Identificazione microbica diretta utilizzando un sistema automatizzato di identificazione microbica per facilitare il metodo RAST EUCAST senza spettrometria di massa

Summary

EUCAST ha sviluppato un protocollo di test di suscettibilità antimicrobica (AST) diretto per le emocolture automatizzate. Tuttavia, la sua dipendenza dall'identificazione microbica basata sulla spettrometria di massa può essere ovviata utilizzando un protocollo di preparazione diretta dell'inoculo in un sistema automatizzato di identificazione microbica. Questo approccio può fornire rapporti AST entro 24 ore dalla raccolta del campione.

Abstract

La sepsi Gram-negativa (GN) è un'emergenza medica in cui la gestione in contesti con risorse limitate si basa su tecniche di coltura microbiologica convenzionali che forniscono risultati in 3-4 giorni. Riconoscendo questo ritardo nei tempi di risposta (TAT), sia EUCAST che CLSI hanno sviluppato protocolli per determinare i risultati dell'AST direttamente da flaconi di emocoltura automatizzati contrassegnati positivamente (+aBC). Il protocollo AST rapido EUCAST (RAST) è stato introdotto per la prima volta nel 2018, dove possono essere riportati i breakpoint del diametro della zona per quattro agenti eziologici comuni della sepsi GN, ovvero Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e complesso Acinetobacter baumannii . Tuttavia, i laboratori clinici che hanno implementato questo metodo nel loro flusso di lavoro di routine si affidano all'identificazione microbica basata sulla spettrometria di massa, che non è facilmente disponibile, precludendone così l'implementazione in contesti con risorse limitate. Per aggirarlo, abbiamo valutato un protocollo di inoculo diretto (DIP) utilizzando un sistema di identificazione microbica automatizzato commerciale e di test di suscettibilità antimicrobica (aMIAST) per consentire l'identificazione microbica precoce entro 8 ore dalla segnalazione positiva di aBC. Abbiamo valutato questo protocollo da gennaio a ottobre 2023 per identificare i quattro GN (RR-GN) RAST segnalabili nell'aBC contrassegnato positivamente. I risultati dell'identificazione microbica nella DIP sono stati confrontati con il protocollo standard di preparazione dell'inoculo (SIP) in aMIAST. Dei 204 +aBC con GN monomorfo (+naBC), uno dei 4 RR-GN è stato identificato in 105 +naBC mediante SIP (E. coli: 50, K. pneumoniae: 20, P. aeruginosa: 9 e complesso di A. baumannii : 26). Di questi, il 94% (98/105) è stato identificato correttamente dal DIP, mentre i tassi di errore maggiore e molto grave sono stati rispettivamente del 6% (7/105) e dell'1,7% (4/240). Quando la DIP per l'identificazione microbica viene eseguita utilizzando il metodo EUCAST RAST, i rapporti clinici provvisori possono essere forniti entro 24 ore dalla ricezione del campione. Questo approccio ha il potenziale per ridurre significativamente la TAT, consentendo l'istituzione precoce di un'appropriata terapia antimicrobica.

Introduction

La sepsi, un importante problema di salute globale, è definita come una disfunzione d'organo pericolosa per la vita a causa di una risposta disregolata dell'ospite all'infezione. Il Global Burden of Diseases Study ha stimato che nel 2017 ci sono stati 48,9 milioni di casi di sepsi e 11 milioni di decessi correlati alla sepsi in tutto il mondo, che hanno rappresentato quasi il 20% di tutti i decessi^globali1. Circa i 2/^{3 delle infezioni} del flusso sanguigno (BSI) che causano mortalità sono dovute a patogeni batterici gram-negativi². Le principali cause di mortalità tra i gram-negativi (GN) sono Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii, che rappresentano circa il 40% dei casi tra 33 patogeni batterici².

Le emocolture rimangono il gold standard per la diagnosi di BSI e l'identificazione microbica rapida insieme ai risultati dei test di suscettibilità antimicrobica (AST) è la chiave per la gestione. È stato stimato che vi è un aumento del 9% delle probabilità di mortalità con ogni ora di ritardo nell'istituzione di antimicrobici appropriati nella sepsi³. Il tempo di consegna (TAT) dei referti di emocoltura microbiologicamente positivi con risultati AST è di circa 48-72 ore con gli strumenti microbiologici disponibili in contesti con risorse limitate, anche con sistemi automatizzati. Come risultato di questa TAT scadente, gli antimicrobici ad ampio spettro vengono utilizzati empiricamente, contribuendo al crescente problema della resistenza antimicrobica (AMR). Riconoscendo questa urgente necessità di ridurre la TAT per le tecniche di coltura microbiologica per la sepsi, EUCAST e CLSI si stanno muovendo verso l'esecuzione dell'AST direttamente da flaconi per emocoltura contrassegnati positivamente (+aBC)^4,5.

Nel 2018 EUCAST ha introdotto per la prima volta il metodo AST rapido (RAST) per determinare l'AST mediante il metodo di diffusione su disco Kirby-Bauer a tempi di incubazione brevi, ovvero 4 ore, 6 ore e 8 ore, direttamente da +aBC ^6,7. Il metodo è attualmente convalidato per determinare l'AST per +aBC contenenti una delle 8 cause più comuni di BSI, vale a dire E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa e A. baumannii tra i gram-negativi e Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, E. faecium e Streptococcus pneumoniae tra i gram-positivi⁸. I breakpoint per la determinazione dell'AST a vari intervalli di tempo sono forniti in base alle specie microbiche sopra elencate. Pertanto, prima dell'interpretazione categorica dei risultati dell'AST, è necessaria l'identificazione microbica. Tuttavia, lo standard RAST non specifica il metodo per consentire l'identificazione microbica entro questo lasso di tempo.

La maggior parte degli studi che valutano il metodo EUCAST RAST nel loro contesto hanno utilizzato l'identificazione microbica basata sulla spettrometria di massa dopo breve incubazione su terreni placcati per identificare i microrganismi 9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Tuttavia, gli strumenti di spettrometria di massa non sono ampiamente disponibili, soprattutto nei paesi a basso e medio reddito (LMIC), il che limita notevolmente la potenziale utilità di questo metodo. Pochi studi hanno riportato l'implementazione di questo metodo nei loro centri senza utilizzare la spettrometria di massa 18,19,20. Tayşi et ^al.18 hanno riportato un'ampia categorizzazione della GN tra Enterobacterales, Pseudomonas e Acinetobacter spp. basata sulla morfologia della colorazione di Gram e sul test dell'ossidasi prima di interpretare i risultati dell'AST. In altri studi di questo centro, di Gupta et ^al.19 e Siddiqui et ^al.20, l'identificazione microbica a livello di specie è stata effettuata preparando un pellet batterico dalla miscela di brodo di sangue contrassegnata positivamente e inoculandolo con i test biochimici convenzionali. Mentre Tayşi et ^al.18 non hanno commentato l'accuratezza dell'identificazione microbica con il loro approccio, Gupta et ^al.19 hanno riferito che con il loro approccio in 165/176 (94%) casi, un RAST segnalabile gram-negativo (RR-GN), cioè E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa e A. baumannii complesso. Tuttavia, con quest'ultimo approccio, la lettura dei risultati RAST è stata effettuata retrospettivamente utilizzando punti di interruzione del diametro della zona di 8 ore solo dopo l'incubazione completa dei risultati biochimici convenzionali, cioè 18-24 ore dopo l'inoculazione, e il tempo medio per la segnalazione è stato di circa 2 giorni.

Per ridurre ulteriormente il TAT dei referti clinici, proponiamo una metodologia alternativa per consentire l'identificazione precoce della GN presente nei +aBC utilizzando aMIAST. Prima dell'introduzione dei sistemi di identificazione microbica basati sulla spettrometria di massa, questi sistemi di identificazione automatizzata erano considerati lo standard di cura per l'identificazione microbica, in cui l'identificazione era resa possibile da cambiamenti colorimetrici e/o fluorimetrici indotti dai batteri in prova quando inoculati in test biochimici miniaturizzati ospitati in una cassetta e corrispondenti ai risultati con il loro database di isolati. Il tempo medio per l'identificazione in questi sistemi è di circa 4-8 ore, tuttavia, sono limitati dal fatto che i produttori raccomandano la crescita notturna dei microbi prima che le rispettive carte di identificazione possano essere inoculate. Questo requisito limita notevolmente la loro utilità nel ridurre i tempi di segnalazione.

Pochi studi hanno valutato metodi per identificare direttamente i microbi da +aBC utilizzando questi sistemi automatizzati 21,22,23,24,25,26,27. Nel caso di +aBC contenenti GN monomorfico, la maggior parte degli studi ha mostrato un'eccellente concordanza tra l'inoculazione diretta da pellet batterico ottenuto da una miscela positiva di brodo di sangue e l'incubazione standard di colonie. Tuttavia, nel caso dei gram-positivi, i tassi di concordanza erano subottimali. Poiché il tempo medio di positività dei +aBC è compreso tra 8 e 16 ore e l'identificazione del GN richiede da ~4 a 8 ore in un sistema automatizzato di identificazione microbica, ipotizziamo che, impiegando il protocollo di inoculazione diretta nell'identificazione microbica automatizzata, possiamo completare la refertazione clinica dei +aBC con GN con un RR-GN entro 24 ore dalla ricezione del campione.

Impostazione per lo studio
Il presente studio è stato condotto nel laboratorio di batteriologia clinica di un istituto accademico di assistenza terziaria di importanza nazionale (INI) da 950 posti letto nell'India centrale da gennaio a ottobre 2023. Il laboratorio è dotato di un sistema di monitoraggio in continuo dell'emocoltura (CBCMS) e di aMIAST. Il laboratorio di batteriologia è operativo 24 ore su 24 con la disponibilità di tecnici e microbiologi per l'elaborazione e la segnalazione di qualsiasi flacone di emocoltura contrassegnato positivamente (+aBCs).

Metodi microbici utilizzati qui
Il flusso di lavoro dello studio è mostrato nella Figura 1. I +aBC che mostrano GN monomorfi (+naBC) sono stati elaborati mediante inoculazione diretta delle corrispondenti carte d'identità per consentire l'identificazione e l'AST utilizzando il protocollo EUCAST RAST. Questi risultati sono stati confrontati con il metodo standard di cura (SoC) per i +aBC, ovvero la subcoltura su terreni convenzionali placcati attraverso agar di sangue di pecora (SBA), agar cioccolato (CA) e agar MacConkey (MA), incubati aerobicamente per 16-24 ore, seguiti da schede di identificazione e AST fornite da aMIAST quando compaiono colonie isolate. Sono state escluse dallo studio le emocolture che mostravano cocchi Gram-positivi, bacilli Gram-positivi, cellule di lievito in gemmazione e ≥2 diversi microrganismi sulla colorazione iniziale di Gram o sui terreni placcati.

Protocol

Lo studio, finanziato dalla sovvenzione per la ricerca intramurale concessa al Dr. Ayush Gupta dall'AIIMS Bhopal, è stato approvato dal Comitato Etico Umano Istituzionale (IHEC) con lettera n.: IHEC- LOP/2022/IL072.

NOTA: È stato utilizzato un volume di campione di 5 ml sulla base degli studi condotti da Quesada et ^al.25 e Munoz-Davila et ^al.27.

1. Protocollo standard di inoculo (SIP) per l'identificazione batterica mediante aMIAST

1. Indossare guanti puliti e, all'interno di una cabina di biosicurezza (BSC) di Classe IIa, disinfettare il setto di +naBC con un tampone contenente alcol isopropilico al 70%.
2. Prelevare circa 1 mL di miscela di brodo di sangue utilizzando una siringa sterile con un ago da 21 G.
3. Erogare 1 grossa goccia della miscela di brodo di sangue dall'ago sulla superficie del terreno di coltura placcato, ovvero SBA, CA e MA. Strisciare le piastre e incubare le piastre di coltura in un'incubatrice a 37 °C ± 2 °C in condizioni aerobiche per 18-24 ore.
4. Dopo l'incubazione, esaminare le piastre per la comparsa di colonie isolate in un BSC e procedere ulteriormente per l'identificazione e l'AST mediante aMIAST.
5. Per ogni isolato, posizionare una provetta di polistirene aMIAST nel supporto per provette aMIAST e aggiungere 3 ml di soluzione fisiologica sterile utilizzando un dosatore collegato al flacone di soluzione fisiologica.
6. Toccare da tre a cinque colonie morfologicamente simili con un filo di inoculazione diritto sterile e trasferire l'inoculo batterico nella prima provetta.
7. Regolare la torbidità utilizzando soluzione fisiologica sterile nella provetta inoculata tra 0,47-0,63 McFarland utilizzando un densitometro.
8. Posizionare l'attacco capillare della carta d'identità gram-negativa aMIAST nella prima provetta.
9. Posizionare le schede selezionate in una posizione appropriata sulla cassetta. L'inoculo nella cassetta è pronto e arriva alla sezione di riempimento aMIAST.
   ATTENZIONE: L'età della sospensione non deve superare i 30 minuti prima dell'inoculazione delle carte.
10. Caricare la cassetta nella sua posizione nella camera di riempimento con il codice a barre del campione rivolto verso l'interno.
11. Chiudere lo sportello e premere Fill nella schermata dell'interfaccia utente. Il riempimento è un ciclo di 70 secondi. Al termine del ciclo, la spia blu sul sistema lampeggerà. L'inserimento delle tessere nel sistema aMIAST distribuisce l'inoculo all'interno delle piccole camere delle tessere dalla macchina.
12. Rimuovere la cassetta dalla camera di riempimento, chiudere lo sportello e posizionarla nella camera di carico. I codici a barre vengono scansionati automaticamente e confrontati con l'elenco di lavoro elettronico della cassetta virtuale. Le cannucce vengono sigillate automaticamente e le carte vengono caricate automaticamente nel carosello. La freccia blu lampeggiante sull'aMIAST indica che il caricamento è terminato.
13. Al termine, rimuovere i rifiuti della cassetta. Vedere la procedura di smaltimento dei rifiuti nella documentazione del prodotto o seguire altre pratiche standard. Utilizzare il resto della sospensione nelle provette per la sottocoltura su agar CLED per il controllo della purezza degli isolati.
14. Leggere i risultati dopo che lo strumento ha completato l'analisi.

2. Protocollo di inoculo diretto (DIP) per l'identificazione batterica mediante aMIAST

1. Indossare guanti sterili e, all'interno di una cabina di biosicurezza, pulire il setto di +naBC con un tampone contenente alcol isopropilico al 70%.
2. Utilizzando una siringa sterile con ago da 21 G, prelevare 5 mL di aliquota dalla miscela di sangue e brodo di +naBC e trasferirla in una provetta di separazione del siero (SST) dopo aver disinfettato il setto di gomma con alcol isopropilico al 70% (Figura 2A).
3. Centrifugare questa aliquota per 10 minuti a 160 x g per depositare le cellule del sangue nella miscela di brodo di sangue. Dopo la prima centrifugazione, osservare il surnatante in cui si depositeranno le cellule del sangue.
4. Aprire il tappo del flaconcino all'interno di una cappa di biosicurezza e, utilizzando un puntale sterile e una pipetta, rimuovere con cautela il surnatante e trasferirlo in un nuovo flaconcino per la raccolta del sangue semplice (parte superiore rossa) rimuovendone la parte superiore.
5. Posizionare il tappo sul flaconcino e centrifugarlo nuovamente per 10 minuti a 2000 x g. Dopo la seconda centrifugazione, sul fondo si formerà un pellet batterico.
6. Aspirare il surnatante ed eliminarlo utilizzando una pipetta e un puntale sterili. Il pellet batterico rimarrà sul fondo del tubo e verrà utilizzato per inoculare la carta d'identità aMIAST.
   NOTA: Nella prima centrifugazione è stata utilizzata una provetta per separatore di siero a 160 x g. Ciò si basava sugli studi condotti da Quesada et ^al.25 e Munoz-Davila et ^al.27_, in cui la prima fase di centrifugazione è stata eseguita rispettivamente a circa 30 x g e 60 x g. La miscela di sangue e brodo di un +aBC è stata prima centrifugata a bassa velocità in un SST per estrarre le cellule del sangue.
7. Posizionare una provetta di polistirene aMIAST nel supporto per provette aMIAST e aggiungere 3 ml di soluzione fisiologica sterile utilizzando un dosatore collegato al flacone di soluzione fisiologica.
8. Utilizzando un ansa di inoculazione sterile, prelevare il pellet batterico dal fondo della fiala e inocularelo nella provetta aMIAST
9. Ripetere i passaggi 1.7-1.14.

3. AST mediante EUCAST protocollo RAST⁴

1. Tenere pronte le piastre circolari per agar Mueller-Hinton (MHA) da 90 mm non inoculate nella cabina di biosicurezza.
2. Indossare guanti sterili e, all'interno di una cabina di biosicurezza, pulire il setto di +naBC con un tampone contenente alcol isopropilico al 70%.
3. Utilizzando una siringa sterile, aspirare 125 μl ± 25 μl di miscela di brodo di sangue non diluito di +naBC e aggiungere a ciascuna piastra MHA al centro.
4. Distribuire delicatamente il brodo sui piatti utilizzando un batuffolo di cotone sterile in tre direzioni e applicare ≤ 6 dischi antimicrobici su ciascun piatto.
5. Incubare le piastre in un incubatore aerobico a 35 °C± 1 °C per 8 ore. Al termine dell'incubazione, osservare la purezza dell'isolato.
6. Leggere le zone di inibizione a 8 ore ± 5 minuti. Interpretare i risultati utilizzando la tabella dei breakpoint RAST per un'incubazione breve dopo aver verificato i risultati dell'identificazione batterica nell'aMIAST.
7. Riportare i risultati dell'AST solo se l'isolato è identificato come uno degli RR-GN e le placche MHA e CLED stanno sviluppando un singolo morfotipo.

4. Controllo di qualità

1. Eseguire il controllo di qualità interno per il protocollo SIP di aMIAST secondo le istruzioni del produttore utilizzando i ceppi di riferimento raccomandati.
2. Eseguire settimanalmente il controllo di qualità interno del metodo RAST utilizzando il ceppo di riferimento raccomandato di E. coli, come descritto di seguito.
   1. Disporre 4 provette di vetro sterili in un supporto per tubi. Erogare 3 mL di soluzione fisiologica sterile nella prima provetta e 990 μL di soluzione fisiologica sterile in ciascuna delle seconde, terze e quarte provette.
   2. Effettuare una sospensione di 0,5 McFarland del ceppo QC dalle colonie isolate di una coltura notturna su terreno placcato.
   3. Utilizzando una pipetta e un puntale sterili, trasferire 10 μl di sospensione dalla prima provetta alla seconda provetta.
   4. Dopo la miscelazione, trasferire 10 μl di sospensione dalla seconda alla terza provetta e successivamente all'ultima provetta.
   5. Dall'ultima provetta, prelevare 1 mL di inoculo utilizzando una siringa sterile con ago e aggiungerlo a un aBC non inoculato.
   6. Aggiungere contemporaneamente 5 mL di sangue di pecora sterile nell'aBC utilizzando una siringa sterile con ago e incubarlo nel CBCMS fino a quando non risulta positivo a causa del cambiamento di colore del sensore di emulsione liquida alla base dell'aBC.
   7. Ripetere i passaggi come spiegato nei passaggi 1-3 per l'identificazione rispettivamente tramite SIP, DIP e RAST. I risultati attesi sono che la deformazione QC dovrebbe essere identificata correttamente da entrambi i protocolli di identificazione dell'aMIAST e che i diametri delle zone nelle piastre RAST dovrebbero essere compresi nell'intervallo^{specificato 28}.

5. Analisi statistica

1. Considerare l'identificazione microbica utilizzando SIP come gold standard e se la stessa identificazione è ottenuta da DIP, considerarla concordante.
2. Se un complesso RR-GN, cioè uno tra E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa e A. baumannii , identificato utilizzando SIP, è discordante nel DIP, considerare questo come errore maggiore (ME) mentre considerare il contrario come errore molto grave (VME) in quanto ha il potenziale di emettere un rapporto con un'identificazione errata.
3. Calcolare il tasso di concordanza per RR-GN come il rapporto tra il numero totale di RR-GN concordanti e il numero totale di RR-GN identificati da SIP moltiplicato per 100.
4. Calcolare il tasso ME come il rapporto tra il numero di +naBC identificati come aventi un non-RR-GN e il numero totale di +naBC con RR-GN identificati da SIP moltiplicato per 100.
5. Calcolare il tasso di VME come il rapporto tra il numero di +naBC erroneamente identificati come aventi un RR-GN in DIP e il totale n. di +naBC testati da DIP moltiplicato per 100.
6. Calcolare il tempo di identificazione dell'isolamento (TTI) come il tempo impiegato per identificare l'isolato da entrambi i protocolli dal momento della segnalazione dell'emocoltura da parte del CBCMS.
7. Calcolare le differenze tra DIP e SIP come riduzione del TTI. Calcola questo solo per i +naBC concordanti che hanno un RR-GN. Prendere nota dei rispettivi punti temporali dagli orologi di CBCMS e aMIAST.
8. Gestisci i dati e analizzali utilizzando un foglio di calcolo. Utilizzare il test U di Mann-Whitney per variabili continue, considerando un valore p a due facce di ≤ 0,05 come statisticamente significativo.

Results

Risultati generali
Durante il periodo di studio, 240 +naBC sono stati identificati da aMIAST utilizzando sia DIP che SIP. Di questi, il 15% (36/240) dei +naBC è risultato polimicrobico dopo l'incubazione notturna sul terreno piastrato. Dei 204 +naBC, la percentuale di RR-GN identificata dal SIP è stata del 51,5% (105/204). Tra questi, il 47,6% (50/105) era costituito da E. coli, il 19% (20/105) da K. pneumoniae, l'8,6% (9/105) da P. aeruginosa e il 24,8% (26/105) da A. baumannii . Una descrizione dettagliata di tutti i risultati dell'identificazione da parte del SIP è fornita nella Tabella 1.

Accuratezza diagnostica nell'identificazione microbica
Dei 105 RR-GN, 98 (93,3%) e 99 (94,2%) erano concordanti con il DIP, fino all'identificazione a livello di specie e genere, rispettivamente. I tassi di concordanza per organismo sono stati del 94% (47/50) per E. coli, del 90% (18/20) per K. pneumoniae, del 100% (9/9) per P. aeruginosa e del 92,3% (24/26) per il complesso A. baumannii , come mostrato nella Tabella 1. In 7 +naBC, i risultati sono stati discordanti fino all'identificazione a livello di specie utilizzando DIP, di cui aMIAST ha fornito non identificato (3) o identificato un Non-RR-GN (4), come mostrato nella Tabella 2. Poiché questi risultati non costringeranno il microbiologo clinico a riferire, sono stati considerati errori gravi (ME). Il tasso di ME nel nostro studio è stato del 6,7% (7/105) fino all'identificazione a livello di specie. La percentuale di non-RR-GN in aMIAST da SIP era del 48,5% (99/204). Tra questi, 60 (60,6%) erano concordanti con DIP fino all'identificazione a livello di specie. Tra 99 non-RR-GN, un RR-GN è stato identificato utilizzando DIP in 4 +naBC, come mostrato nella Tabella 2. Tale discordanza avrebbe potuto portare a un errore di segnalazione ed è stata considerata un errore molto grave (VME). Il tasso complessivo di VME utilizzando DIP è stato dell'1,7% (4/240). Una descrizione completa dei risultati di identificazione e degli errori di tutti i gram-negativi è mostrata nella Tabella supplementare 1.

Riduzione del tempo di identificazione dell'isolamento (TTI)
Il TTI dei +naBC concordanti nel DIP era significativamente inferiore al TTI nel SIP (mediana (IQR): 507,5 min (685-404) vs 2171 min (2532-1855), P2 vs P1, p<0,00001 (test di Mann-Whitney)). La differenza mediana di TTI tra i due protocolli è stata di 1635 minuti (IQR: 1964-1299).

Figura 1: Flusso di lavoro dello studio: rappresentazione del flusso di lavoro nello studio per flaconi di emocoltura contrassegnati positivamente con gram-negativi monomorfi elaborati sia dal protocollo di inoculo standard che da quello diretto. Abbreviazioni: +aBC = flacone per emocoltura con contrassegno positivo, +naBC = flacone per emocoltura con contrassegno positivo e gram-negativi monomorfi, DIP = protocollo di inoculo diretto, SIP = protocollo di inoculo standard, SBA = agar di sangue di pecora, CA = agar al cioccolato, MA = agar MacConkey, RR-GN = gram-negativo segnalabile RAS, TAT = tempo di risposta Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Protocollo di inoculo diretto per l'identificazione batterica: mostra le immagini delle fiale durante l'esecuzione del protocollo di inoculo diretto. Abbreviazioni: +naBC = flacone per emocoltura con contrassegno positivo e gram-negativi Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gram-negativi segnalabili RAST	Isolati testati (n)	Concorde	Identificazione errata	Nessuna identificazione
		n (%)	n (%)	n (%)
Totale	105	98 (93.3%)	4 (3.8%)	3 (2.8%)
Escherichia coli	50	47 (94%)	1	2
Klebsiella pneumoniae	20	18 (90%)	1	1
Complesso Acinetobacter baumannii	26	24 (92.3%)	2#	0
Pseudomonas aeruginosa	9	9 (100%)	0	0
# Un isolato correttamente identificato a livello di genere, ma non a livello di specie (complesso Acinetobacter baumannii identificato come A. haemolyticus)

Tabella 1: Risultati dell'identificazione batterica nel protocollo di inoculo diretto. I risultati sono solo per i Gram-negativi segnalabili RAST. Abbreviazioni: n = numeratore, % = percentuale.

Gram-negativi	Isolati totali testati	Errore grave			Errore molto grave, n (%)
		Numero	Identificazione errata	Nessun documento d'identità	(identificato come)
		n (%)	n	n
Escherichia coli	50	3 (6%)	1 (A. haemolyticus)	2	0
Klebsiella pneumoniae	20	2 (10%)	1 (Ralstonia pickettii)	1	0
Complesso Acinetobacter baumannii	26	2 (7.7%)	2 (A. hemolyticus, Cupriaviadus pauculus)	-	0
Salmonella spp.	10	NA			1 (10%)
					(E. coli)
Complesso Enterobacter cloacae	8	NA			1 (12.5%)
					(E. coli)
Acinetobacter lwoffi	14	NA			1 (7.1%)
					(complesso di A. baumannii)
Sphingomonas paucimobilis	9	NA			1 (11.1%)
					(K. pneumoniae)
Abbreviazioni: n: numeratore, %: percentuale, ID: identificazione, NA: non applicabile,
A: Acinetobacter, E: Escherichia, K : Klebsiella

Tabella 2: Dettagli degli errori maggiori e molto gravi per protocollo di inoculo diretto. Abbreviazioni: n = numeratore, % = percentuale, ID = identificazione, NA = non applicabile, A = Acinetobacter, E = Escherichia, K = Klebsiella.

Tabella supplementare 1: Risultati dettagliati dell'identificazione dell'organismo in entrambi i protocolli insieme ai risultati degli errori nel protocollo dell'inoculo diretto. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Utilizzando la DIP, siamo riusciti a identificare gli RR-GN con una notevole accuratezza diagnostica. Il TTI medio dopo la segnalazione positiva di aBC è stato di soli 507 minuti (~ 8,5 ore). Pertanto, se eseguito in combinazione con il metodo EUCAST RAST per la determinazione dell'AST, può fornire l'identificazione dell'isolato a 8 ore di lettura AST. Questo approccio ha il potenziale per implementare il metodo EUCAST RAST ovviando alla necessità di un'identificazione basata sulla spettrometria di massa. Questo è un vantaggio per le strutture con risorse limitate che desiderano implementare il metodo EUCAST RAST nel loro flusso di lavoro di routine per ridurre i tempi per la refertazione clinica e aggirare i principali ostacoli alla sua implementazione.

Prima dell'introduzione del metodo EUCAST RAST, diversi autori hanno valutato l'accuratezza dei test diretti da +aBC per vari sistemi aMIAST 21,22,23,24,25,26,27,29,30,31. In questi studi, i protocolli di test diretto differivano nel seguire una singola fase di centrifuga 29,30,31,32 o una doppia centrifuga di fase 21,22,24,25,26,27 per fare il pellet batterico. Nel metodo a fase singola, la miscela di sangue e brodo da un +aBC è stata centrifugata ad alta velocità in una provetta separatore di siero (SST) per pellettare i batteri sopra lo strato di gel di silicone. Il pellet è stato utilizzato per preparare l'inoculo per l'inoculazione delle carte d'identità. Nel metodo della doppia centrifugazione, la miscela di sangue e brodo di un +aBC è stata prima centrifugata a bassa velocità in un SST per pellettare le cellule del sangue. Da questa provetta, il surnatante contenente batteri è stato rimosso e trasferito in una nuova provetta e sottoposto a centrifugazione ad alta velocità. Da questo tubo è stato scartato il surnatante e il pellet è stato utilizzato per inoculare le apposite carte d'identità. In questi studi, il tasso di concordanza variava dal 62% al 100%, ma in generale l'accuratezza era maggiore con il metodo della doppia centrifugazione.

Abbiamo scoperto che il metodo era semplice da eseguire ed è stato intrapreso in un laboratorio diagnostico di routine con una forza lavoro di >10 tecnici di laboratorio a rotazione, dimostrando la robustezza del metodo. Nei +naBC del ~94% (98/105) contenenti uno degli RR-GN, il DIP ha identificato correttamente il microrganismo. Anche il tasso di concordanza per le diverse categorie di organismi era paragonabile tra loro in quanto erano rispettivamente del 94%, 90%, 100% e 92,3%, rispettivamente per E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa e A. baumannii. Abbiamo anche scoperto che il tasso di concordanza complessivo per qualsiasi gram-negativo era subottimale, ~77% (157/204). Tuttavia, la maggior parte di queste identificazioni errate riguardava gram-negativi non fermentativi come Acinetobacter spp. diverso dal complesso baumannii, Pseudomonas spp. diverso da aeruginosa, Moraxella spp. e Sphingomonas paucimobilis che sono solitamente considerati contaminanti comuni della pelle. Errori di identificazione con gram-negativi non fermentativi sono stati notati anche da altri autori^21,23, probabilmente a causa della bassa reattività di questi batteri nelle carte di identificazione aMIAST.

Abbiamo riscontrato una significativa riduzione del TTI dei batteri all'interno dei +naBC utilizzando DIP. Il TTI mediano della DIP era circa 4 volte inferiore al TTI mediano della SIP (507 min vs 2171 min) quando eseguito in un laboratorio diagnostico clinico di routine. Questo TTI di ~8,5 ore includeva anche l'intervallo tra la segnalazione positiva di aBC e l'esecuzione dell'inoculazione con carta aMIAST, poiché il tempo medio per isolare l'analisi da parte di aMIAST era di sole 5,45 ore ± 1,6 ore. Aggiungendo il tempo medio alla positività di 728 minuti ± 301 minuti (~12 ore) per i +naBC concordanti nel nostro studio, questo approccio di identificazione batterica ha il potenziale per fornire una segnalazione nello stesso giorno dopo aver ricevuto l'aBC in un laboratorio diagnostico di routine.

Ci sono anche alcune limitazioni, con il DIP. In primo luogo, poiché si tratta di un uso off-label della preparazione dell'inoculo, i risultati dovrebbero essere considerati preliminari e così anche i risultati AST di EUCAST RAST. Tuttavia, serve allo scopo principale di identificare in modo tempestivo solo gli RR-GN con una notevole accuratezza diagnostica. In secondo luogo, esiste la possibilità pratica di spreco di risorse per i test, come in circa il 60% dei +naBC; non saremmo stati in grado di segnalare a causa di infezioni polimicrobiche o dell'identificazione di un non-RRGN. Questo spreco di risorse si applica a tutti i più recenti metodi AST diretti automatizzati per le emocolture. In terzo luogo, il tasso di infezioni polimicrobiche e l'identificazione di contaminanti cutanei comuni era più alto in questo studio a causa di cattive pratiche di raccolta dei campioni. In quarto luogo, non abbiamo confermato l'identità degli isolati testati con la spettrometria di massa, che è l'attuale gold standard per l'identificazione batterica.

Questo studio stabilisce con successo che anche con i test fenotipici, è possibile effettuare la segnalazione in giornata di emocolture positive, specialmente nella batteriemia gram-negativa. Ciò ha il potenziale di ridurre considerevolmente la durata dell'inizio di un'appropriata terapia antimicrobica nei LMIC in cui la diagnostica microbiologica per l'identificazione batterica e l'AST si basano fortemente sui test fenotipici convenzionali. Questo approccio dovrebbe essere convalidato conducendo uno studio multicentrico e il suo potenziale impatto sugli esiti dei pazienti e, come strumento di gestione antimicrobica, dovrebbe essere al centro dei futuri studi clinici nei LMIC.

Per concludere, il DIP per aMIAST integra il metodo EUCAST RAST per consentire l'identificazione precoce degli RR-GN. Ciò ovvia alla necessità di fare affidamento su tecniche avanzate di identificazione microbica e AST, poiché il tempo per la segnalazione con questi approcci è paragonabile a questo approccio. Nel caso di batteri gram-negativi, la segnalazione in giornata è possibile ottenere con metodi fenotipici convenzionali, se ottimizzati al massimo. Ciò ha il potenziale per ridurre la durata del trattamento antimicrobico ad ampio spettro e facilitare la gestione antimicrobica in contesti con risorse limitate.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
forte amikacina >
30 & micro; g	Himedia, Mumbai, India	SD035-1VL	Test di sensibilità antimicrobica
Disco amoxiclav (20/10 µ g)	Himedia, Mumbai, India	SD063-1VL	Test di suscettibilità antimicrobica
Cefotaxime disco 5 µ g	Himedia, Mumbai, India	SD295E-1VL	Test di suscettibilità antimicrobica
Ceftazidima disco 10 µ g	Himedia, Mumbai, India	SD062A-1VL	Test di suscettibilità antimicrobica
Disco di ciprofloxacina (5 µ g)	Himedia, Mumbai, India	SD060-1VL	Test di sensibilità antimicrobica
Disco co-trimossazolo (23,75/1,25 µ g)	Himedia, Mumbai, India	SD010-1VL	Test di sensibilità antimicrobica
Disco di gentamicina 10 µ g	Himedia, Mumbai, India	SD016-1VL	Test di sensibilità antimicrobica
Disco Imipenem 10 µ g	Himedia, Mumbai, India	SD073-1VL	Test di suscettibilità antimicrobica
Disco di levofloxacina 5 µ g	Himedia, Mumbai, India	SD216-1VL	Test di sensibilità antimicrobica
Meropenem disco 10 µ g	Himedia, Mumbai, India	SD727-1VL	Test di sensibilità antimicrobica
Piperacillina-tazobactam disco (30/6 µ g)	Himedia, Mumbai, India	SD292E-1VL	Test di suscettibilità antimicrobica
Disco di tobramicina 10 µ g	Himedia, Mumbai, India	SD044-1VL	Test di suscettibilità antimicrobica
ATCC Escherichia coli 25922	Microbiologics, Minnesota USA	0335A	Ceppo batterico Gram negativo raccomandato per il controllo di qualità in RAST
BacT-Alert 3D 480	bioMerieux, Marcy d' Etoille, Francia	412CM8423	Sistema di emocoltura automatizzato continuo
Cabina di biosicurezza II Tipo A2	Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, India	DFP-2/21-22/149	Per la protezione contro agenti pericolosi e infettivi e per mantenere il controllo di qualità
Base di agar sanguigno n. 2	Himedia, Mumbai, India	M834-500G	Preparazione di agar sanguigno e agar al cioccolato
Modello clinico di centrifuga SP-8BL	Laby Instruments, Ambala, India	HLL/2021-22/021	Centrifugazione a bassa e alta velocità per la separazione del surnatante
Dispensette S Dispenser analogico regolabile in bottiglia	BrandTech, Essex CT, Inghilterra	V1200	Erogazione accurata di soluzione salina
MacConkey agar	Himedia, Mumbai, India	M008-500G	Terreni differenziali per fermentatori / non fermentatori di lattosio Bacilli Gram negativi
Micropipetta (100-1000 µ L)	Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, India	NJ478162	Trasferimento del surnatante dopo la prima centrifugazione, scarto del surnatante dopo la seconda centrifugazione
Puntali per micropipette (200-1000 &; L)	‎ Tarsons Products Pvt. Ltd., Calcutta, India	521020	Trasferimento del surnatante dopo la prima centrifugazione, scarto del surnatante dopo la seconda centrifugazione
Mueller-Hinton agar	Himedia, Mumbai, India	M173-500G	Test di suscettibilità antimicrobica con il metodo Kirby-Bauer di diffusione del disco
Loop di nicromo D-4	Himedia, Mumbai, India	LA019	Per striature su terreni di coltura
Filo dritto Nichrome	Himedia, Mumbai, India	LA022	Per l'inoculazione con pugnalata
Guanti sterili	Nulife MRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, India		Per la sicurezza precauzioni
Fiala semplice (fiala con tappo rosso), Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367815	Ottenere pellet dopo la seconda centrifugazione
Sangue di pecora	Labline Trading Co., Hyderabad, India	70014	Preparazione di agar sangue e cioccolato agar
SST II tubo, Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367954	Separazione del surnatante nella prima centrifugazione
Batuffolo di cotone sterile (con bastoncino di legno)	Himedia, Mumbai, India	PW005-1X500NO	Coltura del prato di brodo di emocoltura per test di suscettibilità antimicrobica
Siringa ipodermica sterile monouso 5ml/cc	Nihal Healthcare, Solan, India	2213805NB2	Preparazione di aliquote dal
kit di riferimento +aBC VITEK DensiCHEK McFarland	bioMerieux, Marcy d' Etoille, Francia	422219	Densitometro per il controllo della torbidità della sospensione
Soluzione salina VITEK (0,45% NaCl)	bioMerieux, Marcy d' Etoille, Francia	V1204	a torbidità standard McFarland
	bioMerieux, Marcy d' Etoille, Francia	533306-4 REV	Supporto per il corretto posizionamento delle provette prima dell'inoculazione della carta d'identità
Provette VITEK	bioMerieux, Marcy d' Etoille, Francia		Provette per la preparazione dell'inoculo
VITEK-2 Compact 60	bioMerieux, Marcy d' Etoille, Francia	VKC15144	Identificazione automatizzata e sistema AST
VITEK-2 GN card	bioMerieux, Marcy d' Etoille, Francia	21341	Identificazione di bacilli Gram negativi