Quantificazione non distruttiva basata su SPE-UPLC di aflatossine e fitoalessine stilbenoidi in arachidi singole (Arachis spp.) Semi

Sommario

Dimostriamo un metodo a medio rendimento per la quantificazione delle aflatossine e delle fitoalessine stilbenoidi in singoli semi di arachidi utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni. Questo metodo è stato sviluppato specificamente per l'analisi delle specie selvatiche di Arachis sfidate dalla specie aflatossigena Aspergillus .

Abstract

Le aflatossine sono metaboliti secondari altamente cancerogeni di alcune specie fungine, in particolare l'Aspergillus flavus. Le aflatossine spesso contaminano prodotti agricoli economicamente importanti, comprese le arachidi, ponendo un rischio elevato per la salute umana e animale. A causa della ristretta base genetica, le cultivar di arachidi dimostrano una resistenza limitata ai patogeni fungini. Pertanto, numerose specie di arachidi selvatiche con tolleranza all'Aspergillus hanno ricevuto una notevole considerazione da parte degli scienziati come fonti di resistenza alle malattie.

Esplorare il germoplasma vegetale per la resistenza alle aflatossine è difficile poiché l'accumulo di aflatossine non segue una distribuzione normale, il che impone la necessità di analizzare migliaia di singoli semi di arachidi. I semi di arachidi (Arachis spp.) sufficientemente idratati, quando infettati da specie di Aspergillus , sono in grado di produrre stilbeni biologicamente attivi (stilbenoidi) che sono considerati fitoalessine difensive. Gli stilbeni delle arachidi inibiscono lo sviluppo fungino e la produzione di aflatossine. Pertanto, è fondamentale analizzare gli stessi semi per gli stilbenoidi delle arachidi per spiegare la natura della resistenza/suscettibilità dei semi all'invasione di Aspergillus . Nessuno dei metodi pubblicati offre analisi su seme singolo per aflatossine e/o fitoalessine stilbene.

Abbiamo cercato di soddisfare la domanda di un metodo di questo tipo che sia rispettoso dell'ambiente, che utilizzi materiali di consumo economici e che sia sensibile e selettivo. Inoltre, il metodo non è distruttivo poiché utilizza solo metà del seme e lascia intatta l'altra metà contenente l'asse embrionale. Tale tecnica consente la germinazione e la crescita della pianta di arachidi fino alla piena maturità dallo stesso seme utilizzato per l'analisi dell'aflatossina e degli stilbenoidi. La parte integrante di questo metodo, la sfida manuale dei semi con Aspergillus, è un passaggio limitante che richiede più tempo e lavoro rispetto ad altri passaggi del metodo. Il metodo è stato utilizzato per l'esplorazione del germoplasma selvatico di Arachis per identificare specie resistenti all'Aspergillus e per determinare e caratterizzare nuove fonti di resistenza genetica a questo patogeno fungino.

Introduzione

L'arachide (Arachis hypogaea L.) è una delle principali colture alimentari del mondo. Viene coltivato in più di 100 paesi con una produzione totale che supera i 45 milioni di tonnellate¹. I prodotti agricoli, come arachidi, mais e semi di cotone, sono spesso invasi da specie di Aspergillus, funghi nati nel suolo che producono aflatossine². Questi prodotti sono particolarmente suscettibili alla contaminazione da aflatossine prima del raccolto quando le condizioni ambientali sono caratterizzate da alte temperature e siccità. Le aflatossine sono tra i più potenti agenti cancerogeni conosciuti³. Contaminano un quarto delle materie prime agricole del mondo⁴ , rendendo circa la metà della popolazione mondiale cronicamente esposta alle aflatossine⁵. A causa della loro elevata cancerogenicità e tossicità, la presenza di aflatossine negli alimenti è regolata ai limiti più bassi praticamente accettabili nella maggior parte dei paesi del mondo⁶.

L'Unione europea (UE) ha legiferato un livello massimo di 2 ng/g per l'aflatossina B₁ e di 4 ng/g per le aflatossine totali (B₁, B₂, G₁ e G₂) nei prodotti per il consumo umano⁷. Limiti così bassi esercitano una notevole pressione sull'agricoltura e sull'industria alimentare che lavora prodotti contaminati da aflatossine. Il monitoraggio dell'aflatossina e il ritrattamento delle arachidi contaminate possono essere considerati una strategia passiva e costosa per prevenire l'ingresso di aflatossine nella catena alimentare. Questo è il motivo per cui tutti i principali segmenti dell'industria delle arachidi subiscono enormi perdite di profitto a causa della contaminazione da aflatossine delle attuali cultivar di arachidi che spesso dimostrano una resistenza limitata alle malattie fungine. Un approccio prospettico per risolvere il problema dell'aflatossina è quello di ottenere cultivar di arachidi resistenti ai funghi attraverso l'introgressione genica, cioè il trasferimento di informazioni genetiche da specie di arachidi selvatiche resistenti a cultivar d'élite. Negli ultimi anni ^8,9, le specie di arachidi selvatiche hanno ricevuto una notevole considerazione come fonti di resistenza alle malattie genetiche perché la ristretta base genetica delle arachidi coltivate non può più fornire il livello necessario di tratti di resistenza alla pianta di arachidi^10,11. Il successo dell'introgressione delle specie di arachidi selvatiche richiede l'analisi di migliaia di singoli semi piccoli e rari (Figura 1A) ¹².

Figura 1: Diagramma di flusso dell'analisi del seme singolo. (A) Dimensioni comparative delle diverse cultivar di arachidi di tipo di mercato rispetto all'Arachis spp. (1) Virginia; (2) corridore; (3) spagnolo; (4) Arachis spp. selvatico (B) Arachis spp. selvatico (tavola A, seme 4) tagliato in tre sezioni, (5) mezzo seme con asse embrionale; questa parte del seme viene utilizzata per far crescere una pianta (E). (C) Le parti (6) e (7) sono perforate con una punta da trapano e (D) inoculate con spore fungine. Dopo un'incubazione di 72 ore a 30 °C, una delle parti del seme, (6) o (7) viene utilizzata per le analisi di aflatossina e fitoalessina, e un'altra viene utilizzata per il sequenziamento di RNA/trascrittoma. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La resistenza delle arachidi ai patogeni fungini è fortemente associata alle fitoalessine 13,14,15,16,17. Le fitoalessine delle arachidi sono rappresentate da stilbenoidi antimicrobici che vengono biosintetizzati e accumulati nei tessuti vegetali dopo l'esposizione a stimoli esogeni, in particolare all'invasione fungina 16,17,18. Il rapido accumulo di concentrazioni sufficienti di fitoalessine nel sito di invasione fungina è inibitorio per la crescita fungina ed è fondamentale per la difesa delle piante 19,20,21. Il patogeno smette di crescere quando le fitoalessine si accumulano a concentrazioni inibitorie^16,22. Il ruolo degli stilbenoidi come composti difensivi contro i funghi aflatossigeni nelle arachidi è stato valutato oltre 30 anni fa in esperimenti sul campo¹³. Questi esperimenti hanno chiaramente supportato l'ipotesi che gli stilbenoidi delle arachidi siano un fattore di resistenza cruciale nella contaminazione da aflatossina pre-raccolta. Tali prove si basano sul fatto che gli stilbeni sono prodotti naturalmente nelle arachidi danneggiate nei campi; gli stilbeni dimostrano un'apprezzabile attività biologica nei confronti dei funghi aflatossigeni; e la contaminazione da aflatossine nei semi è stata rilevata solo quando le arachidi hanno perso la capacità di sintesi della fitoalessina a causa della disidratazione dei semi indotta dalla siccità. Un'altra serie di esperimenti sul campo ha confermato l'associazione tra la produzione di fitoalessina e la resistenza del genotipo delle arachidi alle malattie delle arachidi importanti dal punto di vista agricolo¹⁷.

Una migliore comprensione del meccanismo naturale di resistenza delle arachidi all'invasione fungina a base di fitoalessina è una strategia promettente per il controllo della contaminazione da aflatossine^15,17.Pertanto, oltre alle analisi delle aflatossine, è importante analizzare quantitativamente gli stessi semi per le fitoalessine. Sebbene questo meccanismo di resistenza non sia completamente studiato e compreso, è fondamentale per l'allevamento e la modifica genetica delle piante di arachidi per nuove cultivar resistenti ai funghi²³. Nonostante l'esistenza di varie procedure analitiche per la determinazione dell'aflatossine in diversi prodotti, c'è ancora bisogno di metodi semplici per la ricerca specifica, in particolare quando i metodi tradizionali non soddisfano i requisiti analitici e di efficienza in termini di costi. La maggior parte dei moderni metodi di purificazione utilizzati dall'industria delle arachidi, dall'agricoltura e dai laboratori privati sono i dispositivi basati su anticorpi²⁴ e i dispositivi immunologici 25,26,27. Sono selettivi e sensibili, ma sostanzialmente più costosi delle minicolonne confezionate con adsorbenti comuni. Inoltre, nessuno di questi metodi è stato progettato per l'analisi di campioni di peso di pochi milligrammi. Sulla base delle nostre precedenti ricerche sull'uso analitico delle minicolonne²⁸ impaccate con gel di silice di magnesio (Florisil), abbiamo modificato questa procedura per soddisfare le esigenze dei programmi di pre-allevamento e allevamento in corso e futuri.

Lo scopo di questo lavoro è stato quello di sviluppare un metodo non distruttivo, a media produttività e rispettoso dell'ambiente per la determinazione quantitativa di aflatossine e fitoalessine in singoli semi di arachidi. Tale metodo è stato sviluppato. I suoi vantaggi rispetto ai metodi pubblicati sono una maggiore sensibilità, la capacità di analizzare aflatossine e fitoalessine in un estratto di seme singolo, l'assenza della necessità di pesare i campioni e il costo inferiore grazie ai volumi minori di materiali di consumo. Il diagramma di flusso del metodo integrato è mostrato nella Figura 1. Le analisi genetiche e gli altri passaggi sono menzionati in questo testo e dimostrati nella figura per mostrare l'importanza del metodo suggerito e come è integrato con l'intera procedura.

Protocollo

1. Preparazione dei semi per la sfida fungina

1. Incubare l'aflatossigeno Aspergillus flavus NRRL 3357 su un'inclinazione di agar destrosio di patata (PDA) in provetta per 6 giorni a 30 °C. Raccogliere le spore fungine dalla provetta con 10 mL di acqua con Tween 20 (100 μL di Tween in 1 L di acqua sterile distillata), filtrare attraverso lana di vetro posta in un imbuto e contare le spore con un emocitometro facendo riferimento al manuale d'uso.
2. Diluire la sospensione di spore con acqua sterile a una concentrazione di 1.000 spore/μL. Confermare la concentrazione con un emocitometro.
   NOTA: Preparare la sospensione di spore non prima di 2 ore prima degli esperimenti impegnativi.
3. Rompi delicatamente i baccelli di arachidi e rimuovi i gusci. Mettere i semi in un becher sterile in modo che il volume dei semi non superi 1/5 del volume del becher, aggiungere una soluzione di perossido di idrogeno allo 0,05% a circa il 70% del volume del becher e lasciare che i semi assorbano acqua per 3 ore.
4. Decantare la soluzione di perossido di idrogeno dai semi e aggiungere circa 3 volte la quantità di miscela di etanolo e acqua all'80% (v/v) nel becher per coprire i semi. Lasciare riposare per 1 minuto e poi sciacquare i semi 2 volte con volumi uguali di acqua distillata sterile.
5. Aggiungere 5 volte il volume di perossido di idrogeno al 3% nel becher con i semi sterilizzati con etanolo e lasciare riposare per 5 minuti, quindi decantare il liquido e sciacquare i semi due volte con volumi uguali di acqua sterile (Figura 2A).

Figura 2: Preparazione di semi di arachidi per l'inoculazione, l'incubazione e l'estrazione delle frazioni di aflatossina e fitoalessina. (A) Sterilizzazione dei semi imbevuti con perossido di idrogeno al 3%; (B) rimozione della testa (buccia) dai semi; (C) taglio della parte dell'asse embrionale; (D,E) cavità di perforazione in un mezzo cotiledone con una punta da trapano; (F) posizionamento di parti perforate di semi sull'agar; (G) applicazione di spore fungine nella cavità perforata. (H) Piastra di Petri con semi dopo l'incubazione; (I) collocazione di singoli semi incubati (foto dei campioni di controllo) in tubi di perline rinforzate; J) l'aggiunta del volume misurato del solvente di estrazione; (K) polverizzazione di campioni in un rompitore di perline; (L) centrifugazione di liquame polverizzato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Metti i semi su un tovagliolo di carta sterile, rimuovi la testa del seme con una pinza e taglia circa 1/3 del seme contenente l'asse embrionale con un bisturi (Figura 2B, C).
7. Scartare questa parte del seme o usarla per far crescere una pianta in una provetta con terreno di coltura (Figura 1B, E).
8. Dividere la parte rimanente del seme in due cotiledoni, metterli in una capsula di Petri, coprire le parti del seme con carta da filtro sterile umida, riposizionare il coperchio per evitare la disidratazione e procedere prontamente alla fase di inoculazione.
9. Prima di eseguire gli impegnativi esperimenti, preparare un numero sufficiente di piastre di Petri con terreno di incubazione dei semi versando 26 ml di agar sterile all'1,5% in acqua nelle piastre da 100 x 15 mm e lasciarle solidificare durante la notte.
10. Al centro del lato esterno di ogni cotiledone rimasto, creare una cavità profonda 1,5-2 mm perforando manualmente il seme con una punta affilata sterile di 1,6-2,34 mm di diametro. Ci vogliono ~2-5 s per creare una cavità (Figura 2D, E).
11. Mettere da 4 a 6 pezzi "forati" dei semi in una capsula di Petri con agar e applicare 2 μl delle 1.000 spore/μl di sospensione nella cavità perforata di ciascun pezzo di semicotiledone con un pipettatore da 10 μl. Al posto della sospensione di spore, applicare acqua sterile sui semi di controllo (Figura 2F, G).
12. Coprire tutte le piastre di Petri con i coperchi e incubare a 30 °C senza luce per 72 ore.

2. Campionamento e preparazione dei pezzi di semi incubati per l'analisi dell'aflatossina e della fitoalessina

1. Raccogliere i pezzi di semi a 72 ore rimuovendoli dall'agar con una pinza e inserendo ciascuno di essi in fiale di perline da 7 ml etichettate con 13 perle di ceramica di zirconio (12 di 2,8 mm di diametro e 1 di 6,5 mm di diametro) (Figura 2H, I).
   NOTA: A questo punto, se non vengono lavorate immediatamente, le fiale possono essere poste in un congelatore a -80 °C e conservate fino a 2 mesi prima di un'ulteriore lavorazione.
2. Le fitoalessine e le aflatossine sono determinate nello stesso estratto di semi. Per l'estrazione, a seconda della dimensione visiva del seme (piccolo, medio o grande), aggiungere 2 o 4 mL di miscela metanolo-acqua misurata con precisione (90:10, v/v) alle fiale di perline e polverizzare a 5,5 m/sec per 45 s. Mettere in centrifuga le fiale con i semi polverizzati e centrifugare a 1,860 × g per 3 min (Figura 2J - L).
   NOTA: Sono stati determinati i seguenti importanti derivati^17,22 stilbenoidi (tutti in trans-configurazione): resveratrolo, arachidina-1, arachidina-2, arachidina-3, 3′-isopentadienil-3,5,4′-triidrossistilbene (IPD) e SB-1.
3. Per le analisi delle aflatossine, prima di eseguire gli esperimenti più impegnativi, preparare un numero sufficiente di colonne di pulizia come segue. Posizionare una fritta di polietilene poroso (20 μL) in una colonna di polipropilene da 1,5 mL con l'aiuto di un'asta di vetro tagliata con un angolo di 90^° . Posizionare 50 mg di gel di silice di magnesio (100-200 mesh) nella colonna con un misurino su misura e tappare la colonna con una fritta identica spingendola verso il basso con una bacchetta di vetro (Figura 3A - E).
   NOTA: Questa quantità di gel di silice di magnesio occupa un volume di 75 μl e l'altezza dello strato adsorbente è di 3 mm.

Figura 3: Preparazione delle colonne di pulizia e dei filtri. (A,B) Posizionamento di una fritta porosa nel fusto; (C,D) fusto di riempimento con gel di silice di magnesio; (E) imballare l'adsorbente e inserire una fritta porosa superiore nel fusto. (F) Posizionare un cerchio in fibra di vetro di 11,5 mm di diametro sopra una pipetta Pasteur. (G,H) Spingendo il centro del cerchio con un'asta di plastica o di legno verso il basso fino al fondo del fusto della pipetta Pasteur e compattando saldamente la fibra di vetro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. A questo punto, preparare un numero corrispondente di filtri su misura come mostrato in Figura 3F - H.
5. Per l'analisi delle aflatossine, misurare con precisione fino a 0,5 mL di aliquota del surnatante (ottenuta come descritto al punto 2.2), trasferirla nella minicolonna confezionata su misura e lasciare che l'estratto defluisca per gravità in una fiala di vetro da 4 mL. Trasferire 1,0 mL di miscela metanolo-acqua (90:10, v/v) nella colonna per lavare via le impurità per gravità nella stessa fiala da 4 mL (Figura 4A).

Figura 4: Purificazione degli estratti di semi e preparazione per le analisi UPLC. (A) Scaffale con colonne impaccate. (B) Solvente evaporante con gas N₂ da sei fiale da 4 mL con estratto purificato eluito da colonne di purificazione. (C) Portare le fiale e i filtri a una temperatura inferiore allo zero in contenitori di schiuma (1 e 2) con ghiaccio prima e dopo l'aggiunta del solvente per iniezione (MeOH-H₂O 9:1, v/v) alle fiale da 4 ml. (D) Filtraggio dell'estratto raffreddato da una fiala da 4 ml in una fiala per autocampionatore da 400 μl. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Scartare gli eluati combinati. Eluire la frazione di aflatossina per gravità dalla colonna in un flaconcino di vetro pulito da 4 mL con 1,2 mL di miscela di acetone-acetonitrile-acqua-acido formico all'88% (65:31:3.5:0.5, v/v) (Figura 4A).
7. In alternativa, eluire le aflatossine dalla colonna con 2,0 mL di miscela acetonitrile-acqua-acido formico all'88% (96:3.5:0.5, v/v) e iniettare un'aliquota dell'eluato, fino a 2 μL, direttamente nel sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni (UPLC) (senza evaporazione del solvente con N₂).
   NOTA: In questo caso, aspettatevi un limite di quantificazione fino a 10 volte inferiore per le aflatossine; Nella maggior parte dei casi, un tale calo di sensibilità è accettabile poiché le concentrazioni di aflatossina nelle sementi provocate sono spesso elevate.
8. Rimuovere il solvente dai flaconcini in un flusso di N₂ in un blocco riscaldato a 45 °C. Tappare la fiala e metterla in un contenitore con ghiaccio tritato per 30-45 s per ridurre al minimo l'evaporazione del solvente che viene aggiunto nel passaggio successivo. Posizionare i filtri su misura in provette usa e getta e inserire le provette nel ghiaccio in un altro contenitore per ridurre al minimo l'evaporazione del solvente durante la filtrazione (Figura 4B, C).
9. Dopo l'evaporazione del solvente, sciogliere il residuo secco in 0,25-1,0 mL di miscela metanolo-acqua misurata con precisione (90:10, v/v) e vortice per 1-2 s. Posizionare le fiale con estratti purificati nell'autocampionatore UPLC e iniettare da 0,1 a 3,0 μl nel sistema UPLC (Figura 5A, B).
   NOTA: Se si sospetta che la soluzione dopo il vortice contenga alcune particelle sospese, filtrare la soluzione attraverso il filtro raffreddato (Figura 4D).

Figura 5: Il processo e i risultati delle analisi UPLC di estratti purificati. (A) Posizionamento di un rack con estratti di campioni purificati nell'autocampionatore UPLC. (B) Esecuzione delle analisi strumentali, acquisizione dei dati e interpretazione dei risultati. (C) UPLC di quattro principali aflatossine; i maggiori picchi di interesse, le aflatossine B₁ e B₂ rappresentano rispettivamente 0,04 e 0,004 ng. (D) UPLC delle aflatossine B₁ e B₂; il picco 2 rappresenta l'aflatossina B₁ a un livello di 2 pg (con una cella di flusso da 8 μL). (E) UPLC di estratto purificato di un seme raccolto da un campo di arachidi locale con una specie selvatica di Arachis . (F) UPLC dell'estratto di un seme di arachidi contestato purificato con una minicolonna basica di ossido di alluminio. (G) UPLC dell'estratto di semi di arachidi contestati purificati con una colonna di Florisil; il cromatogramma blu presenta impurità che vengono lavate dalla colonna con 1 mL di miscela metanolo-acqua (90:10 v/v); il cromatogramma nero mostra picchi di aflatossine M₁ e B₁. Il livello di aflatossina B₁ è di 48 ng/g. (H) Un tipico cromatogramma di stilbenoidi di arachidi da un seme sfidato; abbreviazione: IPD = 3′-isopentadienil-3,5,4′-triidrossistilbene. Nota: tutti gli stilbenoidi negli estratti di semi sono in trans-configurazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

10. Per l'analisi delle fitoalessine, da ciascuna fiala di perline, trasferire 200 μL di surnatante nel filtro per pipette Pasteur di cui sopra. Utilizzare il gas N₂ da un serbatoio di azoto compresso per accelerare la filtrazione in una fiala di autocampionatore UPLC da 400 μL e tappare la fiala con un tappo corrispondente con un setto in PTFE (Figura 4D).

3. Analisi delle aflatossine

1. Per la separazione delle aflatossine negli estratti di semi, utilizzare un sistema UPLC dotato di un autocampionatore, una pompa quaternaria, un rivelatore fluorescente, un UPLC BEH C18 3,0 mm x 100 mm, una colonna da 1,7 μm con una precolonna corrispondente e un reattore fotochimico postcolonna (PHRED) con una bobina in PTFE a maglia standard di diametro interno di 0,25 tagliata al 25% della sua lunghezza originale.
   NOTA: Lo strumento UPLC e le apparecchiature associate utilizzate dagli autori sono elencati nella Tabella dei materiali.
2. Utilizzare acqua (A), metanolo (B) e acetonitrile (C) nel seguente gradiente: condizioni iniziali, 62,7% A, 24% B, 13,3% C, modificato linearmente a 30% A, 45% B, 25% C in 3,75 minuti, modificato a 0% A, 64,4% B, 35,6% C in 3,751 minuti, mantenuto isocratico per 3,249 minuti, quindi modificato in condizioni iniziali in 0,01 minuti e mantenuto isocratico per 2,499 minuti prima dell'iniezione successiva. Impostare la portata su 0,45 mL/min e il tempo di esecuzione su 9,5 min. Mantenere la colonna a 40 °C nel riscaldatore della colonna del sistema. Utilizzare 362 nm e 440 nm come lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione, rispettivamente, per la quantificazione delle aflatossine B₁, B₂, G₁, G₂ e M₁ . Le strutture delle principali aflatossine sono mostrate nella Figura 6A.
   NOTA: Nelle condizioni sperimentali, si prevede che solo le aflatossine B₁ e B₂ siano prodotte da A. flavus NRRL 3357; se un ceppo di A. parasiticus viene utilizzato per la sfida con le sementi, è prevista la produzione di aflatossine B₁, B₂, G₁ e G₂ .
3. Determinare le concentrazioni di aflatossine facendo riferimento alle aree di picco degli standard autentici corrispondenti (curva di calibrazione) come descritto nel manuale utente del software.
   NOTA: Poiché la procedura UPLC presenta rumore di base alle impostazioni di alta sensibilità per il rivelatore fluorescente, il limite di rilevamento (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ) per le aflatossine vengono valutati utilizzando il rapporto segnale/rumore ampiamente accettato di 3:1 per LOD e 10:1 per LOQ. Nella configurazione sperimentale di routine per l'analisi dei semi di arachidi, descritta nelle sezioni 2 e 3, i limiti di quantificazione per le aflatossine G₁ e B₁ dovrebbero essere inferiori o uguali a 0,8 e 0,08 ng/g per le aflatossine G₂ e B₂, rispettivamente.

4. Analisi della fitoalessina stilbenoide

1. Per la separazione degli stilbenoidi, utilizzare acqua (A), metanolo (B) e acido formico (C) all'88% nel seguente gradiente: condizioni iniziali, 53% A, 42% B, 5% C, modificato linearmente a 35% A, 60% B, 5% C in 2,0 min, mantenuto isocratico per 4 min, modificato in 0% A, 95% B, 5% C in 0,5 min, mantenuto isocratico per 2,5 min, quindi è passato alle condizioni iniziali in 0,1 minuti e ha mantenuto l'isocratico per 2,9 minuti prima dell'iniezione successiva. Impostare la portata su 0,5 mL/min e il tempo di esecuzione su 12,0 min.
2. Determinare le concentrazioni di stilbenoidi facendo riferimento alle aree di picco degli standard autentici corrispondenti (curva di calibrazione) e/o ai coefficienti di estinzione molare pubblicati, come descritto nel manuale utente del software. Le strutture delle principali fitoalessine derivate dagli stilbeni sono mostrate nella Figura 6B.
   NOTA: La separazione delle fitoalessine si ottiene utilizzando lo stesso sistema ma senza un rivelatore fluorescente e un reattore PHRED. Invece, un rivelatore a matrice di diodi viene utilizzato per il rilevamento e la quantificazione degli stilbenoidi delle arachidi. Il limite di quantificazione (LOQ) per le principali fitoalessine stilbenoidi non ha un significato pratico in quanto le concentrazioni di stilbenoidi superano di alcuni ordini di grandezza le concentrazioni di aflatossine nello stesso estratto; Dopo 3 giorni di incubazione, gli stilbenoidi sono quantificati in modo affidabile.

Risultati

Il metodo sviluppato per la quantificazione dell'aflatossina nei semi è il fulcro dell'intera procedura di valutazione delle specie di arachidi selvatiche per la resistenza all'accumulo di aflatossine. Le minicolonne e i filtri confezionati su misura offrono risparmi sostanziali e semplificano l'intera procedura grazie alla mancanza di grandi volumi di solventi, ai costosi e inutili filtri commerciali da 0,22 o 0,45 μm e ai dispositivi di pompaggio. Il metodo per l'analisi delle aflatossine fornisce recuperi elevati, accuratezza e precisione nell'intervallo testato di 1,0-50,0 ng/g di aflatossine da semi macinati, come mostrato nella Tabella 1. I campioni altamente contaminati sono stati diluiti al valore lineare testato. La Figura 5C mostra una separazione basale delle quattro principali aflatossine, B₁, B₂, G₁ e G₂ entro un tempo di eluizione di 5 minuti, che è accettabile poiché l'impegno fungino dei semi di arachidi è la fase limitante della procedura e non delle analisi UPLC.

Il metodo proposto è sufficientemente sensibile con un limite di quantificazione di 2 pg per l'aflatossina B₁ (Figura 5D). L'elevata purezza degli estratti consente una quantificazione inequivocabile delle aflatossine, come si evince da un UPLC (Figura 5E) di estratto purificato di semi raccolti da un campo con una specie selvatica di Arachis . Un metodo a minicolonna pubblicato in precedenza²⁹ non è in grado di raggiungere una purezza soddisfacente per i semi di arachidi resistenti ai funghi (Figura 5F) rispetto al metodo proposto (Figura 5G). Dalla Figura 5F è evidente che le aflatossine B₂, G₁ e G₂ non possono essere rilevate e quantificate in modo affidabile a causa della presenza di alte concentrazioni di impurità interferenti, molte delle quali, eluite dopo le aflatossine, sono fitoalessine stilbenoidi e metaboliti fungini. Al contrario, la Figura 5G dimostra l'elevata efficienza della colonna di gel di silice di magnesio nel rimuovere le impurità dalla frazione di aflatossina. Il cromatogramma blu presenta impurità interferenti che vengono lavate via dalla colonna con 1 mL di miscela metanolo-acqua (90:10); il cromatogramma nero mostra picchi non oscurati di aflatossine M₁ e B₁. Questo cromatogramma rappresenta l'estratto di un seme di specie selvatica sfidato. Il livello di aflatossina B₁ è di 48 ng/g.

La quantificazione delle fitoalessine di arachidi è un'aggiunta preziosa alle analisi delle aflatossine nello stesso seme, che può essere un seme naturale proveniente da un campo o un seme resistente ai funghi. La Figura 5H mostra un tipico cromatogramma di stilbenoidi difensivi delle arachidi da un seme sfidato. La separazione dei composti si ottiene utilizzando la stessa colonna analitica utilizzata per le analisi delle aflatossine. La colonna e le condizioni cromatografiche scelte forniscono una separazione soddisfacente dei picchi, consentendo una quantificazione affidabile degli stilbenoidi. La valutazione della relazione aflatossina-fitoalessina nei semi contestati esula dallo scopo di questa presentazione e il metodo è qui suggerito come potenziale strumento di ricerca, che è stato utilizzato nel laboratorio degli autori per diversi anni e si è dimostrato utile.

Figura 6: Strutture delle principali aflatossine e fitoalessine di arachidi derivate da stilbeni. (A) Strutture delle principali aflatossine: 1, B₁; 2, B₂; 3, G₁; 4, G₂. (B) Strutture delle principali fitoalessine di arachidi derivate dallo stilbene: 6, resveratrolo; 7, arachidina-1; 8, arachidina-2; 9, arachidina-3; 10, IPD (3′-isopentadienil-3,5,4′-triidrossistilbene); 11, SB-1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Livello di piccoa (ng/g)	Aflatossine
	B1	B2	G1	G2
50	85.87 (0.97)	82.33 (0.67)	86.63 (2.89)	84.01 (0.86)
5	91.43 (2.76)	87.32 (0.47)	88.08 (2.08)	87.73 (0.77)
1	81.21 (3.16)	85.33 (1.98)	81.76 (4.66)	88.46 (3.24)

Tabella 1: Recupero delle aflatossine dai semi di arachidi utilizzando la colonna Florisil e 1,2 mL della miscela di eluizione della frazione aflatossina. [media (DS), %; n = 5]. Campioni di terreno privi di aflatossina (50 g) di cultivar di arachidi Georgia 06G sono stati uniformemente addizionati con l'aiuto di una micro siringa con soluzione madre di aflatossina a 50, 5 o 1 ng/g e lasciati a temperatura ambiente per 16 ore. ^a I livelli di picco sono forniti per le aflatossine B₁ e G₁; per le aflatossine B₂ e G₂ deve essere utilizzato il fattore di moltiplicazione di 0,33.

Discussione

Sulla base della nostra precedente esperienza²⁸, abbiamo sviluppato una procedura chimica semplice, economica e rispettosa dell'ambiente, adatta all'esplorazione di collezioni di germoplasma selvatico di Arachis , al fine di identificare specie resistenti all'Aspergillus e di determinare e caratterizzare nuove fonti di resistenza genetica a questo fungo opportunista. Questo metodo si basa sulla purificazione dell'estratto di semi mediante una tecnica di estrazione in fase solida (SPE) e sulla quantificazione delle aflatossine mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (UPLC) ed è caratterizzato da un recupero, una precisione e un'accuratezza sufficientemente elevati. Il metodo "Florisil" proposto è una modifica della procedura di pulizia a minicolonna singola che si basa sulla proprietà unica di Florisil (gel di silice di magnesio) di trattenere fortemente e selettivamente le aflatossine²⁸. Come nel metodo originale, i campioni di semi sono stati estratti con la miscela MeOH-H₂O, ma in una proporzione diversa di 90:10 (v/v) rispetto all'80:20 (v/v) pubblicato. Questa modifica ha aumentato la portata dei solventi attraverso la colonna di pulizia fino a 2,5 volte con lo stesso tasso di recupero dell'aflatossina. Questa miscela 90:10 (v/v) di metanolo-acqua ha fornito un recupero quasi del 100% delle aflatossine B₁, B₂, G₁ e G₂ che gli standard hanno aggiunto al solvente di estrazione a livelli di picco equivalenti a 5-50 ng di concentrazioni di aflatossina in 1 g di substrato, oltre a fornire recuperi sufficientemente elevati dai campioni di semi di arachidi addizionati (Tabella 1).

È stato dimostrato che le aflatossine possono essere eluite dall'adsorbente Florisil solo con grandi volumi di acetone³⁰, acetone-metanolo^31,32 e miscele acetone-acqua 33,34,35,36. Nel corso della presente ricerca, abbiamo scoperto che l'acetonitrile acidificato si comporta in modo simile all'acetone nella sua capacità di eluire le aflatossine dal Florisil. Per quanto ne sappiamo, questa proprietà dell'acetonitrile non è stata riportata in letteratura. La scoperta di questa proprietà consente di iniettare l'estratto purificato direttamente nel sistema UPLC omettendo la fase di evaporazione del solvente, il che riduce sostanzialmente il tempo di preparazione. Anche quando l'acetonitrile è stato miscelato con acetone (acetone-acetonitrile-acqua-88% acido formico (65:31:3.5:0.5, v/v)), ha fornito una rimozione regolare, completa e rapida dell'acqua dagli eluati purificati riducendo sostanzialmente il tempo di evaporazione del solvente. La presenza di acetonitrile ha consentito l'uso di un unico solvente, una miscela metanolo-acqua (90:10, v/v) per rimuovere efficacemente le impurità dalla colonna Florisil rispetto a un metodo pubblicato, in cui erano necessari due solventi di lavaggio aggiuntivi, metanolo e miscela cloroformio-metanolo. ²⁸

In media, il recupero standard dell'aflatossina B₁ è stato di ~98% quando si utilizzavano 1,2 ml per l'eluizione delle aflatossine. La quantità di 50 mg di Florisil è stata selezionata in modo che 1,2 mL di solvente di eluizione riempissero la minicolonna fino alla sommità del cilindro e, allo stesso tempo, fornissero un recupero soddisfacente (Tabella 1). Questo approccio accelera la procedura di pulizia poiché il cilindro della colonna deve essere riempito una sola volta. Nelle prime fasi di questo progetto, non era chiaro se una frazione commerciale di Florisil con una dimensione delle particelle relativamente grande, 100-200 mesh, sarebbe stata appropriata per una piccola colonna contenente solo uno strato di 3 mm di adsorbente. Pertanto, abbiamo esplorato diverse frazioni di Florisil ottenute da un prodotto commerciale da 100-200 mesh utilizzando setacci analitici standard statunitensi 120-140, 140-170, 170-200, 200-270, 270-400 e >400 mesh. Tutte queste frazioni hanno fornito risultati riproducibili, quasi corrispondenti a un recupero soddisfacente. Sebbene le frazioni granulometriche più piccole mostrassero bande di aflatossina più strette nella colonna sotto la luce UV, tali frazioni non erano superiori in alcun modo al prodotto commerciale a 100-200 maglie. Inoltre, la frazione di 100-200 mesh ha dimostrato i tempi di eluizione più brevi (8-12 min) per l'intera procedura.

L'erogazione di solvente UPLC a gradiente ha consentito una separazione soddisfacente delle aflatossine e la rimozione completa delle impurità non polari dalla colonna (Figura 5G). Questo approccio ha portato a un funzionamento impeccabile della colonna e a risultati riproducibili delle analisi di centinaia di campioni. L'identità delle aflatossine eluite dalla colonna di Florisil è stata confermata come precedentemente descritto. ²⁸ La colonna UPLC analitica di 3 mm di diametro utilizzata qui ha dimostrato una maggiore selettività e una separazione più affidabile delle aflatossine B₁, B₂, G₁ e G₂ a concentrazioni più elevate rispetto alla colonna di 2,1 mm di diametro della stessa chimica. Inoltre, la longevità della colonna da 3 mm (oltre 1.200 iniezioni) era sostanzialmente superiore a quella della colonna da 2,1 mm (fino a 800 iniezioni). Anche se la colonna da 3 mm richiedeva una maggiore velocità della fase mobile (40% in più), questo inconveniente è stato superato dai vantaggi della colonna di cui sopra.

La minicolonna Florisil si è rivelata efficace per la purificazione di estratti di semi di arachidi fortemente contaminati da metaboliti di Aspergillus (Figura 5G); Tali semi contenevano anche alti livelli di fitoalessine stilbenoidi che sono state prodotte dai semi in risposta all'invasione fungina. Tutte queste impurità possono superare la concentrazione di aflatossine nei semi fino a 10⁶ volte²², il che rende questi semi oggetti difficili per le analisi delle aflatossine. La Figura 5G mostra l'assenza di picchi interferenti nel cromatogramma entro i tempi di ritenzione dell'aflatossina, il che ha reso il rilevamento e la quantificazione dell'aflatossina senza compromessi a tutti i livelli testati (Tabella 1). Come si vede nella Tabella 1, l'accuratezza e la precisione del metodo erano sufficientemente elevate all'interno dell'intervallo testato di 1,0-50,0 ng/g, che è anche l'intervallo più critico per la rilevazione dell'aflatossina. I recuperi a diversi livelli per vari genotipi di arachidi selvatiche erano uniformi e le deviazioni standard per cinque diverse estrazioni erano essenzialmente basse.

Il metodo è stato testato anche su semi di arachidi, cotone, mais e riso naturalmente contaminati da zero a livelli estremamente elevati, oltre 10.000 ng/g di aflatossine totali. Il recupero delle aflatossine B₁, B₂, G₁ e G₂ da mais, semi di cotone e riso al livello di 5 ng/g variava rispettivamente dal 76,1% al 93,7%, dal 77,1% all'86,6% e dal 90,5% al 96,2%. Il più alto recupero di aflatossine dal riso era accompagnato dalla "purezza" dell'eluente, cioè praticamente dall'assenza di impurità. Inoltre, il riso rappresentava il più piccolo oggetto singolo testato, in media, 19 mg/seme.

Il tempo totale di preparazione di un singolo seme di arachidi (compresa la sgusciatura, la pesatura, l'estrazione, la centrifugazione e la purificazione) utilizzando una colonna Florisil non ha superato i 20 minuti. Il costo della minicolonna Florisil è >10 volte inferiore a quello delle colonne di pulizia commerciali. Ulteriori risparmi derivano dall'utilizzo di volumi inferiori di adsorbenti, solventi e azoto gassoso rispetto alla procedura pubblicata²⁸. La minicolonna non richiede dispositivi di pompaggio o di vuoto per funzionare e ha una durata di conservazione indefinita.

Esplorare il germoplasma vegetale per la resistenza alle aflatossine è eccezionalmente difficile perché l'accumulo di micotossine non segue una distribuzione normale ^37,38; Per superare questo fenomeno è necessario un gran numero di analisi delle aflatossine in singoli semi. Oltre al contenuto di aflatossine, le informazioni sulla composizione quantitativa della fitoalessina sono molto preziose alla luce di un ampio corpus di informazioni che possono essere ottenute da un singolo seme (Figura 1A) e ricondotte a una pianta specifica (Figura 1E). Il metodo è stato utilizzato con successo per lo screening di centinaia di accessioni, tra cui varietà autoctone, linee di allevamento avanzate e varietà di arachidi d'élite. Il metodo è suggerito per l'uso nei programmi di ricerca sulla preselezione e l'allevamento delle arachidi e può aiutare nella caratterizzazione dei geni delle arachidi per la resistenza fungina.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acetone, Optima	Fisher Scientific	A929-4
Acetonitrile, Optima	Fisher Scientific	A996-4
Acquity BEH C18 2,1 x 5 mm Van-Guard pre-colonna	Waters Corporation	186003975
Acquity BEH C18 3 colonne da 100 mm	Waters Corporation	186004661
Acquity BEH C18 colonna da 2,1 x 100 mm	Waters Corporation
Aflatossine B1, B2, G1 e G2	Sigma-Aldrich	A9441-1VL	Sciogliere il contenuto della fiala commerciale in 5 ml di metanolo per ottenere 5 µ g/mL per le aflatossine B1 e G1 e 1,5 µ g/mL per B2 e G2
Aflatossina B1 (1mg)	Sigma-Aldrich	A6636-1MG
Aflatossina B2 (1mg)	Sigma-Aldrich	A9887-1MG
Aflatossina G1 (1mg)	Sigma-Aldrich	A0138-1MG
Aflatossina G2 (1mg)	Sigma-Aldrich	A0263-1MG
Aflatossina M1 (10 µ g)	Sigma-Aldrich CRM46319
Agar, granulato (2kg)	Becton Dickinson	BD214510
Ossido di allumina basico (60-325 mesh)	Fisher Scientific	A941-500
Terreno basale	Murashige e Skoog	M5519
Bead Ruptor 24	Omni International	19-042E
Becher (1000mL)	Corning (Pyrex)	10001L
Becher (250mL)	Corning (Pyrex)	1000250
Becher (400mL)	Corning (Pyrex)	1000400
Becher (600mL)	Corning (Pyrex)	1000600
Lama, bisturi	Feather	#10
Centrifuga (LSE Compact)	Corning	Modello: 6755
Centrifuga, micro	Corning	Modello: 6770
Perle in ceramica (2,8 mm)	Omni International	19-646
Perle in ceramica (6,5 mm)	Omni International	19-682
Chromeleon 7 series Software	Thermo Scientific
Punta da trapano	Kyocera	07896	Punta da trapano da 1,6 mm
	Kyocera	07357	Punta da trapano da 2,0 mm
	Kyocera	07985	2,34 mm
Etanolo (200 proof)	Decon Labs	2805M
Evaporatore, organimation con azoto		11106	a 6 posizioni
, Microsoft	Microsoft	Office 365
Carta da filtro (#4)	Cytiva Whatman	1004-090
Taglierina per carta da filtro, acciaio inossidabile (ID 11,5 mm)	Sconosciuta
Carta da filtro, fibra di vetro	Cytiva Whatman	934-AH
Flask (2800mL)	Corning (Pyrex)	44202XL
Florisil (100-200 mesh)	Fisher Scientific	F101-500
Pinze	Integra Lifescience ( Miltex)	PM-0300
Acido formico (88%, ACS)	Fisher Scientific	A118P-500
Congelatore (-80oC)	Fisher Scientific	TSX70086D
imbuto (15 x 80 mm)	DWK Life Sciences (Kimax)	2902060
Gelzan (medio)	Caisson Labs	G024
Asta di vetro (su misura)	Lana
	Corning (Pyrex)	3950
Manico, bisturi	Feather	#7
Emocitometro	Hausser Scientific	3100
Perossido di idrogeno	Fisher Scientific	H325-4	30%, Certificato ACS
Secchiello per il ghiaccio, rotondo con coperchio	Corning	432122
Incubatore	Percival	136VL
Kimtech SCIENCE Marca	Kimwipes Kimtech	34120	8.2" x 4.39 "
Kimtech SCIENCE Marca Kimwipes	Kimtech	34256	16.4 "x 14.43"
Camice da laboratorio	Cenmed	B113660SBXL
Metanolo, Optima	Fisher Scientific	A454-4
Mini rack a colonna (su misura)	su misura
, touch (maxi mix II)	Thermolyne	37600 (modello 231)
Guanti in nitrile	Microflex	XC310M
Azoto gassoso, compresso (purezza ultra elevata)	Jones Asciugamano di carta per saldatura
	Georgia-Pacific	20023 (D400)
Misuratore di pH	Fisher Scientific (Accumet)	13-636-AB15
Elettrodo pH/ATC	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-111
Reattore	fotochimico PhCRAcque (Vicam)	600001222
Pipetta, pasteur	Fisher Scientific	13-678-20D	9"
Pipettor (1 mL) (Riferimento 2)	Eppendorf	4924000088
Pipettor (10 μ L) (Riferimento)	Eppendorf	022470051D
Puntali per pipette: 10 μ L, 200 μ L, 1 mL	Eppendorf	F144054M
Pipettor (200 & micro; L)(Ergofit)	Fisher Scientific	12-146-679
Piatti, Petri (100x15mm)	Fisher Scientific	FB0875713
Destrosio di Patate Agar (500g)	Becton Dickinson
Tubo per perline rinforzato (2 mL)	Omni International	19-660
Tubo per perline rinforzato (7 mL)	Omni International	19-651
Repipettor, Dispensette III (10mL)	Brandtech	4701141
Resveratrol	Sigma-Aldrich	R5010-100MG
Scoop (su misura)	Su
barattolo con tappo a vite (250 mL)	Corning (Pyrex)	1395250
Gel di silice, sferico (200-400 mesh)	Supelco	97727-U	100 g
Idrossido di sodio	Fisher Scientific	S318-500
SPE estratto pulito 1,5 ml colonna in polipropilene	Forniture per cromatografia americana	SP-5122382
Estratto SPE fritte in PP pulite (per minicolonna da 1,5 mL)	Forniture per cromatografia americana	SP-3119414
Spettrofotometro, visibile ai raggi UV	Fisher Scientific	14-385-351 (Genesys 50)
Provetta	Corning (Pyrex)	982516X	16x125mm
Provetta (monouso)(16x125mm)	Fisher Scientific	14-961-31
Provetta (monouso)(150x250mm)	Fisher Scientific	14-961-34
Thermo Vanquish DAD detector (UPLC)	Thermo Scientific	VF-D11-A-01
Thermo Vanquish Fluourescense detector (UPLC)	Thermo Scientific	VF-D51-A
Thermo Vanquish pompa quaternaria F (UPLC)	Thermo Scientific	VF-P20-A
Thermo Vanquish Split Sampler FT (UPLC)	Thermo Scientific	VF-A10-A-02
Tween 20 (polisorbato 20) (grado enzimatico)	Fisher Scientific	BP337-500
Tappi per fiale (4mL)	Fisher Scientific	C4015-75A
Tappi per fiale (autocampionatore)	Fisher Scientific	C4010-60A
Fiale e tappi (16 mL)	Thermo Scientific	B7800-4
Fiale, vetro (4mL)	Fisher Scientific	C4015-1
Fiale, polipropilene (autocampionatore) (400mL)	Fisher Scientific	C4010-11
Acqua, Optima	Fisher Scientific	W6-4