Questo protocollo descrive i passaggi dettagliati per la preparazione di campioni retinici per la microscopia elettronica volumetrica, concentrandosi sulle caratteristiche strutturali dei terminali dei fotorecettori retinici.
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Articolo metodologico
Preparazione di campioni retinici per microscopia elettronica volumetrica
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In questo articolo
Sommario
Abstract
La microscopia elettronica volumetrica (Volume EM) è emersa come un potente strumento per visualizzare la struttura 3D di cellule e tessuti con precisione a livello nanometrico. All'interno della retina, vari tipi di neuroni stabiliscono connessioni sinaptiche negli strati plessiformi interno ed esterno. Sebbene le tecniche EM convenzionali abbiano fornito preziose informazioni sugli organelli subcellulari della retina, il loro limite risiede nel fornire dati di immagini 2D, che possono ostacolare misurazioni accurate. Ad esempio, quantificare le dimensioni di tre distinti pool di vescicole sinaptiche, cruciali per la trasmissione sinaptica, è difficile in 2D. Volume EM offre una soluzione fornendo dati 3D su larga scala e ad alta risoluzione. Vale la pena notare che la preparazione del campione è una fase fondamentale dell'EM del volume, che influisce in modo significativo sulla nitidezza e sul contrasto dell'immagine. In questo contesto, delineiamo un protocollo di preparazione del campione per la ricostruzione 3D dei terminali degli assoni fotorecettoriali nella retina. Questo protocollo include tre passaggi chiave: dissezione e fissazione della retina, processi di inclusione del campione e selezione dell'area di interesse.
Introduzione
La retina è densamente piena di assoni neuronali e dendriti intrecciati che formano sinapsi tra di loro1. La microscopia è uno strumento indispensabile per lo studio dell'anatomia retinica in quanto ha strutture fini, intricate e piccole. Sebbene la microscopia elettronica (EM) fornisca una potenza senza pari per studiare l'ultrastruttura degli organelli subcellulari e la localizzazione accurata di proteine specifiche a livello nanometrico2, produce immagini limitate al piano bidimensionale (2D), portando a una potenziale perdita di informazioni chiave.
Lo sviluppo di tecniche emergenti di microscopia elettronica ad alta risoluzione (Volume EM) supporta la fornitura di informazioni strutturali tridimensionali (3D) più complete e su larga scala. Alcuni metodi EM 3D sono stati recentemente esaminati da altri 3,4,5. L'EM 3D consente la ricostruzione della forma neuronale e dei dettagli di connettività, consentendo un'analisi quantitativa precisa delle strutture di interesse. Ciò dimostra che i dati ottenuti per volume EM sono più sistematici, completi e accurati.
I fotorecettori retinici, che costituiscono i neuroni iniziali nella segnalazione visiva 6,7, stabiliscono sinapsi con dendriti di cellule bipolari e orizzontali di secondo ordine nel terminale del fotorecettore per facilitare i segnali eccitatori 8,9. Questi terminali, indicati come peduncoli conici e sferule a bastoncello, comprendono tre componenti cruciali: mitocondri, nastri sinaptici e vescicole sinaptiche. Mentre gli studi precedenti si sono concentrati prevalentemente sulla struttura generale delle sinapsi a nastro, c'è stata una notevole assenza di indagini sulla struttura fine dei componenti principali, tra cui mitocondri, nastro, pool di vescicole e la loro organizzazione spaziale nei terminali 10,11,12,13. Un'analisi precisa e sistematica di ciascun componente, insieme alla comprensione della loro interassociazione all'interno dei terminali dei fotorecettori, è vitale per svelare l'organizzazione spaziale e comprendere in modo completo le funzioni di elaborazione visiva. Nei fotorecettori, i mitocondri sono presenti principalmente nel segmento interno, nel corpo cellulare e nel terminale. Ci siamo concentrati qui sui mitocondri nei fotorecettori terminali. La microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato (FIB-SEM), un tipo di EM volumetrico che vanta un'alta risoluzione (risoluzione x, y e z < 5 nm) e un flusso volumetrico relativamente grandedi 4,14, rappresenta un potente strumento per visualizzare con precisione la struttura 3D dei terminali dei fotorecettori.
Sia il FIB-SEM che il microscopio elettronico a scansione frontale a blocchi seriali (SBF-SEM) sono EM volumetrici basati sul SEM per ottenere l'immagine dei tessuti scansionando la superficie del campione. Le caratteristiche ultrastrutturali della superficie di un campione sono rivelate attraverso il contrasto creato dall'intensità degli elettroni secondari o retrodiffusi (BSE) quando il fascio di elettroni scansiona il campione15. In sostanza, il rilevamento di BSE o elettroni secondari dalla superficie della sezione trasversale di un campione di tessuto incorporato in resina nel SEM consente di ottenere immagini del campione incorporato16,17. Quando la BSE o gli elettroni secondari sono meno generati, è possibile ottenere solo informazioni sulla superficie del campione. Per ottenere un contrasto costante e immagini seriali di alta qualità è necessaria una deposizione sufficiente di metalli pesanti nel campione. Pertanto, i protocolli specifici di preparazione dei campioni sono fondamentali per la successiva segmentazione, ricostruzione 3D e analisi quando si utilizza il SEM per l'imaging seriale. Il metodo osmio-tiocarboidrazide-osmio (OTO) è un tipico schema di preparazione del campione per la microscopia elettronica 3D di campioni biologici, preservando la struttura delle membrane contenenti lipidi e mantenendo un buon contrasto18,19.
Qui abbiamo sviluppato il metodo OTO per la preparazione di campioni retinici per l'uso di Volume EM. Questo processo si concentra in particolare sulla dissezione della retina, sulla determinazione del tempo di fissazione ottimale per il tessuto retinico e sulla descrizione dettagliata delle procedure e delle precauzioni specifiche nella preparazione del campione 3D. Inoltre, la segmentazione e la ricostruzione 3D della struttura target sono fasi integranti di questa applicazione estesa. La retina, essendo una struttura piccola e impegnativa da cui ricavare materiali, richiede operazioni rapide e precise per l'EM, con tempi fissi e reagenti freschi preparati per l'uso immediato.
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Protocollo
I protocolli per la cura e l'uso degli animali sono stati approvati dal Comitato Etico dell'Università di Medicina di Wenzhou e hanno seguito le linee guida stabilite dall'Associazione per la Ricerca in Visione e Oftalmologia (ARVO). Tutti i topi sono stati mantenuti in un ciclo di luce di 12 ore e buio e sono stati alimentati con una dieta chow standard.
1. Dissezione e fissazione della retina
- Anestetizzare i topi (C57BL/6J, maschio, 8 settimane, 20-25 g) iniettando 2,2,2-tribromoetanolo (0,25 mg/g di peso corporeo) per via intraperitoneale. Confermare la profondità dell'anestesia senza retrazione della zampa posteriore dopo aver pizzicato l'alluce o senza riflesso di ammiccamento. Quindi, lussare la vertebra cervicale mentre è ancora sotto anestesia per sopprimere l'animale.
NOTA: Il tribromoetanolo è stato scelto per la sua efficacia ben documentata nell'indurre un'anestesia rapida e affidabile in piccoli modelli animali, in particolare per le procedure a breve termine. Sebbene siano preferiti gli anestetici di grado farmaceutico, il tribromoetanolo offre vantaggi specifici in alcuni protocolli, rendendolo un'alternativa adatta se adeguatamente preparato e somministrato. Sono state prese tutte le precauzioni per garantirne l'uso sicuro ed efficace. Questo studio aderisce a considerazioni etiche garantendo un'adeguata preparazione, somministrazione e monitoraggio per mitigare i potenziali rischi associati al suo utilizzo. - Rimuovere gli occhi con le forbici curve e immergere gli occhi in una soluzione mista contenente il 2% di glutaraldeide e il 2% di paraformaldeide in tampone fosfato (PB, 0,1 M, pH 7,4).
- Rimuovere il segmento anteriore e il vitreo dagli occhi con una pinza al microscopio da dissezione.
- Sbucciare la sclera con le due pinze fino a quando la retina non è completamente isolata dall'oculare.
- Tagliare rapidamente la retina in strisce spesse 100 - 200 μm con un rasoio e maneggiare le strisce di retina con una pipetta Pasteur in una nuova provetta per microcentrifuga (EP) contenente il 2% di glutaraldeide e il 2% di paraformaldeide in tampone fosfato (PB, 0,1 M, pH 7,4) per 2 ore a temperatura ambiente (RT) sul rotatore. Al termine, posizionare i tubi per fissarli a 4 °C per 24 ore.
2. Processo di inclusione del campione
- Dopo il lavaggio in tampone di cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7,4) 5 volte per 15 minuti ciascuna, incubare le strisce retiniche con una soluzione contenente ferrocianuro di potassio all'1,5% e OsO4 all'1% (in PB, pH 7,4) in cacodilato di sodio 0,1 M con CaCl2 4 mM per 1,5 ore al buio su ghiaccio.
NOTA: L'incubazione al buio e la mancanza di fosfato possono prevenire la precipitazione e gli artefatti nel campione. - Lavare le strisce retiniche 3 volte in ddH2O per 10 minuti ciascuna, quindi trattare con tiocarboidrazide all'1% in ddH2O per 30 minuti al buio a RT.
- Dopo aver risciacquato in ddH2O 3 volte per 15 minuti ciascuna, incubare le strisce di retina in OsO4 al 2% (in PB, PH 7,4) per 45 minuti al buio a RT.
- Dopo il lavaggio in ddH2O 3 volte per 15 minuti ciascuna, immergere le strisce di retina in acetato di uranile acquoso all'1% al buio a 4 °C per una notte.
- Il giorno successivo, dopo il lavaggio in ddH2O 3 volte per 15 minuti ciascuna, trattare le strisce retiniche con nitrato di piombo allo 0,66% in acido L-aspartico (0,03 M, pH 5,5) per 40 minuti a 65 °C.
- Dopo il lavaggio in ddH2O 3 volte per 15 minuti ciascuna, disidratare le strisce di retina con una concentrazione crescente di etanolo del 30%, 50%, 70%, 90% e 100% per 20 minuti in ciascuna soluzione.
- Trattare le strisce retiniche con una soluzione mista contenente etanolo e acetone uguali per 20 minuti, seguite da un lavaggio con acetone 2 volte per 20 minuti ciascuna.
- Infiltrare le strisce retiniche in acetone/resina miscelata in un rapporto di 7:3 al buio a RT durante la notte e poi acetone/resina a 3:7 al buio per 24 ore a RT.
NOTA: La composizione precisa della resina è la seguente: Epon812 10,06 mL, DDSA 4 mL, MNA 5,94 mL e DMP-30 0,2 mL. - Sostituire i tubi il giorno successivo e infiltrare le strisce retiniche con resina pura per 24 ore a 45 °C. Sostituire nuovamente la resina il giorno successivo e incorporare le strisce di retina per 48 ore a 60 °C.
NOTA: Lo scopo dell'aumento della temperatura è quello di migliorare la penetrazione.
3. Selezione dell'area di interesse
- Tagliare i blocchi di resina in sezioni spesse 1 μm, colorare le sezioni con l'1% di blu di toluidina e osservare la struttura generale della retina al microscopio ottico per selezionare le regioni ruvide di interesse.
- Rivestire i blocchi di resina con platino utilizzando un rivestimento sputter, seguito da una fresatura con sezione spessa 70 nm utilizzando una microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato con una corrente di 0,23 nA e una tensione di accelerazione di 30 kV.
- Pre-screening della sezione utilizzando FIB-SEM con ingrandimento 2000x per identificare le regioni di interesse precise.
- Raccogli i dati utilizzando FIB-SEM con una corrente del fascio di 0,69 nA e una tensione di accelerazione di 2 kV. Gli altri parametri sono i seguenti: tempo di permanenza = 2 μs, dimensione del voxel = 1,8 nm x 1,8 nm x 15 nm.
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Risultati
La Figura 1A mostra l'immagine dei terminali dei fotorecettori retinici preparati utilizzando il tradizionale metodo chimico a doppia fissazione e la Figura 1B mostra l'immagine dei terminali dei fotorecettori retinici preparati utilizzando il metodo OTO. Entrambi sono stati campionati mediante FIB-SEM. Si può vedere chiaramente che la struttura della membrana cellulare può essere mantenuta il più possibile utilizzando il metodo OTO e anche il contorno delle ves...
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Discussione
Abbiamo implementato il protocollo di preparazione del campione Volume EM di OTO per analizzare la struttura terminale dei fotorecettori nel tessuto retinico. L'attenzione si è concentrata sui dettagli dell'intera procedura, a partire dal distacco e dalla fissazione della retina fino alla presentazione dei risultati della ricostruzione 3D dei terminali degli assoni dei fotorecettori.
La caratteristica distintiva del tessuto retinico, a differenza del tessuto c...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno divulgazioni.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni del National Key Research and Development Program of China (2022YFA1105503), dello State Key Laboratory of Neuroscience (SKLN-202103), della Zhejiang Natural Science Foundation of China (Y21H120019).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2,2,2-Tribromoetanolo | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Acetone Microscopia Elettronica | Scienza 10000 | ||
| Amira 6.8 | Thermo Fisher Scientific CaCl | ||
| 2 | Sigma | C-2661 | |
| Stampo da incasso | Beijing Zhongjingkeyi Technology | GP10590 | |
| Epon resina | Microscopia elettronica Scienza | 14900 | |
| Etanolo | Sigma | 64-17-5 | |
| Glutaraldeide | Microscopia elettronica Scienza | 16020 | |
| Helios NanoLab 600i a doppio raggio SEM | FEI | ||
| Acido L-aspartico | Sigma | 56-84-8 | |
| Nitrato di piombo | Sigma | 10099-74-8 | |
| Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | Un componente del tampone fosfato |
| NaH2PO4. H2O | Sigma | 71507 | Un componente del tampone fosfato |
| OsO4 | TED PELLA | 4008-160501 | |
| Microscopia elettronica paraformaldeide | Scienza | 157-8 | |
| Ferrocianuro di potassio | Sigma | 14459-95-1 | |
| Cacodilato di sodio | Sigma | 6131-99-3 | |
| Verniciatore sputter | Leica | ACE200 | |
| Tiocarboidrazide | Sigma | 2231-57-4 | |
| Acetato di uranile | TED PELLA | CA96049 |
Riferimenti
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