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Articolo metodologico

Valutazione delle misure di esito della connettività dell'unità motoria del diaframma di ratto come biomarcatori quantitativi della degenerazione e della compensazione del motoneurone frenico

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DOI:

10.3791/66568

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19 aprile 2024

 ,  ,  ,  , 
1NextGen Precision Health, University of Missouri, 2Department of Biomedical Sciences, University of Missouri, 3Department of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Missouri, 4Department of Neurology, University of Missouri, 5Department of Medical Pharmacology and Physiology, University of Missouri, 6Dalton Cardiovascular Research Center, University of Missouri

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

In questo studio, presentiamo un metodo in vivo per stimare il numero e le dimensioni dell'unità motoria per quantificare la connettività dell'unità motore del diaframma di ratto. Viene descritto un approccio graduale a queste tecniche.

Abstract

La perdita della funzione del muscolo ventilatorio è una conseguenza della lesione del motoneurone e della neurodegenerazione (ad esempio, lesione del midollo spinale cervicale e sclerosi laterale amiotrofica, rispettivamente). I motoneuroni frenici sono l'ultimo collegamento tra il sistema nervoso centrale e il muscolo, e le rispettive unità motorie (gruppi di fibre muscolari innervate da un singolo motoneurone) rappresentano la più piccola unità funzionale del sistema ventilatorio neuromuscolare. Il potenziale d'azione muscolare composto (CMAP), il potenziale di unità motoria singola (SMUP) e la stima del numero di unità motorie (MUNE) sono approcci elettrofisiologici consolidati che consentono la valutazione longitudinale dell'integrità dell'unità motoria in modelli animali nel tempo, ma sono stati applicati principalmente ai muscoli degli arti. Pertanto, gli obiettivi di questo studio sono descrivere un approccio negli studi preclinici sui roditori che può essere utilizzato longitudinalmente per quantificare la MUNE frenica, la dimensione dell'unità motoria (rappresentata come SMUP) e il CMAP, e quindi dimostrare l'utilità di questi approcci in un modello di perdita di motoneuroni. Biomarcatori sensibili, oggettivi e traslazionalmente rilevanti per il danno neuronale, la degenerazione e la rigenerazione nel danno e nelle malattie del motoneurone possono aiutare e accelerare in modo significativo le scoperte della ricerca sperimentale per i test clinici.

Introduzione

I motoneuroni frenici (MN), che si estendono dai livelli di miotomo C3 a C6, formano l'ultimo collegamento dal sistema nervoso centrale (SNC) al muscolo diaframma1. Le unità motorie freniche (MU) sono costituite da un singolo MN spinale e dalle sue fibre muscolari del diaframma innervate che formano la più piccola unità funzionale del sistema neuromuscolare respiratorio. La funzione ventilatoria richiede un'adeguata contrazione del muscolo diaframma ottenuta attraverso l'attivazione coordinata del pool frenico di MU 2,3. Molte malattie neurologiche, tra cui la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), provocano una grave compromissione ventilatoria, contribuendo in ultima analisi alla causa della morte4.

Diversi approcci elettrofisiologici possono essere impiegati per valutare e monitorare l'integrità del pool di unità motorie (MU) in vivo. Il potenziale d'azione muscolare composto (CMAP) riflette la depolarizzazione sommata di tutte le fibre muscolari in un muscolo specifico o gruppo muscolare dopo la stimolazione dei nervi periferici ed è sensibile a una serie di condizioni neuromuscolari, tra cui la SLA 5,6 e l'atrofia muscolare spinale (SMA)7,8,9. Una limitazione della valutazione CMAP è che la germinazione collaterale può portare al mantenimento dell'ampiezza e dell'area CMAP anche in presenza di perdita di MU10. Per superare questa limitazione, sono state apportate modifiche alla tecnica CMAP per valutare sia il numero dell'unità motoria che la taglia11. Inoltre, uno studio in vivo che ha indagato la valutazione funzionale della CMAP del diaframma mediante un sistema elettrofisiologico ha suggerito che potrebbe anche essere fattibile utilizzare la tecnica di registrazione CMAP del diaframma descritta per la stima del numero di unità motorie12.

La tecnica di stima incrementale del numero di unità motorie (MUNE) è stata inizialmente introdotta nei primi anni '70 da McComas et al. per il muscolo estensore breve delle dita nell'uomo13. L'approccio incrementale MUNE è stato una modifica della tradizionale tecnica di registrazione CMAP durante la quale è stata erogata una stimolazione gradualmente crescente per registrare incrementi quantistici, tutti o nessuno, submassimali come indici delle risposte di singole unità motorie. Gli incrementi sommati e medi sono stati utilizzati per calcolare una stima della dimensione di un potenziale di una singola unità motoria (SMUP). Questa dimensione calcolata è stata poi divisa nell'ampiezza CMAP per stimare il numero di MU che innervano il muscolo in esame11. MUNE dimostra un'elevata sensibilità nel rilevare e monitorare la perdita di unità motorie, consentendo l'identificazione della disfunzione dell'unità motoria prima di cambiamenti osservabili in misure come l'ampiezza CMAP o l'area14,15. Nei pazienti affetti da SLA, MUNE ha dimostrato di essere eccezionalmente sensibile, fungendo da importante biomarcatore per l'insorgenza, la progressione e la prognosi della malattia16,17.

Numerosi adattamenti di MUNE sono stati sviluppati e ampiamente utilizzati per valutare la funzione MU in condizioni come la neurodegenerazione, il danno neurale e il naturale processo di invecchiamento 18,19,20,21. Dalla descrizione iniziale, vari adattamenti che utilizzano sia le risposte elettrofisiologiche che le misurazioni della forza incrementale (meccanica) sono stati impiegati sia negli studi sull'uomo che nei modelli animali22. MUNE fornisce una valutazione funzionale non invasiva della connettività dei motoneuroni con il muscolo. L'applicazione longitudinale di MUNE consente la comprensione della progressione della malattia o del fenotipo indotto e la valutazione degli effetti protettivi o rigenerativi degli interventi terapeutici, sia in ambito clinico che preclinico. Indipendentemente dall'efficacia delle misure MUNE e dalla rilevanza clinica della tecnica per i pool di MU nella maggior parte del corpo umano, gli sforzi si sono in gran parte concentrati sui muscoli degli arti nei muscoli dei roditori 10,23,24,25.

Pertanto, gli obiettivi di questo studio erano descrivere un approccio per ottenere il potenziale d'azione muscolare composto (CMAP), SMUP e il numero di unità motorie freniche (MUNE) come valutazioni in vivo che possono essere utilizzate longitudinalmente negli studi preclinici sui roditori per quantificare il MUNE, la dimensione dell'unità motoria (rappresentata come SMUP) e il CMAP. Inoltre, presentiamo dati rappresentativi che evidenziano la perdita del numero di MU del diaframma in seguito alla somministrazione intrapleurica di un agente degenerativo frenico MN, il frammento della tossina B del colera coniugato alla saporina (CTB-SAP).

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Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate e condotte in conformità con le linee guida stabilite dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università del Missouri. Gli esperimenti sono stati eseguiti su ratti maschi adulti di Sprague-Dawley, di età compresa tra 11 e 15 settimane. Questi ratti sono stati alloggiati in coppia e tenuti sotto un ciclo luce-buio 12:12, con accesso a cibo pellettato standard commerciale e acqua trattata con HCl disponibile in ogni momento.

1. Preparazione degli animali e somministrazione dell'anestesia

  1. Indossare adeguati dispositivi di protezione individuale durante la manipolazione dei topi.
  2. Somministrare un anestetico per inalazione con isoflurano al 3-5%, garantendo una corretta induzione. Una volta che il ratto è adeguatamente anestetizzato, metterlo in posizione supina e mantenere l'anestesia con l'1-3% di isoflurano inalato. Verificare la sufficienza della profondità dell'anestesia applicando delicatamente una pressione sul cuscinetto del piede dell'arto posteriore utilizzando una pinza per assicurarsi che non vi sia alcuna risposta di ritiro.
    NOTA: In base alle dimensioni e al peso del ratto, monitorare la profondità dell'anestesia e regolare di conseguenza la concentrazione di isoflurano.
  3. Mantenere la temperatura di 37 °C utilizzando una piastra riscaldante termostatica per evitare variazioni di temperatura che possono influire sull'ampiezza e sulla latenza del CMAP.
  4. Applicare un unguento veterinario a base di petrolio sugli occhi per prevenire la secchezza. Monitora la profondità dell'anestesia osservando la frequenza respiratoria e controllando le risposte di astinenza dopo aver applicato pressione al cuscinetto del piede con una pinza.
  5. Rimuovere i peli dal terzo inferiore del torace e del collo da studiare utilizzando un tagliacapelli. Monitorare la respirazione del ratto durante l'intero esperimento.
    NOTA: Dopo le registrazioni CMAP e MUNE e l'interruzione dell'anestesia, non lasciare il ratto incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza. Non rimettere l'animale nella gabbia di casa fino a quando non si è completamente ripreso.

2. Posizionamento e configurazione dell'elettrodo

  1. Posizionare una coppia di elettrodi ad ago monopolari da 28 G per registrare CMAP, SMUP e MUNE come illustrato nella Figura 1.
    1. Posizionare l'elettrodo dell'ago attivo (E1) per via sottocutanea sopra la linea clavicolare media inferiore all'ultimo bordo costale e l'elettrodo dell'ago di riferimento (E2) per via sottocutanea nell'angolo tra il processo xifoideo e l'ultima cartilagine sternocostale.
      NOTA: Gli elettrodi dell'ago non devono essere inseriti nel muscolo del diaframma; Invece, dovrebbero essere posizionati nella zona sottocutanea.
  2. Per la stimolazione del nervo frenico sul foglio carotideo, utilizzare una coppia di elettrodi ad ago monopolari da 28 G come catodo e anodo per la stimolazione nervosa e posizionati per via sottocutanea sopra il collo laterale tra i muscoli scaleno anteriore e medio, separati da circa 1 cm. Assicurarsi che il posizionamento degli aghi stimolanti sia al livello inferiore alla quarta vertebra cervicale (C4).
    NOTA: Evitare di inserire gli elettrodi stimolanti troppo in profondità per evitare lesioni al nervo frenico o ad altre strutture. La Figura 1 illustra il posizionamento degli elettrodi.
  3. Per l'elettrodo di terra, posizionare un elettrodo di superficie monouso sulla coda.

3. Acquisizione dati

  1. CMAP frenico
    1. Registrare le risposte CMAP freniche applicando impulsi catodici monofasici a onda quadra con una durata di 0,1 ms e un'intensità compresa tra 60 e 100 mA per stimolare il nervo frenico.
    2. Ottenere risposte CMAP aumentando progressivamente l'intensità dello stimolo fino a quando l'ampiezza della risposta cessa di mostrare un ulteriore aumento. Per garantire una stimolazione sopramassimale, aumentare l'intensità dello stimolo a circa il 120% del livello utilizzato per suscitare una risposta massimale e registrare una risposta aggiuntiva. Se le dimensioni del CMAP non aumentano più, considerare questa risposta come il CMAP massimo.
      NOTA: È preferibile erogare la stimolazione durante l'espirazione per ridurre al minimo il rumore dell'attività muscolare concomitante durante la registrazione CMAP.
    3. Misurare e documentare le ampiezze picco-picco del CMAP in millivolt (mV) (Figura 2).
      NOTA: L'ampiezza CMAP può essere valutata da base a picco e da picco a picco. I sistemi elettrodiagnostici clinici sono spesso predefiniti per valutare il rapporto base-picco, che viene calcolato dalla linea di base isoelettrica al picco negativo iniziale.
  2. Dimensione media del potenziale di unità motore singola (SMUP) e calcolo MUNE
    1. Calcolare la dimensione media della SMUP utilizzando una tecnica di stimolazione incrementale.
      1. Per ottenere risposte incrementali, somministrare una stimolazione submassimale con una durata di 0,1 ms a una frequenza di 1 Hz, aumentando gradualmente l'intensità con incrementi di 0,03 mA fino a raggiungere una risposta minima tutto o niente. Acquisire la risposta iniziale con un'intensità di stimolo compresa tra 2 mA e 10 mA.
      2. Se la risposta iniziale non si verifica con un'intensità dello stimolo compresa tra 2 mA e 10 mA, modificare la posizione del catodo stimolante, avvicinandolo o allontanandolo dal nervo frenico nel collo, per diminuire o aumentare l'intensità dello stimolo necessaria, rispettivamente.
      3. Se la prima risposta incrementale viene ottenuta con un'intensità di stimolo compresa tra 2 mA e 10 mA, salvare la prima risposta e acquisire incrementi aggiuntivi con intensità di stimolo progressivamente più elevate, regolando con incrementi di 0,03 mA, per ottenere un totale di 9 incrementi aggiuntivi che soddisfano i seguenti criteri nel passaggio 3.2.2.
        NOTA: Ogni SMUP viene quantificato sottraendo ogni incremento dall'incremento precedente.
    2. Durante la misurazione delle risposte incrementali, assicurarsi che ogni incremento soddisfi i seguenti criteri:
      1. Assicurarsi che il picco negativo iniziale delle risposte incrementali si allinei temporalmente con il picco negativo della risposta CMAP massima.
        NOTA: I lievi movimenti osservati a causa del rumore di fondo dei cicli respiratori sono inerenti alla natura dell'esperimento. Tuttavia, la presenza costante di SMUP durante l'osservazione dal vivo conferma la loro identità per quello specifico CMAP.
      2. Poiché il diaframma è un muscolo dinamico coinvolto nella respirazione, ogni ciclo di respirazione può indurre un movimento di base. Pertanto, verificare la stabilità e l'assenza di frazionamento in ciascuna risposta incrementale confermando la coerenza tra tre risposte duplicate.
        NOTA: Per distinguere i potenziali evocati di bassa ampiezza, in particolare il primo SMUP, dal rumore di fondo dovuto all'attività respiratoria, è importante rimanere vigili e osservare per 3-4 cicli respiratori. Garantire inoltre l'allineamento dei picchi con quelli del CMAP per garantire la precisione.
      3. Assicurati che ogni incremento sia distinto e maggiore del precedente. Pertanto, distinguere visivamente le risposte incrementali in tempo reale, osservandole mentre si sovrappongono agli incrementi registrati in precedenza.
        NOTA: È possibile eseguire repliche multiple dello stimolo ad ogni ampiezza per garantire la coerenza degli incrementi e il rispetto dei criteri predefiniti.
      4. Dopo aver verificato visivamente ogni incremento con i criteri di cui sopra, verificare che l'ampiezza dell'incremento sia di almeno 25 μV. Se l'incremento è inferiore a 25 μV, scartare la misurazione e rivalutare la risposta.
      5. Dopo la registrazione di 10 risposte incrementali, verificare che l'ampiezza di ciascuna risposta incrementale non sia superiore a un terzo dell'ampiezza combinata di tutti e 10 gli incrementi, che rappresenta l'ampiezza totale della risposta finale. Se questo criterio non è soddisfatto, ripetere la misurazione delle 10 risposte incrementali.
        NOTA: La soglia di un terzo si basa sul presupposto che ogni risposta incrementale rappresenti l'attivazione di una singola unità motoria. Se l'ampiezza di una risposta incrementale supera un terzo dell'ampiezza combinata di tutti e dieci gli incrementi, ciò suggerisce che la risposta potrebbe non essere attribuibile esclusivamente all'attivazione di una singola unità motoria. Invece, potrebbe essere influenzato dal reclutamento di unità motorie aggiuntive o dalla presenza di attività non specifiche, come rumore elettrico o artefatti22,26.
      6. Per stimare l'ampiezza media degli SMUP, fare la media dei valori dei 10 incrementi. Un altro metodo per misurare l'ampiezza media della SMUP consiste nel dividere l'intera ampiezza della risposta incrementale finale per il numero totale di incrementi11.
    3. Determinare MUNE dividendo l'ampiezza massima del CMAP (picco-picco) per l'ampiezza media del SMUP (picco-picco). In alcuni sistemi elettrofisiologici, gli SMUP sono registrati in microvolt (μV), mentre il CMAP è solitamente espresso in millivolt (mV). Se necessario, convertire le misure CMAP e SMUP nelle stesse unità prima di calcolare MUNE.
      NOTA: Il CMAP da picco a picco, l'SMUP medio e il MUNE sono in genere calcolati automaticamente dai sistemi di elettromiografia clinica):
      figure-protocol-1
      CMAP = Potenziale d'azione muscolare composto
      SMUP = Potenziale di unità motore singola
      MUNE = Stima del numero di unità motorie

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Risultati

Le tecniche CMAP, SMUP e MUNE descritte in questo rapporto consentono la registrazione della funzione neuromuscolare nel muscolo diaframma utilizzando il posizionamento di elettrodi minimamente invasivo (Figura 1). I parametri di ampiezza e area possono essere impiegati per caratterizzare la dimensione sovramassima del CMAP, fornendo una misura complessiva dell'output del gruppo muscolare (Figura 2). Tuttavia, nei nostri metodi attuali, ci affidiamo all'ampiezza...

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Discussione

Nelle malattie degenerative MN, come la SLA, è fondamentale valutare le MU coinvolte nella ventilazione28. Nonostante l'insorgenza di degenerazione respiratoria MN nei pazienti affetti da SLA, l'insorgenza specifica e la progressione della morte MN rimangono incomplete 29,30,31. Riconoscendo l'importanza di questo aspetto, vari modelli, sia su base genetica (ad esempio, S...

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Dichiarazioni

WDA ha ricevuto finanziamenti per la ricerca da NMD Pharma, Avidity Biosciences e onorari di consulenza da NMD Pharma, Avidity Biosciences, Dyne Therapeutics, Novartis, Design Therapeutics, Catalyst Pharmaceuticals e Novartis.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del programma di ricerca sulle lesioni/malattie del midollo spinale del Missouri Spinal Cord Injury/Disease Research Program (NLN e WDA).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa in vetro da 2 mLKent Scientific CorporationSOMNO-2ML
50 mL, siringa modello 705 RNHamilton Company7637-01Utilizzato per condurre l'iniezione intrapleurica
5008 - Formulab DietLabDiet 0001325
Aghi autoclavabili da 26 G (26S RN 9,52 mm 40°)Hamilton Company7804-04Utilizzato per condurre l'iniezione intrapleurica
della tossina del colera B-subunità (CTB)MilliporeSigmaC9903Utilizzato per l'iniezione intrapleurica per etichettare i motoneuroni sopravvissuti della
tossina del colera B-subunità coniugata alla saporina (CTB-SAP)Advanced Targeting SystemsIT-14Utilizzato per l'iniezione intrapleurica per causare la morte del motoneurone
Cavo staccabileTechnomed202845-0000per collegare l'elettrodo del registratore alla macchina elettrodiagnostica
Elettrodo a disco monouso da 2" x 2" con caviCadwell302290-000Elettrodo di terra
monouso aghi monopolari 28 GTechnomed202270-000Elettrodi stimolanti catodici e anodici- elettrodi di registrazione
Cavo ago EMG (scatola interruttore Amp/stim)Cadwell190266-200per collegare gli elettrodi monopolari allo stimolatore elettrodiagnostico
Helping Hands clip a coccodrillo con base in ferroRadio Shack64-079Mantenimento del posizionamento degli elettrodi di registrazione 
Isoflurano (flacone da 250 ml)Piramal Healthcare
Covidien81412012utilizzata per l'applicazione del gel per elettrodi Sistema di
monitoraggio fisiologico PhysioSuite con riscaldamento omeotermico RightTempKent Scientific CorporationPS-RTInclude un cuscinetto riscaldante a infrarossi, una sonda rettale e una sonda di temperatura
del pad Pro trimmer Pet Kit per la toelettaturaOster078577-010-003tosatrici per depilazione
Saporin (SAP)Advanced Targeting SystemsPR-01Utilizzato per l'iniezione intrapleurica (agente di controllo quando iniettato da solo)
Sistema EMG Sierra SummitCadwell Industries, Inc., Kennewick, WAsistema elettrodiagnostico portatile
SomnoSuite Sistema di anestesia digitale a basso flussoKent Scientific CorporationSOMNOInclude adattatore per tappo di bottiglia anti-fuoriuscita e anti-vapore; Tubo adattatore a Y; filtro per lo scavenging del carbone
Sprague-Dawley ratEnvigo colony 208a, Indianapolis, IN
Unguento oftalmico veterinario a base di petrolio Puralube26870applicato durante l'anestesia per evitare lesioni corneali
Siringa per irrigazione a punta curva monoject

Riferimenti

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Valutazione delle misure di esito della connettività dell'unità motoria del diaframma di ratto come biomarcatori quantitativi della degenerazione e della compensazione del motoneurone frenico
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