Articolo metodologico

Protocollo di esercizio di nuoto e metodi di cura per i ratti gravidi

DOI:

10.3791/66577

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5 aprile 2024

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1Department of Exercise Physiology, Beijing Sport University, 2Laboratory of Sports Stress and Adaptation of General Administration of Sport, Beijing Sport University, 3Key Laboratory of Physical Fitness and Exercise, Ministry of Education, Beijing Sport University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un protocollo per delineare i metodi di riproduzione dei ratti, le procedure di addestramento al nuoto e i protocolli infermieristici post-riproduzione per i ratti gravidi dopo l'addestramento. Questo protocollo fornisce un modello animale per lo studio degli effetti dell'esercizio materno durante la gravidanza sulla prole e dei suoi meccanismi sottostanti.

Abstract

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Il concetto di origini evolutive della salute e della malattia evidenzia l'impatto degli ambienti precoci sulle malattie croniche non trasmissibili come il diabete, le malattie cardiovascolari e il cancro. Gli studi che utilizzano modelli animali hanno studiato come fattori materni come la denutrizione, l'ipernutrizione, l'obesità e l'esposizione a sostanze chimiche o ipossia influenzino lo sviluppo fetale e la salute della prole, portando a problemi come il basso peso alla nascita, l'ipertensione, la dislipidemia e l'insulino-resistenza. Data la crescente prevalenza di sovrappeso e obesità tra le donne in età riproduttiva, interventi efficaci sono fondamentali. L'esercizio materno durante la gravidanza è emerso come un intervento chiave, a beneficio sia della madre che della prole e riducendo il rischio di malattia. Questo studio confronta le differenze di tre modelli di esercizio su ratti gravidi: corsa volontaria su ruote, tapis roulant motorizzati e nuoto. Il nuoto è l'opzione più vantaggiosa grazie ai suoi livelli di intensità sicuri e controllati. Questo protocollo descrive in dettaglio i metodi di riproduzione dei ratti, l'addestramento al nuoto durante la gravidanza e i protocolli infermieristici post-riproduzione. Questo modello, adatto a varie specie di ratti e topi, è utile per studiare i benefici dell'esercizio materno sulla salute della prole e sul benessere intergenerazionale.

Introduzione

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Il concetto di Developmental Origins of Health and Disease (DOHaD) è emerso negli ultimi due decenni, il che ha dimostrato che le influenze ambientali durante lo sviluppo precoce influenzano il rischio di successivi processi fisiopatologici associati alle malattie croniche non trasmissibili (NCD), in particolare il diabete, le malattie cardiovascolari e alcuni tipi di cancro1. Durante la fase più plastica dello sviluppo fetale, in cui la prole è esposta all'ambiente intrauterino, l'interazione genico e ambiente e la perfusione utero-placentare sono fattori cruciali della riprogrammazione fetale2. Studi precedenti hanno utilizzato prevalentemente modelli animali per studiare gli effetti dannosi, come la denutrizione materna, l'ipernutrizione o l'obesità durante la gravidanza, e l'esposizione prenatale a sostanze chimiche o ipossia, sullo sviluppo fetale e sugli effetti fenotipici a lungo termine nella prole3. Ciò ha prodotto un basso peso alla nascita e una successiva crescita e ha prodotto effetti avversi sulla prole, tra cui pressione sanguigna elevata, dislipidemia e insulino-resistenza4. Poiché il tasso di sovrappeso e obesità è in rapido aumento tra le donne in età riproduttiva, è urgentemente necessario stabilire interventi efficaci per prevenire la trasmissione intergenerazionale di questi deleteri disturbi materni, che hanno un impatto importante sulla salute della popolazione 5,6.

L'esercizio fisico è stato a lungo riconosciuto come un'importante terapia preventiva per il diabete di tipo 2, l'ipertensione e molte altre malattie7. L'esercizio fisico durante la gravidanza ha effetti benefici per la madre e conferisce effetti benefici alla prole, riducendo così la trasmissione materna della malattia alla prole8. Diversi anni di ricerca hanno dimostrato la sicurezza dell'esercizio fisico e i profondi benefici, tra cui sostanziali riduzioni delle comuni condizioni di gravidanza come il diabete mellito gestazionale 9,10. Per quanto riguarda la sicurezza materna e fetale, condurre l'allenamento fisico e i protocolli post-infermieristici è impegnativo.

David11et al. Modelli di esercizio animale descritti applicabili alla ricerca sulla salute cardiovascolare. I tre modelli di esercizi comunemente usati, la corsa volontaria su ruote, i tapis roulant motorizzati e il nuoto, presentano vantaggi e svantaggi. La ruota che gira volontariamente imita da vicino il comportamento locomotore dei ratti, consentendo loro di muoversi secondo il loro ritmo circadiano. Tuttavia, questo tipo di esercizio richiede una regolazione più precisa dell'intensità e della durata. Il tapis roulant motorizzato può controllare l'intensità, il volume e la durata dell'esercizio, ma a volte necessita di stimolazione elettrica, che può innescare stress fisico e psicologico negli animali. Il nuoto è ampiamente utilizzato negli studi sui roditori a causa dell'intrinseca capacità di nuoto dei ratti, che può anche evitare la stimolazione elettrica o danni meccanici alle zampe e alla coda12. Negli studi sui modelli di esercizio prenatale 13,14, il nuoto è una modalità di esercizio comunemente usata. Man mano che la gravidanza progredisce e l'addome del ratto si gonfia, gli esercizi di corsa su tapis roulant e ruote possono causare il contatto ripetuto dell'addome con superfici dure. Al contrario, l'ambiente acquatico nel nuoto fornisce galleggiabilità, riducendo il rischio di lesioni legate all'esercizio per gli animali in gravidanza.

Questo protocollo presenta i metodi di allevamento dei ratti, come eseguire l'allenamento di nuoto durante la gravidanza e i protocolli di allattamento post-riproduzione per i ratti gravidi dopo l'addestramento. Questo modello di addestramento al nuoto in gravidanza può essere applicato a un'ampia gamma di specie di ratti e topi, che possono quindi fornire un utile modello di roditore per future indagini utilizzando modelli basati su animali per studiare i meccanismi che regolano gli effetti benefici dell'esercizio materno sulla salute della prole e i benefici dell'esercizio attraverso le generazioni.

Protocollo

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Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal comitato etico animale dell'Università dello Sport di Pechino ed eseguiti in conformità con le linee guida del National Institutes of Health (NIH) e le leggi cinesi sulla protezione degli animali e le linee guida istituzionali.

1. Accoppiamento e alimentazione dei ratti

  1. Acquista ratti femmina Wistar di 10 settimane e ratti maschi Wistar di 11 settimane senza agenti patogeni (SPF) specifici.
  2. Implementare l'alimentazione adattiva: nutrire i ratti Wistar ad libitum con una dieta standard per roditori e fornire l'accesso all'acqua del rubinetto per una settimana nell'impianto di alimentazione designato. Assicurarsi che tutti i ratti siano alloggiati in un ciclo luce-buio di 12 ore a una temperatura costante di 22 °C e un'umidità del 45-55%.
  3. Esamina l'estro della femmina di ratto.
    1. Preparare l'attrezzatura e i materiali, inclusi vetrini da microscopio in vetro puliti, tamponi di cotone da 2 mm di diametro, soluzione salina (NaCl 0,9%) e microscopio.
    2. Etichettare ogni vetrino da microscopio con la data e l'identificazione del ratto.
    3. Tra le 18 e le 19, per ridurre al minimo lo stress, trattenere delicatamente la femmina di ratto. Afferrare la base della coda con il pollice e l'indice mentre si applica la pressione delle altre dita sulla vertebra lombare del ratto.
    4. Solleva la punta della coda ed esponi la vagina. Inumidisci un batuffolo di cotone con una soluzione salina, quindi metti la punta nella vagina e arrotola delicatamente la punta per raccogliere le secrezioni vaginali.
    5. Far rotolare la punta del tampone sul vetrino, evitando di riapplicarla nella stessa area.
    6. Esaminare lo striscio al microscopio e utilizzare l'obiettivo a basso ingrandimento (10x) per localizzare e osservare le cellule.
      NOTA: Durante l'estro, le secrezioni vaginali hanno nuclei epiteliali più grandi scomparsi, sostituiti da cellule epiteliali cheratinizzate esfoliate squamose che si sono accumulate in un tumulo.
    7. Registra la fase del ciclo estrale per ogni ratto.
  4. Tra le 19 e le 20, metti un ratto maschio e una femmina nella gabbia di accoppiamento.
    NOTA: Le femmine di ratto devono essere in proestro o estro per l'accoppiamento.
  5. Il secondo giorno, tra le 7 e le 8 del mattino, ispezionare la gabbia di accoppiamento per verificare la presenza di tappi copulatori. Se si trova un tappo copulatorio alla base della gabbia di accoppiamento, procedere alla creazione di uno striscio di secrezione vaginale per la femmina di ratto seguendo lo stesso metodo descritto nei passaggi 1.3.4- 1.3.6.
    NOTA: I tappi copulatori sono materiali gelatinosi di colore bianco latte o giallastro costituiti da vescicole seminali di ratto maschio e secrezioni prostatiche combinate con secrezioni vaginali.
  6. Confermare la gravidanza nella femmina di ratto: dopo aver trovato i tappi copulatori nella gabbia di accoppiamento, osservare gli spermatozoi sullo striscio di secrezione vaginale. Designare questo giorno come giorno di gestazione 1 (GD1).
  7. Isolare il ratto gravido in una gabbia separata.
    NOTA: Durante le fasi iniziali della gravidanza, è imperativo evitare che un ratto gravido incontri segnali chimici maschili sconosciuti nel suo ambiente o che coabita con un ratto maschio sconosciuto.
  8. I periodi di gestazione del ratto durano in genere 21-23 giorni. Misura e registra il peso corporeo dei ratti da GD1 a GD20.
  9. Su GD20, sostituire la gabbia del ratto gravido con una pulita e posizionare del cotone assorbente medico (di dimensioni simili al ratto) nella gabbia. Fornire acqua e cibo sufficienti per la sopravvivenza di sette giorni e posizionare la gabbia in un luogo tranquillo.
    NOTA: Non cambiare la gabbia per almeno 1 settimana dopo il parto del ratto. Quando si passa a una gabbia pulita, trasferire il cotone assorbente usato dalla gabbia sporca a quella nuova per assicurarsi che i ratti possano riconoscere l'odore della loro prole.
  10. Il 21° giorno dopo il parto, separare la prole per sesso e metterla in due gabbie.
    NOTA: A causa delle dimensioni ridotte della prole di 21 giorni, posizionare i pellet di mangime duro in una capsula di Petri di vetro all'interno della gabbia.

2. Programma di allenamento prenatale per il nuoto

  1. Condurre un addestramento all'adattamento per tutti i ratti femmina sperimentali per 5 giorni.
    1. Preparare un contenitore di plastica trasparente di almeno 20 cm di altezza e riempirlo con 10 cm di acqua a 34 ± 1°C.
    2. Afferra la punta della coda del topo e sollevala, quindi metti il topo nell'acqua.
    3. Durante l'allenamento adattivo di 15 minuti, monitora attentamente la temperatura dell'acqua ogni 5 minuti, aggiungendo acqua calda per mantenere la temperatura.
    4. Dopo l'addestramento, trasferire il ratto in acqua pulita a 34 ± 1°C per lavare il pelo. Quindi, trasferisci il topo in una gabbia con asciugamani e usa un asciugacapelli per asciugare il pelo.
      NOTA: Il rumore e un ambiente caldo possono causare stress ai ratti. Pertanto, si consiglia di utilizzare un asciugacapelli silenzioso e a temperatura regolabile.
    5. Si prega di riportare il topo nelle rispettive gabbie.
  2. Accoppiamento del ratto (seguire i passaggi 1.3-1.6).
  3. Dopo il passaggio 1.7, assegnare in modo casuale i ratti gravidi a un gruppo sedentario (SED) e a un gruppo di esercizi (EX).
  4. Pesare il ratto ogni giorno prima di ogni sessione di allenamento.
    NOTA: Durante l'allenamento adattivo, la perdita di peso dei ratti non deve superare i 3 g/giorno. Durante l'addestramento prenatale, il peso dei ratti dovrebbe aumentare gradualmente. Se i ratti perdono più di 3 g al giorno, ridurre il tempo di allenamento giornaliero del 50% per consentire il recupero.
  5. Condurre l'allenamento di nuoto prenatale per l'EX da GD1 a GD20, 6 giorni alla settimana, dalle 8:00 alle 9:00 del mattino.
    1. Preparare un secchio d'acqua circolare con un diametro di 50 cm e un'altezza minima di 50 cm e riempirlo con 40 cm di acqua ad una temperatura di 34 ± 1°C.
    2. Da GD1 a GD5, eseguire inizialmente l'allenamento di nuoto per 20 min al giorno e aumentare progressivamente fino a 60 min al giorno.
    3. Da GD6 a GD20, continua l'allenamento per 60 minuti al giorno per 6 giorni a settimana.
    4. Per la cura successiva, fare riferimento ai passaggi 2.1.4-2.1.5.
    5. Dopo l'esercizio, somministrare all'EX rat 5 g di semi di girasole per roditori per fornire supporto nutrizionale.
  6. Durante l'allenamento EX ogni giorno, posizionare il ratto SED nello stesso ambiente acquatico dell'allenamento adattivo (passaggio 2.1.1). Lascia che il ratto SED trascorra lo stesso tempo nell'ambiente acquatico del ratto EX. Dopo l'esercizio, dai al ratto SED 5 g di semi di girasole per roditori per fornirgli supporto nutrizionale ed emozioni rilassanti.
  7. Dopo ogni sessione di allenamento di nuoto, pulisci e disinfetta tutte le attrezzature con luce ultravioletta, compresi secchi d'acqua e asciugamani.

3. Caratteristiche fisiche dei feti

  1. La mattina di GD20.5, anestetizzare la femmina di ratto con isoflurano al 3% e sopprimerla in una camera di CO2 .
  2. Usa un coltello chirurgico per praticare un'incisione nell'addome inferiore del ratto. Assicurarsi che l'incisione sia inclinata verso entrambi i lati dell'addome, garantendo la completa esposizione dell'utero.
  3. Aprire con cautela l'utero usando pinze e forbici per esporre i feti e la placenta. Separare delicatamente il sottile amnio che circonda i feti usando una pinza per evitare danni indotti dalle forbici ai feti e alle placenta.
  4. Pulisci i corpi dei feti usando una garza sterile per rimuovere sangue e muco. Separare in sequenza feti e placente in base alle loro posizioni anatomiche, quindi pesarli.
  5. Osservare la distanza tra l'ano e i genitali per determinare il sesso dei feti. I feti maschi hanno una distanza maggiore rispetto alle femmine. Registrare il sesso e la quantità di feti per riferimento futuro.
  6. Misurare la lunghezza dei feti usando un calibro mentre si è sdraiati. Poiché i feti sono ancora vivi, possono raggomitolarsi dopo essere stati sezionati, quindi apri i loro corpi per prendere le misure.
    NOTA: Per garantire la coerenza dei risultati sperimentali e la coerenza dei metodi di misurazione, lo stesso sperimentatore mantiene gli stessi standard per tutto il tempo. I feti sono stati soppressi secondo le linee guida raccomandate dall'istituzione e sono stati raccolti campioni di tessuto per ulteriori analisi, se necessario.

Risultati

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Nella sezione sui metodi di riproduzione dei ratti (Figura 1), determiniamo il ciclo estrale delle femmine di ratto effettuando vetrini di secrezione vaginale per aumentare il tasso di successo della riproduzione. Il ciclo estrale dei ratti dura 4-5 giorni, tra cui proestro, estro, metestro e diestro. Le femmine di ratto in metestro o diestro mostrano comportamenti come allontanarsi dai maschi. Allo stesso tempo, quelli in estro sono disposti ad accoppiarsi e l'ovulazione nelle femmine di ratto si verifica principalmente alla fine dell'estro. Durante il proestro, i campioni di striscio vaginale contengono principalmente cellule epiteliali nucleate con occasionali cellule cheratinizzate. Nell'estro, lo striscio vaginale è costituito prevalentemente da cellule epiteliali squamose cheratinizzate, raggruppate in pile, con la scomparsa dei nuclei ingrossati delle cellule epiteliali osservata nel metestro. Nel metestro, lo striscio vaginale contiene principalmente globuli bianchi con poche cellule epiteliali cheratinizzate. Lo stadio di diestro è caratterizzato da una predominanza di globuli bianchi, con occasionali cellule epiteliali nucleate e cheratinizzate (Figura 1A).

Il tappo copulatorio è una sostanza gelatinosa composta da secrezioni vaginali e seminali. La femmina di ratto forma un tappo copulatorio per impedire ad altri ratti maschi di accoppiarsi di nuovo, bloccando anche la vagina della femmina di ratto per impedire la fuoriuscita dello sperma del ratto maschio. La presenza del tappo copulatorio non indica necessariamente il successo della riproduzione, ma piuttosto indica solo il verificarsi del comportamento di accoppiamento. Pertanto, è necessario eseguire nuovamente lo striscio vaginale sulla femmina di ratto al mattino dopo l'accoppiamento. La presenza di spermatozoi nello striscio vaginale indica il successo della riproduzione. È importante monitorare il peso delle femmine di ratto dopo questa giornata per osservare se aumenta gradualmente, il che è un segno di gravidanza di successo. Se non c'è formazione di tappo copulatorio entro due giorni dall'accoppiamento, o se si forma un tappo copulatorio ma non si osserva spermatozoi nello striscio, si raccomanda di sostituire il ratto maschio e tentare di riprodursi. Esaminando i vetrini di secrezione vaginale al microscopio, determiniamo lo stadio del ciclo estrale nelle femmine di ratto e utilizziamo quelli in proestro ed estro per la riproduzione. I ratti gravidi sono stati assegnati in modo casuale a un gruppo sedentario (SED) o di esercizio fisico (EX), con allenamento di nuoto condotto da GD1 a GD20 (Figura 1B). Per osservare i tappi copulatori che si formano dopo l'accoppiamento del ratto, utilizziamo una gabbia di accoppiamento appositamente progettata per l'accoppiamento del ratto. La gabbia di accoppiamento è costituita da un vassoio di base, un fondo in rete metallica, un telaio della gabbia senza fondo e una copertura della gabbia metallica (Figura 1C).

Prima del parto, i ratti gravidi possono mostrare un comportamento di nidificazione (Figura 1E), utilizzando i materiali nel loro ambiente per costruire un nido accogliente e caldo per la loro prole. Si consiglia di posizionare una quantità di cotone sgrassato nella gabbia corrispondente alle dimensioni del ratto gravido ogni volta che lo si trasferisce in una nuova gabbia pulita su GD20. Per studiare i ratti giovani, devono essere allevati fino a una certa età. I ratti vengono svezzati a circa 21 giorni dopo la nascita. Pertanto, il 21° giorno dopo la nascita, i ratti vengono separati per sesso (Figura 1F) per l'allevamento individuale. Il metodo per identificare il sesso dei ratti consiste nell'osservare la distanza tra i genitali e l'ano. Nei maschi, la distanza è maggiore e hanno il pelo tra i genitali e l'ano. I genitali maschili sono più prominenti e pronunciati rispetto alle femmine. Le femmine di ratto hanno capezzoli più evidenti rispetto ai maschi.

Si raccomanda la pesatura e la registrazione giornaliera da GD1 a GD20 durante la gravidanza di ratti (Figura 2). Il peso dei ratti dovrebbe aumentare gradualmente durante la gravidanza (Figura 2A) e i pesi giornalieri dovrebbero essere confrontati con il peso del giorno precedente. Questo è fondamentale perché i ratti tendono a consumare i loro embrioni dopo un aborto spontaneo, rendendo difficile rilevarli attraverso la sola osservazione. Inoltre, il monitoraggio del peso dei ratti può aiutare a identificare l'esercizio fisico eccessivo. Se il peso del ratto diminuisce di oltre 3 g, ridurre la durata dell'allenamento per quel giorno del 50%. Su GD20.5, i ratti gravidi vengono sezionati per ottenere feti e placente, e il rapporto tra il peso fetale e il peso placentare è definito come efficienza placentare (Figura 2B). Misurare la lunghezza del feto dalla punta della testa alla parte inferiore della groppa in posizione laterale utilizzando un righello per ottenere la lunghezza del corpo fetale (Figura 1G e 2C).

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Figura 1: Modello di gravidanza di ratto. (A) I risultati dello striscio vaginale in diversi periodi estrali, le immagini del plug copulatorio dei ratti e la presenza di spermatozoi negli strisci vaginali il secondo giorno dopo l'accoppiamento. (B) Schema che illustra il programma di allenamento di nuoto prenatale. (C) Viste d'insieme della gabbia di accoppiamento per i ratti. (D) Una foto dell'allenamento di nuoto per ratti gravidi che dimostri il diametro del secchio d'acqua utilizzato. (E) Il comportamento dei ratti nel costruire il nido. (F) Le diverse apparizioni degli organi riproduttivi nei ratti maschi e femmine a 21 giorni di età. (G) L'aspetto dei feti e delle placente e una rappresentazione schematica del metodo per misurare la lunghezza del corpo del feto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Peso corporeo delle ratte gravide e caratteristiche fisiche dei feti. (A) Le variazioni di peso delle ratte gravide da GD1 a GD20 nei gruppi SED ed EX (n = 9 ciascuno). (B) La differenza di efficienza placentare tra i due gruppi. (C) La variazione della lunghezza corporea dei feti tra i gruppi SED ed EX. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Confronto di diversi metodi di esercizio per ratti femmine gravide. I vantaggi e gli svantaggi dei diversi metodi di esercizio per le femmine di ratto gravide: corsa volontaria su ruote (VWR), tapis roulant motorizzato (MT) e nuoto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Programma di esercizi di nuoto. (A) Il processo completo di accoppiamento, gravidanza, esercizio di nuoto, parto e allattamento descritto nelle fasi del protocollo 1.1-1.10 utilizzando ratti Wistar femmine. (B) Il processo di allenamento del nuoto durante la gravidanza descritto nelle fasi del protocollo 2.1-2.6, compreso l'allenamento di adattamento e l'allenamento formale. La temperatura dell'acqua viene mantenuta durante tutto il processo a 34 ± 1 °C. Durante l'allenamento di adattamento, la profondità dell'acqua è di 10 cm, mentre durante l'allenamento formale, è di 10 cm per il SED e di 40 cm per l'EX. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Possibili problemi nell'esercizio di nuoto e nell'assistenza postpartum per ratti gravidi e loro soluzioni. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Un'analisi comparativa dei programmi di esercizio fisico in femmine e maschi gravidi di ratti o topi. MT: tapis roulant motorizzato; VWR: circolazione volontaria delle ruote; MLC: test di massima capacità di carico. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

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Questo studio mira a stabilire un programma di esercizi fattibile per i ratti gravidi, inclusi metodi dettagliati di accoppiamento dei ratti, protocolli di allenamento al nuoto e metodi di ricerca per valutare gli indicatori fisiologici nei feti. Abbiamo sviluppato un modello di allenamento prenatale per l'esercizio di nuoto attraverso la pratica, con soluzioni corrispondenti a potenziali problemi che possono sorgere nel protocollo (Tabella 1). Questo protocollo lo renderà più pratico e aiuterà i ricercatori a stabilire modelli di esercizio prenatale.

I risultati della nostra ricerca indicano che l'utilizzo del programma di allenamento per il nuoto in gravidanza dei ratti non interferisce con il normale processo di gravidanza dei ratti e non porta a esiti avversi della gravidanza. L'impatto dell'esercizio prenatale sugli esiti della gravidanza nei ratti è stato valutato misurando i tassi di aborto spontaneo e le dimensioni della cucciolata. Lo studio ha concluso che l'esercizio prenatale non ha influenzato in modo significativo questi fattori15,16. Per studiare i feti, i ricercatori sezionano ratti gravidi su GD20.5 per ottenere campioni fetali. Durante la dissezione, vengono raccolti feti e placente ed è fondamentale tenere traccia del numero di prole per cucciolata per determinare gli esiti della gravidanza, richiedendo il conteggio del numero fetale e della lunghezza del corpo fetale. Inoltre, l'efficienza placentare è il rapporto tra il peso fetale e il peso placentare, che richiede misurazioni sia del peso fetale che di quello placentare. I nostri risultati precedenti hanno indicato che l'esercizio prenatale non ha influenzato significativamente la lunghezza del corpo fetale, ma ha migliorato significativamente l'efficienza placentare nel gruppo di esercizio iperteso rispetto al gruppo di controllo iperteso15. Il comportamento materno13,17 può servire come indicatore per valutare l'impatto dell'esercizio fisico durante la gravidanza sulla madre. Pertanto, indicatori come il tasso di aborto spontaneo, le dimensioni della cucciolata, la lunghezza e il peso del corpo fetale, l'efficienza placentare e il comportamento materno possono essere utilizzati per valutare gli effetti dell'esercizio gestazionale sugli esiti fetali. Pertanto, consigliamo di adottare il nostro protocollo sperimentale quando si modellano modelli di esercizi in gravidanza per evitare danni inutili agli animali da esperimento.

Dallo sviluppo della teoria DOHaD, c'è stata una maggiore enfasi sull'esplorazione dell'influenza delle variabili ambientali precoci sulla salute individuale18. Sono stati condotti numerosi studi per indagare le vie fisiopatologiche putative nei disturbi di origine fetale utilizzando modelli animali19. Poiché i modelli di roditori che includono l'esercizio fisico durante la gravidanza possono imitare con successo questo processo, vari tipi di esercizio vengono esplorati in modelli animali con diverse malattie di derivazione fetale20. Ruote da corsa autonome, piattaforme da corsa, attrezzature per l'arrampicata portante e protocolli di nuoto sono esempi di tecniche di allenamento comuni. L'obesità, il diabete e l'ipertensione sono tutti modelli animali tipici21. Possiamo vedere che diverse routine di esercizi hanno vantaggi e svantaggi distinti dalla classificazione e dal confronto dei metodi di esercizio utilizzati in vari studi di ricerca 15,16,21,22,23,24 (Figura 3 e Tabella 2).

Offriamo una spiegazione dettagliata del controllo della gravidanza nei ratti, dell'esecuzione della routine di esercizi di nuoto e della valutazione dei feti e della progenie in questo protocollo. Controllando attentamente il comportamento di accoppiamento dei ratti, è stato possibile ottenere una stima più accurata della durata di una gravidanza. Ciò ha permesso interventi di esercizio fisico durante la gravidanza e ha creato un modello per lo studio dell'esercizio prenatale. A 21 giorni di gestazione, i campioni di feti e placenta possono essere sezionati per valutare gli effetti intergenerazionali dell'attività materna durante la gravidanza sulla funzione placentare e sullo sviluppo fetale. Inoltre, la prole di ratti con esercizio gestazionale è stata nutrita fino all'età adulta e persino alla vecchiaia per studiare i processi fisiologici e patologici a lungo termine alla base di questi effetti.

Quando si imposta un programma di allenamento di nuoto per i ratti, è importante considerare che potrebbero cercare di evitare di nuotare nascondendosi negli angoli, uscendo dalla piscina, aggrappandosi ad altri ratti o persino galleggiando sulle bolle d'aria nella loro pelliccia. Per evitare ciò, la piscina dovrebbe essere in plastica ed essere cilindrica. L'acqua nella piscina dovrebbe essere più profonda di 1,5 volte la lunghezza del ratto, misurata dal naso alla fine della coda. La profondità dell'acqua dovrebbe essere principalmente superiore a 50 cm e la superficie dovrebbe essere abbastanza ampia da consentire il nuoto illimitato. Fornire ai ratti uno spazio minimo per nuotare di 1000 cm2 è importante11. Pertanto, abbiamo progettato un attrezzo per l'allenamento del nuoto che consiste in un secchio con un'altezza di 55 cm e un diametro di 50 cm. Durante l'allenamento di nuoto, il livello dell'acqua dovrebbe essere di 40 cm e il diametro della superficie dell'acqua dovrebbe essere di 45 cm. Inoltre, è importante mantenere la temperatura dell'acqua a 34 ± 1°C. Questo apparecchio è adatto per l'addestramento di un ratto alla volta. È importante aumentare gradualmente l'intensità dell'allenamento di nuoto per i ratti gravidi. Ciò consente loro di adattarsi all'esercizio e all'ambiente acquatico. Improvvisi cambiamenti di intensità potrebbero causare reazioni allo stress, che possono aumentare il rischio di aborto spontaneo. Inoltre, si consiglia di avere almeno un giorno di riposo alla settimana per prevenire l'affaticamento indotto dall'esercizio.

I modelli animali utilizzati nella nostra precedente ricerca25 sull'esercizio durante la gravidanza includevano ratti spontaneamente ipertesi (SHR) e controlli di ratti normotesi Wistar Kyoto (WKY), rendendo la routine di esercizio di questo protocollo ugualmente adatta per ratti ipertesi o altri modelli di malattia. Il nostro studio ha già scoperto che l'esercizio fisico durante la gravidanza ha ridotto significativamente la pressione sanguigna nella prole ipertesa di 3 mesi e che l'esercizio prenatale ha avuto un impatto importante sulla riduzione della reattività cardiovascolare14. È stato anche scoperto che l'esercizio materno induce modificazioni epigenetiche del gene α1C (Cacna1c) del canale Ca2+ voltaggio-dipendente di tipo L, del gene del recettore dell'angiotensina II di tipo 1 (Agtr1a) e del gene NADPH ossidasi-4 (Nox4) per migliorare la funzione vascolare nella prole ipertesa 14,25,26.

Molteplici fattori possono influenzare il processo riproduttivo nei ratti. L'età del ratto, lo stato di salute, la motilità degli spermatozoi, l'estro della femmina di ratto, la temperatura, l'umidità e gli spostamenti di luce nell'habitat di riproduzione influenzano l'accoppiamento. Inoltre, il rumore e le vibrazioni indoor durante l'allevamento possono causare agitazione nei ratti ipertesi, portare ad aborto spontaneo o rifiutare l'alimentazione postpartum. Il cotone insonorizzato copre le gabbie degli animali durante l'allevamento per ridurre questi impatti.

In questo protocollo, offriamo una guida completa sui metodi di accoppiamento dei ratti, un programma di esercizi di nuoto per ratti gravidi, cure postnatali per ratti gravidi, metodi per allevare ratti prole e tecniche di osservazione per misurare le caratteristiche fisiche dei feti. I risultati della nostra ricerca contribuiscono allo studio dell'eredità intergenerazionale dell'esercizio materno e dimostrano un approccio di ricerca razionale ed efficace. Il nostro obiettivo è quello di stabilire un modello di esercizio di nuoto efficace per le donne in gravidanza nel campo della fisiologia dell'esercizio, che aiuterà la ricerca futura in questo settore.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (32071174, 32200941, 32371183 e 31771312).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
CalibroMitutoyo Measuring Instruments (Shanghai) Co., Ltd530-101 N15Feto dissezionare
Secchio d'acqua circolareNaliyaN/ARat nuoto
Strumento chirurgico sperimentale Shenzhen RWD Life Technology Co., LTDSP0001-Gdissezionare
fetoJiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD80312-3161Striscio vaginale
Capsula di Petri in vetroMerck Life TechnologiesBR455751-10EAAsciugacapelli per l'allevamento della prole
PanasonicEH-WNE5Hla cura post-nuoto
Zhongke Scienze della vitaSS3Accoppiamento di ratti
IsofluranoShenzhen RWD Life Technology Co., LTDR510-22-10Feto dissezionare
Microscopio otticoOlympusIX71-F22PHStriscio vaginale
Gabbia di accoppiamentoZhongke Life ScienceSS3Rat accoppiamento
Cotone assorbente medicoHongxiang Sanitary Materials Co., Ltd N/AI ratti in gravidanza sono anticipando il parto
Roditore Anestesia Macchina, Gas AnesthesiaShenzhen RWD Life Technology Co., LTDR500IEFeto dissezionare
Roditore Allevamento MangimeBeijing Huafukang Biotechnology Co., LTD1032Ratto incinta alimentazione
Roditore manutenzione MangimeBeijing Huafukang Biotechnology Co., LTD1022Prole allevamento
Roditore semi di girasoleJollyJP241Integratore alimentare
Cotone insonorizzatoKufu Medical InstrumentN/AI ratti gravidi stanno aspettando il parto
Tampone di cotone sterile (2 mm di diametro)Kufu Medical InstrumentN/AStriscio vaginale
Garza sterileKufu Medical InstrumentN/AFeto dissezionare
Soluzione salina fisiologica per l'ictus (0,9% NaCl)Shandong Hualu Pharmaceutical Co., LTDN/AStriscio vaginale
TermometroOrganismo BeekmanN/AIl monitoraggio del nuoto dei ratti
AsciugamaniGraceN/ACura post-nuoto
Contenitore di plastica trasparenteNaliyaN/ANuoto allenamento adattivo
Luce ultraviolettaMerck Life TechnologiesZ169633-1EAScaldabagno post-nuoto
HaierEC6001-Q6SBilancia per il nuoto dei ratti
Electronlc AcaleJM. A10001Misurazione del peso corporeo
Wistar RattiVital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd N/AEsperimento
Vetrini per microscopio in vetro per Scheda informativa per

Riferimenti

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