migliore comprensione di questi processi si basa sull'uso di modelli animali preclinici ed è aiutata dalla capacità di studiare il traffico di cellule immunitarie all'interno del trapianto in tempo reale. La microscopia intravitale a due fotoni può essere utilizzata per l'imaging di tessuti e organi per profondità fino a diverse centinaia di micron con un fotodanno minimo, il che offre un grande vantaggio rispetto alla microscopia confocale a singolo fotone. L'uso selettivo di topi transgenici con espressione proteica fluorescente promotore-specifica e/o il trasferimento adottivo di cellule marcate con colorante fluorescente durante la microscopia intravitale a due fotoni consente lo studio dinamico di singole cellule all'interno del loro ambiente fisiologico. Il nostro gruppo ha sviluppato una tecnica per stabilizzare i polmoni di topo, che ci ha permesso di visualizzare le dinamiche cellulari nei polmoni naïve e negli innesti polmonari trapiantati ortotopicamente. Questa tecnica consente una valutazione dettagliata del comportamento cellulare all'interno del sistema vascolare e nell'interstizio, nonché l'esame delle interazioni tra le varie popolazioni cellulari. Questa procedura può essere facilmente appresa e adattata per studiare i meccanismi immunitari che regolano le risposte infiammatorie e tollerogeniche dopo il trapianto di polmone. Può anche essere esteso allo studio di altre condizioni polmonari patogene.

Introduzione

Il trapianto di polmone è l'opzione finale per molti pazienti affetti da malattia polmonare allo stadio terminale; Tuttavia, la sopravvivenza a lungo termine dopo il trapianto di polmone è scarsa rispetto ad altri trapianti di organi solidi. La sopravvivenza a 5 anni è solo ~60%-70%1, rispetto all'80%-90% nei cuori2 e all'85%-90% nei reni3. Molte complicanze dopo il trapianto di polmone, come la disfunzione primaria del trapianto, il rigetto mediato da anticorpi e la disfunzione cronica dell'allotrapianto polmonare, sono dovute alla risposta immunitaria dell'ospite all'allotrapianto. Ad esempio, il nostro gruppo ha dimostrato che i neutrofili vengono rapidamente reclutati nell'allotrapianto polmonare a seguito di danno da ischemia-riperfusione indotta dal trapianto e formano cluster dinamici che circondano i monociti del sangue4. Il crosstalk tra le cellule donatrici e riceventi è responsabile delle risposte alloimmunitarie deleterie 5,6,7 e la capacità di studiare queste interazioni cellulari dinamiche in un modello animale vivo è inestimabile.

La microscopia a due fotoni consente l'imaging intravitale ad alta risoluzione per profondità fino a diverse centinaia di micron con un fotosbiancamento minimo dei tessuti 8,9. Viene utilizzato in una varietà di tessuti e siti anatomici, tra cui la neocorteccia10,11, la pelle12,13 e il rene 14,15. Più recentemente, è stato adattato a organi non statici come il polmone e il cuore 4,16,17. In questo protocollo, descriviamo una tecnica per l'imaging di innesti polmonari stabilizzati, ventilati e perfusi dopo trapianto di polmone sinistro ortotopico murino. Un vantaggio chiave del modello di trapianto è la capacità di manipolare geneticamente il donatore e il ricevente separatamente. Le singole popolazioni cellulari possono essere visualizzate con ceppi di topi transgenici con espressione proteica fluorescente knock-in, trasferimento adottivo di cellule marcate con fluorescenza5 o iniezione endovenosa di anticorpi marcati con fluorescenza per legare marcatori specifici della cellula 4,16,17,18.

Al fine di stabilizzare il polmone durante l'imaging, questo protocollo prevede l'incollaggio del polmone a un vetrino di copertura, mentre altri gruppi hanno descritto la stabilizzazione dell'aspirazione utilizzando un dispositivo di vuoto reversibile su misura19. Il nostro protocollo presenta diversi vantaggi, tra cui un'area di imaging più ampia e una relativa facilità di configurazione utilizzando materiali comunemente disponibili in un laboratorio di microscopia (inclusi vetrino coprioggetto e colla). Poiché questa tecnica di incollaggio vincola il polmone sulla superficie superiore, si prevede che riduca il movimento ventilatorio e consenta un imaging più profondo. Questa tecnica di imaging intravitale consente un'osservazione dettagliata del comportamento e delle interazioni delle cellule immunitarie in tempo reale, contribuendo allo studio dei meccanismi immunitari che regolano le risposte infiammatorie rispetto a quelle tollerogeniche dopo il trapianto di polmone.

Protocollo

Tutte le procedure di manipolazione degli animali sono state condotte in conformità con le linee guida del National Institutes of Health Care and Use of Laboratory Animals e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso la Washington University School of Medicine.

1. Anestesia e intubazione

NOTA: Viene eseguito il trapianto ortotopico di polmone sinistro di topo, come precedentemente descritto20,21. I polmoni di topi C57BL/6 (B6) da 20-25 g vengono trapiantati in riceventi di B6 di pari sesso ed età. B6. I topi reporter LysM-GFP sono utilizzati come destinatari per esperimenti selezionati per visualizzare l'infiltrazione di neutrofili negli innesti polmonari. I topi riceventi possono essere sottoposti a imaging immediatamente dopo un trapianto di polmone.

  1. Anestetizzare nuovamente i topi con somministrazione intraperitoneale di ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (8-10 mg/kg). Somministrare buprenorfina a rilascio prolungato (0,5-1,0 mg/kg) per via sottocutanea per un ulteriore controllo del dolore. Confermare un'adeguata profondità dell'anestesia con un pizzico di zampa.
    NOTA: Se il tempo tra il trapianto di polmone e l'imaging intravitale pianificato è inferiore a due ore, è possibile ridosare l'anestetico con il 50% della dose iniziale di ketamina.
  2. Rimuovere i peli da tutto il torace sinistro utilizzando un tagliacapelli elettrico e strofinare il torace per rimuovere i peli tagliati in eccesso.
  3. Applicare un unguento oftalmico non medicato sugli occhi del topo per prevenire l'essiccazione corneale.
  4. Reintubare il topo per via orotracheale con un angiocatheter da 20 G, come descritto in precedenza21.
  5. Ventilare con aria ambiente a una velocità di 120 respiri/min e un volume corrente di 0,5 cc.
  6. Erogare l'1% di isofluorano per via endotracheale durante l'intera procedura.
  7. Per visualizzare i vasi sanguigni durante l'imaging, iniettare 20 μL di punti quantici non bersaglio (q-dot) da 655 nm in 50 μL di soluzione salina tamponata con fosfato per via endovenosa almeno 5 minuti prima dell'imaging.

2. Preparazione chirurgica del polmone sinistro per l'imaging

  1. Posizionare il mouse in posizione di decubito laterale destro (vedi Figura 1A).
  2. Disinfettare la pelle del torace con una miscela di iodio allo 0,75% ed etanolo al 70%, tre volte.
  3. Riaprire la toracotomia sinistra (da trapianto di polmone di topo) attraverso il terzo spazio intercostale (vedi Figura 1A).
  4. Rimuovere una porzione della pelle e dei tessuti molli sopra il sito di toracotomia sinistro, che misura 1,5 cm x 1,5 cm (vedere Figura 1B).
  5. Prima della resezione delle costole, clamp prima le costole per ~10 s per trombotizzare qualsiasi microvascolarizzazione per ottenere l'emostasi (vedi Figura 1C, D).
  6. Resecare porzioni della 3-5a costola per creare una finestra di imaging sufficientemente grande da districare il polmone (~0,8 cm cranio-caudalmente e ~1,0 cm antero-posteriormente, Figura 1D, E).
  7. Fermare qualsiasi ulteriore sanguinamento dai bordi delle costole con l'elettrocauterizzazione.
    NOTA: È fondamentale ottenere l'emostasi nel bordo tagliato delle costole per evitare un'eccessiva perdita di sangue durante il periodo di imaging.
  8. Posizionare una piccola protuberanza (4 cm x 4 cm, garza piegata longitudinalmente 3 volte) sotto il torace destro (vedi Figura 1E).
  9. Utilizzando tamponi di cotone, sollevare l'innesto polmonare dal torace e posizionare la parte inferiore del polmone su una striscia di 1 cm x 3 cm di garza imbevuta di soluzione salina (vedere Figura 1F).
    NOTA: Questa striscia di garza imbevuta di soluzione salina impedisce lo scivolamento del polmone, mantiene un ambiente umido per il polmone, protegge il polmone dai bordi taglienti delle costole resecate e separa il polmone dal movimento cardiaco. Una volta applicata la camera di imaging circonferenziale sul polmone (Figura 1G, H, descritta nella sezione 3), dovrebbe esserci una minima perdita di calore e liquidi dalla cavità toracica aperta durante il periodo di imaging.

3. Preparazione della camera di imaging

NOTA: Una camera di imaging è costruita su misura (vedere la Figura 2A). Questa camera di imaging è costituita da una piastra di base e da una piastra superiore tra le quali il mouse è posizionato e fissato in posizione con bulloni a molla su entrambi i lati (Figura 2B). La piastra superiore contiene un ritaglio circolare di ~2 cm di diametro. Un O-ring nero di dimensioni corrispondenti è posizionato in questa apertura sul lato anteriore della piastra superiore, che proteggerà la lente dell'obiettivo (Figura 2C). Un vetro di copertura da 24 mm x 50 mm viene fatto aderire alla parte posteriore della piastra superiore utilizzando grasso per alto vuoto, che creerà una tenuta stagna. Questo vetro di copertura fungerà da finestra di imaging aderendo al polmone sottostante e tenendo il supporto di imaging (cioè l'acqua) sopra. Assicurarsi che il grasso sottovuoto non penetri all'interno della finestra di imaging circolare. Il vetro di copertura verrà sostituito per ogni nuovo esperimento di imaging. La piastra di base viene riscaldata a 35-37 °C utilizzando una sonda di temperatura a termocoppia (Figura 2A).

  1. Posizionare il topo intubato sulla piastra di base della camera di imaging con il torace sinistro aperto rivolto verso l'alto (vedere Figura 1G, H). Fissare il mouse con del nastro di seta sul viso, sulle zampe anteriori e sulla coda (vedere la Figura 1H e la Figura 2A).
  2. Applicare la colla sul lato inferiore del vetro di copertura attaccato alla piastra superiore (cerchio grigio nella Figura 2C, in basso), lasciando un cerchio privo di colla di 0,8-1,0 cm al centro.
    NOTA: Esiste un compromesso tra la dimensione del cerchio senza colla e la quantità di artefatto di movimento; Pertanto, si raccomanda che il cerchio non superi 1,0 cm di diametro.
  3. Abbassare la piastra superiore fino a quando il vetro di copertura non tocca il polmone, con la colla che tocca la superficie polmonare (vedere Figura 1G).
    NOTA: Il polmone sinistro sarà incollato al vetrino di copertura con un cerchio pulito e privo di colla al centro, che è l'area che verrà ripresa.
  4. Tenere il coprioggetto contro il polmone e gonfiare il polmone per 1-2 s in modo che l'area di colla aderisca al tessuto circostante. Realizzare il gonfiaggio polmonare occludendo il tubo di deflusso dal tubo endotracheale del topo al ventilatore.
    NOTA: Non gonfiare il polmone per più di 1-2 secondi, poiché ciò potrebbe causare un barotrauma eccessivo.
  5. Staccare leggermente la piastra superiore per ridurre la pressione sul tessuto polmonare. Assicurarsi che l'area del polmone all'interno della finestra di imaging non si muova con la ventilazione.
  6. Fissare entrambe le estremità della piastra superiore fissando il dado a testa zigrinata su ciascun bullone (vedere la Figura 2B).

4. Imaging a due fotoni

NOTA: Per la microscopia intravitale è necessario utilizzare un microscopio verticale a stadio fisso con un obiettivo a immersione in acqua con apertura numerica (NA) 20x o 25x >1.0. Di seguito è riportata la configurazione utilizzata in questo studio per un B6 a B6. Trapianto di polmone sinistro LysM-GFP con marcatura dei vasi sanguigni q-dot a 655 nm. Quando si applica questo protocollo, la configurazione del microscopio, dei laser e dei filtri dicroici può essere adattata in base alle esigenze dell'esperimento specifico e dei reporter fluorescenti utilizzati.

  1. Posizionare l'intera camera di imaging con il topo ricevente intubato (polmone sinistro B6 trapiantato in B6. LysM-GFP con q-dot da 655 nm) sul tavolino del microscopio (vedi Figura 2A).
  2. Utilizzare filtri dicroici di lunghezze d'onda 480 nm, 560 nm e 635 nm, che separeranno in modo appropriato i segnali dal reporter GFP, dai punti q e dal segnale di generazione di seconda armonica (SHG) (445 nm) generato dal collagene. Questi filtri possono essere adattati in base all'esperimento specifico.
    NOTA: Il segnale SHG generato dal collagene delimita strutture scure simili a crateri, che rappresentano spazi aerei alveolari (vedi frecce bianche in Figura 3).
  3. Impostare il laser pulsato a femtosecondi in titanio-zaffiro su 890 nm (nell'intervallo del vicino infrarosso) per l'eccitazione. Utilizzare la potenza laser più bassa possibile per ottenere un segnale sufficiente.
    NOTA: Le impostazioni del laser devono essere regolate per l'esperimento specifico per massimizzare la separazione del segnale.
  4. Applicare ~1 ml di acqua per coprire completamente il vetro di copertura sulla piastra superiore, che sarà tenuto in posizione dall'O-ring e dal paragrasso sottovuoto del vetro di copertura sulla piastra superiore (vedere Figura 1G e Figura 2C).
  5. Utilizzare l'obiettivo a immersione in acqua 20x >1.0 NA sul microscopio. Assicurarsi che la lente dell'obiettivo sia adattata in base all'esperimento specifico.
    NOTA: Un NA più grande consente una maggiore raccolta della luce, un contrasto più elevato e immagini più dettagliate. Gli obiettivi ad immersione in acqua sono preferiti in quanto l'acqua o il tampone sono più compatibili con i tessuti biologici.
  6. Abbassare l'obiettivo del microscopio nell'acqua e mettere a fuoco la superficie del polmone.
  7. Attivare il riscaldatore della piastra di base e mantenere la temperatura a 35-37 °C.
    NOTA: In caso di dubbi sull'incapacità di mantenere la temperatura dei tessuti o un'adeguata perfusione polmonare, è possibile collegare due resistori aggiuntivi per riscaldare la piastra superiore oltre alla piastra di base (vedere la Figura 1 supplementare).
  8. Acquisisci stack di immagini con il software di acquisizione preferito.
    NOTA: Assicurarsi che la stanza sia completamente buia durante l'acquisizione, il che può comportare l'uso di tende/persiane oscuranti e una copertura strategica di tutte le fonti di luce.

5. Acquisizione video

NOTA: I seguenti parametri possono essere adattati in base all'esperimento specifico. I passaggi 5.1-5.3 descrivono i parametri specifici utilizzati per i modelli da B6 a B6. Trapianto di polmone sinistro murino Lysm-GFP, che può essere utilizzato come guida di riferimento.

  1. Utilizzando uno scanner bidirezionale a velocità video, impostare le dimensioni della scansione x-y su 512 x 512 pixel.
  2. Utilizzando un'unità passo-passo xyz, è possibile acquisire registrazioni time-lapse di uno z-stack a 21 step con una media di 10 fotogrammi per step. Ogni stack richiede circa 20 s per l'acquisizione, che include il tempo necessario per la media dei fotogrammi, il motore passo-passo per muoversi e controllare la sua posizione e un ritardo di 100 ms.
    NOTA: Lo scanner bidirezionale sul microscopio utilizzato in questo studio funziona a una velocità video di 30 fotogrammi/s. Questo può variare a seconda della configurazione specifica del microscopio.
  3. Acquisisci 80 z-stack consecutivi per ottenere l'imaging time-lapse della migrazione dei leucociti all'interno del parenchima tissutale. Questo richiede circa ~27 minuti a 20 s/stack.
    NOTA: La dimensione della pila, la media dei fotogrammi, la potenza del laser e la lunghezza totale della registrazione time-lapse devono essere ridotte al minimo per evitare un'eccessiva esposizione del laser al tessuto. Se i reporter fluorescenti utilizzati sono luminosi (ad esempio, GFP) e la potenza del laser è bassa, la ripetizione di uno z-stack di 21 passi con una media di 10 fotogrammi, una scansione di 512 x 512 pixel, a intervalli di 20 s per ~27 minuti è ben tollerata dal mouse. Se si desiderano periodi di imaging più lunghi, il tempo di acquisizione per stack deve essere aumentato per mantenere la stessa esposizione laser totale (ad esempio, 1 min per stack su ~1,5 ore). Queste impostazioni dovranno essere ottimizzate in base ai reporter fluorescenti utilizzati.
  4. Eutanasia del mouse al termine dell'acquisizione dell'immagine. Per l'eutanasia, anestetizzare il topo con ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (8-10 mg/kg), seguita da una successiva lussazione cervicale. Le preparazioni di imaging tipiche mantengono facilmente la vitalità del topo fino a 2 ore.
    NOTA: Per prolungare questo periodo, potrebbe essere necessaria un'ulteriore integrazione di liquidi, l'anestesia con isoflurano e l'attenzione alla regolazione della temperatura.
  5. Rendering video completo con Imaris. È possibile utilizzare anche altri software di imaging (come ImageJ).
    NOTA: Le immagini possono essere elaborate dopo l'acquisizione utilizzando il miglioramento del contrasto, l'attenuazione e l'aritmetica dei canali per rimuovere la diafonia dei canali.

Risultati

Dopo 1 ora di conservazione ischemica a freddo a 4 °C, abbiamo trapiantato ortotopicamente il polmone sinistro da un topo B6 a un B6. LysM-GFP sul topo4, e quindi è stato eseguito l'imaging intravitale a due fotoni, come descritto sopra. Abbiamo eseguito l'imaging in due punti temporali dopo il trapianto: 2 ore (Figura 3A) e 24 ore (Figura 3B). I vasi sanguigni sono etichettati in rosso dai punti q iniettati immediatamente prima dell'imaging. Inoltre, possiamo visualizzare i monociti che hanno assorbito i punti q a 24 ore4. I neutrofili derivati dal ricevente con etichetta verde possono essere visti infiltrarsi nell'innesto polmonare nel video corrispondente a 24 ore dopo il trapianto (Video supplementare 1). Gli alveoli possono essere visualizzati come crateri scuri dovuti all'SHG del collagene (frecce bianche nella Figura 3). Osserviamo che a 24 ore dopo il trapianto, ci sono più neutrofili nel polmone rispetto a 2 ore dopo il trapianto (Figura 3).

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Figura 1: Preparazione del topo per l'imaging a due fotoni. (A) Riapertura della pelle sopra la toracotomia sinistra. (B) Cute e tessuti molli asportati sul torace sinistro. (C, D) Nervature bloccate per 10 s prima della divisione. (E) Costole sinistra della3a-5a resecate per creare una finestra che misura ~0,8 cm cranio-audalmente x 1,0 cm antero-posteriormente. (F) Polmone sinistro sollevato dal torace sinistro e posto su una striscia di garza. (G) Una camera di imaging con una finestra di imaging si sovrappone al polmone sinistro. (H) La camera di imaging è posizionata sul tavolino del microscopio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Configurazione della camera di imaging. (A) La camera di imaging posizionata sul tavolino del microscopio. (B) Vista ingrandita del meccanismo dell'otturatore caricato a molla per fissare la piastra superiore sul polmone sinistro. (C) Parte anteriore e posteriore della piastra superiore con O-ring e vetro di copertura applicati. Le linee bianche rappresentano l'area in cui viene applicato il grasso sottovuoto per far aderire il vetro coprioggetto alla piastra superiore. Il cerchio grigio rappresenta un anello di colla da applicare sul vetro di copertura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Imaging intravitale a due fotoni di trapianto di polmone sinistro di topo da B6 a B6. Topo LysM-GFP con 1 ora di conservazione ischemica a freddo. L'imaging viene eseguito a (A) 2 ore e (B) 24 ore dopo il trapianto. Il rosso rappresenta i punti q. Il verde rappresenta i neutrofili della B6. Ricevente di LysM-GFP. Il blu rappresenta l'SHG degli alveoli ricchi di collagene. Le frecce bianche mostrano gli spazi aerei alveolari. La barra della scala rappresenta 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Piastra superiore con due resistenze attaccate per fornire un riscaldamento aggiuntivo. Clicca qui per scaricare questo file.

Video supplementare 1: Imaging time-lapse a due fotoni del polmone sinistro di topo trapiantato da B6 a B6. Topo LysM-GFP con 1 ora di conservazione ischemica a freddo, eseguita a 24 ore dopo il trapianto. Il rosso rappresenta i punti q. Il verde rappresenta i neutrofili del ricevente di LysM-GFP. Il blu rappresenta la seconda generazione armonica degli alveoli ricchi di collagene. La barra della scala rappresenta 20 μm. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

L'eccitazione a due fotoni è stata descritta per la prima volta nella sua tesi di dottorato da Maria Göppert-Mayer nel 1931, che in seguito vinse il premio Nobel per la fisica per aver descritto la struttura del guscio nucleare22,23. La microscopia a fluorescenza tradizionale si basa sull'eccitazione di un singolo fotone, con lunghezze d'onda di eccitazione più corte e più elevate rispetto alle lunghezze d'onda di emissione. A differenza della microscopia a singolo fotone, la microscopia a due fotoni comporta l'eccitazione simultanea di due fotoni, ciascuno con lunghezze d'onda più lunghe di quella del segnale di fluorescenza emesso 24,25,26. Poiché due singoli fotoni devono co-localizzarsi per eccitare un singolo punto focale nel tessuto, l'eccitazione a due fotoni è spazialmente a un piccolo volume di campione, consentendo il sezionamento ottico 24,25,26 e c'è meno fotosbiancamento sopra e sotto il piano contenente il punto focale27. La probabilità di eccitazione simultanea da parte di due fotoni è molto bassa, quindi è necessario un laser pulsato a femtosecondi per raggiungere l'intensità di eccitazione richiesta per un segnale di emissione di fluorescenza 25,26,27. Il laser di eccitazione si trova nella gamma del vicino infrarosso (700-1100 nm), il cui vantaggio è una minore dispersione, che consente alla luce di penetrare più profondamente nel tessuto28. La profondità dell'imaging dipende dalla velocità di oscillazione e dalla potenza del laser24. All'interno del polmone, è possibile raggiungere profondità di imaging di ~500-600 μm17. Pertanto, la combinazione di profondità di imaging e basso fotobleaching rende la microscopia a due fotoni altamente adatta per l'imaging intravitale degli organi.

La microscopia a due fotoni è stata utilizzata in diversi tessuti e siti anatomici, come la pelle12,13, i linfonodi29, l'endotelio venoso30, la corteccia cerebrale10,11, il rene14,15 e il fegato31,32. Ad esempio, nel derma di topo, l'imaging intravitale a due fotoni è stato utilizzato per descrivere lo sciame di neutrofili a seguito di lesioni fisiche sterili12. In un modello di trombosi venosa, sono stati visualizzati monociti del sangue e neutrofili striscianti lungo l'endotelio della vena cava inferiore30. Le microglia umane sono state analizzate con successo in vivo dopo essere state xenotrapiantate in un modello di organoide cerebrale umano33. Grazie ai continui progressi della microscopia a due fotoni, l'imaging intravitale è possibile a profondità maggiori e anche in organi non statici. Ad esempio, profondità fino a 1000 μm sono state acquisite nella neocorteccia nei topi utilizzando un amplificatore rigenerativo Ti:Al2O3 34.

Una delle sfide dell'imaging intravitale negli organi toracici è la stabilizzazione dell'immagine. A causa del movimento del cuore che batte e della respirazione polmonare, gli artefatti da movimento possono ridurre significativamente la qualità dell'immagine. Sono stati sviluppati diversi metodi di stabilizzazione per l'imaging cardiaco e polmonare, tra cui l'incollaggio dell'organo 4,7, l'aspirazione-stabilizzazione 19,35,36,37 e la correzione del movimento a posteriori 38. La nostra tecnica di imaging del polmone si basa sull'incollaggio della superficie polmonare a un vetrino di copertura stabilizzato. Manteniamo il polmone perfuso, ventilato e normotermico, che simula le condizioni riscontrate in vivo. Rispetto al metodo di aspirazione-stabilizzazione descritto da Looney et al.19, questo protocollo presenta diversi vantaggi. In primo luogo, non richiediamo la creazione di un dispositivo di aspirazione specializzato. Invece, la nostra camera di imaging e la piastra superiore possono essere costruite con materiali prontamente disponibili in un laboratorio di microscopia. Inoltre, rispetto al dispositivo di aspirazione (che ha un diametro interno di 4 mm), la tecnica di incollaggio utilizzata in questo studio consente di ottenere una superficie di imaging più ampia (fino a 10 mm). Con l'incollaggio circonferenziale, l'area del polmone all'interno del cerchio di colla è adeguatamente vincolata e il movimento ventilatorio è ridotto al minimo. Rispetto alla tecnica di aspirazione, l'approccio del vetro di copertura impedisce la deformazione convessa della superficie polmonare, che potrebbe influenzare il flusso sanguigno capillare subpleurico. Gli svantaggi del nostro sistema includono l'impossibilità di rimuovere il vetrino coprioggetti senza compromettere la giunzione pleuroparenchimale. Pertanto, non è possibile visualizzare il polmone una seconda volta con la tecnica di colla utilizzata qui, mentre la tecnica di aspirazione consente l'imaging seriale. Inoltre, l'uso di una toracotomia richiede la perdita della normale pressione intratoracica negativa, che, combinata con la ventilazione a pressione positiva, non è fisiologica. Ulteriori limitazioni dell'imaging a due fotoni sono discusse di seguito.

Mentre il torace è aperto durante l'imaging intravitale, è fondamentale mantenersi il più vicino possibile a un ambiente fisiologico. La piastra di base su cui giace il topo viene mantenuta a una temperatura di 35-37 °C. Con solo la piastra di base riscaldata, abbiamo scoperto che la temperatura interna del topo (misurata tramite una sonda rettale) è ben regolata per diverse ore. Nella nostra esperienza, la motilità e il comportamento cellulare sono visibilmente influenzati solo quando la temperatura scende al di sotto di 32 °C, cosa improbabile che si verifichi con questa configurazione. Se si riscontra una difficoltà nel mantenere la normotermia tissutale o la perfusione polmonare durante la configurazione iniziale di questa camera di imaging, è possibile collegare due resistori aggiuntivi per riscaldare la piastra superiore oltre alla piastra di base (Figura 1 supplementare). Una volta ottimizzata la camera di imaging, non è necessario monitorare regolarmente la temperatura interna del topo durante ogni esperimento di imaging. Inoltre, abbiamo scoperto che la combinazione di garza imbevuta di soluzione salina posizionata sopra la cavità toracica aperta e l'anello occlusivo di colla attorno all'area del polmone da visualizzare sono efficaci nel ridurre al minimo le perdite di liquidi durante l'imaging.

Un'importante considerazione tecnica è il raggiungimento di una buona emostasi durante la resezione costale durante la creazione della finestra di imaging toracico. Parti della 3ae 5a costola sinistra vengono resecate e l'emorragia continua da queste costole tagliate comprometterà la sopravvivenza del topo durante l'imaging. Per combattere questo problema, si consiglia di bloccare prima le costole prossimalmente al punto in cui devono essere resecate per 10 s per trombosizzare la microvascolarizzazione (vedere Figura 1C, D). Quindi, dopo la resezione delle costole, i bordi tagliati delle costole devono essere coagulati liberamente con elettrocauterizzazione. Infine, è fondamentale posizionare il polmone sinistro sopra la striscia di garza imbevuta di soluzione salina (vedere Figura 1F) durante l'imaging per evitare che i bordi affilati delle costole perforano il polmone. Con questa combinazione di considerazioni tecniche, possiamo catturare video chiari del traffico di cellule immunitarie all'interno del parenchima polmonare con artefatti di movimento minimi per diverse ore senza lesioni polmonari o perdita dei normali modelli di perfusione.

La microscopia a due fotoni è stata utilizzata nei polmoni per studiare modelli di malattie infettive e infiammazioni sterili. Un gruppo ha utilizzato l'imaging a due fotoni per studiare la motilità e la migrazione delle cellule B della memoria residente a seguito di ripetute sfide dei polmoni di topo con il virus dell'influenza39. Inoltre, la microscopia a due fotoni è stata utilizzata nel trapianto di pelle, reni e isole pancreatiche 40,41,42,43. Con un modello di trapianto, il donatore e il ricevente possono essere modificati geneticamente per studiare le rispettive popolazioni cellulari. Per quanto ne sappiamo, il nostro gruppo è stato il primo a eseguire l'imaging intravitale a due fotoni nei trapianti di polmone murino4. Abbiamo osservato un rapido reclutamento e raggruppamento dei neutrofili a seguito di danno da ischemia-riperfusione mediato dal trapianto, che si è ridotto con la deplezione farmacologica dei monociti del sangue4. In lavori successivi, abbiamo dimostrato che i monociti derivati dalla milza ricevente facilitano lo stravaso dei neutrofili attraverso la produzione di IL-1B44. L'imaging intravitale in questi studi ci ha permesso di scoprire regolatori a monte dello stravaso dei neutrofili come possibili bersagli terapeutici per ridurre la risposta infiammatoria post-trapianto45. Inoltre, abbiamo anche eseguito l'imaging intravitale in cuori di topo battibili dopo trapianto eterotopico16. Abbiamo visualizzato il reclutamento dei neutrofili nel miocardio e abbiamo scoperto che la morte cellulare ferroptotica delle cellule del trapianto cardiaco avvia l'infiammazione dopo il trapianto di cuore46. Abbiamo applicato una tecnica di stabilizzazione simile agli archi aortici trapiantati per visualizzare il traffico monocitico nelle placche aterosclerotiche47. Questi studi hanno dimostrato la fattibilità e l'utilità dell'imaging intravitale di organi toracici trapiantati non statici.

Infine, vale la pena discutere i metodi per visualizzare i diversi tipi di cellule e il parenchima polmonare. Per marcare le cellule vengono utilizzati due metodi principali: 1) ceppi di topi transgenici con mutazioni knock-in di proteine fluorescenti e 2) anticorpi marcati con fluorescenza per colorare le cellule. I ceppi di topi transgenici comunemente usati per identificare le cellule immunitarie mediante microscopia a due fotoni includono LysM-GFP per i neutrofili48, CX3Cr1-GFP per varie popolazioni di macrofagi interstiziali49,50, CCR2-GFP per i monociti classici51, CD19-tdTomato per le cellule B52 e Foxp3-GFP per le cellule T regolatorie5. In particolare, CX3Cr1 da solo non è sufficiente per identificare in modo univoco le cellule, ma ciò può essere aiutato dalla morfologia e dalla posizione cellulare coerenti con quella dei macrofagi interstiziali. I macrofagi alveolari possono essere visualizzati senza marcatura a causa della loro autofluorescenza 53,54, della morfologia distintiva e del comportamento (cioè la mancanza di motilità alla risoluzione temporale delle registrazioni time-lapse). Rispetto agli eosinofili, che sono anch'essi autofluorescenti, i macrofagi alveolari sono più grandi e considerevolmente più luminosi con un'eccitazione di 890 nm54. In alternativa, i macrofagi alveolari possono anche essere marcati in base alla loro funzione fagocitaria attraverso la somministrazione intrapolmonare di aggregati coloranti54.

La visualizzazione delle cellule immunitarie nei riceventi di trapianto può essere ottenuta anche mediante trasferimento adottivo intravascolare di cellule marcate in fluorescenza o mediante iniezione di anticorpi marcati in fluorescenza contro marcatori di superficie specifici per le cellule18,55. Un altro vantaggio intrinseco della microscopia a due fotoni è l'SHG da parte di alcune strutture birrifrangenti all'interno del tessuto, come il collagene56. Questo fenomeno è particolarmente utile per l'imaging polmonare a causa dell'elevato contenuto di collagene nelle sacche alveolari, che funge da indicatore intrinseco della struttura alveolare senza ulteriori coloranti fluorescenti. Inoltre, gli alveoli sono anche circoscritti da capillari alveolari marcati da q-dot da 655 nm. Infine, i vasi sanguigni possono essere marcati con l'iniezione endovenosa di q-dots (come descritto in questo protocollo) o di rodamina B destrano. Quando si progetta un esperimento di microscopia intravitale a due fotoni, si raccomanda l'uso di non più di quattro diversi canali di emissione per ridurre al minimo il rischio di sanguinamento e scarsa differenziazione tra i canali.

Uno dei principali limiti della nostra tecnica di stabilizzazione della colla descritta è l'incapacità di rimuovere il vetrino coprioggetto dal polmone senza potenziali danni ai tessuti e residui di colla sulla superficie polmonare. Pertanto, il polmone può essere esaminato solo una volta piuttosto che in più punti temporali nell'arco di più giorni. Per affrontare questa limitazione, un gruppo ha descritto una finestra di imaging toracico semipermanente, che consente l'imaging seriale del polmone57. Tuttavia, nella nostra esperienza, questo approccio non consente un'adeguata stabilizzazione polmonare per periodi prolungati di imaging. Questa tecnica offre la possibilità di visualizzare il polmone per più ore, il che fornisce informazioni chiave sulle risposte immunitarie innate e adattative dopo il trapianto.

Altre limitazioni dell'imaging a due fotoni includono il costoso costo iniziale della configurazione e l'esperienza necessaria per mantenere il sistema. I campi di scansione sono relativamente piccoli rispetto all'imaging in immunofluorescenza. Il danneggiamento termico e il fotodanneggiamento possono essere significativi senza un'attenta ottimizzazione dei parametri di acquisizione. La funzione di diffusione del punto di eccitazione a due fotoni è ampia, il che limita in qualche modo la risoluzione, specialmente nella dimensione z. Inoltre, l'imaging a due fotoni richiede che le cellule di interesse siano marcate in fluorescenza e alcune cellule non possono essere etichettate in modo inequivocabile con un singolo marcatore cellulare. Il numero di segnali che possono essere riprodotti contemporaneamente è spesso limitato a quattro o meno. Infine, l'anestesia, la chirurgia e l'imaging possono indurre un'infiammazione aggiuntiva e cambiamenti fisiologici oltre al trapianto di polmone che possono confondere i risultati sperimentali e le interpretazioni nonostante i migliori sforzi per mantenere un ambiente fisiologico. Le direzioni future includono lo sviluppo di metodi minimamente invasivi di imaging intravitale (ad esempio attraverso una toracotomia più piccola o un approccio broncoscopico).

In conclusione, la microscopia intravitale a due fotoni è uno strumento prezioso nello studio di molteplici processi patologici. Qui, descriviamo una tecnica affidabile di immobilizzazione polmonare e imaging a due fotoni, che consente l'osservazione intravitale del traffico cellulare e delle interazioni dinamiche tra diverse popolazioni cellulari dopo il trapianto di polmone murino. Questa tecnica ha ampliato la nostra comprensione del panorama immunitario post-trapianto e continuerà ad essere uno strumento indispensabile nello studio del trapianto di polmone e di altri processi di malattie polmonari.

Dichiarazioni

Gli autori non riportano alcuna divulgazione rilevante.

Ringraziamenti

Questo lavoro è sostenuto da sovvenzioni del NIH 1P01AI11650 e della Foundation for Barnes-Jewish Hospital. Ringraziamo l'In Vivo Imaging Core della Washington University School of Medicine.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,75% povidone-iodioAplicareNDC 52380-0126-2Per disinfettante
Catetere IV da 1 pollice 20GTerumoSROX2025CAPer tubo endotracheale (ETT)
Nastro di seta da 1 polliceDurapore3M ID 7100057168Per fissare il mouse in posizione
Obiettivo lungo ad immersione in acqua 20x
3M VetbondMedi-Vet.com10872Per incollare il vetro coprioggetto ai punti
quantici non mirati da 655 nmThermoFisherQ21021MPPer l'etichettatura di vasi sanguigni
70% etanoloSigma AldrichEX0281Per disinfettante
Argent High Temp Penna cauterica a punta fineMcKesson231
Black O-ring (2 cm)FerramentaN/APer imaging su misura bullone
della camera (2)Negozio di ferramentaN/APer camera di imaging su misura
Dado a testa zigrinata in ottone (2)Negozio di ferramentaN/APer camera di imaging su misura
Buprenorfina 1,3 mg/mLFidelis Animal HealthNDC 86084-100-30Per il controllo del dolore
Laser pulsato a femtosecondi camaleonte titanio-zaffiroCoerenteN/A
Vetro di copertura (24 mm x 50 mm)Thomas Scientific1202F63Per camera di imaging su misura
Morsetto per zanzare curvo (1)Fine Science Tools13009-12
Controller riscaldatore a doppio canaleWarner InstrumentsTC-344B
Forbici fini (1)Fine Science Tools15040-11
Microscopio verticale a tavolino fissoOlympusBX51WI
Garza (tagliata a 1 cm x 3 cm)McKesson476709Da posizionare sotto il polmone sinistro
Grasso per alto vuotoDow CorningN/APer far aderire il vetro coprioggetto sulla piastra superiore
Isoflurano 1%Sigma Aldrich26675-46-7Per anestesia
Ketamina cloridrato 100 mg/mLVedcoNDC 50989-996-06Per anestesia
Foglio metallico (3 cm x 7 cm)FerramentaN/APer camera di imaging su misura
Applicatori appuntiti con punta in cotoneSolon56225Per manipolare i polmoni e per la dissezione contundente
Power Pro Ultraclipper Oster078400-020-001
Unguento per gli occhi Puralube VetMedi-Vet.com11897Per prevenire la disidratazione oculare
Ventilatore per piccoli animaliHarvard Apparecchio55-0000
Pinze diritte (1)Fine Science Tools91113-10
Driver per otturatore a tre canaliUniblitzVMM-D3Scanner risonante
x.y.z motore passo-passo otticoPrior ScientificOptiScan II
Xilazina 20 mg/mLAkornNDC 59399-110-20Per il controllo del dolore
Colla Olympus N20X-PFH

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