I modelli Lung-on-chip superano le tradizionali colture 2D imitando l'interfaccia aria-liquido e la perfusione delle cellule endoteliali, simulando il flusso sanguigno e lo scambio di nutrienti cruciali per gli studi di fisiologia polmonare. Ciò migliora la rilevanza della ricerca polmonare, offrendo un ambiente dinamico e fisiologicamente accurato per far progredire la comprensione e il trattamento delle infezioni respiratorie.
Articolo metodologico
Modello immunocompetente di alveoli su chip per lo studio delle risposte immunitarie della mucosa alveolare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Introduciamo un modello avanzato immunocompetente lung-on-chip progettato per replicare la struttura e la funzione alveolare umana. Questo modello innovativo impiega un biochip microfluidico-perfuso che supporta un'interfaccia aria-liquido che imita l'ambiente negli alveoli umani. L'ingegneria tissutale viene utilizzata per integrare componenti cellulari chiave, tra cui cellule endoteliali, macrofagi e cellule epiteliali, per creare un modello tissutale rappresentativo dell'alveolo. Il modello facilita esami approfonditi delle risposte immunitarie della mucosa a vari agenti patogeni, tra cui virus, batteri e funghi, migliorando così la nostra comprensione dell'immunità polmonare. L'obiettivo principale di questo protocollo è fornire dettagli per stabilire questo modello di alveolo su chip come una solida piattaforma in vitro per studi sulle infezioni, consentendo ai ricercatori di osservare e analizzare da vicino le complesse interazioni tra i patogeni e il sistema immunitario dell'ospite all'interno dell'ambiente polmonare. Ciò si ottiene attraverso l'applicazione di tecniche basate sulla microfluidica per simulare le condizioni fisiologiche chiave degli alveoli umani, tra cui il flusso sanguigno e la stimolazione biomeccanica delle cellule endoteliali, oltre a mantenere un'interfaccia aria-liquido cruciale per l'esposizione realistica delle cellule epiteliali all'aria. Il sistema modello è compatibile con una serie di test standardizzati, come la colorazione in immunofluorescenza, la profilazione delle citochine e l'analisi delle unità formanti colonie (CFU)/placche, consentendo una visione completa delle dinamiche immunitarie durante l'infezione. L'Alveolus-on-chip è composto da tipi di cellule essenziali, tra cui le cellule epiteliali polmonari distali umane (H441) e le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) separate da membrane porose in polietilene tereftalato (PET), con macrofagi primari derivati da monociti posizionati strategicamente tra gli strati epiteliale ed endoteliale. Il modello tissutale migliora la capacità di sezionare e analizzare i fattori sfumati coinvolti nelle risposte immunitarie polmonari in vitro. Come strumento prezioso, dovrebbe contribuire al progresso della ricerca polmonare, fornendo un modello in vitro più accurato e dinamico per studiare la patogenesi delle infezioni respiratorie e testare potenziali interventi terapeutici.
Introduzione
Il polmone umano ha un ruolo notevole nella respirazione e nella difesa immunitaria, con complesse interazioni tra le risposte immunitarie della mucosa alveolare1. La capacità degli alveoli di creare una risposta immunitaria efficiente è fondamentale per prevenire le infezioni polmonari e garantire la salute polmonare. Poiché i polmoni sono costantemente esposti a un'ampia gamma di potenziali rischi, tra cui batteri, virus, funghi, allergie e particolato, comprendere la complessità delle risposte immunitarie della mucosa alveolare è fondamentale per scoprire i meccanismi alla base delle infezioni respiratorie, dei disturbi infiammatori e del trattamento delle malattie polmonari1.
Per studiare in vitro i processi correlati all'infezione e all'infiammazione delle vie respiratorie, sono necessari modelli in grado di imitare fedelmente l'ambiente alveolare e le risposte immunitarie. Le colture cellulari 2D e i moduli animali sono stati utilizzati per decenni come strumenti essenziali per la ricerca biomedica sulla risposta immunitaria polmonare. Tuttavia, spesso hanno limitazioni nel loro potenziale traslazionale per le situazioni umane. I modelli Lung-on-chip possono contribuire a colmare il divario tra i tradizionali modelli in vitro e in vivo e fornire un nuovo approccio allo studio delle risposte immunitarie specifiche per l'uomo 2,3. I modelli lung-on-chip possono imitare l'interfaccia aria-liquido, necessaria alle cellule polmonari per ricapitolare le condizioni fisiologiche del tratto respiratorio e per sviluppare un modello tissutale più accurato e robusto. Questa tecnica di coltura consente un esame preciso della differenziazione cellulare, del funzionamento e delle risposte ai farmaci o agli stimoli correlati alla malattia in vitro2.
In questo studio, presentiamo un modello basato sulla microfluidica dell'alveolo umano come strumento efficace per ricapitolare l'ambiente alveolare umano applicando la perfusione per imitare il flusso sanguigno e la stimolazione biomeccanica delle cellule endoteliali e incorporando un'interfaccia aria-liquido con cellule epiteliali esposte verso una fase aerea4. Abbiamo sviluppato un alveolo microfluidico perfuso su chip che imita la struttura fisica e le interazioni biologiche dell'alveolo umano, con particolare attenzione all'interfaccia aria-liquido. Questa interfaccia svolge un ruolo cruciale nella differenziazione delle cellule epiteliali respiratorie, essenziale per modellare accuratamente l'ambiente polmonare. Il modello utilizza cellule epiteliali polmonari distali umane (H441) e cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVECs), separate da membrane porose in polietilene tereftalato (PET), con macrofagi primari derivati da monociti posizionati tra gli strati cellulari. Questa configurazione replica l'intricata disposizione cellulare dell'alveolo ed è fondamentale per simulare accuratamente l'interfaccia aria-liquido, che è un fattore significativo nella funzione fisiologica del tessuto polmonare.
Il razionale alla base dello sviluppo del modello si estende all'integrazione delle cellule immunitarie circolanti e residenti nei tessuti. Questo approccio è progettato per imitare accuratamente la risposta infiammatoria dell'ospite alle infezioni respiratorie umane, fornendo un ambiente dinamico per studiare le interazioni patogeno-ospite. La presenza di macrofagi consente l'esame delle risposte immunitarie immediate e della loro interazione con i patogeni, riflettendo la prima linea di difesa contro le infezioni respiratorie. Inoltre, il design della piattaforma di biochip facilita la manipolazione comoda e precisa di segnali biofisici e biochimici, che è fondamentale per replicare la funzione degli alveoli in vitro. Questa flessibilità è fondamentale per sezionare i fattori che contribuiscono alle infezioni umane, consentendo ai ricercatori di regolare le condizioni per riflettere vari stati patologici o di testare potenziali interventi terapeutici. La compatibilità della piattaforma con diverse tecnologie di lettura, tra cui la microscopia avanzata, le analisi microbiologiche e l'analisi biochimica degli effluenti, ne migliora l'utilità. Queste capacità consentono una valutazione completa della risposta tissutale alle infezioni, compresa la valutazione del comportamento cellulare, della proliferazione dei patogeni e dell'efficacia delle risposte immunitarie.
Presentiamo un protocollo dettagliato e tecniche per creare e utilizzare un modello di alveolo umano su chip incentrato sulla replicazione dell'interfaccia aria-liquido e sull'integrazione delle cellule immunitarie per studiare le infezioni umane in vitro.
Protocollo
Le cellule HUVEC sono isolate dal cordone ombelicale e utilizzate fino al passaggio 4. I monociti primari sono isolati da donatori sani da sangue intero. Lo studio è stato approvato dal comitato etico dell'Ospedale universitario di Jena, Jena, Germania (3939-12/13). Secondo la Dichiarazione di Helsinki, tutti gli individui che hanno donato cellule per lo studio hanno dato il loro consenso informato.
1. Giorno 1: Preparazione del biochip
- I biochip sono disponibili in diverse dimensioni e modelli. Per gli esperimenti, utilizzare il modello BC002. Posizionare il biochip in una capsula di Petri di vetro, riempire la capsula e lavare tutte le cavità con etanolo sterile al 70% (EthOH). Incubare per 45 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, sciacquare le cavità 2 volte con ddH2O. Rimuovere il ddH2O.
- Rivestire la membrana del biochip di entrambe le cavità con una soluzione sterile di collagene IV (0,5 mg/mL in acido acetico 0,5 mM; utilizzare una concentrazione di 1:100 nella soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco contenente magnesio e calcio PBS (+/+)) lavando delicatamente la soluzione di collagene IV attraverso entrambe le cavità utilizzando una pipetta da 1.000 μL con punte blu. Incubare per 15 minuti a 37 °C e 5% di CO2.
NOTA: Si consiglia di utilizzare una pipetta da 1.000 μl con puntali con filtro blu (P1000) durante l'intero protocollo. Il diametro dell'apertura della punta del filtro copre completamente l'apertura delle porte che collegano i canali, evitando l'inserimento di bolle d'aria nel chip. - Dopo 30 minuti di incubazione, sciacquare le camere inferiore e superiore 2 volte con PBS sterile (+/+) per eliminare il collagene e l'acido acetico rimanenti.
- Preparare il terreno EC aggiungendo 1:100 (v/v) Penicillina/Streptomicina (10.000 U/mL). Riempire la camera superiore di ciascuna cavità con 250 μL di terreno EC e la camera inferiore con 150 μL di terreno EC.
- Prelevare l'HUVEC da un pallone confluente in T25: lavare con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco senza PBS di magnesio e calcio (-/-), aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,25% + 1 mM di EDTA in PBS (-/-) e incubare per 3 minuti a 37 °C. Arrestare l'attività della tripsina aggiungendo 5 mL di PBS (+/+) + 5% FCS e centrifugare a 350 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) in una provetta conica da 50 mL. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno EC.
- Utilizzare una diluizione seriale 1:10 quando si esegue il conteggio delle cellule. Aggiungere 10 μl di pellet di cella risospesa a 90 μl di terreno cellulare. Combina i campioni con cura. Utilizzare una provetta da microcentrifuga con 10 μL di colorante blu di tripano. Diluire la soluzione cellulare con blu di tripano (1:1) utilizzando i vetrini della camera di conteggio delle cellule. Conteggio manuale delle celle con una camera Neubauer o con un contatore di celle automatizzato. Determinare la conta delle cellule e regolare la concentrazione a 0,4 x 106 cellule per 200 μl.
- Sostituire il terreno cellulare endoteliale nella camera superiore del biochip con 200 μl di terreno EC contenente HUVEC sospesi. Pipettare delicatamente per evitare la formazione di bolle d'aria nei canali o nelle camere. Posizionare la capsula di Petri in vetro con i biochip a 37 °C e 5% di CO2.
2. Giorno 2: Controllo dello strato cellulare
- Il giorno 2, controllare visivamente la confluenza dello strato cellulare HUVEC nella camera superiore. Eseguire lo scambio del fluido nella camera superiore con 300 μL di terreno EC. Pipettare delicatamente per evitare il distacco delle cellule dalla membrana. Esegui lo scambio di media ogni giorno dopo 24 ore. Posizionare la capsula di Petri in vetro con i biochip a 37 °C e 5% di CO2.
3. Giorno 3: Preparazione della camera bassa
- Controllare visivamente la confluenza dello strato di cellule endoteliali. A questo punto, determinare la presenza di uno strato confluente e di una morfologia simile a un ciottolo (Figura 1). Eseguire lo scambio del fluido nella camera superiore con 300 μL di terreno EC.
- Successivamente, preparare la camera inferiore per la semina delle cellule che formano lo strato epiteliale. Lavare delicatamente la camera inferiore con 150 μL di terreno RPMI (aggiungere 1:100 (v/v) Penicillina/Streptomicina (10.000 U/mL), 5% di siero fetale di vacca, 1 μM di desametasone).
- Per la camera inferiore, seminare 0,5 x 106 cellule H441 sospese in 200 μL di terreno RPMI (RPMI) per cavità.
- Raccolta di cellule H441
- Lavare le cellule con 5 ml di PBS (-/-) una volta. Aggiungere 2 mL di tripsina allo 0,25% + 1 mM EDTA in PBS (-/-).
- Incubare le cellule per 5 minuti a 37 °C e 5% di CO2. Il tempo di incubazione varia a seconda della confluenza dello strato. Entro 5-7 minuti, le cellule dovrebbero staccarsi completamente.
- Arrestare l'attività della tripsina con 10 mL di PBS (+/+) + 5% FBS, raccogliere le cellule e centrifugare a 200 x g per 4 min.
- Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante, risospendere il pellet in 1 mL di RPMI e contare.
- Seminare 0,5 x 106 cellule per camera pipettando delicatamente la soluzione cellulare nella camera inferiore. Chiudere tutte le porte e capovolgere il biochip in modo che le cellule possano attaccarsi alla membrana in PET. Tenere il biochip capovolto e incubare per una notte in un incubatore per colture cellulari a 37 °C e 5% di CO2.
4. Giorni 4 - Giorno 7: Mantenimento delle cellule e raccolta dei monociti
- Eseguire lo scambio quotidiano del fluido nella camera superiore e inferiore. Per la camera superiore, eseguire lo scambio del terreno con 300 μL di terreno EC.
- Utilizzare 200 μL di RPMI+ (terreno RPMI più 1:100 (v/v) Penicillina/Streptomicina (10.000 U/mL), 10 ng/mL GM-CSF, 10% siero umano autologo, 1 μM di desametasone) per la camera inferiore. Il giorno 7, lavare la camera inferiore con RPMI+ per preparare la cavità per la semina dei monociti.
- Seme 0,1 x 106 monociti sospesi in 200 μL di RPMI+ nella camera inferiore.
- Raccolta di monociti
- Lavare le cellule con 1 mL di PBS (-/-) e incubare per 7 minuti a 37 °C in PBS (-/-) preriscaldato contenente 4 mg/mL di lidocaina + 5 mM di EDTA a 37 °C e 5% di CO2.
- Raccogliere le cellule e centrifugare a 350 x g per 7 minuti, risospendere le cellule in 1 ml di RPMI+ e contare. Posizionare le porte del biochip rivolte verso il basso in modo che le cellule si attacchino alla membrana.
5. Giorno 8: Perfusione di biochip
- A questo punto, assicurarsi che i biochip siano pronti per essere collegati al flusso e perfusi. Prima di iniziare la perfusione, preparare un'incubatrice vuota e posizionare la pompa peristaltica all'interno.
- Perfusione dei biochip
- Prima di collegare il tubo sterilizzato al biochip, lavare il tubo con 200 μL di PBS (+/+), seguiti da 200 μL di terreno EC. Il tubo ha un diametro interno di 0,5 mm, costituito da lati più lunghi (20 cm) e più corti (12 cm) divisi da due tappi peristaltici della pompa. Metti da parte il tubo e prepara i serbatoi per il fluido.
- Eseguire lo scambio del terreno nella camera superiore e inferiore lavandole con il rispettivo terreno di coltura cellulare appena preparato.
- Inserire il serbatoio sul lato di uscita del biochip e collegare il serbatoio con il tubo all'ingresso del biochip (Figura 2). Collegare il tubo al serbatoio e al biochip in modo che vi sia una perfusione circolare del mezzo tra il serbatoio e il biochip.
- Una volta che tutto è collegato alle porte, riempire il serbatoio con 500 μL di mezzo EC. Collegare il biochip con il tubo su una perfusione con una portata di 21 μL/min (Figura 2). Osservare attentamente durante i primi 15 minuti di perfusione per l'inserimento delle bolle. Eseguire quotidianamente uno scambio medio in entrambe le camere.
6. Giorno 9 - Giorno 11: Stabilire un'interfaccia aria-liquido
- Arrestare la perfusione, svuotare i serbatoi e riempire con il terreno appena preparato sotto un armadietto di sicurezza sterile. Pipettare 500 μl di terreno EC nei serbatoi e lavare delicatamente la camera inferiore con 200 μl di RPMI+. Riavviare la perfusione con una velocità di perfusione di 21 μl/min.
- Interfaccia aria-liquido (ALI)
- Stabilire l'ALI dal giorno 12 fino alla fine dell'esperimento (giorno 14). Durante la coltura di ALI, esporre le cellule epiteliali all'aria.
- Per stabilire la coltura ALI, preparare un nuovo mezzo vascolare EC (aggiungere 1:100 (v/v) Penicillina/Streptomicina (10.000 U/mL), 10 ng/ml di GM-CSF, 20% di siero umano autologo, 1μM di desametasone) per mantenere tutti i tipi di cellule nel chip. A questo punto, il mezzo contiene una concentrazione più elevata di AS (20%).
- Aprire i tappi nella camera inferiore sotto un armadio di sicurezza sterile e assorbire con cura il fluido fino a quando non è visibile una bolla d'aria, come mostrato nella Figura 3. Assicurarsi che l'intero liquido dal canale e dalla camera sia stato rimosso e chiudere accuratamente le porte.
- Riempire i serbatoi con terreno EC (-/-) e continuare la coltura di perfusione con una portata di 21 μl/min. Scambiare il terreno solo nella camera superiore fino al giorno 14 e mantenere le cellule epiteliali nella camera inferiore solo con aria.
7. Giorno 14: Prelievo e analisi dei tessuti
- Scollegare il biochip dal flusso. Scollegare il tubo e controllare al microscopio la confluenza cellulare. A causa dell'aria nella camera inferiore, gli strati cellulari potrebbero apparire sfocati e difficili da visualizzare. A questo punto, il modello è pronto per ulteriori sperimentazioni.
- Fissazione e colorazione di tessuti in biochip
- Lavare le cavità con PBS (+/+) per rimuovere il terreno di coltura cellulare. Pipettare 300 μl di paraformaldeide (PFA) al 4% disciolta in PBS (-/-) nella camera superiore e 200 μl nella camera inferiore e incubare per 10 minuti a RT.
NOTA: Quando si lavora con prodotti chimici di fissaggio come il PFA, utilizzare una cappa aspirante. Raccogliere e smaltire i rifiuti di conseguenza. - Lavare le camere 3 volte con PBS (+/+). Dopo la fissazione, conservare i biochip a 4 °C o utilizzarli direttamente per la colorazione in immunofluorescenza delle cellule.
- Per la permeabilizzazione, pipettare 300 μl di Triton X-100 allo 0,25% in PBS (+/+). Incubare per 30 minuti a RT.
- Dopo l'incubazione, lavare entrambe le camere con PBS (+/+) e pipettare 300 μl di albumina sierica bovina (BSA) al 3% in PBS (+/+) in entrambe le camere. Incubare per 1 ora a RT.
- Nel frattempo, preparare il pannello anticorpale per la colorazione in immunofluorescenza. Per preparare il pannello anticorpale per la colorazione in immunofluorescenza, è stata installata una provetta con una quantità sufficiente di BSA al 3% per diluire gli anticorpi. Utilizzare 50 μL di diluizioni di anticorpi per ciascuna membrana. Utilizzare un rapporto di diluizione di 1:100 per i pannelli di anticorpi primari e di 1:200 per i pannelli di anticorpi secondari. Inoltre, per il pannello degli anticorpi secondari, preparare DAPI con un rapporto di diluizione di 1:2.000. Per gli anticorpi corrispondenti, vedere (Tabella 1).
- Per accedere direttamente alle cellule all'interno del biochip, la lamina di legame deve essere rimossa. Per aprire le camere microfluidiche, eseguire un taglio preciso all'esterno della cavità e rimuovere la lamina di legame. Tagliare la membrana rimuovendo i bordi sigillati al biochip con il bisturi.
NOTA: Lavorare in modo preciso e accurato durante questa fase per evitare danni alla membrana e lesioni dovute all'affilatura del bisturi. - Dopo aver staccato la membrana dal biochip, dividere la membrana in due pezzi. Raccogliere i pezzi di membrana con una pinzetta e posizionarli su un vetrino microscopico per la colorazione.
- Pipettare 50 μl di soluzione anticorpale per pezzo di membrana. Incubare per una notte a 4 °C, al riparo dalla luce.
- Dopo l'incubazione, immergere la membrana in 500 μL di PBS (-/-) in una piastra a 24 pozzetti e lavare la membrana 3 volte per 5 minuti ciascuna in PBS (+/+). Dopo il lavaggio, pipettare 50 μL di soluzione di anticorpi secondari e incubare per 1 ora a RT al riparo dalla luce.
- Lavare la membrana con PBS (+/+) 3 volte per 5 min ciascuna. Nel frattempo, preparare ed etichettare i vetrini microscopici per l'esperimento. Posizionare una goccia di mezzo di montaggio sul vetrino e posizionare la membrana corrispondente. Ripetere questo passaggio per tutte le membrane. Alla fine, posizionare un'altra goccia del mezzo di montaggio sulla parte superiore della membrana e utilizzare un vetro di copertura. Conservare a 4 °C.
- Lavare le cavità con PBS (+/+) per rimuovere il terreno di coltura cellulare. Pipettare 300 μl di paraformaldeide (PFA) al 4% disciolta in PBS (-/-) nella camera superiore e 200 μl nella camera inferiore e incubare per 10 minuti a RT.
Risultati
Un esame delle alterazioni morfologiche e dell'espressione di proteine marcatrici potrebbe essere eseguito utilizzando la colorazione in immunofluorescenza. Dopo la co-coltura per 14 giorni, i lati vascolare ed epiteliale vengono analizzati per l'espressione dei rispettivi marcatori cellulari. Questo metodo è utile per studiare le interazioni e l'integrità delle componenti vascolari ed epiteliali, che è essenziale per la modellazione della malattia come lettura biologica funzionale correlata all'infezione. La colorazione in immunofluorescenza potrebbe essere supportata dalla quantificazione dell'analisi, dalla valutazione morfologica e dai saggi funzionali, tra cui il rilascio di citochine, l'analisi degli effluenti dei marcatori di morte cellulare come il rilascio di LDH e il cambiamento nella morfometria delle cellule5. Dal punto di vista vascolare, l'integrità e la morfologia delle proteine della giunzione delle cellule endoteliali, come la VE-caderina, possono essere studiate per valutare la confluenza e la formazione della barriera endoteliale6 (Figura 4A). Dopo la perfusione, lo strato di cellule endoteliali deve essere confluente con un'espressione chiaramente strutturata di VE-caderina ai bordi delle cellule endoteliali. La parte inferiore della membrana può essere immunocolorata per marcatori epiteliali come l'E-caderina e la proteina A del tensioattivo (SP-A)7. L'espressione di SP-A, un componente chiave del tensioattivo polmonare e una complessa miscela di lipidi e proteine, riduce la tensione superficiale all'interfaccia aria-liquido epiteliale e quindi previene in vivo il collasso degli alveoli durante l'espirazione e il mantenimento della corretta funzione polmonare e dello scambio gassoso 6,8. Nel nostro modello, le cellule epiteliali esprimono SP-A dopo il trattamento con ALI e possono essere visualizzate mediante colorazione in immunofluorescenza (Figura 4B). La confluenza e l'integrità dello strato di cellule epiteliali possono essere confermate dalla colorazione in immunofluorescenza per la E-caderina, un importante marcatore giunzionale epiteliale delle cellule epiteliali alveolari (Figura 4C). La presenza di macrofagi può essere confermata dalla colorazione in immunofluorescenza per la proteina produttrice di macrofagi CD686 (Figura 4C). Per studiare l'infezione virale, batterica o fungina, si prega di trovare i dettagli sui modelli di infezione forniti in Deinhardt-Emmer et al.6, Schicke et al.7 e Hoang et al.9.
Figura 1: Immagine rappresentativa di uno strato confluente di HUVECs nel biochip il giorno 3. L'immagine mostra la microscopia in campo chiaro con ingrandimento 10x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Configurazione per l'induzione dell'alveolo su chip e dell'ALI. (A) Immagine rappresentativa della configurazione di perfusione per il modello alveolo-on-chip e (B) un'immagine rappresentativa dell'induzione di un ALI nella camera assorbendo il mezzo e introducendo aria nelle cellule. La formazione di una bolla d'aria all'interno della camera indica che le celle sono esposte all'aria. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Panoramica schematica dell'alveolo su chip. Un protocollo dettagliato per 14 giorni di coltura indica passaggi importanti per la semina e la crescita delle cellule all'interno del biochip. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Colorazione in immunofluorescenza degli strati cellulari endoteliali ed epiteliali. (A) Cellule endoteliali HUVEC che esprimono VE-caderina (arancione), (B-C) Cellule epiteliali H441 che esprimono (B) SP-A (rosso) e (C) E-caderina (arancione), SP-A (rosso) e CD68 (verde) sul lato epiteliale. DAPI (blu) colora il DNA e indica i nuclei cellulari. La barra della scala rappresenta 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Cavità | Cellule |
| Cavità superiore | Endoteliale (0,4 x 106) |
| Cavità inferiore | Epiteliale (0,5x10,6H441+, 1x10,5 monociti) |
Tabella 1: Panoramica della semina cellulare nel biochip.
Discussione
Il modello alveolo-on-chip rappresenta un modello tissutale multistrato dell'alveolo umano, che integra tipi cellulari essenziali del tratto respiratorio inferiore, comprese le cellule epiteliali polmonari, le cellule endoteliali e i macrofagi, coltivate in una disposizione organotipica in un ALI con media perfusione del rivestimento endoteliale. Cellule di diversi strati esprimono specifiche proteine marcatrici cellulari come la E-caderina, una molecola di adesione calcio-dipendente delle cellule epiteliali polmonari, che è centrale nella creazione di barriere epiteliali intercellulari 5,10. L'E-caderina costituisce un elemento di barriera fisica e controlla la risposta immunologica agli agenti patogeni e alle sostanze nocive nell'ambiente10,11. Le cellule epiteliali H441 esprimono ulteriormente la proteina A del tensioattivo, che è anche cruciale nella prima linea di difesa dell'ospite contro le infezioni, mediando l'attività immunomodulante e antibatterica8. L'integrazione di cellule immunitarie nel modello alveolare aumenta la sua complessità cellulare, replicando così meglio la risposta immunitaria ai fattori scatenanti dell'infiammazione, cioè durante l'infezione. In questo contesto, il modello è stato utilizzato per studiare la co-infezione del virus dell'influenza A e del patogeno opportunistico umano Staphylococcus aureus (S. aureus)5. Nello studio, è stato rivelato un meccanismo di co-infezione nella polmonite in cui l'infezione virale delle cellule epiteliali innesca una risposta infiammatoria significativa, che provoca un danno considerevole alle cellule endoteliali, portando a una perdita della funzione di barriera. In un altro studio, il modello è stato utilizzato per dimostrare che l'infezione da S. aureus riduce i livelli extracellulari della proteina tensioattivo-A (SP-A), un componente cruciale della difesa immunitaria nei polmoni, probabilmente a causa delle proteasi batteriche6. Sebbene l'espressione di SP-A non sia direttamente influenzata da S. aureus o dal virus dell'influenza A, è significativamente sottoregolata dal TNF-α, una citochina altamente prodotta in risposta alle infezioni batteriche, specialmente in presenza di macrofagi. Questi risultati suggeriscono che le mono- e super-infezioni batteriche possono abbassare i livelli di SP-A nel polmone, peggiorando potenzialmente l'esito della polmonite batterica6. Inoltre, il modello alveolare è stato utilizzato per studiare l'infezione fungina dell'alveolo con Aspergillus fumigatus e l'efficacia dei farmaci antifungini sfruttando la microscopia ad alta risoluzione e l'analisi delle immagini basata su algoritmi in combinazione con saggi biologici molecolari, tra cui la colorazione in immunofluorescenza e la profilazione delle citochine7. La modellazione dell'aspergillosi polmonare invasiva nell'alveolo su chip ha rivelato funzioni chiave dei macrofagi umani che potrebbero inibire parzialmente la crescita del fungo. I macrofagi erano centrali nel rilascio di citochine e chemochine proinfiammatorie, che erano correlate con un aumento del numero di ife fungine invasive. Inoltre, lo studio ha confermato che il farmaco fungistatico caspofungin limita efficacemente la crescita fungina e induce cambiamenti morfologici nella struttura fungina, in linea con i risultati di altri studi. Questi studi confermano il potenziale della piattaforma modello per identificare bersagli cellulari di infezione e testare farmaci a concentrazioni clinicamente rilevanti.
Ci sono diversi aspetti che devono essere considerati durante la creazione dell'alveolo su chip. Una semina cellulare precisa è fondamentale per ottenere una distribuzione cellulare uniforme e la formazione degli strati. Assicurati che le cellule siano seminate alla densità appropriata per ottenere la confluenza senza crescere eccessivamente l'una con l'altra, che potrebbe compromettere l'integrità e la funzionalità degli strati cellulari. Durante il processo di costituzione dell'ALI, rimuovere con cautela il fluido dal lato apicale e chiudere le porte per evitare la contaminazione. Il mantenimento di condizioni ottimali di co-coltura, come la temperatura, i livelli di CO2 e la composizione del terreno, è fondamentale per la sopravvivenza e l'interazione delle cellule endoteliali ed epiteliali. Eseguire sempre con attenzione le sostituzioni del fluido per evitare di disturbare gli strati cellulari o introdurre bolle d'aria. Pipettare delicatamente e assicurarsi che tutte le apparecchiature utilizzate siano sterili per ridurre al minimo il rischio di contaminazione. Per evitare la formazione di bolle d'aria, pipettare lentamente e inclinare il chip durante i cambi di fluido per consentire la fuoriuscita delle bolle. Lavora in un ambiente pulito, sterile e controllato per ridurre al minimo la contaminazione. Considerare la complessità e la precisione necessarie per stabilire e mantenere il modello 3D per i successivi esperimenti con il modello. Se gli strati cellulari non si formano correttamente, prendere in considerazione l'ottimizzazione della densità cellulare e dei lotti cellulari, poiché possono verificarsi differenze nella crescita cellulare a seconda del donatore e del lotto.
Sebbene il modello offra miglioramenti significativi rispetto ai metodi esistenti, è anche essenziale riconoscere che è necessario considerare alcune limitazioni. Una di queste limitazioni è la complessità e il costo associati al funzionamento del dispositivo microfluidico. L'esecuzione di modelli organ-on-chip richiede attrezzature specializzate e competenze in microfluidica per adottare il modello alveolo-on-chip. Inoltre, mentre questo modello può replicare con successo molte delle caratteristiche chiave dell'ambiente alveolare, non può replicare completamente tutte le interazioni cellulari e le forze meccaniche presenti in vivo. Ad esempio, il modello non dispone di un sistema immunitario completo o dell'intera gamma di tipi di cellule nel polmone umano, il che potrebbe influire sull'accuratezza degli studi di interazione patogeno-ospite.
Nonostante queste limitazioni, il modello lung-on-chip offre progressi rispetto alle tradizionali colture cellulari 2D come i sistemi Transwell. Incorporando un'interfaccia aria-liquido, cellule endoteliali ed epiteliali e componenti immunitarie in un tessuto multistrato all'interno di un ambiente dinamico e perfuso, il modello rappresenta un approccio fisiologicamente più rilevante per lo studio della fisiologia polmonare, della malattia e delle risposte al trattamento in vitro. Questo è fondamentale per far progredire la nostra comprensione delle infezioni respiratorie umane e sviluppare terapie più efficaci. La capacità del modello di manipolare con precisione i segnali biofisici e biochimici rappresenta una caratteristica importante per sezionare i meccanismi di progressione della malattia e l'azione dei farmaci. L'uso di materiale cellulare umano può ridurre ulteriormente le differenze tra le specie osservate negli esperimenti sugli animali. L'integrazione di più analisi di biomarcatori migliora ulteriormente la profondità e l'ampiezza dei dati ottenibili da un singolo esperimento, contribuendo a ridurre i costi della sperimentazione in vitro. Pur riconoscendo i suoi limiti, il modello lung-on-chip rappresenta un significativo passo avanti nella ricerca sulle malattie respiratorie, offrendo un'alternativa più accurata, etica ed efficiente ai metodi tradizionali.
Dichiarazioni
K.R. è CEO di Dynamic42 GmbH e detiene il capitale della società. A.S.M. è consulente scientifico di Dynamic 42 GmbH e detiene il capitale della società. Tutti gli altri autori non hanno conflitti di interesse.
Ringraziamenti
H.K. e A.S.M. riconoscono il finanziamento del Leibniz Science-Campus InfectoOptics Jena, finanziato dalla linea di finanziamento Strategic Networking dell'Associazione Leibniz. M.A. e A.S.M. sono stati sostenuti dal progetto IGF IMPROVE finanziato dal Ministero Federale per gli Affari Economici e l'Energia sulla base di una risoluzione del Bundestag tedesco. A.S.M riconosce inoltre il sostegno finanziario del Cluster of Excellence Balance of the Microverse nell'ambito della Strategia di Eccellenza della Germania - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiali di consumo | |||
| Vetrini per camera di conteggio cellulare (Countess) | Invitrogen | C10283 | |
| Piastre multipozzetto per colture cellulari, 24 pozzetti, sterili | Greiner Bio-One | 662 160 | |
| Piastre multipozzetto per colture cellulari, 6 pozzetti, steril | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| Vetrini coprioggetti (24x40mm; #1.5) | Menzel-Glä ser | 15747592 | |
| Salviette ecologiche | Dr. Schuhmacher | 00-915-REW10003-01 | |
| Eppies 2.0 | Sarstedt | 72.691 | |
| Eppis 0.5 | Sarstedt | 72.699 | |
| Eppis 1.5 | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Falcons 15mL | Greiner Bio-One | 188 271-TRI | |
| Falcons 50mL | Greiner Bio-One | 227 261-TRI | |
| Tampone di garza | Noba | PZN 2417767 | |
| Guanti Nitril 3000 | Meditrade | 1280 | |
| Vetrini per microscopio | Menzel-Glä ser | AAAA000001##12E | |
| Piastre multipozzetto 24 pozzetti, sterili | Greiner Bio-One | 662 160 | |
| Pipette Pasteur (vetro) 150mm | Assistent | 40567001 | |
| Pipette Pasteur (vetro) 230mm | Assistent | 40567002 | |
| Provette a fondo tondo (PS, 5mL) | Falcon | 352052 | |
| Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm | Sarstedt | 85.1637.235 | |
| Bisturi | Dahlhausen | 11.000.00.715 | |
| Pipette sierologiche 10mL | Greiner Bio-One | 607 160-TRI | |
| Pipette sierologiche 25mL | Greiner Bio-One | 760 160-TRI | |
| Pipette sierologiche 2mL | Greiner Bio-One | 710 160-TRI | |
| Pipette sierologiche 50mL | Greiner Bio-One | 768 160-TRI | |
| Pipette sierologiche 5mL | Greiner Bio-One | 606 160-TRI | |
| S-Monovette, 7,5ml Z-Gel | Sarstedt | 1.1602 | |
| S-Monovette, 9,0ml K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | |
| Softasept N | Braun | 3887138 | |
| T25 pallone | Greiner | Bio-One 690 960 | |
| Puntali sterili 10µ L | Greiner Bio-One | 771 261 | |
| Puntali sterili 1250µ L | Greiner Bio-One | 750 261 | |
| Puntali sterili 300µ L | Greiner Bio-One | 738 261 | |
| Puntali non sterili 10µ L | Greiner Bio-One | 765 290 | |
| Puntali non sterili 1000µ L | Greiner Bio-One | 739 291 | |
| Puntali non sterili 200µ L | Greiner Bio-One | 686 290 | |
| Pinzette (Prä zisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | |
| Chemicals | |||
| Descosept AF | Dr. Schuhmacher | N-20338 | |
| Etanolo 96% | Nordbrand-Nordhausen | 410 | |
| Isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano (3-5kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Terreno di montaggio fluorescente | Dako | S3023 | |
| Metanolo | VWR | 20847.295 | |
| Saponina | Fluka | 47036 | |
| Tergazyme | Alconox | 1304-1 | |
| Coltura cellulare | |||
| Collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533-5MG | |
| Dexametason | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DPBS (-/-) | Lonza | BE17-516F | |
| DPBS (+/+) | Lonza | BE17-513F | |
| Soluzione EDTA | Sigma-Aldrich | E788S | |
| Terreno di crescita delle cellule endoteliali | Promocell | C-22020 | |
| Mix di integratori di terreno per la crescita delle cellule endoteliali | Promocell | C-39225 | |
| Fetale Siero Bovino | Sigma-Aldrich | E2129-10g | |
| H441 | ATCC | ||
| Ricombinante umano GM-CSF | Peprotech | 300-30 | |
| Lidocaina | Sigma-Aldrich | L5647-15G | |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15140-122 /-163 | |
| RPMI | Gibco | ||
| Colorazione blu Trypane 0,4% | Invitrogen | T10282 | |
| Tripsina | Gibco | 15090-046 | |
| Anticorpi primari | |||
| Caderina-5 / VE-Caderina (capra) | BD | 610252 | |
| CD68 (coniglio) | CellSignaling | 76437 | |
| E-Caderina (capra) | R& D | AF748 | |
| SP-A (topo) | Abcam | ab51891 | |
| Anticorpi secondari | |||
| AF488 (asino anti topo) | Invitrogen | R37114 | |
| AF647 (asino anti topo) | invitrogen | A31571 | |
| AF647 (asino anti coniglio) | Invitrogen | A31573 | |
| Cy3 (asino anti capra) | jackson research | 705-165-147 | |
| Microfluidic | |||
| Chip | Dynamic 42 | BC002 | |
| Maschio Luer Lock (piccolo) | ChipShop | 09-0503-0270-09 | |
| Maschio mini luer plugs, fila di quattro, PP, verde | Microfluidic chipshop | 09-0558-0336-11 | |
| Tappi mini luer maschio, fila di quattro, PP, opaco | Microfluidic chipshop | 09-0556-0336-09 | |
| Tappi mini luer maschio, fila di quattro, PP, rosso | Microfluidic chipshop | 09-0557-0336-10 | |
| Tappi | Cole Parmer | GZ-45555-56 | |
| Serbatoio 4,5 ml | ChipShop | 16-0613-0233-09 | |
| Tubo | dinamico 42 | ST001 | |
| Equipment | |||
| Autoclave | Centrifuga Tuttnauer | 5075 ELV | |
| Incubatore | CO2 Eppendorf | 5424 | |
| Heracell | 150i | ||
| Contatore di cellule automatizzato Countess | Invitrogen | C10227 | |
| Citometro a flusso | BD | FACS Canto II | |
| Congelatore (-20 ° C) | Congelatore Liebherr | LCexv 4010 | |
| (-80 ° C) | Heraeus | Herafreeze HFU 686 | |
| Frigorifero | Liebherr | LCexv 4010 | |
| Heraeus Multifuge | Thermo Scientific | X3R | |
| Microscopio | Leica | DM IL LED | |
| Agitatore orbitale | Heidolph | Reax2000 | |
| Pompa peristaltica | REGLO Digital MS-4/12 | ISM597D | |
| Pipette 10µ L | Eppendorf Research plus | 3123000020 | |
| Pipette 100µ L | Eppendorf Research plus | 3123000047 | |
| Pipette 1000µ L | Eppendorf Research plus | 3123000063 | |
| Pipette 2,5µ L | Eppendorf Research plus | 3123000012 | |
| Pipette 20µ L | Eppendorf Research plus | 3123000039 | |
| Pipette 200µ L | Eppendorf Research plus | 3123000055 | |
| Scala | Sartorius | 6101 | |
| Scala | Sartorius | TE1245 | |
| Banco sterile | Kojair | Biowizard SL-130 | |
| Bagno d'acqua | Julabo | SW-20C | |
| Fluorescence Microscopio Configurazione | |||
| Apotome.2 | Zeiss Dispositivo di | ||
| illuminazione | Zeiss | HXP 120 C | |
| Microscopio | Zeiss | Axio Observer 5 | |
| Sezionamento ottico | Zeiss | ApoTome | |
| Alimentatore Microscopio | Zeiss | Eplax Vp232 | |
| Software | |||
| ZEN | Zeiss |
Riferimenti
- Mettelman, R. C., Allen, E. K., Thomas, P. G. Mucosal immune responses to infection and vaccination in the respiratory tract. Immunity. 55 (5), 749-780 (2022).
- Artzy-Schnirman, A., et al. Advanced in vitro lung-on-chip platforms for inhalation assays: From prospect to pipeline. Eur J Pharma Biopharma. 144, 11-17 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nat Meth. 13 (2), 151-157 (2016).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. A multi-organ chip with matured tissue niches linked by vascular flow. Nat Biomed Eng. 6 (4), 351(2022).
- Deinhardt-Emmer, S., et al. Co-infection with staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model. Biofabrication. 12 (2), 025012(2020).
- Schicke, E., et al. Staphylococcus aureus lung infection results in down-regulation of surfactant protein-a mainly caused by pro-inflammatory macrophages. Microorganisms. 8 (4), 577(2020).
- King, S. D., Chen, S. Y. Recent progress on surfactant protein a: Cellular function in lung and kidney disease development. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (2), C316-C320 (2020).
- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420(2022).
- Yuksel, H., Ocalan, M., Yilmaz, O. E-cadherin: An important functional molecule at respiratory barrier between defence and dysfunction. Front Physiol. 12, 720227(2021).
- Van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule e-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).
Ristampe e permessi
