Articolo metodologico

Tecnica chirurgica di impianto osseo per modelli di diabete e osteoporosi della tibia di ratto

DOI:

10.3791/66591

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5 luglio 2024

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1Faculty of Medicine and Health Sciences, University of Barcelona, 2Department of Oral Surgery, Davallmed Clinic. Porto, 3Biomaterials, Biomechanics and Tissue Engineering Group, Department of Materials Science and Engineering, Universitat Politècnica de Catalunya, 4Barcelona Research Centre in Multiscale Science and Engineering, Universitat Politècnica de Catalunya, 5Department of Periodontology, Davallmed Clinic. Porto, 6Department of Odontostomatology, University of Barcelona, 7Oral Health and Masticatory System Research Group at the Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 8Preclinical imaging platform, Vall d'Hebron Research Institute, Barcelona, 9Preclinical Therapeutics Core, Helen Diller Family Comprehensive Cancer Center, University of California, San Francisco, 10Animal facility, Vall d'Hebron Research Institute, Barcelona, 11UCSF Gnotobiotics Core Facility, University of California, San Francisco, 12Human Anatomy and Embryology Unit, Experimental Pathology and Therapeutics Department, Faculty of Medicine and Health Sciences, University of Barcelona

In questo articolo

Sommario

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Il posizionamento di impianti in un modello di ratto è una procedura sperimentale essenziale per la ricerca clinica. Questo studio presenta un protocollo chirurgico completo per l'impianto di impianti in tibia nella tibia di modelli di ratto con diabete e osteoporosi.

Abstract

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Il ratto è stato a lungo un prezioso modello animale in implantologia dentale e ortopedia, in particolare nello studio delle interazioni tra biomateriali e tessuto osseo. La tibia del ratto è spesso scelta per il suo facile accesso chirurgico attraverso strati sottili di tessuto (pelle e muscoli) e la forma appiattita della sua faccia mediale, facilitando l'inserimento chirurgico di dispositivi intraossei. Inoltre, questo modello consente l'induzione di malattie specifiche, imitando varie condizioni cliniche per valutare le risposte biologiche a diverse condizioni dell'impianto come la geometria, la struttura superficiale o i segnali biologici. Tuttavia, nonostante la sua robusta struttura corticale, alcuni dispositivi intraossei possono richiedere adattamenti nel design e nelle dimensioni per un impianto di successo. Pertanto, la definizione di metodi chirurgici standardizzati per la manipolazione dei tessuti molli e duri nella regione di impianto è essenziale per garantire il corretto posizionamento dell'impianto o del dispositivo a vite, in particolare in campi come l'implantologia dentale e l'ortopedia. Questo studio ha incluso ottanta ratti Sprague Dawley divisi in due gruppi in base alle rispettive malattie: Gruppo 1 con osteoporosi e Gruppo 2 con diabete di tipo 2. Gli impianti sono stati eseguiti a 4 settimane e 12 settimane, con lo stesso chirurgo che ha seguito una tecnica chirurgica coerente. È stata osservata una risposta biologica positiva, che indica la completa osteointegrazione di tutti gli impianti posizionati. Questi risultati convalidano il successo del protocollo chirurgico, che può essere replicato per altri studi e fungere da punto di riferimento per la comunità dei biomateriali. In particolare, i valori di osteointegrazione sono rimasti stabili sia a 4 settimane che a 12 settimane per entrambi i modelli di malattia, dimostrando un'integrazione duratura dell'impianto nel tempo e sottolineando l'instaurazione di una connessione ossea intima già a 4 settimane.

Introduzione

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La scelta comune dei ratti come soggetti sperimentali è dovuta al fatto che sono facili da allevare e relativamente economici rispetto ai modelli animali più grandi. L'emergere di nuove procedure, come la riproduzione affidabile di un disturbo, ad esempio l'osteoporosi o il diabete, rende questo modello particolarmente utile per analizzare il potenziale uso di trattamenti e/o l'influenza della malattia nella risposta biologica a farmaci e dispositivi o procedure chirurgiche 1,2.

L'aumento di massa ossea del ratto avviene per lo più durante i primi 6 mesi di vita, anche se alcuni ricercatori ritengono che l'osso lungo cresca costantemente per almeno un anno con un progressivo aumento dellalunghezza1. Con l'invecchiamento, c'è una transizione dalla modellazione al rimodellamento, che non si verifica in tutti i casi allo stesso modo in tutte le ossa2. Le femmine di ratti Sprague Dawley crescono più lentamente dei ratti maschi e raggiungono un picco di peso inferiore rispetto ai ratti maschi1. L'allungamento osseo continuo e le varie dinamiche di rimodellamento osseo nei ratti sono fattori che devono essere presi in considerazione quando si affrontano i problemi di salute umana; Tuttavia, non è stato ancora possibile trovare alcuna ricerca sperimentale che dimostri lo sviluppo dell'osso di ratto per tutta la vita o l'incapacità della specie di rimodellare l'osso1. Se la sperimentazione inizia intorno ai 10 mesi di età, un margine di almeno 1 mm dalla cartilagine di accrescimento della tibia deve essere lasciato intatto a causa di questa crescita ossea longitudinale, un problema da considerare negli studi di implantologia dentale2. Gli ormoni sono anche un parametro chiave nella ricerca ossea poiché a 8 mesi di età, è stato riscontrato che i ratti maschi hanno una larghezza ossea maggiore del 22% e una resistenza alla rottura del 33% superiore rispetto alle femmine nella tibia3.

La riproduzione affidabile di una malattia è quindi molto importante in ortopedia e implantologia poiché l'osteointegrazione di una vite ortopedica o di un impianto dentale è un processo complesso che dipende da numerosi fattori che influenzano la risposta sistemica all'impianto del dispositivo nell'osso. È noto che disturbi sistemici come l'osteoporosi e il diabete influenzano il tasso di successo in ortopedia e implantologia, quindi la riproduzione affidabile di tali disturbi in modelli di ratto può essere applicata per esplorare modi per superare queste limitazioni.

La tibia di ratto, grazie al facile accesso chirurgico, al volume osseo moderato e alla forma piatta sulla placca mediale, la rende adatta per esperimenti chirurgici di impianto osseo 4,5 ed è stata utilizzata in numerosi studi di ricerca che esplorano gli effetti della superficie dell'impianto sull'osteointegrazione 4,5,6. Un numero crescente di studi valuta gli effetti sull'osteointegrazione dei rivestimenti e delle sostanze aggiunte alla superficie dell'impianto sia in animali sani7 che in animali compromessi affetti da diabete o osteoporosi 8,9,10,11,12,13,14.

Il numero di dispositivi impiantabili inseriti nella tibia di un ratto è limitato e può variare a seconda del tipo di studio. A seconda del numero di impianti o delle condizioni di studio, le dimensioni dei dispositivi devono essere adattate per ridurre al minimo il trauma chirurgico. Negli studi con un impianto, è possibile posizionare un impianto di dimensioni quasi umane (2,0 mm di diametro e da 4 a 5 mm di lunghezza) e si può ottenere un ancoraggio bi-corticale 6,7,15,16. Le dimensioni degli impianti nei protocolli multi-implantari devono adottare una dimensione dell'impianto appropriata (1,5 mm di diametro e 2,5 mm di lunghezza)4,17.

Il presente studio si propone di descrivere un protocollo chirurgico standardizzato per il posizionamento di impianti in titanio sulla tibia di due modelli di ratto: il modello di ratto per l'osteoporosi e il modello di ratto per il diabete. Inoltre, questo studio consente di testare il protocollo chirurgico per valutare diversi tipi di biofunzionalizzazione della superficie implantare e il suo effetto sull'osteointegrazione.

Un campione di 80 ratti è stato diviso in due gruppi. Nel gruppo 1 sono state selezionate 40 femmine di Sprague Dawley ovariectomizzate e 5 animali fittizi, con un peso medio di 484 g e un'età media di 12 settimane. Sulla base delle raccomandazioni dei fornitori (vedi Tabella dei materiali), tre mesi dopo la sterilizzazione, l'esperimento è iniziato. Questo periodo di attesa ha assicurato la scomparsa degli ormoni sessuali. L'osteoporosi è stata confermata al momento dell'intervento chirurgico sulla base dell'analisi ossea con tomografia microcomputerizzata (micro-CT), che ha riflesso una perdita ossea media del 20% rispetto al gruppo fittizio. Il gruppo 2 era composto da 40 ratti BBDR (Bio Breeding Diabetes Resistant) geneticamente modificati Sprague Dawley con diabete di tipo II. Il peso medio era di 730 g e l'età media era di 12 settimane. Prima dell'intervento chirurgico, lo stato diabetico è stato confermato con tre giorni consecutivi di misurazioni del glucosio con risultati superiori a 200 mg/dL. Il glucosio è stato misurato con un glucometro in 6 ore di digiuno e una goccia di sangue è stata raccolta mediante puntura della coda.

Sono stati utilizzati impianti in titanio di grado 3 di 2 mm di lunghezza e 1,8 mm di diametro. Tutti gli impianti sono stati sterilizzati in camera bianca, mediante ecografia in cicloesano (3 volte per 2 minuti), acetone (una volta per 1 minuto), acqua deionizzata (3 volte per 2 minuti), etanolo (3 volte per 2 minuti) e acetone (3 volte per 2 minuti) utilizzando un bagno a ultrasuoni (230 V CA, 50/60 Hz, 360 W). Quindi, i campioni sono stati essiccati con azoto gassoso e un fascio di azoto a 0,5 bar è stato applicato direttamente sui campioni. Prima dell'impianto, gli impianti sono stati prima immersi in acqua deionizzata e poi immersi in etanolo al 70% (v/v) per 10 minuti. Successivamente, gli impianti sono stati trasferiti in provette sterili per microcentrifuga e mantenuti in condizioni sterili fino all'intervento chirurgico.

Protocollo

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Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con le Linee Guida della Comunità Europea per la protezione degli animali utilizzati a fini scientifici (Direttiva 2010/63/UE) come recepite dalla legge spagnola (Regio Decreto 53/2013) e dai regolamenti della Generalitat de Catalunya (Decreto 214/97). L'approvazione etica per tutte le procedure e la manipolazione degli animali è stata ottenuta dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale dell'Institut de Recerca Vall D'Hebron (numero di registrazione 72/18 CEEA). Per il modello osteoporotico, sono state utilizzate femmine di ratti Sprague Dawley con un peso medio di 484 g e un'età media di 12 settimane. Per quanto riguarda il modello diabetico, sono state impiegate femmine di ratti BBDR (Bio Breeding Diabetes Resistant) geneticamente modificati con un peso medio di 730 g e un'età media di 12 settimane. Tutti gli animali provenivano da un fornitore commerciale. I dettagli specifici degli animali, dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Anestesia/farmacologia e preparazione degli animali

  1. Somministrare analgesia prechirurgica utilizzando buprenorfina a 0,05 mg/kg e meloxicam a 2 mg/kg attraverso iniezioni sottocutanee 10-15 minuti prima di iniziare la procedura chirurgica.
  2. Eseguire l'anestesia intra-chirurgica con isoflurano per via inalatoria: iniziare al 5% all'aria aperta durante l'induzione e mantenere al 3%. Indurre l'anestesia in una camera di ratto e mantenere l'apporto di isoflurano con un adattamento del naso conico durante l'intervento chirurgico.

2. Preparazione per l'intervento chirurgico

  1. Misurare la temperatura corporea dell'animale anestetizzato con una sonda rettale e utilizzare un termoforo a controllo elettronico per il supporto termico durante la procedura chirurgica. L'unguento per gli occhi deve essere applicato prima dell'inizio dell'intervento chirurgico per evitare la secchezza corneale.
    NOTA: Se necessario, l'unguento deve essere riapplicato dopo aver controllato la secchezza oculare.
  2. Taglia i peli con un rasoio elettrico e applica una crema depilatoria per eliminare il pelo rimasto.
  3. Ottenere un campo chirurgico asettico pulendo la pelle del ginocchio in un modello di iodio ed etanolo al 70% (v/v) utilizzando tamponi sterili, partendo dall'interno e spostandosi verso l'esterno della linea di incisione senza ritracciare. Eseguire un minimo di tre cicli di pulizia consecutivi (iodio-etanolo-iodio).
  4. Isolare il campo operatorio posizionando un telo chirurgico fenestrato sterile sopra l'animale, esponendo la zampa attraverso l'apertura centrale (Figura 1).

3. Chirurgia

  1. Esposizione chirurgica
    1. Praticare un'incisione cutanea a tutto spessore di circa 1 cm di lunghezza verticalmente lungo il bordo prossimale della faccia anteromediale della tibia, nella regione della metafisi per esporre l'osso (Figura 2).
    2. Stabilizzare la gamba e tendere la pelle contro l'osso sottostante mentre si esegue l'incisione, assicurandosi che un'incisione pulita rimanga nella posizione corretta. Gestire pulendo l'emorragia leggera prevista con un impacco imbevuto di soluzione salina (Figura 2).
      NOTA: La pelle del ratto è sottile e cadente o allentata. La stabilizzazione della pelle è fondamentale e necessaria.
    3. Staccare completamente il tessuto dall'osso utilizzando piccoli elevatori periostali (Figura 3).
    4. Esporre l'osso fino all'identificazione dell'inserzione del muscolo tibiale craniale, del gracile e del muscolo laterale della testa del gastrocnemio nel bordo posteriore dell'aspetto mediale della tibia, come un tessuto bianco fibroso saldamente aderente all'osso (Figura 3).
      NOTA: È importante identificare questo gruppo di inserzioni muscolari per consentire il posizionamento dell'impianto in una regione ossea con caratteristiche e stimoli simili in tutto il campione, indipendentemente dalle dimensioni del ratto.
  2. Processo di foratura
    1. Iniziare il processo di perforazione nella regione corretta tra la cresta tibiale prossimale e il limite posteriore della faccia mediale dell'osso tibiale, contigua all'inserzione del muscolo tibiale craniale, del gracile e del muscolo laterale della testa del gastrocnemio, evitando qualsiasi lesione muscolare.1
      NOTA: La posizione corretta deve essere a 5 mm ± 2 mm dal piatto tibiale.
    2. Forare con un massimo di 150 giri/min (giri/min) in irrigazione in soluzione salina a una temperatura prossima a 20 °C con un motore elettrico chirurgico con contrangolo di riduzione 20:1.
      NOTA: Sono stati necessari solo due esercizi.
    3. Iniziare con un trapano pilota a lancia (Figura 4) a una profondità di 2,4 mm in irrigazione con soluzione salina.
      NOTA: Ogni trapano ha avuto un massimo di 10 utilizzi.
    4. Come seconda punta, utilizzare (Figura 4) una punta elicoidale a una profondità di 2,4 mm con un diametro di 1,6 mm in soluzione salina.
      NOTA: Ogni trapano ha avuto un massimo di 10 utilizzi.
  3. Posizionamento dell'impianto
    1. Inserire l'impianto con un pezzo intermedio (Figura 5) attaccato al contrangolo di riduzione 20:1.
    2. Prima di posizionare l'impianto, pulire l'impianto da eventuali residui di sterilizzante chimico ruotandolo nel contrangolo con irrigazione salina simultanea per 10 s (Figura 5).
    3. Posizionare l'impianto in titanio (2 mm di lunghezza e 1,8 mm di diametro) utilizzando il pezzo intermedio a 20 giri/min monitorando il valore della coppia in tempo reale, registrando la coppia di inserimento massima.
      NOTA: Si prevede una difficoltà iniziale nell'inserimento dell'impianto a causa della differenza tra la fresa finale e l'impianto, nonché del profilo cilindrico dell'impianto; Tuttavia, questa difficoltà iniziale si normalizza rapidamente non appena l'impianto penetra nell'osso corticale iniziale.
    4. Completare l'inserimento dell'impianto prima che passi completamente l'osso corticale in cui è inserito, ovvero la faccia mediale piatta della tibia.
      NOTA: Nel momento finale dell'inserimento dell'impianto, è importante lasciare l'impianto leggermente al di fuori dell'osso corticale o all'altezza dell'osso corticale in cui è inserito, ovvero la faccia mediale piatta della tibia, per garantire la stabilità primaria (Figura 6).
  4. Chiusura della ferita
    1. Sutura i bordi del tessuto muscolare con semplici suture interne utilizzando una sutura sintetica riassorbibile monofilamento 4/0 (gliconato) (Figura 7).
    2. Eseguire la chiusura della pelle con una sutura intradermica utilizzando una sutura sintetica riassorbibile in monofilamento 4/0 (gliconato) (Figura 7).

4. Scansione micro-CT

  1. Dopo aver completato l'intervento chirurgico e ancora in anestesia generale, eseguire una scansione micro-CT per confermare il corretto posizionamento dell'impianto.
  2. Rimuovere il ratto dal lettino operatorio e posizionarlo sul lettino di scansione. Localizzare la gamba operata utilizzando la modalità di scansione dal vivo micro-CT e centrare il campo visivo sull'impianto.
    NOTA: I parametri di acquisizione consigliati sono un campo visivo di 5 mm, una risoluzione spaziale di 0,0001 mm3, 50 kV, 200 μA e un tempo di acquisizione di 3 min.
  3. Una volta acquisita la scansione, confermare la corretta distanza tra l'aspetto prossimale dell'impianto e la superficie del piatto tibiale, secondo il passaggio 5.2.1.
    NOTA: Questo valore sarà utile per la standardizzazione della tecnica (Figura 8).

5. Cure postoperatorie

  1. Dopo l'acquisizione dell'imaging, riportare il ratto nella sua gabbia e monitorarlo fino al completo recupero.
    NOTA: Questo richiede circa 5-10 minuti, a seconda del modello animale. Ci si aspetta che i ratti diabetici rimangano anestetizzati più a lungo e abbiano un tempo di recupero più lungo a causa dei cambiamenti metabolici associati al diabete.
  2. Somministrare buprenorfina (0,1 mg/kg) ogni 6-8 ore e meloxicam (5 mg/kg) ogni 24 ore, per via sottocutanea, fino a 72 ore.
  3. Tempo di rimozione della sutura
    1. Esaminare quotidianamente la ferita chirurgica per verificare la presenza di infezioni, integrità della sutura o altri problemi e rimuovere i residui di sutura, se necessario, 15 giorni dopo l'intervento.

6. Eutanasia

  1. Eutanasia degli animali utilizzando una camera di CO2 , secondo le linee guida del National Institutes of Health (NIH), con un tasso di riempimento di CO2 del 30%-70% del volume della camera/min dopo il tempo di impianto (4 settimane o 12 settimane).

7. Analisi post-chirurgica

  1. Per entrambi i modelli (osteoporosi e diabete), rimuovere la tibia mediante disarticolazione dopo l'eutanasia per ulteriori analisi.
    NOTA: Per quanto riguarda l'analisi micro-CT, dati consentiti per il calcolo del contatto osso-impianto (BIC). L'acquisizione TC è stata condotta utilizzando i parametri precedentemente descritti, e l'analisi BIC è stata eseguita dividendo l'area ossea (mm2) per l'area implantare (mm2) calcolata in corrispondenza della regione corticale, adattando un protocollo già descritto in letteratura18. Vengono mostrate immagini rappresentative per ciascun modello, osteoporosi (Figura 9) e diabete (Figura 10).

Risultati

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Fase chirurgica
È importante ricordare che entrambi i modelli animali utilizzati in questo studio presentano alcuni vincoli dovuti alle malattie indotte. Questi vincoli relativi alla manipolazione dei tessuti duri e molli si riflettono durante la procedura chirurgica.

Nel modello diabetico, il ratto è più grande, il che rende difficile stabilizzare le zampe durante le procedure chirurgiche. Questo aumenta il tempo chirurgico e, di conseguenza, il tempo di anestesia, che richiede un tempo di recupero più lungo e, quindi, richiede una maggiore vigilanza nel periodo postoperatorio.

Per quanto riguarda il modello osteoporotico, i requisiti erano molto diversi, essendo più concentrati al momento della manipolazione ossea. In questo caso, è possibile osservare un sanguinamento maggiore durante la procedura di perforazione. Inoltre, il processo di posizionamento dell'impianto diventa più difficile. Possono verificarsi alcune complicanze, come piccole crepe nell'osso, che alterano la progressione dell'impianto durante il suo ingresso e lo rendono più instabile a causa della mancanza di resistenza ossea sulle pareti laterali dell'impianto. Questa limitazione richiede una maggiore pressione manuale e stabilizzazione durante il posizionamento, rendendo più difficile il controllo fino a quando non viene raggiunto il corretto posizionamento dell'impianto.

Per quanto riguarda la coppia massima di inserimento dell'impianto, sono stati osservati valori relativamente diversi per le due malattie (Tabella 1). In generale, la coppia di inserzione media massima osservata per il modello osteoporotico era superiore a quella per il modello diabetico. Con questi risultati, è interessante capire l'effetto che il diabete ha sulla densità ossea e sulla resistenza ossea all'inserimento dell'impianto, poiché questa condizione sembra avere un effetto più grave sulle proprietà meccaniche dell'osso rispetto all'osteoporosi.

Analisi post-chirurgica
L'adeguato posizionamento degli impianti in titanio dopo 4 settimane e 12 settimane dall'impianto è stato analizzato mediante imaging micro-CT. Immagini rappresentative sono fornite sia per i ratti osteoporotici (Figura 9) che per quelli diabetici (Figura 10). Nel complesso, le protesi sono state correttamente impiantate attraverso le tibie corticali e trabecolari, mostrando un contatto intimo e continuo con la parte corticale, e senza alcun segno di infiammazione o reazioni avverse, dimostrando così il successo del protocollo chirurgico per entrambi i modelli di patologia.

Nel complesso, l'analisi delle immagini ha anche permesso di calcolare il rapporto tra l'area ossea (mm2) e l'area dell'impianto (mm2), denominata V(BIC), nella regione corticale, e di confrontare le prestazioni della procedura chirurgica nel tempo e all'interno dei modelli. Come mostrato in Figura 11, i valori di V(BIC) sono rimasti costanti per il modello osteoporotico a 4 settimane e 12 settimane, indicando un'integrazione stabile dell'impianto nel tempo ed evidenziando che una connessione intima con l'osso è assicurata già a 4 settimane. Da notare che sono stati ottenuti valori molto simili per il modello diabetico, dimostrando così l'adeguatezza del protocollo di studio per entrambi i modelli di patologia.

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Figura 1: Campo chirurgico. Il campo chirurgico che mostra la corretta posizione del ratto e l'esposizione dell'area su cui intervenire, l'adattamento dell'adattatore conico alle vie aeree per il mantenimento dell'anestesia durante la procedura, nonché gli strumenti necessari per l'intervento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Incisione chirurgica. Corretta stabilizzazione della zampa del ratto e, allo stesso tempo, fissaggio della sottile pelle mobile per ottenere una corretta incisione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Esposizione ossea e inserzione muscolare Identificazione. Lato sinistro: distacco totale dei tessuti con la conseguente esposizione ossea. Per preservare ed evitare danni all'inserzione del muscolo tibiale craniale, dei gracali e dei muscoli laterali della testa del gastrocnemio, è importante identificare correttamente il tessuto bianco fibroso saldamente aderente all'osso, visibile nella figura sul lato destro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Sequenza di foratura. La sequenza del processo di foratura inizia con la punta pilota a sinistra, seguita dalla punta elicoidale a destra. Per garantire una procedura di perforazione stabile e sicura, è importante mantenere la stabilizzazione delle gambe e dei tessuti molli durante la perforazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Preparazione per l'inserimento dell'impianto. L'impianto viene inserito su un pezzo intermedio per essere sottoposto al processo di pulizia con una soluzione salina mentre l'impianto ruota a 20 giri/min. Questo pezzo intermedio consente l'inserimento dell'impianto nell'osso con un dispositivo elettronico. Questo dispositivo garantisce il controllo della velocità di inserimento dell'impianto e registra la coppia di inserimento in tempo reale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Posizionamento dell'impianto in titanio. Il posizionamento dell'impianto all'interno dell'osso richiede il suo posizionamento sulla faccia piatta dell'osso mediale, lontano dal bordo prossimale della faccia antero-mediale dell'osso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Chiusura della ferita. I passaggi per la chiusura della ferita sono osservati su 2 piani diversi. A sinistra: il primo piano, più profondo, è realizzato con semplici punti di sutura per approssimare i bordi del tessuto muscolare. A destra: il secondo piano, più superficiale, viene effettuato con una sutura intradermica per approssimare la pelle evitando che il nodo si trovi in posizione esternalizzata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Scansione micro-CT del posizionamento dell'impianto dopo la procedura chirurgica. La figura illustra il posizionamento del ratto nello scanner Micro-CT e le immagini della posizione dell'impianto sono divise in tre sezioni, corrispondenti rispettivamente alle viste x, y e z. L'impianto è puntato con una freccia rossa nelle diverse viste. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 9: Scansione micro-CT di un impianto inserito nella tibia di un ratto osteoporotico. Immagini micro-TC post-chirurgiche rappresentative di impianti in titanio posizionati nelle tibie di ratti osteoporotici dopo (A) 4 settimane e (B) 12 settimane dall'impianto. Ogni immagine è divisa in tre sezioni, corrispondenti rispettivamente alle viste x, y e z. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 10: Scansione Micro-CT di un impianto inserito nella tibia di un ratto diabetico. Immagini micro-TC post-chirurgiche rappresentative di impianti in titanio posizionati nelle tibie di ratti osteoporotici dopo (A) 4 settimane e (B) 12 settimane dall'impianto. Ogni immagine è divisa in tre sezioni, corrispondenti rispettivamente alle viste x, y e z. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 11: Analisi del contatto osso-impianto (BIC). Valori V(BIC) calcolati come area ossea (mm2) *100/ area dell'impianto (mm2) da immagini micro-CT per i modelli osteoporotico (Osteo) e diabetico (Diab) dopo 4 settimane (4 w) e 12 settimane (12 w) dopo l'impianto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Coppia massima di inserimento dell'impianto [N·cm]
ModelloGamba destraGamba sinistra
Osteoporosi6,11 ± 0,966.49 ± 1.34
Diabete4,79 ± 1,704,90 ± 1,76

Tabella 1: Coppia massima di inserimento. Differenze nei valori di coppia massima ottenuti durante l'inserimento dell'impianto tra ratti diabetici e ratti osteoporotici. I ratti diabetici presentano valori di coppia massima inferiori rispetto ai ratti osteoporotici.

Discussione

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Sebbene il ratto sia un modello ampiamente utilizzato per lo studio dell'osteointegrazione, è importante definire e descrivere una tecnica chirurgica riproducibile per posizionare adeguatamente gli impianti. Tale tecnica potrebbe servire da guida per la comunità scientifica. Inoltre, il fatto che alcune malattie, come l'osteoporosi e il diabete, alterino il metabolismo osseo implica una maggiore necessità di progettare correttamente le procedure chirurgiche. Il ratto si confronta favorevolmente con altri modelli animali poiché presenta le caratteristiche principali sia dell'osteoporosi (fratture spontanee e a basso impatto) che del diabete e dell'obesità indotta dalla dieta senza richiedere costose strutture specializzate e lunghi e costosi esperimenti, e il controllo e il mantenimento postoperatorio19. Le piccole dimensioni, l'elevata fecondità e la breve vita del ratto facilitano esperimenti su larga scala ed efficienti in termini di tempo, soddisfacendo al contempo i tre requisiti R degli esperimenti sugli animali (sostituzione, riduzione e raffinamento)20.

Nonostante la notevole quantità di letteratura scientifica in questo campo, ci sono solo pochi articoli scientifici che descrivono in dettaglio le tecniche chirurgiche. Tuttavia, la stragrande maggioranza omette informazioni chirurgiche cruciali, impedendo così la possibilità di replicare le tecniche descritte.

In questo protocollo chirurgico, è necessario considerare diversi passaggi critici durante la procedura chirurgica, come la posizione dell'incisione, la posizione precisa per la perforazione e il posizionamento dell'impianto, la tecnica di perforazione, le dimensioni esatte dell'impianto e la fresa finale utilizzata per l'inserimento dell'impianto.

In letteratura, la posizione esatta dell'incisione è spesso imprecisa, mancando di una base scientifica per il suo posizionamento. L'incisione deve essere praticata in una regione diversa da quella del posizionamento dell'impianto. È importante evitare di posizionare l'incisione e la conseguente sutura direttamente sopra l'area impiantata per mantenere l'integrità del periostio staccato sopra l'impianto. Un'incisione e il distacco iniziale del lembo a tutto spessore possono interrompere l'afflusso di sangue e danneggiare il periostio, portando potenzialmente a un disturbo dell'attività delle cellule periostali durante la formazione di nuovo osso, come osservato in altri studi21. Questo approccio mira a ottimizzare la formazione dell'osso perimplantare e a ridurre al minimo i traumi, la scarsa cicatrizzazione, la fibrosi o il rischio di colonizzazione batterica nell'area della sutura. In questo metodo, l'incisione viene dettagliata ed eseguita nella cresta tibiale prossimale, assicurandosi che non sia direttamente sopra il sito di posizionamento dell'impianto.

Quando si determina la regione per il posizionamento dell'impianto, è fondamentale garantire una densità ossea uniforme in tutto il campione. In genere, le misurazioni si riferiscono al piatto tibiale. Data la variazione longitudinale delle dimensioni tra i ratti, è necessario un riferimento anatomico per posizionare costantemente gli impianti nella stessa regione. In questo metodo, l'area adiacente all'inserzione dei muscoli laterali della testa tibiale craniale, gracile e gastrocnemio funge da riferimento anatomico affidabile. Si prevede che questa regione, caratterizzata da inserzioni muscolari, mostri una densità ossea omogenea in tutto il campione.

Quando si discute del metodo di perforazione, è fondamentale fornire dettagli accurati sul tipo/dimensioni della/e punta/e, la velocità di perforazione (solitamente misurata in giri/min) e la temperatura della soluzione salina. Questi fattori sono essenziali per prevenire un'estesa area necrotica e la successiva formazione di tessuto fibroso22,23, come evidenziato in diversi studi focalizzati sulle reazioni necrotiche indotte da drilling. Tuttavia, alcuni articoli superano questi limiti biologici24 nei loro metodi di perforazione, mentre altri omettono completamente queste informazioni cruciali 4,25,26,27,28. Questo studio sottolinea le meticolose precauzioni prese durante le procedure di perforazione per ridurre i traumi chirurgici e la necrosi tissutale. Abbiamo optato per una procedura di perforazione di sicurezza con una velocità limitata a 150 giri/min, un livello considerato sicuro in termini di temperatura ossea anche senza soluzione salina. Questo approccio è efficace in termini di velocità di perforazione e consente un buon controllo della fresa durante la procedura29,30. Inoltre, abbiamo mantenuto l'irrigazione e il raffreddamento utilizzando una soluzione salina a circa 20 °C per mitigare ulteriormente eventuali effetti termici.

Un'altra informazione rilevante che viene spesso omessa è la dimensione dell'impianto utilizzato. Questa omissione rende impossibile interpretare il rapporto tra la dimensione della fresa finale e la dimensione dell'impianto. Questa discrepanza è fondamentale per valutare la stabilità dell'impianto, che in un deficit può portare a instabilità, mentre in eccesso può causare un eccesso di pressione e una reazione ischemico-necrotica.

È fondamentale notare che per ottenere la stabilità primaria, dovrebbe esserci una leggera differenza di diametro tra la fresa finale e l'impianto, con l'impianto leggermente più grande. Questo parametro chirurgico critico per il raggiungimento della stabilità primaria non è sempre coerente in letteratura, poiché alcune metodologie presentano una fresa finale con un diametro maggiore rispetto all'impianto posizionato4. Dato che questa regione è caratterizzata da inserzioni muscolari, ci si aspetta una densità ossea omogenea e robusta in tutto il campione. Questa caratteristica aiuta ad evitare la limitazione primaria riportata per gli interventi tibiali nel ratto, vale a dire la crescita longitudinale della tibia nel tempo31. Inoltre, questo metodo consente il controllo della temperatura, affrontando una delle cause delle complicanze e della successiva morbilità23. Tuttavia, analogamente ad altri studi, anche questo studio deve affrontare una limitazione relativa alla necessità di adattare il dispositivo a causa delle variazioni delle dimensioni della tibia 4,17.

Un'altra preoccupazione legata al numero di animali utilizzati è l'importanza di selezionare una dimensione del campione appropriata. Questo è fondamentale per massimizzare l'impatto dei risultati della ricerca riducendo al minimo l'uso degli animali. Tale strategia non solo migliora l'efficienza e l'affidabilità degli studi, ma enfatizza anche le considerazioni etiche nella ricerca scientifica. Dovrebbero essere compiuti sforzi costanti per ottimizzare questa efficienza.

In sintesi, il presente metodo fornisce una descrizione dettagliata di tutte le procedure chirurgiche e consente l'osservazione di varie sfide chirurgiche in entrambe le malattie. Inoltre, questo protocollo si distingue come un metodo valido perché tutti i campioni a contatto diretto con l'osso hanno raggiunto valori di V(BIC) stabili. Tuttavia, si differenzia dalla maggior parte degli studi sperimentali in letteratura per la presentazione di una tecnica dettagliata e giustificata, che consente una riproduzione esatta. Di conseguenza, può essere utilizzato per studiare l'effetto di diverse superfici implantari in varie malattie, comprese quelle che influenzano la densità ossea.

Dichiarazioni

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Con la presente dichiariamo che non vi è alcun conflitto di interessi in merito a questo articolo scientifico.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano l'Agenzia statale spagnola per la ricerca per il sostegno finanziario attraverso i progetti PID2020-114019RBI00 e PID2021-125150OB-I00.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Aghi da 22 G+A2:C30TerumoNN-2238R
4/0 sutura sintetica riassorbibile monofilamentoBraun ( MonoSyn)
Siringhe da 5 mL, 10 mLBraun4617100V-02 4606051V
PinzaAdson Antã oRif. medico: A586
BBDR ( Biobreeding Diabetes Resistant ) Sprague Dawley RatsJanvier Labs
BetadineMylan
BuprecareAnimalcare (UK)
Castroviejo Calibro 0-40 mm 15 cm angolatoUL AMIN Industries
Castroviejo Needle HolderFormicaã o MedicalRef: AM1702
Forbici per chirurgia dentale curve e diritteAntã o MedicalAMA603 / AMA600
Rasoio elettricoOster Pro 3000i34264482227
Pinza Graefe Extra FineF.S.TRif: 11150-10
Garze padsCOVIDIEN441001
GlucometroMenarini (Italia)
Trapano elicoidale / OSTEO-PIN DRILL Ø 1,6 mmsoadcoRef. OS-8001
Impianti / VITE OSTEO-PIN Ø 1,8 x 2,0 mmsoadcoRef. OS-3
IsofloLe Vet Pharma (Paesi Bassi)
Trapano pilota a lancia / Trapano lanceolato (DS)soadcoRef. 10 02 01 T
Guanti in lattice - Guanti chirurgici steriliHartmannRef: 9426495
Lucas Curette chirurgicaAntã oMedical Ref: AMA940-3
MetacamBoehringer Ingelheim (Germania)
Micro pinze drittenopaRef: AB 542/12
Micro-CT scan( Quantum Fx microCT )Perkin Elmer (US)
Osteoporotic Sprague Dawley femmine Ratti JanvierLabs Elevatore
periostale -  Molt 2-4Formicaã o MedicalRef: A1564
Soluzione fisiologica per l'irrigazioneHygitechRef: 10238
Lama per bisturi Acciaio al carbonio 15CRazor Med Ref: 02846
Tamponi di garza steriliAlledentalRef: 270712
Sistema di irrigazione sterileHygitechRef: HY1-110001D
Asciugamani sterili (1 pezzo per animale)Dinarex4410
Contrangolo chirurgicoW& HRif: WS-75 LED G
Contrangolo chirurgicoW& HSN 08877
Contrangolo chirurgicoW& HSN 01309
Motore elettrico chirurgicoWH Implantmed Tipo: SI-1023  Rif: 30288000
Manico per bisturi chirurgicoAsaDentalRif: 0350-3
Pinze per asciugamaniXelpov surgicalAF-773-11
Dispositivo ad ultrasuoniJ.P. Selecta, Abrera, Spagna

Riferimenti

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