Articolo metodologico

Crescita del biofilm micobatterico come modello per studiare la resistenza antimicrobica

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DOI:

10.3791/66607

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12 luglio 2024

 , 
1Department of Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo robusto per lo sviluppo di biofilm a pellicola. Il metodo è scalabile a diversi volumi di coltura, consentendo una facile adozione per vari obiettivi sperimentali. La progettazione del metodo consente una valutazione qualitativa o quantitativa del potenziale di formazione del biofilm di diverse specie di micobatteri.

Abstract

Molti batteri prosperano in intricate comunità naturali, esibendo attributi chiave della multicellularità come la comunicazione, la cooperazione e la competizione. La manifestazione più diffusa del comportamento multicellulare batterico è la formazione di biofilm, spesso legati alla patogenicità. I biofilm offrono un rifugio contro gli agenti antimicrobici, favorendo l'emergere della resistenza antimicrobica. La pratica convenzionale di coltivare batteri in colture liquide di palloni non riesce a rappresentare la loro corretta crescita fisiologica in natura, limitando di conseguenza la nostra comprensione delle loro intricate dinamiche. In particolare, i profili metabolici e trascrizionali dei batteri che risiedono nei biofilm assomigliano molto a quelli delle cellule in crescita naturale. Questo parallelismo sottolinea l'importanza dei biofilm come modello ideale per la ricerca di base e traslazionale. Questo articolo si concentra sull'utilizzo di Mycobacterium smegmatis come organismo modello per illustrare una tecnica per la coltivazione di biofilm a pellicola. L'approccio è adattabile a vari volumi di coltura, facilitandone l'implementazione per diversi obiettivi sperimentali come gli studi antimicrobici. Inoltre, la progettazione del metodo consente la valutazione qualitativa o quantitativa delle capacità di formazione del biofilm di diverse specie di micobatteri con piccoli aggiustamenti.

Introduzione

I batteri sono in grado di sopravvivere come entità unicellulari; Tuttavia, nella maggior parte delle condizioni fisiologicamente rilevanti, si organizzano in mimetici di comunità. Il biofilm è un'organizzazione comunitaria ampiamente riconosciuta di batteri formati da cellule aggregate racchiuse in una matrice autoprodotta1. Tale assemblaggio possiede firme di multicellularità precoce e fornisce una maggiore resilienza allo stress ai sistemi batterici. I biofilm sono spesso tolleranti agli antimicrobici e si stima che siano responsabili di quasi l'80% delle infezioni microbiche 2,3.

Le colture a base di fiasche e piastre sono state tradizionalmente le pratiche abituali per la coltura batterica. La loro enorme accettabilità e successo possono essere attribuiti alla loro facilità di gestione, riproducibilità e scalabilità. Tuttavia, la mancanza di un contesto fisiologico limita il potenziale traduttivo della conoscenza generata utilizzando tali sistemi4. Pertanto, i biofilm stanno diventando un sistema modello attraente per studiare la fisiopatologia batterica. I biofilm forniscono un sistema di modelli dinamico, che rispecchia da vicino le condizioni naturali, consentendo ai ricercatori di replicare aspetti fisiologici come i gradienti di nutrienti e l'eterogeneità spaziale 5,6.

Lo stile di vita del biofilm è particolarmente pertinente negli studi sui micobatteri, poiché i micobatteri, incluso il famigerato Mycobacterium tuberculosis, sono abili formatori di biofilm7. La loro capacità di prosperare all'interno dei biofilm contribuisce alla loro persistenza nei tessuti dell'ospite durante le infezioni. Rappresenta una sfida formidabile nel trattamento delle malattie micobatteriche, data l'intrinseca resistenza agli antibiotici associata agli stili di vita del biofilm8. I biofilm forniscono anche un sistema modello ideale per studiare il metabolismo micobatterico, in quanto consentono di studiare gli adattamenti metabolici unici e le strategie di utilizzo dei nutrienti impiegate dai micobatteri all'interno di comunità microbiche complesse9.

Mentre il biofilm è sempre più accettato come un sistema modello migliore per gli studi sui micobatteri10, c'è bisogno di procedure operative standard coerenti e riproducibili, soprattutto per tracciare parallelismi tra gli studi condotti in diversi laboratori. Il metodo qui descritto descrive le procedure di formazione del biofilm per una specie micobatterica, M. smegmatis. M. smegmatis è un modello più accessibile per lo studio dei biofilm micobatterici, data la sua non patogenicità e la cinetica di formazione del biofilm più rapida. Il metodo può essere modificato per adattarsi ad applicazioni come lo screening antimicobatterico, l'estrazione di metaboliti e gli studi omici.

Protocollo

I dettagli di tutti i reagenti e le attrezzature utilizzate per lo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. La preparazione dei media di Sauton

  1. Preparare 50 mL di soluzione di diidrogeno fosfato di potassio al 2,5% pesando attentamente 1,25 g di diidrogeno fosfato di potassio e sciogliendolo in 50 mL di acqua deionizzata.
  2. Preparare 50 ml di soluzione di solfato di magnesio al 2,5% pesando 2,56 g di solfato di magnesio e sciogliendoli in 50 ml di acqua deionizzata.
  3. Preparare 10 mL di soluzione di citrato di ammonio ferrico al 5% pesando 0,5 g di citrato di ammonio ferrico e sciogliendolo in 10 mL di acqua deionizzata. Conservalo in un tubo d'ambra.
  4. Preparare 100 mL di soluzione di glucosio al 20% pesando 20 g di glucosio e sciogliendoli in 100 mL di acqua deionizzata. Filtrare-sterilizzare utilizzando una siringa sterile da 50 mL e un filtro per siringa in PVDF da 0,2 μM in una provetta.
  5. Preparare 10 mL di soluzione sterile di solfato di zinco all'1% pesando attentamente 0,1 g di solfato di zinco e sciogliendolo in 10 mL di acqua deionizzata. Sterilizzare con filtro utilizzando una siringa sterile da 10 ml e un filtro per siringa in PVDF da 0,2 μM nella cappa laminare.
  6. Miscelare i componenti preparati in 750 mL di acqua deionizzata come descritto nella Tabella 1. Misurare il pH della soluzione e regolarlo a 7. Portare il volume a 900 ml con acqua deionizzata.
  7. Autoclavare il fluido a 15 PSI e 121 °C per 15-20 minuti. Lasciate raffreddare. Quindi, aggiungere 100 μl di solfato di zinco all'1% sterilizzato con filtro. Aggiungere 100 ml di glucosio al 20% sterilizzato con filtro e scioglierlo bene.

2. Preparazione di filtro sterilizzato al 5% Tween-80

  1. Sciogliere 0,5 mL di Tween-80 in 9,5 mL di acqua deionizzata.
  2. Sterilizzare la soluzione con filtro utilizzando una siringa sterile da 10 ml e un filtro per siringa in PVDF da 0,2 μM nella cappa laminare.

3. Preparazione della coltura primaria

  1. Nella cappa laminare, utilizzare una pipetta sierologica per erogare 2 mL di terreno LB autoclavato in due provette sterili da 14 mL.
  2. Aggiungere 20 μl di Tween-80 al 5% sterilizzato con filtro alle provette utilizzando una micropipetta.
  3. Inoculare M. smegmatis in una delle provette aggiungendo il suo crio-stock utilizzando un ciclo di inoculazione. L'altra provetta funge da controllo del fluido.
  4. Incubare le provette per 48 ore in un incubatore con agitatore a 300 giri/min e 37 °C.
    NOTA: Il tubo di controllo del supporto non deve mostrare alcuna crescita.

4. Preparazione della coltura secondaria

  1. Nella cappa laminare, utilizzare una pipetta sierologica per erogare 2 mL di terreno LB autoclavato in due provette sterili da 14 mL.
  2. Aggiungere 20 μl di Tween-80 al 5% sterilizzato con filtro alle provette utilizzando una micropipetta.
  3. Aggiungere 20 μl della coltura primaria a una delle provette utilizzando una micropipetta. Tenete l'altro tubo come controllo multimediale.
  4. Incubare le colture in un incubatore shaker a 300 giri/min e 37 °C fino a raggiungere un OD600 compreso tra 0,6 e 0,8.
    NOTA: In genere sono necessarie dalle 12 alle 14 ore per raggiungere un OD600 compreso tra 0,6 e 0,8. Possono essere utilizzate anche altre densità cellulari, ma un valore OD600 definito aiuta con gli studi comparativi.

5. Impostazione del biofilm

  1. Nella cappa laminare, erogare 6 mL di terreno di Sauton integrato con glucosio al 2% in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti utilizzando una pipetta sierologica.
  2. Inoculare i rispettivi pozzetti con 120 μl (cioè il 2%) di inoculo secondario utilizzando una micropipetta. Tenerne uno non inoculato bene come un controllo dei media.
  3. Miscelare il terreno e la coltura pipettando su e giù con una micropipetta da 1 ml. Coprire il coperchio e sigillare accuratamente il piatto con pellicola di paraffina.
  4. Incubare la piastra indisturbata in un'incubatrice statica a 37 °C per 7 giorni.

6. Impostazione di biofilm per osservazioni specifiche dello stadio

NOTA: La configurazione generale del biofilm è la stessa descritta al punto 5. Per raccogliere o visualizzare il biofilm in momenti diversi, si suggerisce di impostare lo stesso biofilm in più set su piastre separate.

  1. Per osservare i biofilm tra il giorno 3 e il giorno 6, preparare quattro piastre con condizioni identiche e utilizzare una piastra al giorno per l'imaging.
    NOTA: Lo strato di biofilm inizia ad apparire sull'interfaccia aria-mezzo a partire dal terzo giorno di configurazione della piastra.

7. Stima dello sviluppo del biofilm

  1. Stima visiva
    1. Visualizzare le lastre utilizzando un sistema di documentazione su gel con illuminazione a luce bianca epi (Figura 1).
      NOTA: L'imaging fornisce una stima qualitativa e quantitativa lorda del biofilm formato. In alternativa è possibile utilizzare qualsiasi fotocamera di buona qualità.
  2. Stima del peso a secco
    1. Eseguire la misurazione del peso secco per una quantificazione più precisa.
    2. Per misurare il peso secco, inizia pesando una carta assorbente.
      NOTA: La carta da filtro può essere utilizzata anche al posto della carta assorbente.
    3. Estrarre il biofilm dalla piastra a 6 pozzetti e trasferirlo sulla carta utilizzando una spatola.
    4. Raccogli con cura la maggior parte del biofilm dalla coltura, facendo attenzione a non trasferire quantità eccessive di terreno sulla carta.
    5. Posizionare il biofilm sulla carta assorbente.
    6. Metterlo in un incubatore a 50 °C per 0,5-1 h fino a quando il biofilm non si asciuga completamente.
    7. Misurare il peso combinato della carta e del biofilm.
      NOTA: Peso a secco del biofilm = (Peso del biofilm + carta) - (Peso della carta)

8. Saggio di tolleranza agli antibiotici nei biofilm

  1. Stimare la MIC90 della rifampicina nella coltura planctonica di M. smegmatis seguendo il protocollo descritto da Irith Wiegand et al. utilizzando il terreno di Sauton11. Aggiungere l'antibiotico quando le colture raggiungono un OD600 di 0,2.
  2. Impostare le piastre per la crescita del biofilm come descritto nella fase 5 del protocollo.
  3. Il quarto giorno di incubazione, aggiungere rifampicina alle colture alla concentrazione di MIC90 (64 μg/mL) dai lati del pozzetto utilizzando una micropipetta nella cappa laminare.
    NOTA: Fallo con attenzione senza disturbare troppo il biofilm. Lasciare uno dei pozzetti con biofilm non trattato.
  4. Agitare lentamente le piastre per mescolare gli antibiotici.
  5. Copri i lati delle piastre con pellicola di paraffina e tienile nell'incubatrice per un'ulteriore crescita.
  6. Dopo 24 h, rimuovere le piastre dalla cappa laminare e aggiungere Tween-80 ad una concentrazione finale dello 0,2% in tutti i pozzetti contenenti biofilm.
  7. Ancora una volta, coprire le piastre con pellicola di paraffina e mantenerle a 4 °C e 100 giri/min per 12 h.
  8. Estrarre le piastre in una cappa laminare e omogeneizzare i componenti con una micropipetta da 1 mL.
  9. Lavare i componenti con il terreno di Sauton utilizzando il protocollo descritto in Anand et al.12.
  10. Infine, risospendere le cellule in 6 mL di terreno di Sauton e diluirle alle concentrazioni finali di 10-4, 10-5, 10-6 e 10-7.
  11. Distribuire 100 μl di ciascuna diluizione su piastre LB-agar utilizzando perle di vetro autoclavate.
  12. Sigillare tutte le piastre con pellicola di paraffina e conservarle in un'incubatrice a 37 °C.
  13. Dopo 3 giorni di incubazione, contare le colonie su ogni piastra. Considera solo le piastre con un numero di colonie compreso tra 30 e 300.
  14. Calcolare CFU/mL e la relativa diminuzione di CFU/mL utilizzando le formule fornite13.
    NOTA: CFU/mL = (N. di colonie × fattore di diluizione) / (Volume placcato (in mL))
    Diminuzione relativa di CFU/mL = ((CFU/mL in Non Trattato - CFU/mL in Trattato)) / ((CFU/mL in Non Trattato)) × 100

Risultati

Le pellicole di biofilm diventano visibili ad occhio nudo a partire dal terzo giorno. Sebbene il biofilm cresca sui terreni di Sauton senza il 2% di glucosio, è stato osservato un miglioramento nella reticolazione quando è stato aggiunto. Abbiamo ottenuto 10,48 mg ± 3,13 mg (n = 4) di peso secco del biofilm da ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con 1,5 mL di terreno di Sauton (integrato con glucosio al 2%) coltivato per quattro giorni. Nella Figura 2, lo sviluppo del biofilm era visibile dal giorno 3 al giorno 6. Inizia a formare un film con una leggera reticolazione il giorno 3 e al giorno 5 è completamente maturo. Dal 6° giorno in poi, il biofilm inizia a disintegrarsi. La MIC90 della rifampicina (64 μg/mL) ha ridotto le CFU del biofilm solo del 25% ± del 12% (n = 3).

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Figura 1: Biofilm di M. smegmatis dopo 4 giorni di incubazione in terreno di Sauton. (1) Senza glucosio e inoculato con inoculo al 2%. (2) Senza glucosio e inoculato con inoculo al 4%. (3) Con glucosio al 2% e inoculato con inoculo al 2%. (4) Con glucosio al 2% e inoculato con inoculo al 4%. (5) e (6) sono controlli dei media. Qui, i campioni sono in piastre standard a 6 pozzetti. Le fotografie vengono catturate senza alcun ingrandimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Morfologia del biofilm di M. smegmatis dal 3° giorno dopo l'inoculazione al 6° giorno. Qui, i campioni sono in piastre standard a 24 pozzetti. Le fotografie vengono catturate senza alcun ingrandimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

S. No.ComponenteConcentrazione di lavoro (w/v)Concentrazione della soluzione madreVolume/peso della soluzione madre
1Diidrogeno fosfato di potassio0.05%2.50%20 ml
2Solfato di magnesio0.05%2.50%20 ml
3Citrato ferrico di ammonio0.01%5%1 ml
4Glicerolo6%100%60 ml
5L- Asparagina0.40%NA4 g
6Acido citrico0.20%NA2 g

Tabella 1: Componenti per la preparazione dei terreni di Sauton.

Discussione

Lo stile di vita multicellulare dei microbi è stato descritto quasi un secolo fa; Tuttavia, gli studi clinici rimangono scarsi, principalmente a causa della mancanza di metodi robusti14. I metodi descritti nei lavori sulla biologia del biofilm sono spesso difficili da adattare. In questo caso, la metodologia dettagliata, aiutata da dimostrazioni di passaggi critici, dovrebbe migliorare la riproducibilità dei protocolli.

Il metodo di produzione del biofilm descritto in questo articolo è scalabile e richiede un aumento proporzionale del volume medio e delle dimensioni dell'inoculo. Applicazioni come l'estrazione dei metaboliti richiedono un volume di coltura più elevato, mentre i saggi di suscettibilità antimicrobica richiedono una biomassa più piccola12. Inoltre, la dimensione dell'inoculo può essere regolata per personalizzare il tasso di formazione del biofilm. Questa flessibilità consente ai ricercatori di controllare in modo appropriato la durata degli esperimenti.

Le condizioni di crescita e il microambiente giocano un ruolo cruciale nella fisiologia del biofilm15. In particolare, la presenza di glucosio non è obbligatoria per la formazione di un biofilm; Tuttavia, è stato osservato che l'inclusione del 2% di glucosio migliora la reticolazione e la stabilità del biofilm. Un'altra osservazione interessante è il potenziale di miglioramento del biofilm derivante dal posizionamento di un vetrino coprioggetti sul fondo dei pozzetti di coltura. L'aggiunta di Tween-80 sia nelle colture primarie che in quelle secondarie è fondamentale per mitigare l'aggregazione cellulare.

Lo sviluppo del biofilm comporta fasi di crescita distinte come l'attaccamento, la maturazione e la dispersione. Mentre la configurazione del biofilm qui descritta è tipicamente incubata per 7 giorni, le pellicole diventano visibili ad occhio nudo dal 3° giorno in poi. Questa configurazione consente di studiare le dinamiche temporali dello sviluppo del biofilm. Sebbene questo articolo descriva la stima del peso secco per valutare la biomassa del biofilm, la configurazione è anche suscettibile di colorazione convenzionale con cristallovioletto o di stima basata sulla microscopia12,16.

La produzione di biofilm da parte dei micobatteri svolge un ruolo significativo nella loro patogenicità e conferisce una maggiore resistenza ai farmaci 8,17. Abbiamo osservato una tolleranza agli antibiotici da sette a otto volte superiore nelle colture di biofilm rispetto alle colture di fiaschetta. Diversi gruppi utilizzano i biofilm come sistema modello per lo studio della fisiologia batterica; Una più ampia adozione di questa modalità di crescita da parte della comunità di ricerca sui micobatteri può fornire nuove intuizioni sulla fisiopatologia di varie specie patogene all'interno di questo genere.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla DBT-Ramalingaswami Fellowship assegnata ad Amitesh Anand.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,2 µ M Filtro per siringa in PVDFAxivaSFNY04 R
1 mL punteGenetixGXM-611000 C
10 µ Punte a LGenetixGXM-6110 C
200 µ Punte a LGenetixGXM-61200C
Piastre in polipropilene a 6 pozzettiTarsons980010
Tubi ambratiTarsons546051
AutoclaveHospharma
Armadio di biosicurezza A IIMSET
Carta assorbenteQualsiasi fornitore
CentrifugaEppendorf
Acido citricoSigma251275
CuvetteBio-Rad2239955
Citrato di ammonio ferricoSigmaF5879
Sistema di documentazione su gelBio-Rad
Glass BeadsSigmaG8772
GlucosioSigma49139
GlycerolSigmaG5516
Anelli di inoculazioneGenaxyHS81121C
L-AspargineSigmaA0884
LB-agarHimediaM1151
LB-mediaHimediaM575
M. smegmatis mc2155 crio-stockATCC700084
Solfato di magnesioSigmaM2643
MicropipetteGilson
ParafilmTarsons
Piastra di PetriTarsons460020
Misuratore di pHLabman Scientific Instruments
Lettore di piastreTecan
Provette in polipropileneGenaxyGEN-14100-PS
Fosfato di potassio monobasicoSigmaP5379
RifampicinaMedchemExpressHY-B0272
Pipetta sierologicaSPL Life Sciences95210
Incubatore agitatoreEppendorf
Spatola
SpettrofotometroThermo Scientific
Incubatore staticoCARON
Siringa sterile da 10 mLBecton Dickinson309642
Siringa sterile da 50 mLBecton Dickinson309653
Tween-80SigmaP1754
BilanciaSartorius
Solfato di zincoSigmaZ0251
adatto

Riferimenti

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