Qui, presentiamo un protocollo per l'imaging intravitale del polmone sinistro del topo trapiantato utilizzando la microscopia a due fotoni. Questo rappresenta uno strumento prezioso per studiare le dinamiche e le interazioni cellulari in tempo reale dopo il trapianto di polmone murino.
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Articolo metodologico
Microscopia intravitale a due fotoni del polmone di topo trapiantato
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le complicanze dopo il trapianto di polmone sono in gran parte correlate alla risposta del sistema immunitario dell'ospite al trapianto. Tali risposte immunitarie sono regolate dal crosstalk tra le cellule donatrici e riceventi. Una migliore comprensione di questi processi si basa sull'uso di modelli animali preclinici ed è aiutata dalla capacità di studiare il traffico di cellule immunitarie all'interno del trapianto in tempo reale. La microscopia intravitale a due fotoni può essere utilizzata per l'imaging di tessuti e organi per profondità fino a diverse centinaia di micron con un fotodanno minimo, il che offre un grande vantaggio rispetto alla microscopia confocale a singolo fotone. L'uso selettivo di topi transgenici con espressione proteica fluorescente promotore-specifica e/o il trasferimento adottivo di cellule marcate con colorante fluorescente durante la microscopia intravitale a due fotoni consente lo studio dinamico di singole cellule all'interno del loro ambiente fisiologico. Il nostro gruppo ha sviluppato una tecnica per stabilizzare i polmoni di topo, che ci ha permesso di visualizzare le dinamiche cellulari nei polmoni naïve e negli innesti polmonari trapiantati ortotopicamente. Questa tecnica consente una valutazione dettagliata del comportamento cellulare all'interno del sistema vascolare e nell'interstizio, nonché l'esame delle interazioni tra le varie popolazioni cellulari. Questa procedura può essere facilmente appresa e adattata per studiare i meccanismi immunitari che regolano le risposte infiammatorie e tollerogeniche dopo il trapianto di polmone. Può anche essere esteso allo studio di altre condizioni polmonari patogene.
Introduzione
Il trapianto di polmone è l'opzione finale per molti pazienti affetti da malattia polmonare allo stadio terminale; Tuttavia, la sopravvivenza a lungo termine dopo il trapianto di polmone è scarsa rispetto ad altri trapianti di organi solidi. La sopravvivenza a 5 anni è solo ~60%-70%1, rispetto all'80%-90% nei cuori2 e all'85%-90% nei reni3. Molte complicanze dopo il trapianto di polmone, come la disfunzione primaria del trapianto, il rigetto mediato da anticorpi e la disfunzione cronica dell'allotrapianto polmonare, sono dovute alla risposta immunitaria dell'ospit....
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Protocollo
Tutte le procedure di manipolazione degli animali sono state condotte in conformità con le linee guida del National Institutes of Health Care and Use of Laboratory Animals e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso la Washington University School of Medicine.
1. Anestesia e intubazione
NOTA: Viene eseguito il trapianto ortotopico di polmone sinistro di topo, come precedentemente descritto20,21. I polmoni di topi C57BL/6 (B6) da 20-25 g vengono trapiantati in riceventi di....
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Risultati
Dopo 1 ora di conservazione ischemica a freddo a 4 °C, abbiamo trapiantato ortotopicamente il polmone sinistro da un topo B6 a un B6. LysM-GFP sul topo4, e quindi è stato eseguito l'imaging intravitale a due fotoni, come descritto sopra. Abbiamo eseguito l'imaging in due punti temporali dopo il trapianto: 2 ore (Figura 3A) e 24 ore (Figura 3B). I vasi sanguigni sono etichettati in rosso dai punti q iniettati immediatamente prima dell'imag.......
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Discussione
L'eccitazione a due fotoni è stata descritta per la prima volta nella sua tesi di dottorato da Maria Göppert-Mayer nel 1931, che in seguito vinse il premio Nobel per la fisica per aver descritto la struttura del guscio nucleare22,23. La microscopia a fluorescenza tradizionale si basa sull'eccitazione di un singolo fotone, con lunghezze d'onda di eccitazione più corte e più elevate rispetto alle lunghezze d'onda di emissione. A di.......
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Dichiarazioni
Gli autori non riportano alcuna divulgazione rilevante.
Ringraziamenti
Questo lavoro è sostenuto da sovvenzioni del NIH 1P01AI11650 e della Foundation for Barnes-Jewish Hospital. Ringraziamo l'In Vivo Imaging Core della Washington University School of Medicine.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,75% povidone-iodio | Aplicare | NDC 52380-0126-2 | Per disinfettante |
| Catetere IV da 1 pollice 20G | Terumo | SROX2025CA | Per tubo endotracheale (ETT) |
| Nastro di seta da 1 pollice | Durapore | 3M ID 7100057168 | Per fissare il mouse in posizione |
| Obiettivo lungo ad immersione in acqua 20x | |||
| 3M Vetbond | Medi-Vet.com | 10872 | Per incollare il vetro coprioggetto ai punti |
| quantici non mirati da 655 nm | ThermoFisher | Q21021MP | Per l'etichettatura di vasi sanguigni |
| 70% etanolo | Sigma Aldrich | EX0281 | Per disinfettante |
| Argent High Temp Penna cauterica a punta fine | McKesson | 231 | |
| Black O-ring (2 cm) | Ferramenta | N/A | Per imaging su misura bullone |
| della camera (2) | Negozio di ferramenta | N/A | Per camera di imaging su misura |
| Dado a testa zigrinata in ottone (2) | Negozio di ferramenta | N/A | Per camera di imaging su misura |
| Buprenorfina 1,3 mg/mL | Fidelis Animal Health | NDC 86084-100-30 | Per il controllo del dolore |
| Laser pulsato a femtosecondi camaleonte titanio-zaffiro | Coerente | N/A | |
| Vetro di copertura (24 mm x 50 mm) | Thomas Scientific | 1202F63 | Per camera di imaging su misura |
| Morsetto per zanzare curvo (1) | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Controller riscaldatore a doppio canale | Warner Instruments | TC-344B | |
| Forbici fini (1) | Fine Science Tools | 15040-11 | |
| Microscopio verticale a tavolino fisso | Olympus | BX51WI | |
| Garza (tagliata a 1 cm x 3 cm) | McKesson | 476709 | Da posizionare sotto il polmone sinistro |
| Grasso per alto vuoto | Dow Corning | N/A | Per far aderire il vetro coprioggetto sulla piastra superiore |
| Isoflurano 1% | Sigma Aldrich | 26675-46-7 | Per anestesia |
| Ketamina cloridrato 100 mg/mL | Vedco | NDC 50989-996-06 | Per anestesia |
| Foglio metallico (3 cm x 7 cm) | Ferramenta | N/A | Per camera di imaging su misura |
| Applicatori appuntiti con punta in cotone | Solon | 56225 | Per manipolare i polmoni e per la dissezione contundente |
| Power Pro Ultra | clipper Oster | 078400-020-001 | |
| Unguento per gli occhi Puralube Vet | Medi-Vet.com | 11897 | Per prevenire la disidratazione oculare |
| Ventilatore per piccoli animali | Harvard Apparecchio | 55-0000 | |
| Pinze diritte (1) | Fine Science Tools | 91113-10 | |
| Driver per otturatore a tre canali | Uniblitz | VMM-D3 | Scanner risonante |
| x.y.z motore passo-passo ottico | Prior Scientific | OptiScan II | |
| Xilazina 20 mg/mL | Akorn | NDC 59399-110-20 | Per il controllo del dolore |
Riferimenti
- Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-eighth adult lung transplantation report - 2021; Focus on recipient characteristics. J Heart Lung Transplant. 40 (10), 1060-1072 (2021).
- Khush, K. K.,
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Ristampe e permessi
