Articolo metodologico

Preparazione di campioni retinici per microscopia elettronica volumetrica

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DOI:

10.3791/66589

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24 maggio 2024

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Laboratory of Retinal Physiology and Disease, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive i passaggi dettagliati per la preparazione di campioni retinici per la microscopia elettronica volumetrica, concentrandosi sulle caratteristiche strutturali dei terminali dei fotorecettori retinici.

Abstract

La microscopia elettronica volumetrica (Volume EM) è emersa come un potente strumento per visualizzare la struttura 3D di cellule e tessuti con precisione a livello nanometrico. All'interno della retina, vari tipi di neuroni stabiliscono connessioni sinaptiche negli strati plessiformi interno ed esterno. Sebbene le tecniche EM convenzionali abbiano fornito preziose informazioni sugli organelli subcellulari della retina, il loro limite risiede nel fornire dati di immagini 2D, che possono ostacolare misurazioni accurate. Ad esempio, quantificare le dimensioni di tre distinti pool di vescicole sinaptiche, cruciali per la trasmissione sinaptica, è difficile in 2D. Volume EM offre una soluzione fornendo dati 3D su larga scala e ad alta risoluzione. Vale la pena notare che la preparazione del campione è una fase fondamentale dell'EM del volume, che influisce in modo significativo sulla nitidezza e sul contrasto dell'immagine. In questo contesto, delineiamo un protocollo di preparazione del campione per la ricostruzione 3D dei terminali degli assoni fotorecettoriali nella retina. Questo protocollo include tre passaggi chiave: dissezione e fissazione della retina, processi di inclusione del campione e selezione dell'area di interesse.

Introduzione

La retina è densamente piena di assoni neuronali e dendriti intrecciati che formano sinapsi tra di loro1. La microscopia è uno strumento indispensabile per lo studio dell'anatomia retinica in quanto ha strutture fini, intricate e piccole. Sebbene la microscopia elettronica (EM) fornisca una potenza senza pari per studiare l'ultrastruttura degli organelli subcellulari e la localizzazione accurata di proteine specifiche a livello nanometrico2, produce immagini limitate al piano bidimensionale (2D), portando a una potenziale perdita di informazioni chiave.

Lo sviluppo di tecniche emergenti di microscopia elettronica ad alta risoluzione (Volume EM) supporta la fornitura di informazioni strutturali tridimensionali (3D) più complete e su larga scala. Alcuni metodi EM 3D sono stati recentemente esaminati da altri 3,4,5. L'EM 3D consente la ricostruzione della forma neuronale e dei dettagli di connettività, consentendo un'analisi quantitativa precisa delle strutture di interesse. Ciò dimostra che i dati ottenuti per volume EM sono più sistematici, completi e accurati.

I fotorecettori retinici, che costituiscono i neuroni iniziali nella segnalazione visiva 6,7, stabiliscono sinapsi con dendriti di cellule bipolari e orizzontali di secondo ordine nel terminale del fotorecettore per facilitare i segnali eccitatori 8,9. Questi terminali, indicati come peduncoli conici e sferule a bastoncello, comprendono tre componenti cruciali: mitocondri, nastri sinaptici e vescicole sinaptiche. Mentre gli studi precedenti si sono concentrati prevalentemente sulla struttura generale delle sinapsi a nastro, c'è stata una notevole assenza di indagini sulla struttura fine dei componenti principali, tra cui mitocondri, nastro, pool di vescicole e la loro organizzazione spaziale nei terminali 10,11,12,13. Un'analisi precisa e sistematica di ciascun componente, insieme alla comprensione della loro interassociazione all'interno dei terminali dei fotorecettori, è vitale per svelare l'organizzazione spaziale e comprendere in modo completo le funzioni di elaborazione visiva. Nei fotorecettori, i mitocondri sono presenti principalmente nel segmento interno, nel corpo cellulare e nel terminale. Ci siamo concentrati qui sui mitocondri nei fotorecettori terminali. La microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato (FIB-SEM), un tipo di EM volumetrico che vanta un'alta risoluzione (risoluzione x, y e z < 5 nm) e un flusso volumetrico relativamente grandedi 4,14, rappresenta un potente strumento per visualizzare con precisione la struttura 3D dei terminali dei fotorecettori.

Sia il FIB-SEM che il microscopio elettronico a scansione frontale a blocchi seriali (SBF-SEM) sono EM volumetrici basati sul SEM per ottenere l'immagine dei tessuti scansionando la superficie del campione. Le caratteristiche ultrastrutturali della superficie di un campione sono rivelate attraverso il contrasto creato dall'intensità degli elettroni secondari o retrodiffusi (BSE) quando il fascio di elettroni scansiona il campione15. In sostanza, il rilevamento di BSE o elettroni secondari dalla superficie della sezione trasversale di un campione di tessuto incorporato in resina nel SEM consente di ottenere immagini del campione incorporato16,17. Quando la BSE o gli elettroni secondari sono meno generati, è possibile ottenere solo informazioni sulla superficie del campione. Per ottenere un contrasto costante e immagini seriali di alta qualità è necessaria una deposizione sufficiente di metalli pesanti nel campione. Pertanto, i protocolli specifici di preparazione dei campioni sono fondamentali per la successiva segmentazione, ricostruzione 3D e analisi quando si utilizza il SEM per l'imaging seriale. Il metodo osmio-tiocarboidrazide-osmio (OTO) è un tipico schema di preparazione del campione per la microscopia elettronica 3D di campioni biologici, preservando la struttura delle membrane contenenti lipidi e mantenendo un buon contrasto18,19.

Qui abbiamo sviluppato il metodo OTO per la preparazione di campioni retinici per l'uso di Volume EM. Questo processo si concentra in particolare sulla dissezione della retina, sulla determinazione del tempo di fissazione ottimale per il tessuto retinico e sulla descrizione dettagliata delle procedure e delle precauzioni specifiche nella preparazione del campione 3D. Inoltre, la segmentazione e la ricostruzione 3D della struttura target sono fasi integranti di questa applicazione estesa. La retina, essendo una struttura piccola e impegnativa da cui ricavare materiali, richiede operazioni rapide e precise per l'EM, con tempi fissi e reagenti freschi preparati per l'uso immediato.

Protocollo

I protocolli per la cura e l'uso degli animali sono stati approvati dal Comitato Etico dell'Università di Medicina di Wenzhou e hanno seguito le linee guida stabilite dall'Associazione per la Ricerca in Visione e Oftalmologia (ARVO). Tutti i topi sono stati mantenuti in un ciclo di luce di 12 ore e buio e sono stati alimentati con una dieta chow standard.

1. Dissezione e fissazione della retina

  1. Anestetizzare i topi (C57BL/6J, maschio, 8 settimane, 20-25 g) iniettando 2,2,2-tribromoetanolo (0,25 mg/g di peso corporeo) per via intraperitoneale. Confermare la profondità dell'anestesia senza retrazione della zampa posteriore dopo aver pizzicato l'alluce o senza riflesso di ammiccamento. Quindi, lussare la vertebra cervicale mentre è ancora sotto anestesia per sopprimere l'animale.
    NOTA: Il tribromoetanolo è stato scelto per la sua efficacia ben documentata nell'indurre un'anestesia rapida e affidabile in piccoli modelli animali, in particolare per le procedure a breve termine. Sebbene siano preferiti gli anestetici di grado farmaceutico, il tribromoetanolo offre vantaggi specifici in alcuni protocolli, rendendolo un'alternativa adatta se adeguatamente preparato e somministrato. Sono state prese tutte le precauzioni per garantirne l'uso sicuro ed efficace. Questo studio aderisce a considerazioni etiche garantendo un'adeguata preparazione, somministrazione e monitoraggio per mitigare i potenziali rischi associati al suo utilizzo.
  2. Rimuovere gli occhi con le forbici curve e immergere gli occhi in una soluzione mista contenente il 2% di glutaraldeide e il 2% di paraformaldeide in tampone fosfato (PB, 0,1 M, pH 7,4).
  3. Rimuovere il segmento anteriore e il vitreo dagli occhi con una pinza al microscopio da dissezione.
  4. Sbucciare la sclera con le due pinze fino a quando la retina non è completamente isolata dall'oculare.
  5. Tagliare rapidamente la retina in strisce spesse 100 - 200 μm con un rasoio e maneggiare le strisce di retina con una pipetta Pasteur in una nuova provetta per microcentrifuga (EP) contenente il 2% di glutaraldeide e il 2% di paraformaldeide in tampone fosfato (PB, 0,1 M, pH 7,4) per 2 ore a temperatura ambiente (RT) sul rotatore. Al termine, posizionare i tubi per fissarli a 4 °C per 24 ore.

2. Processo di inclusione del campione

  1. Dopo il lavaggio in tampone di cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7,4) 5 volte per 15 minuti ciascuna, incubare le strisce retiniche con una soluzione contenente ferrocianuro di potassio all'1,5% e OsO4 all'1% (in PB, pH 7,4) in cacodilato di sodio 0,1 M con CaCl2 4 mM per 1,5 ore al buio su ghiaccio.
    NOTA: L'incubazione al buio e la mancanza di fosfato possono prevenire la precipitazione e gli artefatti nel campione.
  2. Lavare le strisce retiniche 3 volte in ddH2O per 10 minuti ciascuna, quindi trattare con tiocarboidrazide all'1% in ddH2O per 30 minuti al buio a RT.
  3. Dopo aver risciacquato in ddH2O 3 volte per 15 minuti ciascuna, incubare le strisce di retina in OsO4 al 2% (in PB, PH 7,4) per 45 minuti al buio a RT.
  4. Dopo il lavaggio in ddH2O 3 volte per 15 minuti ciascuna, immergere le strisce di retina in acetato di uranile acquoso all'1% al buio a 4 °C per una notte.
  5. Il giorno successivo, dopo il lavaggio in ddH2O 3 volte per 15 minuti ciascuna, trattare le strisce retiniche con nitrato di piombo allo 0,66% in acido L-aspartico (0,03 M, pH 5,5) per 40 minuti a 65 °C.
  6. Dopo il lavaggio in ddH2O 3 volte per 15 minuti ciascuna, disidratare le strisce di retina con una concentrazione crescente di etanolo del 30%, 50%, 70%, 90% e 100% per 20 minuti in ciascuna soluzione.
  7. Trattare le strisce retiniche con una soluzione mista contenente etanolo e acetone uguali per 20 minuti, seguite da un lavaggio con acetone 2 volte per 20 minuti ciascuna.
  8. Infiltrare le strisce retiniche in acetone/resina miscelata in un rapporto di 7:3 al buio a RT durante la notte e poi acetone/resina a 3:7 al buio per 24 ore a RT.
    NOTA: La composizione precisa della resina è la seguente: Epon812 10,06 mL, DDSA 4 mL, MNA 5,94 mL e DMP-30 0,2 mL.
  9. Sostituire i tubi il giorno successivo e infiltrare le strisce retiniche con resina pura per 24 ore a 45 °C. Sostituire nuovamente la resina il giorno successivo e incorporare le strisce di retina per 48 ore a 60 °C.
    NOTA: Lo scopo dell'aumento della temperatura è quello di migliorare la penetrazione.

3. Selezione dell'area di interesse

  1. Tagliare i blocchi di resina in sezioni spesse 1 μm, colorare le sezioni con l'1% di blu di toluidina e osservare la struttura generale della retina al microscopio ottico per selezionare le regioni ruvide di interesse.
  2. Rivestire i blocchi di resina con platino utilizzando un rivestimento sputter, seguito da una fresatura con sezione spessa 70 nm utilizzando una microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato con una corrente di 0,23 nA e una tensione di accelerazione di 30 kV.
  3. Pre-screening della sezione utilizzando FIB-SEM con ingrandimento 2000x per identificare le regioni di interesse precise.
  4. Raccogli i dati utilizzando FIB-SEM con una corrente del fascio di 0,69 nA e una tensione di accelerazione di 2 kV. Gli altri parametri sono i seguenti: tempo di permanenza = 2 μs, dimensione del voxel = 1,8 nm x 1,8 nm x 15 nm.

Risultati

La Figura 1A mostra l'immagine dei terminali dei fotorecettori retinici preparati utilizzando il tradizionale metodo chimico a doppia fissazione e la Figura 1B mostra l'immagine dei terminali dei fotorecettori retinici preparati utilizzando il metodo OTO. Entrambi sono stati campionati mediante FIB-SEM. Si può vedere chiaramente che la struttura della membrana cellulare può essere mantenuta il più possibile utilizzando il metodo OTO e anche il contorno delle vescicole può essere visto chiaramente. Inoltre, anche il contrasto delle immagini ottenute utilizzando il metodo OTO è più chiaro.

La Figura 2 illustra il flusso di lavoro sperimentale impiegato per ricostruire le caratteristiche ultrastrutturali dei terminali dei fotorecettori. La ricostruzione si è concentrata su quattro tipi di terminali fotorecettoriali, tra cui i peduncoli del cono M, i peduncoli del cono S, le sferule dei bastoncelli 1 e i fiocchetti dei bastoncelli 2. L'enfasi principale è stata posta sui componenti essenziali, come i mitocondri, i nastri sinaptici e i pool di vescicole sinaptiche all'interno dei terminali dei fotorecettori.

La Figura 3 mostra i mitocondri ricostruiti e i nastri sinaptici nei terminali dei fotorecettori dei bastoncelli. In particolare, i nastri sinaptici delle sferule rod2 mostrano una caratteristica forma a ferro di cavallo, tipicamente caratterizzata da un singolo nastro per sferule. Inoltre, la Figura 2 evidenzia la presenza di due mitocondri nelle sferule dei bastoncelli, con una posizione coerente all'interno dello spazio centrale dei terminali, situati sopra i nastri sinaptici. Tutte le strutture sono state tracciate manualmente, pagina per pagina.

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Figura 1: Esempi di immagini campionate utilizzando FIB-SEM per il metodo tradizionale di doppia fissazione chimica e il metodo OTO. (A) Metodo tradizionale di doppia fissazione chimica. (B) Metodo OTO. Barra di scala: 1000 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Flusso di lavoro di ricostruzione 3D per terminali fotorecettori utilizzando FIB-SEM. Dopo l'allineamento con il software di visualizzazione dei dati 3D, le immagini seriali sono state segmentate manualmente e renderizzate per ulteriori analisi. (A) Immagini seriali originali. (B) Immagini allineate. (C) Immagini segmentate. (D) Immagini ricostruite. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Ricostruzione 3D. Le immagini rappresentative della ricostruzione 3D raffigurano i terminali dei fotorecettori in bianco, i mitocondri in arancione e i nastri sinaptici in blu. Barra della scala: 500 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Abbiamo implementato il protocollo di preparazione del campione Volume EM di OTO per analizzare la struttura terminale dei fotorecettori nel tessuto retinico. L'attenzione si è concentrata sui dettagli dell'intera procedura, a partire dal distacco e dalla fissazione della retina fino alla presentazione dei risultati della ricostruzione 3D dei terminali degli assoni dei fotorecettori.

La caratteristica distintiva del tessuto retinico, a differenza del tessuto cerebrale, risiede nella sua mancanza di differenze regionali. Composta da tre strati di corpi cellulari neuronali e due strati di connessioni sinaptiche, la retina mostra una struttura regolare e gerarchica nonostante la complessità delle sue componenti neuronali e sinaptiche20. Nella dissezione della retina, diventa imperativo assicurarsi che le strisce sottili siano ridotte al minimo per garantire un contrasto uniforme nelle successive fasi di preparazione del campione. I terminali degli assoni fotorecettoriali, strutture critiche di interesse, sono situati nello strato plessiforme esterno (OPL) della retina. La natura gerarchica e organizzata della retina consente una localizzazione efficiente delle strutture target, facilitando il campionamento preciso durante l'EM e garantendo l'accuratezza dei successivi risultati della ricostruzione 3D.

Volume EM facilita la visualizzazione tridimensionale dei circuiti neurali locali e delle connessioni sinaptiche all'interno della retina su scala nanometrica, utilizzando sezioni seriali21,22. Questa tecnica consente la generazione automatica di immagini 3D ad alta risoluzione e FIB-SEM ha il potenziale per svelare dettagli intricati di attività fisiologiche e patologiche. Pertanto, mantenere stabile il contrasto dell'immagine durante l'intero blocco è fondamentale durante il processo di preparazione del campione. Per ottenere una conduttività uniforme, impieghiamo il metodo OTO pre-embedding, un approccio classico ampiamente riconosciuto per la sua efficacia nel migliorare il contrasto nella microscopia elettronica a scansione (SEM)18,23,24. Questo metodo prevede un doppio rivestimento di osmio combinato con tiocarboidrazide, garantendo una conduttività di massa ottimale per campioni di grandi dimensioni. Inoltre, il doppio trattamento con osmio contribuisce alla conservazione superiore delle strutture della membrana lipidica, aggiungendo un livello di precisione alle nostre indagini. I campioni retinici sono gerarchici, i blocchi di tessuto sono piccoli e facili da penetrare e il metodo OTO può mantenere un migliore contorno della membrana cellulare e un contrasto uniforme dell'immagine.

Diversi fattori critici contribuiscono al successo di questo protocollo. In primo luogo, un rapido prelievo retinico e tempi di fissazione precisi sono fondamentali per mantenere una struttura subcellulare ottimale. In secondo luogo, garantire concentrazioni adeguate di osmio e tiocarboidrazide è essenziale per preservare il contrasto nella struttura della membrana delle immagini della serie. L'osmio, in particolare, svolge un ruolo cruciale legandosi con le molecole lipidiche, potenziando il segnale della BSE.

Il nostro protocollo di preparazione dei campioni retinici è facile da usare, non richiede apparecchiature aggiuntive e riduce al minimo i tempi di elaborazione. Questa caratteristica evidenzia la sua potenziale applicabilità ad altre tecniche di EM di volume, suggerendo versatilità e facilità di adozione in diversi setup sperimentali. Il metodo dell'OTO migliora notevolmente il contrasto delle immagini FIB-SEM. Tuttavia, i dettagli sulla membrana cellulare, in particolare la struttura a doppio strato, possono ancora apparire un po' sfocati. Il nostro attuale schema di preparazione dei campioni comporta in una certa misura un certo sacrificio di piccoli dettagli nella struttura cellulare. Il nostro obiettivo è quello di sviluppare metodi ottimizzati in futuro per affrontare e migliorare questa limitazione.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno divulgazioni.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni del National Key Research and Development Program of China (2022YFA1105503), dello State Key Laboratory of Neuroscience (SKLN-202103), della Zhejiang Natural Science Foundation of China (Y21H120019).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2,2,2-TribromoetanoloSigma-AldrichT48402
Acetone Microscopia ElettronicaScienza 10000
Amira 6.8Thermo Fisher Scientific CaCl
2SigmaC-2661
Stampo da incassoBeijing Zhongjingkeyi TechnologyGP10590
Epon resinaMicroscopia elettronica Scienza14900
EtanoloSigma64-17-5
GlutaraldeideMicroscopia elettronica Scienza16020
Helios NanoLab 600i a doppio raggio SEMFEI
Acido L-asparticoSigma56-84-8
Nitrato di piomboSigma10099-74-8
Na2HPO4.12H2OSigma71650Un componente del tampone fosfato
NaH2PO4. H2OSigma71507Un componente del tampone fosfato
OsO4TED PELLA4008-160501
Microscopia elettronica paraformaldeideScienza157-8
Ferrocianuro di potassioSigma14459-95-1
Cacodilato di sodioSigma6131-99-3
Verniciatore sputterLeicaACE200
TiocarboidrazideSigma2231-57-4
Acetato di uranileTED PELLACA96049

Riferimenti

  1. Masland, R. H. The fundamental plan of the retina. Nat Neurosci. 4 (9), 877-886 (2001).
  2. Harris, J. R. Transmission electron microscopy in molecular structural biology: A historical survey. Arch Biochem Biophys. 581, 3-18 (2015).
  3. Varsano, N., Wolf, S. G. Electron microscopy of cellular ultrastructure in three dimensions. Curr Opin Struct Biol. 76, 102444(2022).
  4. Briggman, K. L., Bock, D. D. Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction. Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 154-161 (2012).
  5. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biol Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  6. Sterling, P., Matthews, G. Structure and function of ribbon synapses. Trends Neurosci. 28 (1), 20-29 (2005).
  7. Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. Synaptic transmission at retinal ribbon synapses. Prog Retin Eye Res. 24 (6), 682-720 (2005).
  8. Thoreson, W. B. Transmission at rod and cone ribbon synapses in the retina. Pflugers Arch. 473 (9), 1469-1491 (2021).
  9. Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea. Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).
  10. Schmitz, F. The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do. Neuroscientist. 15 (6), 611-624 (2009).
  11. Kantardzhieva, A., Peppi, M., Lane, W. S., Sewell, W. F. Protein composition of immunoprecipitated synaptic ribbons. J Prot Res. 11 (2), 1163-1174 (2011).
  12. Zampighi, G. A., et al. Conical tomography of a ribbon synapse: structural evidence for vesicle fusion. PLoS One. 6 (3), e16944(2011).
  13. Barnes, S., et al. Morphological diversity of the rod spherule: A study of serially reconstructed electron micrographs. Plos One. 11 (3), e0150024(2016).
  14. Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. Elife. 6, e25916(2017).
  15. Crewe, A. V., Lin, P. S. The use of backscattered electrons for imaging purposes in a scanning electron microscope. Ultramicroscopy. 1 (3), 231-238 (1976).
  16. Richards, R. G., Gwynn, I. A. Backscattered electron imaging of the undersurface of resin-embedded cells by field-emission scanning electron microscopy. J Microsc. 177, Pt 1 43-52 (1995).
  17. Wergin, W. P., et al. Imaging thin and thick sections of biological tissue with the secondary electron detector in a field-emission scanning electron microscope. Scanning. 19 (6), 386-395 (1997).
  18. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. J Histochem Cytochem. 32 (4), 455-460 (1984).
  19. Buravkov, S. V., Chernikov, V. P., Buravkova, L. B. Simple method of specimen preparation for scanning electron microscopy. Bull Exp Biol Med. 151 (3), 378-382 (2011).
  20. Masland, R. H. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).
  21. Svara, F. N., Kornfeld, J., Denk, W., Bollmann, J. H. Volume EM reconstruction of spinal cord reveals wiring specificity in speed-related motor circuits. Cell Rep. 23 (10), 2942-2954 (2018).
  22. Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis. Front Neural Circuits. 12, 98(2018).
  23. Guo, J., et al. An optimized approach using cryofixation for high-resolution 3D analysis by FIB-SEM. J Struct Biol. 212 (1), 107600(2020).
  24. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid-containing membranes and droplets in osmium tetroxide-fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide (TCH). J Cell Biol. 30 (2), 424-432 (1966).

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