Purificazione e caratterizzazione di vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali di derivazione adiposa umana

Summary

Questo protocollo descrive tutte le procedure, dalla coltura di cellule staminali mesenchimali di derivazione adiposa umana (ADSC) e la raccolta del surnatante all'estrazione delle vescicole extracellulari (EV) mediante ultracentrifugazione.

Abstract

Le cellule staminali mesenchimali di derivazione adiposa umana (ADSC) possono promuovere la rigenerazione e la ricostruzione di vari tessuti e organi. Recenti ricerche suggeriscono che la loro funzione rigenerativa può essere attribuita al contatto cellula-cellula e agli effetti paracrini cellulari. L'effetto paracrino è un modo importante per le cellule di interagire e trasferire informazioni su brevi distanze, in cui le vescicole extracellulari (EV) svolgono un ruolo funzionale come trasportatori. Esiste un potenziale significativo per le EV ADSC nella medicina rigenerativa. Diversi studi hanno riportato l'efficacia di questi metodi. Attualmente sono descritti vari metodi per l'estrazione e l'isolamento delle vescicole extracellulari basati su principi quali centrifugazione, precipitazione, dimensione molecolare, affinità e microfluidica. L'ultracentrifugazione è considerata il gold standard per l'isolamento delle vescicole extracellulari. Tuttavia, manca ancora un protocollo meticoloso per evidenziare le precauzioni durante l'ultracentrifugazione. Questo studio presenta la metodologia e le fasi cruciali coinvolte nella coltura dell'ADSC, nella raccolta del surnatante e nell'ultracentrifugazione EV. Tuttavia, anche se l'ultracentrifugazione è conveniente e non richiede ulteriori trattamenti, ci sono ancora alcuni inevitabili inconvenienti, come un basso tasso di recupero e l'aggregazione di EV.

Introduction

La maggior parte delle ADSC deriva dal tessuto adiposo ed è stato dimostrato che promuove la rigenerazione e la ricostruzione di vari tessuti e organi, tra cui il miocardio, l'osso e la pelle¹. Ricerche recenti suggeriscono che la funzione rigenerativa delle ADSC può essere dovuta al contatto intercellulare e agli effetti paracrini delle cellule². L'effetto paracrino è un mezzo importante per le cellule per interagire e trasferire informazioni su brevi distanze, e questa funzione si ottiene attraverso le vescicole extracellulari (EV).

Le EV sono strutture di membrana a doppio strato prodotte da celle, con un diametro che varia da 40 nm a 160 nm (con una media di circa 100 nm). Influenzano diverse funzioni cellulari, come la produzione di citochine, la proliferazione cellulare, l'apoptosi e il metabolismo ^3,4. Sono stati condotti numerosi studi sulle funzioni delle EV ADSC, tra cui la promozione della rigenerazione ossea, la rigenerazione del tessuto mucoso orale, la sopravvivenza del tessuto adiposo dopo il trapianto di tessuto e la riparazione delle ferite cutanee 5,6,7,8. L'enorme potenziale delle EV ADSC nella medicina rigenerativa è evidente. Esistono vari metodi per estrarre e separare le vescicole extracellulari dal surnatante, come le tecniche basate sulla centrifugazione, la precipitazione, la dimensione molecolare, l'affinità e la microfluidica. Il metodo dell'ultracentrifugazione è ampiamente considerato il gold standard per l'isolamento delle vescicole extracellulari⁹. Il principio fondamentale dell'ultracentrifugazione per la separazione delle vescicole extracellulari si basa sul fatto che le particelle nel campione hanno coefficienti di sedimentazione variabili, con conseguente sedimentazione e aggregazione in strati di separazione distinti. Tuttavia, non è stato ancora stabilito un protocollo dettagliato che enfatizzi le precauzioni durante l'ultracentrifugazione.

Pertanto, questo studio delinea oggettivamente la coltura dell'ADSC, la raccolta del surnatante e le procedure di ultracentrifugazione delle vescicole extracellulari e i punti chiave con un flusso logico di informazioni e un linguaggio chiaro e formale. Questo fornisce un prezioso riferimento per esperimenti futuri.

Protocol

La panoramica dei passaggi del protocollo è illustrata nella Figura 1. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione dei terreni

1. Preparare un terreno di coltura per ADSC senza esosomi utilizzando 450 ml di terreno di coltura basale, 50 ml di siero fetale bovino senza esosomi e 5 ml di triplo antibiotico.

2. Rianimazione e coltura degli ADSC

NOTA: Rianimare gli ADSC.

1. Accendere preventivamente i raggi UV del tavolo ultra-pulito e disinfettarlo per 30 minuti.
2. Preriscaldare prima il fluido a bagnomaria a 37 °C.
3. Prelevare 2 provette di ADSC (P3) congelate dall'azoto liquido e agitarle in un bagno d'acqua a 37 °C a temperatura costante fino a completo scongelamento.
   NOTA: L'apertura del tubo del congelatore non deve essere a contatto con l'acqua per evitare contaminazioni.
4. Disinfettare la provetta per crioconservazione con alcol al 75% e poi spostarla sul tavolo ultra-clean. Aspirare la sospensione cellulare utilizzando una pipetta e posizionarla in una provetta da centrifuga da 15 mL.
5. Posizionare la provetta da centrifuga in una centrifuga a bassa velocità e centrifugare a 250 x g per 5 minuti a 4 °C.
6. Preparare quattro piastre di coltura da 10 cm e mettere 9 ml di terreno in ciascuna piastra. Segnare il nome, il tipo di cella, la generazione e la data dell'esperimento, quindi preriscaldarli in un incubatore di celle termostatiche a 37 °C.
7. Disinfettare la provetta da centrifuga e spostarla sul tavolo ultra-clean. Rimuovere il surnatante con una pipetta.
8. Aggiungere 4 mL di terreno e agitare delicatamente la soluzione (1 x 10⁵ cellule/mL) fino a quando non si disperde uniformemente.
   NOTA: Fare attenzione a non eliminare il pellet della cella durante l'estrazione del surnatante.
9. Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare a ciascun piatto. Scuotere i piatti con un metodo a croce.
   NOTA: Posizionare la piastra su una superficie piana e agitarla a croce (spostandola su, giù, sinistra e destra) per 5-6 ripetizioni. Evitare movimenti circolari, in quanto potrebbero causare l'accumulo di cellule al centro.
10. Osservare le cellule con un ingrandimento di 40x con il microscopio ottico, quindi posizionare le piastre nell'incubatrice.
    NOTA: Lo scopo principale dell'osservazione delle cellule è determinare se sono distribuite uniformemente, poiché una distribuzione irregolare influenzerà la crescita successiva.
11. Preparare il terreno di scambio per le cellule.
    1. Accendere preventivamente i raggi UV del tavolo ultra-pulito e disinfettarlo per 30 minuti.
    2. Preriscaldare prima il fluido a bagnomaria a 37 °C.
    3. Osservare lo stato della cellula al microscopio ottico con un ingrandimento di 40x. Il livello di confluenza è di circa il 50%.
       NOTA: Il livello di confluenza è calcolato come il rapporto tra l'area occupata dalle cellule e l'area superficiale della capsula di Petri dopo che le cellule hanno aderito alla parete e si sono completamente allungate.
    4. Trasferire la piastra di coltura sul tavolo ultra-pulito (livello di biosicurezza 2) dopo la disinfezione e rimuovere il terreno.
    5. Sciacquare delicatamente ogni piatto di coltura due volte con 2 ml di soluzione di PBS.
    6. Aggiungere 10 ml di terreno in ogni piatto. Trasferire i piatti nell'incubatrice.

3. Raccolta del surnatante ADSC ed estrazione delle EV

1. Accendere preventivamente i raggi UV del tavolo ultra-pulito e disinfettarlo per 30 minuti.
2. Osservare lo stato della cellula al microscopio. Il livello di confluenza è di circa l'80%.
3. Trasferire il piatto sul tavolo ultra-pulito dopo la disinfezione. Raccogliere con cura il surnatante con una pipetta e metterlo in una provetta da centrifuga da 50 ml.
   NOTA: Le celle possono essere congelate o scartate. Se la sterilità non è richiesta, è possibile eseguire i seguenti passaggi sul tavolo operatorio. A questo punto, l'esperimento può essere messo in pausa e quindi riavviato in un secondo momento. Se l'esperimento viene interrotto, conservare il surnatante in frigorifero a 4 °C per non più di una settimana. La conservazione a lungo termine non è consigliata in quanto potrebbe influire sull'attività dei veicoli elettrici. L'approccio ottimale è quello di estrarre immediatamente le EV.
4. Centrifugare (300 x g, 10 min, a temperatura ambiente) per rimuovere le celle sospese. Raccogliere il surnatante con una pipetta.
   NOTA: Non versare. Lasciare un po' di surnatante per evitare che il pellet venga aspirato.
5. Centrifugare per rimuovere i detriti cellulari (2000 x g, 10 min, 4 °C), quindi continuare a raccogliere il surnatante con una pipetta.
   NOTA: I punti chiave sono gli stessi del passaggio 3.4.
6. Filtrare il surnatante con una membrana da 0,22 um per rimuovere particelle di grandi dimensioni e detriti cellulari.
   NOTA: Filtrare il surnatante con 2 mL di PBS sterile per inumidire la membrana del filtro prima della filtrazione.
7. Centrifugare nella macchina ultracentrifuga (10.000 x g, 30 min, 4 °C).
8. Successivamente, centrifugare a 1,00,000 x g per 70 minuti a 4 °C per rimuovere il pellet e raccogliere il surnatante.
   NOTA: Le vescicole extracellulari ottenute sono state purificate mediante centrifugazione più volte per aumentarne la purezza. Il pallino potrebbe non essere visibile ad occhio nudo. Pertanto, è fondamentale azionare delicatamente la pipetta e lasciare un po' di surnatante sul fondo per evitare la raccolta di pellet.
9. Rimuovere il surnatante con una pipetta. Risospendere il pellet con PBS e centrifugare (1,00,000 x g, 70 min, 4 °C).
   NOTA: Il pallino potrebbe non essere visibile ad occhio nudo. Pertanto, quando si aspira il surnatante con una pipetta, è fondamentale rimuovere delicatamente e accuratamente il surnatante per massimizzare la purezza delle vescicole extracellulari.
10. Rimuovere il surnatante e ottenere il pellet EVs. Risospenderlo con 1 mL di PBS, trasferirlo in una provetta da centrifuga da 1 mL e conservarlo in frigorifero a 4 °C per il successivo rilevamento.
    NOTA: Il pallino potrebbe non essere visibile ad occhio nudo. Di conseguenza, quando si aspira il surnatante con una pipetta, è fondamentale rimuovere delicatamente e accuratamente il surnatante per massimizzare la purezza delle vescicole extracellulari. Se i campioni non sono necessari per un periodo prolungato, conservarli in frigorifero a -80 °C.

Results

In primo luogo, le ADSC sono state caratterizzate e identificate, compresa la loro morfologia¹⁰ e gli anticorpi di superficie. Sulla base della Figura 2A, è evidente che le ADSC sono disposte a forma di fuso e formano un vortice dopo una crescita densa. Le cellule coltivate sono state differenziate in cellule adipogeniche, osteogeniche e condrogeniche e colorate con Oil Red O, Alizarin Red e Alcian Blue¹¹. L'esperimento di differenziazione indotta e la citometria a flusso hanno convalidato che si tratta effettivamente di ADSC con il potenziale per la differenziazione multidirezionale. Tuttavia, il 22% delle cellule è CD45 positivo nei risultati, il che non influenzerà la conclusione poiché un numero sufficiente di anticorpi positivi e negativi la supporta (Figura 2A, B).

Successivamente, l'identificazione delle EV estratte è essenziale. Comprende principalmente tre aspetti: morfologia, dimensione delle particelle e proteine marcatrici. I risultati della TEM rivelano chiaramente la struttura EV a forma di coppa con una membrana a doppio strato¹² (Figura 3A). NTA indica che le vescicole extracellulari hanno una distribuzione granulometrica di circa 50-150 nm, con una concentrazione di circa 1,6 x 10¹⁰ particelle/mL (Figura 3B). L'analisi Western Blot mostra anche che le proteine marcatrici delle vescicole extracellulari, tra cui CD9, CD63 e TSG101¹³, sono espresse in modo uniforme (Figura 3C).

Figura 1: Panoramica dei passaggi del protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Caratterizzazione delle ADSC. (A) La morfologia delle ADSC è fusiforme. Le ADSC sono state coltivate nel terreno per la differenziazione adipogenica, osteogenica e condrogenica, rispettivamente. La differenziazione adipogenica è stata identificata mediante colorazione con O rosso olio. La differenziazione osteogenica e condrogenica è stata confermata rispettivamente dalla colorazione con rosso di alizarina e dalla colorazione con blu di alciano. Barra della scala: 100 μm. (B) Analisi in citometria a flusso di ADSC per marcatori di superficie MSC (CD90, CD105, CD29 e CD73) e marcatori specifici per cellule ematopoietiche (CD31, CD34, CD45 e HLA-DR). La strategia di gating: cerchiare prima il gruppo vuoto. Sulla base di ciò, circolare CD90, CD105, CD29, CD73, CD31, CD34, CD45 e HLA-DR in successione in base agli anticorpi marcati di ciascun gruppo. Questa figura è adattata da Han, Y. D. et ^al.13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Caratterizzazione delle vescicole extracellulari. (A) I risultati della TEM rivelano chiaramente la struttura a forma di coppa della membrana a doppio strato. Barra della scala: 200 nm. (B) L'NTA indica che le vescicole extracellulari hanno una distribuzione granulometrica di circa 50-150 nm, con una concentrazione di circa 1,6 x 10¹⁰ particelle/mL. (C) Rilevamento delle espressioni di TSG101, CD9 e CD63 negli esosomi mediante Western blot. Questa figura è adattata da Han, Y. D. et ^al.13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Durante il processo sperimentale formale, diversi punti sono cruciali per ottenere i migliori risultati sperimentali. Sulla base della nostra esperienza precedente, si consiglia di optare per ADSC di passaggio 3-6, in quanto garantiscono il miglior stato cellulare possibile. Prima della P3, i globuli rossi, le cellule endoteliali e altre cellule varie potrebbero non essere stati sottoposti a screening. Dopo P6, le cellule possono invecchiare gradualmente, il che può influenzare lo stato delle vescicole extracellulari secrete. In secondo luogo, il surnatante deve essere raccolto quando il grado di confluenza cellulare è compreso tra l'80% e il 90% per garantire una secrezione sufficiente del maggior numero possibile di vescicole extracellulari. Per mantenere la massima purezza delle vescicole extracellulari, i ricercatori devono prestare attenzione durante le prime tre centrifugazioni e assicurarsi che non rimangano residui liquidi per evitare l'aspirazione di impurità e pellet. Durante le ultime due centrifugazioni, assicurarsi che il surnatante sia completamente rimosso proteggendo il pellet.

L'ultracentrifugazione è economica e non richiede ulteriori trattamenti. Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata negli studi sulle vescicole extracellulari e ha dimostrato un'efficienza soddisfacente nell'ottenimento di vescicole extracellulari, come confermato da esperimenti di caratterizzazione. Tuttavia, ci sono alcuni inevitabili inconvenienti. Innanzitutto, il tasso di recupero dei veicoli elettrici è basso. In secondo luogo, i veicoli elettrici tendono ad aggregarsi a volte. Inoltre, i componenti non cellulari possono essere isolati e alcune vescicole extracellulari possono rompersi durante il processo, portando all'accumulo di detriti 14,15,16. Per affrontare questi difetti, la maggior parte della ricerca si concentra sulla purificazione delle vescicole extracellulari^12,13. Tuttavia, questo protocollo copre l'intero processo, dalla coltura cellulare alla purificazione degli esosomi, perché riteniamo che l'intero processo influisca sullo stato e sulla purezza delle vescicole extracellulari estratte finali. È fondamentale attenersi alle linee guida di cui sopra durante il funzionamento. Inoltre, la raccolta di più surnatante e l'implementazione della coltura cellulare 3D possono essere utili, poiché numerosi studi hanno dimostrato che la coltura 3D è più efficace nello stimolare la secrezione di vescicole extracellulari rispetto alla coltura 2D^17,18.

Questo protocollo delinea il processo di estrazione delle vescicole extracellulari dalle ADSC mediante ultracentrifugazione. Fornisce una guida pratica e consente agli sperimentatori di evitare il più possibile i dettagli durante l'operazione. In sintesi, il protocollo aiuta gli sperimentatori a migliorare la qualità dei campioni e serve a ricordare che non dovremmo concentrarci solo sui dettagli di ogni fase, ma anche considerare l'esperimento nel suo insieme.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filtro ad ago Acrodisc di Supor Membrana	Acros Organics	4652	0.22 μ m
Terreno basale per coltura cellulare	OriCell	BHDM-03011
Siero fetale bovino senza EXO + integratore di coltura (per cellule staminali mesenchimali di derivazione adiposa umana)	OriCell	HUXMD-05002
Microscopio invertito	OLYMPUS	Lx70-S8F2
Centrifuga a bassa velocità	Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co., Ltd.	SC-3612
Normocin	InvivoGen	ant-nr-05
Optima Max-XP Ultracentrifuga da tavolo	Beckman Coulter	393315
Soluzione di penicillina-streptomicina-gentamicina (100x)	Solarbio	P1410