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Articolo metodologico

Ricostituzione del canale del recettore del glutammato batterico mediante incapsulamento di un sistema di espressione libero da cellule

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DOI:

10.3791/66595

⸱

8 marzo 2024

 ,  , 
1Neuroscience Program, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 5Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive il metodo dell'emulsione invertita utilizzato per incapsulare un sistema di espressione libera da cellule (CFE) all'interno di una vescicola unilamellare gigante (GUV) per lo studio della sintesi e dell'incorporazione di una proteina modello di membrana nel doppio strato lipidico.

Abstract

I sistemi di espressione libera cellulare (CFE) sono potenti strumenti nella biologia sintetica che consentono la biomimetica di funzioni cellulari come il biorilevamento e la rigenerazione di energia nelle cellule sintetiche. La ricostruzione di un'ampia gamma di processi cellulari, tuttavia, richiede la ricostituzione di successo delle proteine di membrana nella membrana delle cellule sintetiche. Mentre l'espressione di proteine solubili è solitamente efficace nei comuni sistemi CFE, la ricostituzione delle proteine di membrana nei doppi strati lipidici delle cellule sintetiche si è dimostrata impegnativa. Qui, viene dimostrato un metodo per la ricostituzione di una proteina modello di membrana, il recettore batterico del glutammato (GluR0), in vescicole unilamellari giganti (GUV) come cellule sintetiche modello basate sull'incapsulamento e l'incubazione della reazione CFE all'interno di cellule sintetiche. Utilizzando questa piattaforma, è stato dimostrato l'effetto della sostituzione del peptide segnale N-terminale di GluR0 con il peptide segnale della proteorhodopsina sulla traslocazione cotraduzionale di GluR0 nelle membrane di GUV ibridi. Questo metodo fornisce una procedura robusta che consentirà la ricostituzione senza cellule di varie proteine di membrana in cellule sintetiche.

Introduzione

La biologia sintetica dal basso verso l'alto ha guadagnato un crescente interesse nell'ultimo decennio come campo emergente con numerose potenziali applicazioni nella bioingegneria, nella somministrazione di farmaci e nella medicina rigenerativa 1,2. Lo sviluppo di cellule sintetiche come pietra miliare della biologia sintetica bottom-up, in particolare, ha attratto un'ampia gamma di comunità scientifiche grazie alle promettenti applicazioni delle cellule sintetiche e alle loro proprietà fisiche e biochimiche simili a quelle cellulari che facilitano gli studi biofisici in vitro 3,4,5,6 . Le cellule sintetiche sono spesso ingegnerizzate in vescicole unilamellari giganti delle dimensioni di una cellula (GUV) in cui vengono ricreati diversi processi biologici. La ricostituzione del citoscheletro cellulare 7,8, la rigenerazione dell'energia dipendente dalla luce9, la comunicazione cellulare10,11 e il biosensing12 sono esempi di sforzi compiuti per ricostruire comportamenti simili a cellule nelle cellule sintetiche.

Mentre alcuni processi cellulari si basano su proteine solubili, molte caratteristiche delle cellule naturali, come il rilevamento e la comunicazione, spesso utilizzano proteine di membrana, inclusi canali ionici, recettori e trasportatori. Una delle principali sfide nello sviluppo delle cellule sintetiche è la ricostituzione delle proteine di membrana. Sebbene i metodi tradizionali di ricostituzione delle proteine di membrana nei doppi strati lipidici si basino sulla purificazione mediata da detergenti, tali metodi sono laboriosi, inefficaci per le proteine che sono tossiche per l'ospite di espressione, o spesso non sono adatti per la ricostituzione delle proteine di membrana nei GUVs13.

Un metodo alternativo per l'espressione proteica sono i sistemi di espressione libera da cellule (CFE). I sistemi CFE sono stati un potente strumento nella biologia sintetica che consente l'espressione in vitro di varie proteine utilizzando lisato cellulare o macchinari di trascrizione-traduzione purificati14. I sistemi CFE possono anche essere incapsulati in GUV, consentendo così reazioni di sintesi proteica compartimentate che possono essere programmate per varie applicazioni, come la creazione di cellule sintetiche che raccolgono la luce9 o biosensori meccanosensibili15,16. Analogamente ai metodi di espressione delle proteine ricombinanti, l'espressione delle proteine di membrana è impegnativa nei sistemi CFE17. L'aggregazione, il ripiegamento errato e la mancanza di modificazioni post-traduzionali nei sistemi CFE sono i principali colli di bottiglia che ostacolano il successo della sintesi proteica di membrana utilizzando i sistemi CFE. La difficoltà della ricostituzione delle proteine di membrana dal basso verso l'alto utilizzando sistemi CFE è dovuta in parte all'assenza di una complessa via di biogenesi delle proteine di membrana che si basa su peptidi segnale, particelle di riconoscimento del segnale, transloconi e molecole chaperoning. Tuttavia, recentemente, diversi studi hanno suggerito che la presenza di strutture membranose come microsomi o liposomi durante la traduzione promuove il successo dell'espressione delle proteine di membrana 18,19,20,21. Inoltre, Eaglesfield et al. e Steinküher et al. hanno scoperto che l'inclusione di specifici domini idrofobici noti come peptidi segnale nell'N-terminale della proteina di membrana può migliorare significativamente la sua espressione22,23. Nel complesso, questi studi suggeriscono che la sfida della ricostituzione delle proteine di membrana nelle cellule sintetiche può essere superata se la traduzione proteica avviene in presenza della membrana GUV e se viene utilizzato un peptide segnale N-terminale appropriato.

Qui viene presentato un protocollo per l'incapsulamento della sintesi proteica utilizzando reazioni CFE con elementi ricombinanti (PURE) per la ricostituzione delle proteine di membrana nei GUV. Il recettore batterico del glutammato24 (GluR0) è stato selezionato come proteina modello di membrana e ha studiato l'effetto del suo peptide segnale N-terminale sulla sua ricostituzione di membrana. L'effetto del peptide segnale della proteorodopsina, che ha dimostrato di migliorare l'efficienza della ricostituzione delle proteine di membrana da Eaglesfield et al.22, è studiato costruendo una variante mutata di GluR0 indicata come PRSP-GluR0 e la sua espressione e localizzazione di membrana con GluR0 wild-type (indicato come WT-GluR0 di seguito) che ospita il suo peptide segnale nativo. Questo protocollo si basa sul metodo dell'emulsione invertita25 con modifiche che lo rendono robusto per l'incapsulamento CFE. Nel metodo presentato, le reazioni CFE vengono prima emulsionate utilizzando una soluzione di lipidi in olio che genera goccioline di dimensioni micron che contengono il sistema CFE e sono stabilizzate dal monostrato lipidico. Le goccioline di emulsione vengono quindi stratificate sopra un'interfaccia olio-acqua che è satura di un altro monostrato lipidico. Le goccioline di emulsione sono quindi costrette a viaggiare attraverso l'interfaccia olio-acqua tramite la forza centrifuga. Attraverso questo processo, le goccioline ottengono un altro monostrato, generando così una vescicola lipidica a doppio strato. I GUV contenenti la reazione CFE vengono quindi incubati, durante i quali la proteina di membrana viene espressa e incorporata nella membrana GUV. Sebbene questo protocollo sia specificato per l'espressione libera da cellule di GluR0, può essere utilizzato per la sintesi libera da cellule di altre proteine di membrana o per diverse applicazioni cellulari sintetiche come la ricostituzione del citoscheletro o gli studi di fusione di membrana26.

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Protocollo

I reagenti e le attrezzature utilizzate per questo studio sono forniti nella Tabella dei materiali.

1. Reazioni di massa di CFE in presenza di piccole vescicole unilamellari (SUV)

  1. Preparazione SUV
    NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito in una cappa aspirante seguendo le istruzioni di sicurezza per lavorare con il cloroformio.
    1. Preparare 5 mM di 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) SUV in un flaconcino di vetro trasferendo 76 μL di soluzione madre POPC 25 mg/mL disciolta in cloroformio.
    2. Ruotando delicatamente la fiala di vetro, soffiare un leggero flusso di argon nella fiala per formare una pellicola di lipidi secchi sul fondo. Quindi, trasferire la fiala di vetro in un essiccatore con il tappo avvitato in modo lasco per far evaporare il cloroformio in eccesso.
    3. Conservare il flaconcino di vetro nell'essiccatore per 1 ora. Quindi, aggiungere 0,5 ml di acqua deionizzata ultrapura per sciogliere il film lipidico e vorticare per circa 2 minuti.
    4. Installare un apparato di miniestrusione immergendo due supporti filtranti in acqua deionizzata e posizionandoli su ciascuno dei supporti interni della membrana. Quindi, immergere un filtro in policarbonato da 100 nm e posizionarlo tra i due supporti membrana interni tenuti insieme dall'involucro esterno dell'estrusore e dal dado di ritegno. Posiziona questa configurazione nel supporto dell'estrusore.
    5. Sciacquare due siringhe a tenuta di gas da 1 ml 3 volte con acqua deionizzata ultrapura.
    6. Caricare il campione di miscela lipidico-acqua in una delle siringhe a tenuta di gas da 1 ml e posizionarlo in un'estremità del mini estrusore utilizzando le clip a braccio oscillante per tenere la siringa in posizione. Inserisci la seconda siringa nell'altra estremità del mini-estrusore e assicurati che sia completamente premuta.
      NOTA: Quando si carica la siringa con la miscela di lipidi e acqua, assicurarsi che non ci sia aria nella siringa prima di farla passare attraverso il mini-estrusore.
    7. Passare delicatamente la miscela di acqua e lipidi dalla siringa originale alla siringa vuota attraverso l'apparato del mini-estrusore. Ripeti questo passaggio 11 volte per formare i SUV. Trasferire i SUV in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
      NOTA: La soluzione SUV può essere conservata a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
  2. Assemblaggio di reazione CFE
    1. Assemblare la reazione CFE seguendo il protocollo di espressione libera da cellule fornito dal produttore con lievi modifiche descritte di seguito.
    2. Miscelare 10 μl di soluzione 1 (contenente amminoacidi, NTP, tRNA e substrati per enzimi e tampone necessario), 1 μl di soluzione 2 (proteine in glicerolo al 20%), 2 μl di soluzione 3 (ribosoma (20 μM)), una quantità appropriata di DNA che codifica per sfGFP-sfCherry(1-10)27 solubile (di seguito denominato sfGFP solubile), WT-GluR0-sfGFP o PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 ng/1000 coppie di basi), 1 μL di inibitore dell'RNAsi murina e 4 μL di soluzione SUV da 5 mM per le proteine di membrana o 4 μL di acqua per le proteine solubili.
    3. Portare il volume finale della reazione a 20 μl aggiungendo acqua deionizzata ultrapura.
      NOTA: Durante il montaggio del sistema CFE, tutti i componenti devono essere tenuti in ghiaccio. Tutti i materiali sono sensibili alla temperatura e possono degradarsi se raggiungono la temperatura ambiente.
  3. Incubazione e monitoraggio della reazione CFE
    1. Trasferire la soluzione CFE in una piastra conica a fondo V a 96 pozzetti. Per evitare l'evaporazione durante il corso della reazione, coprire la piastra con una pellicola sigillante.
    2. Incubare la piastra a 37 °C in un lettore di piastre per 4-5 ore mentre si monitora la reazione CFE misurando il segnale GFP con un guadagno di 100 a lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 488 nm/528 nm ogni 2 minuti.

2. Reazioni CFE incapsulate in GUV

  1. Preparazione della soluzione tampone esterna GUV
    1. In una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, miscelare 1,5 μL di spermidina 1 M, 37,5 μL di ATP 100 mM, 25 μL di 100 mM GTP, 12,5 μL di 100 mM CTP, 12,5 μL di 100 mM UTP, 25 μL di 1 M di creatina fosfato, 18 μL di acetato di magnesio 1 M, 93,33 μL di glutammato di potassio 3 M, 50 μL di 1 M HEPES KOH (pH 7,4), 1,15 μL di acido folinico 332 mM, 100 μL di glucosio 2 M e 50 μL dalla soluzione madre di una miscela di 6 mM di ciascuno dei 20 amminoacidi (preparata seguendo il protocollo descritto da Sun et al.28).
    2. Portare il volume finale della soluzione a 1 ml aggiungendo acqua deionizzata ultra-purificata.
      NOTA: Tutti i componenti devono essere tenuti in ghiaccio. Aggiungere la miscela di aminoacidi alla fine per evitare l'esaurimento degli aminoacidi28. La soluzione può essere aliquotata in aliquote da 330 μL e conservata a -20 °C fino al momento dell'uso.
  2. Preparazione della miscela lipidica in olio
    NOTA: questo passaggio deve essere eseguito in una cappa aspirante seguendo le istruzioni di sicurezza per lavorare con il cloroformio.
    1. In una cappa aspirante, miscelare 17,3 μL di soluzione madre POPC da 25 mg/mL e 1,08 μL di copolimero poli(butadiene)-b-poli(ossido di etilene) (PEO-b-PBD) da 50 mg/mL in un flaconcino di vetro da 15 mL.
      NOTA: La soluzione finale di lipidi in olio contiene 0,5 mM di lipidi con il 95% e il 5% di POPC e PEO-b-PBD, rispettivamente. La PEO-b-PBD è stata utilizzata per migliorare la stabilità della membrana durante l'espressione proteica, ma è stata mantenuta a un basso rapporto molare per ridurre la tendenza del copolimero ad aggregarsi in micelle separate dalle molecole lipidiche29,30.
    2. Soffiare con cautela un leggero flusso di gas argon nella fiala di vetro mentre si ruota la fiala per far evaporare il cloroformio.
    3. Pipettare 1,2 mL di olio minerale leggero nella fiala di vetro da 15 mL contenente i lipidi essiccati.
    4. Mescolare i lipidi e l'olio agitando alla massima velocità per 10-20 s. La miscela lipidico-copolimero disciolta apparirà torbida.
    5. Per garantire che tutti i possibili aggregati lipidici nell'olio siano completamente disciolti e dispersi in tutto l'olio, porre la fiala di vetro in un forno a circa 50 °C per 20 minuti prima di agitare per altri 10-20 s alla massima velocità.
  3. Assemblaggio e incapsulamento della reazione CFE (la Figura 1 riassume i seguenti passaggi).
    1. Preparare 300 μl della soluzione esterna GUV in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL mescolando 270 μl di soluzione tampone esterna CFE preparata nella fase 2.1, 15 μl di NaCl 5 M e 15 μl di KCl 4,5 M.
      NOTA: A questo punto, aggiungere 0,45 μl di 1 M 1,4-ditiotreitolo (DTT) alla soluzione esterna GUV. Lo scopo dell'aggiunta di NaCl e KCl è quello di regolare l'osmolalità della soluzione esterna in modo che corrisponda alla soluzione interna di CFE. Il volume esatto di NaCl e KCl dipende dalla regolazione dell'osmolalità desiderata. Si può aggiungere NaCl o KCl o entrambi per regolare l'osmolalità.
    2. Pipettare delicatamente 300 μL di miscela di lipidi in olio sopra la soluzione esterna GUV.
      NOTA: Quando si aggiunge la miscela di olio lipidico, è importante che l'olio non si mescoli con la soluzione acquosa esterna. Dopo l'aggiunta, dovrebbe esserci un'interfaccia visibile tra la miscela di lipidi in olio e la soluzione esterna di GUV.
    3. Incubare l'interfaccia olio-acqua a temperatura ambiente per 2 ore per consentire al monostrato lipidico di formarsi e stabilizzarsi all'interfaccia.
    4. Nel frattempo, seguire la sezione 1.2.1 per assemblare una reazione CFE contenente il DNA plasmidico che codifica per le varianti proteiche di membrana o GFP solubile. Sostituire i 4 μl di soluzione SUV da 5 mM o l'acqua con 4 μl di saccarosio 1 M. Questa reazione sarà la soluzione interna del GUV.
      NOTA: Un osmometro è stato utilizzato per misurare l'osmolalità delle soluzioni interne ed esterne. L'osmolalità della soluzione esterna è stata quindi regolata di conseguenza mediante l'aggiunta di NaCl o acqua. L'osmolalità della reazione CFE è tipicamente di circa 1600 mOsm/Kg. L'aggiunta di saccarosio alla reazione aumenta la densità interna della soluzione, consentendo così alle vescicole di viaggiare attraverso l'interfaccia olio-acqua durante la fase di centrifugazione. Un'alternativa al saccarosio è la soluzione a gradiente di densità Opti-Prep.
    5. Aggiungere 600 μl di miscela di lipidi e oli alla provetta per microcentrifuga contenente la reazione CFE e pipettare su e giù energicamente per ~1 min per emulsionare la reazione in soluzione di lipidi in olio e formare il monostrato lipidico attorno alle cellule sintetiche.
      NOTA: La soluzione finale non deve avere bolle e deve apparire opaca.
    6. Pipettare delicatamente l'emulsione della soluzione interna sopra lo strato di olio nella provetta per microcentrifuga da 1,5 ml in cui è stata impostata l'interfaccia olio-acqua.
      NOTA: Fare attenzione a non disturbare o destabilizzare l'interfaccia.
    7. Centrifugare per 10 minuti a 2.000 x g a 4 °C.
      NOTA: La velocità di centrifugazione è stata ottimizzata per questo protocollo. Adir et al.31 hanno riportato una diversa velocità di centrifugazione.
    8. Una volta terminata la centrifugazione, rimuovere con cura l'olio in eccesso e la soluzione esterna dalla provetta della microcentrifuga utilizzando un pipettatore. Rimuovere la soluzione esterna fino a quando il volume rimanente è di circa 100 μL.
      NOTA: Un pellet di GUV è solitamente visibile sul fondo della provetta della microcentrifuga. Tuttavia, la mancanza di un pellet visibile non significa necessariamente che non ci sia resa in GUV. Invece di utilizzare un pipettatore, l'olio in eccesso sopra la soluzione esterna può essere rimosso mediante aspirazione. È fondamentale assicurarsi che la soluzione lipidica in olio sia completamente rimossa. La contaminazione da olio nella soluzione GUV può causare immagini di bassa qualità.
    9. Risospendere il pellet GUV nella soluzione rimanente da 100 μl pipettando delicatamente verso l'alto e verso il basso. Quindi, trasferire la soluzione GUV in una piastra a fondo piatto pulita e trasparente da 96 pozzetti per incubare.

3. Incubazione e imaging della reazione CFE incapsulata

  1. Coprire la piastra con una pellicola sigillante per evitare l'evaporazione. Incubare la piastra a 37 °C per 5-6 ore. È possibile utilizzare un lettore di piastre e seguire il passaggio 1.3.2 per preparare il lettore di piastre per la fase di incubazione.
  2. Una volta terminata l'incubazione, posizionare la piastra a 96 pozzetti sul tavolino di imaging di un microscopio invertito dotato di una fotocamera EMCCD (o una fotocamera sCMOS), un laser controllato DAQ-MX (o un sistema di combinazione laser integrato) e un confocale a disco rotante CSU-X1 (o un confocale a scansione laser). Concentrati su qualsiasi ROI contenente GUV e acquisisci immagini a una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm utilizzando un obiettivo Plan-Apochromat 60 x/1.4 NA.
  3. Salva le immagini dei GUV in formato .tiff.
  4. Aprire le immagini in un software di elaborazione delle immagini (ad esempio, ImageJ o Fiji). Aprire il pannello delle impostazioni Luminosità/Contrasto . Regola la luminosità e il contrasto su impostazioni appropriate che rendano visibili le proteine fluorescenti.
  5. Se l'obiettivo è confrontare l'intensità del segnale di diverse proteine espresse, per prima cosa impila singole immagini di GUV contenenti proteine diverse utilizzando il pannello Immagini da impilare situato nel sottomenu Immagine > Impila. Quindi, regolare la luminosità e il contrasto di tutte le immagini utilizzando il pannello Luminosità/Contrasto .

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Risultati

Prima dell'incapsulamento delle reazioni CFE, due varianti di GluR0-sfGFP che ospitano peptidi segnale nativi e proteorhodopsina (le sequenze di peptidi segnale sono presentate nella Tabella supplementare 1) e la sfGFP solubile sono state espresse individualmente in reazioni di massa e la loro espressione è stata monitorata rilevando il segnale sfGFP utilizzando un lettore di piastre (Figura 2A). Le proteine di membrana sono state espresse in assenza o prese...

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Discussione

Praticamente qualsiasi processo cellulare che dipende dal trasferimento di molecole o informazioni attraverso la membrana cellulare, come la segnalazione cellulare o l'eccitazione cellulare, richiede proteine di membrana. Pertanto, la ricostituzione delle proteine di membrana è diventata il principale collo di bottiglia nella realizzazione di vari progetti di cellule sintetiche per diverse applicazioni. La tradizionale ricostituzione mediata da detergenti delle proteine di membrana nelle membrane biologiche richiede meto...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

L'APL riconosce il sostegno della National Science Foundation (EF1935265), del National Institutes of Health (R01-EB030031 e R21-AR080363) e dell'Army Research Office (80523-BB)

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Filtro in policarbonato da 100 nmSTERLITECH1270193
Piastra inferiore trasparente a 96 pozzettiThermoFisher Scientific165305
Lettore multimodale ibrido BioTek Synergy H1MAgilent11-120-533
Creatina fosfatoMillipore Sigma10621714001
Unità scanner confocale CSU-X1YokogawaCSU-X1 
Mezzo di gradiente di densità (Optiprep)Millipore SigmaD1556Opzionale per la commutazione con saccarosio nella soluzione interna
Supporti filtroAvanti610014
Fisherbrand microprovette (1,5 mL)Fisher Scientific05-408-129 
Acido folinico sale di calcio idratoMillipore SigmaF7878
GlucosioMillipore Sigma158968
HEPESMillipore SigmaH3375
iXon X3 camera AndorDU-897E-CS0 
Acido L-glutammico sale di potassio monoidratoMillipore SigmaG1501
Olio minerale leggeroMillipore SigmaM5904
Acetato di magnesio tetraidrato Millipore SigmaM5661
(incluso supporto siringa e supporto estrusore)Avanti610020
Microscopio invertito Olympus IX81Obiettivo per microscopio ad olio OlympusIX21
Olympus PlanApo N 60x Olimpo1-U2B933 
Fonte di polimeroPEO-b-PBDP41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP DNA plasmidicofatto in casaN/A
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) DNA plasmidicofatto in casaN/A
pET28b-WT-GluR0-sfGFPFatto in casaN/A
POPC lipidi in cloroformio Avanti850457C
Cloruro di potassioMillipore SigmaP9541
PUREfrex 2.0Cosmo Bio USAGFK-PF201
Set di soluzioni ribonucleotidicheNew England BioLabsN0450
Inibitore della RNasi, Campionatore di aminoacidi MurineNew England BioLabsM0314S
RTSBiotechrabbitBR1401801
Cloruro di sodioMillipore SigmaS9888
SpermidinaMillipore SigmaS2626
SaccarosioMillipore SigmaS0389
VAPRO Osmometro a pressione di vapore Modello 5600ELITechGroupVAPRO 5600
Kit mini-estrusore

Riferimenti

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