Miglioramento delle mappe di densità rimuovendo la maggior parte delle particelle negli stack finali di microscopia elettronica criogenica a singola particella

Summary

Un metodo avanzato di selezione delle particelle per la crio-EM, ovvero CryoSieve, migliora la risoluzione della mappa di densità rimuovendo la maggior parte delle particelle nelle pile finali, come dimostrato dalla sua applicazione su un set di dati del mondo reale.

Abstract

Nell'ultimo decennio, i progressi tecnologici e metodologici nel campo della microscopia elettronica criogenica (cryo-EM) e dell'analisi di singole particelle (SPA) hanno notevolmente migliorato la nostra capacità di esaminare le macromolecole biologiche ad alta risoluzione. Questo progresso ha inaugurato una nuova era di intuizioni molecolari, sostituendo la cristallografia a raggi X come metodo dominante e fornendo risposte a domande di lunga data in biologia. Poiché la crio-EM non dipende dalla cristallizzazione, che è una limitazione significativa della cristallografia a raggi X, cattura particelle di qualità variabile. Di conseguenza, la selezione delle particelle è fondamentale, poiché la qualità delle particelle selezionate influenza direttamente la risoluzione della mappa di densità ricostruita. Un innovativo approccio iterativo per la selezione delle particelle, denominato CryoSieve, migliora significativamente la qualità delle mappe di densità ricostruite riducendo efficacemente il numero di particelle nella pila finale. L'evidenza sperimentale mostra che questo metodo può eliminare la maggior parte delle particelle nelle pile finali, con conseguente notevole miglioramento della qualità delle mappe di densità. Questo articolo descrive il flusso di lavoro dettagliato di questo approccio e ne illustra l'applicazione su un set di dati del mondo reale.

Introduction

La microscopia elettronica criogenica (cryo-EM) e l'analisi di singole particelle (SPA) sono diventate un metodo dominante per determinare mappe di densità tridimensionali ad alta risoluzione di macromolecole biologiche. Grazie a una serie di innovazioni tecnologiche 1,2,3,4,5,6, denominate rivoluzione^{a risoluzione 7}, la crio-EM ha la capacità di determinare le strutture di macromolecole biologiche con risoluzione fino a quella atomica a un ritmo senza precedenti. Questa scoperta segna l'inizio di una nuova era nelle intuizioni molecolari, superando la cristallografia a raggi X come tecnica predominante e rispondendo a domande biologiche di lunga data.

Cryo-EM SPA si discosta dalla cristallografia a raggi X non richiedendo la cristallizzazione di macromolecole biologiche. Invece, una soluzione contenente le macromolecole biologiche bersaglio viene rapidamente congelata nel ghiaccio vitreo. Viene quindi ripreso con un fascio di elettroni per produrre una serie di micrografie, bypassando la necessità di cristallizzazione⁸. Successivamente, vengono utilizzati algoritmi di prelievo delle particelle per estrarre singole particelle grezze da queste micrografie 4,9,10,11,12. Poiché la crio-EM non dipende dalla cristallizzazione, è naturale che le particelle estratte siano prevalentemente danneggiate o in stati conformazionali indesiderati, il che richiede più cicli di selezione delle particelle per ottenere una mappa di densità ad alta risoluzione. Nell'elaborazione delle immagini cryo-EM SPA, la selezione delle particelle è quindi fondamentale per ottenere mappe di densità ad alta risoluzione¹³.

Nella cryo-EM SPA, i metodi standard di selezione delle particelle includono la classificazione bidimensionale (2D) e tridimensionale (3D)¹⁴. La classificazione 2D classifica le particelle in un numero predefinito di gruppi, ottenendo un'immagine media e una risoluzione 2D stimata per ciascuna classe. I ricercatori possono quindi ispezionare visivamente queste classi, rimuovendo le particelle dai gruppi a risoluzione più bassa per utilizzare quelle rimanenti nelle ricostruzioni volte a ottenere una risoluzione più elevata. Una volta stabilite le pose delle particelle utilizzando algoritmi di raffinamento, i ricercatori procederanno con la classificazione 3D, raggruppando le particelle in più classi. Ciò consente l'ispezione visiva della mappa di densità ricostruita per ciascuna classe, consentendo l'esclusione di particelle indesiderate, come quelle provenienti da conformazioni indesiderate. Dopo diversi cicli di classificazione, si ottiene una pila finale comprendente particelle di qualità relativamente elevata. Queste pile finali sono strumentali nella produzione di mappe di densità a risoluzione atomica o quasi atomica.

Zhu e i suoi colleghi hanno dimostrato che un'ulteriore selezione delle particelle può essere condotta su queste pile finali¹⁵. CryoSieve¹⁵, un metodo iterativo innovativo per la selezione delle particelle, può essere applicato per migliorare la qualità della mappa di densità finale riducendo significativamente il numero di particelle. Mentre altri criteri e software di smistamento delle particelle, come il metodo di correlazione incrociata normalizzata (NCC)¹⁶, l'approccio di coerenza del grafo angolare (AGC)¹⁷ e la classificazione di non allineamento⁵, sono attualmente in uso nel campo, questo metodo ha dimostrato di superare questi algoritmi in termini di efficacia.

In questo studio, presentiamo una guida dettagliata all'intero processo. Come caso di studio, abbiamo applicato questo nuovo metodo al set di dati del trimero dell'emoagglutinina dell'influenza (voce EMPIR: 10097)¹⁸, che include 130.000 particelle nel suo stack finale. La nostra procedura ha scartato con successo circa il 73,8% delle particelle dalla pila finale di questo set di dati, migliorando la risoluzione della mappa di densità ricostruita da 4,11 Å a 3,62 Å. Oltre al trimero di emoagglutinina dell'influenza, i risultati di più set di dati sono presentati nella precedente pubblicazione¹⁵, che mostra una varietà di risoluzioni e pesi molecolari delle biomolecole.

Protocol

1. Installazione

1. Controllare e configurare l'ambiente di accelerazione GPU
   1. Apri il terminale e inserisci il comando: nvidia-smi. Assicurati che il comando visualizzi correttamente tutte le informazioni sulle schede GPU e che la versione di CUDA sia superiore a 10.2. Eseguire il comando: conda -V per verificare se Conda è installato (Figura supplementare 1).
2. Configurare l'ambiente virtuale
   1. Inserisci il seguente comando per configurare l'ambiente virtuale, sostituendo CRYOSIEVE_ENV con il nome dell'ambiente desiderato: conda create -n CRYOSIEVE_ENV python=3.8 cudatoolkit=10.2 cupy=10.0 pytorch=1.10 -c pytorch -c conda-forge. Attendere alcuni minuti fino a quando l'ambiente non viene configurato correttamente (Figura 2 supplementare).
      NOTA: gli utenti hanno la flessibilità di modificare il nome dell'ambiente in base alle esigenze. Il comando fornito è specifico di CUDA 10.2. Se si desidera una versione diversa di CUDA, modificare il numero di versione per cudatoolkit.
3. Installa CryoSieve
   1. Attiva l'ambiente eseguendo il comando: conda activate CRYOSIEVE_ENV. Installare il software eseguendo: pip install cryosieve o conda install -c mxhulab cryosieve (Figura 3 supplementare). Immettere cryosieve -h e assicurarsi che le informazioni di aiuto siano visualizzate correttamente (Figura 4 supplementare).

2. Setacciatura delle particelle

1. Recupera i dati
   1. Scarica il set di dati dello stack finale EMPIAR-10097 da EMPIAR (vedi Tabella dei materiali). Scarica il file stella, il file maschera (mask.mrc) e il modello iniziale (per la fase di ristima; initial.mrc) da Github (vedi Tabella dei materiali). Inserire tutti questi file in una cartella insieme (Figura 5 supplementare).
      NOTA: Il repository in https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos utilizza Git Large File Storage (Git LFS). L'installazione di Git LFS è essenziale per clonare l'intero repository. In alternativa, accedi al file tramite il collegamento GitHub e fai clic sul pulsante Scarica file raw per scaricare un singolo file.
2. Setacciatura delle particelle di processo
   1. Apri il terminale e usa il comando: cd FILEPATH per navigare nella cartella in cui si trova il set di dati. Attiva l'ambiente Conda: conda activate CRYOSIEVE_ENV.
   2. Inserisci il seguente comando per iniziare il nostro esperimento di setacciatura delle particelle: cryosieve --reconstruct_software relion_reconstruct --postprocess_software relion_postprocess --i T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star --o output/ --mask mask.mrc --angpix 1.3099979 --num_iters 10 --frequency_start 40 --frequency_end 3 --retention_ratio 0.8 --sym C3 --num_gpus 1 --balance (Figura supplementare 5). Durante l'esecuzione, il terminale visualizzerà i log di output per ogni iterazione.
      NOTA: Istruzioni dettagliate per ciascuna opzione sono disponibili nel File supplementare 1. Il tempo di elaborazione e i requisiti minimi per l'esecuzione sono descritti in dettaglio nel fascicolo supplementare 2. T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star è stato perfezionato da CryoSPARC da T40_HA_130K-Equalized_run-data.star (scaricato da EMPIAR) per mitigare gli effetti determinati dai progressi nelle tecniche di stima dell'orientamento.

3. Trovare l'iterazione ottimale

1. Controllare le risoluzioni
   1. Utilizzare il comando: grep "+ FINAL RESOLUTION:" output/_postprocess*.txt per stampare i risultati della risoluzione per le 10 iterazioni di setacciatura (Figura 1). Poiché la pila di particelle filtrata nella^{7a iterazione} ha la risoluzione più alta con il minor numero di particelle, è probabile che fornisca il risultato ottimale.
      NOTA: Per evitare il trasferimento involontario di informazioni dalle particelle scartate a quelle conservate¹⁵ e per garantire che la pila di particelle dopo la settima iterazione sia effettivamente ottimale, gli utenti sono tenuti a eseguire un passaggio di ristima per le iterazioni vicine. In questo protocollo, le iterazioni 4, 5, 6, 7 e 8 sono soggette a verifica.
2. Importazione di particelle setacciate
   1. Apri l'interfaccia web di CryoSPARC e segui questi passaggi: Entra in un'area di lavoro e fai clic sul pulsante Builder in alto a destra del pannello. Nel pannello, seleziona e fai clic sull'opzione Importa pila di particelle . Nella sezione Parametri del pannello Importazione pila di particelle, specificare il meta percorso della particella come file _iter{n}.star che si trova nella cartella di output dei risultati completati e il percorso dei dati della particella nella cartella in cui è memorizzato il file mrcs. Fare clic sul pulsante Accoda processo , quindi fare clic sul pulsante Coda per avviare il processo. Utilizzare lo stesso modo per importare le iterazioni rimanenti che necessitano di una nuova stima (Figura 6A supplementare).
3. Importazione del modello iniziale
   1. Fai clic sul pulsante Builder in alto a destra del pannello. Nel pannello, selezionare e fare clic sull'opzione Importa volumi 3D .
   2. Specificare il percorso dei dati del volume come file initial.mrc. Fare clic sul pulsante Accoda processo , quindi fare clic sul pulsante Coda per avviare il processo (Figura 6B supplementare).
      NOTA: Il modello iniziale può essere generato anche attraverso la ricostruzione ab initio (File Supplementare 3).
4. Perfezionamento omogeneo (processo di compilazione)
   1. Fai clic sul pulsante Builder in alto a destra del pannello. Nel pannello, selezionare e fare clic sull'opzione Perfezionamento omogeneo .
      NOTA: È applicabile anche un affinamento non uniforme.
5. Affinamento omogeneo (importazione di particelle)
   1. Nel pannello principale a sinistra, apri il lavoro per l'importazione della pila di particelle della 5a^iterazione (o dell'iterazione desiderata). Trascina il modulo particelle importate dal lato destro del pannello principale e rilascialo nella sezione Pile di particelle del Builder a destra. Chiudi il processo Importa pila di particelle facendo clic sulla X rossa nell'angolo in alto a destra del pannello principale.
   2. Aprire il lavoro per l'importazione di volumi 3D. Trascinare il modulo dei volumi importati dal lato destro del pannello principale e rilasciarlo nella sezione Volume iniziale del Builder sulla destra.
6. Affinamento omogeneo (Modifica dei parametri)
   1. Nella piega Parametri, individua l'opzione Simmetria e impostala su C3. Trova l'opzione Forza ripetizione della divisione GS e disabilitala. Fare clic sul pulsante Metti in coda il processo , quindi fare clic sul pulsante Coda per avviare il perfezionamento omogeneo. Eseguire l'affinamento omogeneo per le iterazioni rimanenti utilizzando lo stesso metodo (Figura 6C-D supplementare).
      NOTA: L'opzione Forza ripetizione divisione GS è fondamentale. Disabilitando questa opzione, CryoSPARC mantiene la divisione gold standard fornita dalla lima stellare, evitando l'overfitting. Una motivazione dettagliata per disabilitare la divisione GS Force Re-do può essere trovata nel file supplementare 4.
7. Attendere il completamento dell'esecuzione di tutti i processi per ottenere i risultati. Sulla base dei risultati, si conferma che la pila di particelle filtrata nella 6a^iterazione è il risultato ottimale effettivo.
   NOTA: È normale che i risultati ottenuti presentino piccole deviazioni casuali dai risultati forniti in questo protocollo. Queste deviazioni non influiscono sulla conclusione complessiva.

Results

In questo protocollo, abbiamo utilizzato il set di dati del trimero dell'emoagglutinina dell'influenza (voce EMPAR: 10097) come dimostrazione dell'efficacia di questo processo. A causa dell'orientamento preferito del campione, l'acquisizione dei dati richiedeva un'inclinazione di 40°. La proteina presenta simmetria C3 e ha un peso molecolare di 150 kDa.

Abbiamo implementato il protocollo descritto in precedenza per elaborare la pila di particelle finale. Ha rimosso progressivamente il 20% delle particelle in ogni iterazione, ottenendo un rapporto di ritenzione dell'80,0%, 64,0%, 51,2% e così via. Come illustrato nella Figura 1 e nella Figura 2, la risoluzione delle particelle trattenute inizialmente è migliorata, ma alla fine è diminuita. Tra le iterazioni, la sesta^iterazione è stata identificata come il sottoinsieme più ottimale, contenente il minor numero di particelle che raggiunge la massima risoluzione. Il nostro algoritmo ha identificato con successo un sottoinsieme di particelle che comprendeva solo il 26,2% della pila originale, con conseguente miglioramento della risoluzione da 4,19 Å a 3,62 Å (ri-stimata da CryoSPARC), mostrata nella Figura 2. Inoltre, le mappe di densità prima e dopo l'uso di CryoSieve sono state confrontate nella Figura 3. Vengono mostrate anche la curva di correlazione a guscio di Fourier (FSC) da modello a mappa e la curva FSC a semimappa delle mappe di densità ricostruite prima e dopo il metodo (Figura 3A-B). Sono state confrontate anche le mappe di densità grezze e le mappe di densità nette ottenute, con l'applicazione del livello di contorno equivalente (Figura 3C). Sono state confrontate le catene laterali delle mappe di densità nitide, mostrando il miglioramento delle mappe di densità ricostruite. Il fattore B stimato di Rosenthal-Henderson è stato adottato anche per i criteri di qualità delle particelle¹⁹. Dopo aver rimosso la maggior parte delle particelle nella pila finale, il fattore B di Rosenthal-Henderson è aumentato da 226,9 Ų a 146,2 Ų (Figura 3D). Per il confronto sono stati utilizzati anche la risoluzione locale, il fattore B locale²⁰ e ResLog²¹, indicando che CryoSieve migliora effettivamente sia la qualità delle mappe di densità che delle particelle (Figura 4). 

Figura 1: Risoluzioni di ogni iterazione. Le risoluzioni che sono state segnalate sono evidenziate in caselle rosse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Risoluzioni di ogni iterazione. Le risoluzioni identificate da lavori di rifinitura omogenei sono evidenziate in caselle rosse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Mappe di densità. (A) Confronto della curva FSC modello-mappa delle mappe di densità ricostruite prima e dopo l'utilizzo di CryoSieve. L'asse y rappresenta FSC, mentre l'asse x rappresenta la risoluzione. La linea tratteggiata rossa segna la soglia di 0,5 per l'FSC. La linea tratteggiata verticale illustra la risoluzione delle mappe di densità ottenute sotto una soglia di 0,5. (B) Le semimappe della curva FSC sono state ottenute da mappe di densità ricostruite prima e dopo l'utilizzo di CryoSieve tramite CryoSPARC. L'asse y rappresenta FSC, mentre l'asse x rappresenta la risoluzione. (C) Sono state mostrate mappe di densità grezze e mappe di densità nitide sia per le particelle trattenute da CryoSieve che per l'insieme completo di particelle nelle pile finali. Il livello di contorno equivalente di 0,65 è stato applicato per le mappe di densità grezze. Il livello di contorno equivalente di 0,84 è stato applicato per le mappe di densità nitide. Le mappe di densità nitide sono state ottenute direttamente da CryoSPARC. Le mappe di densità nitide sono state auto-post-elaborate, prima pesate FSC (basate su FSC fornite da CryoSPARC). Quindi, il fattore B è stato affinato utilizzando i fattori B autodeterminati (232,0 Ų per tutte le particelle nella pila finale e 160,8 Ų per CryoSieve). Le catene laterali nelle mappe di densità nitida sono state confrontate, incorporando modelli atomici come riferimento. Le frecce rosse evidenziano le regioni migliorate. (D) Il fattore B stimato di Rosenthal-Henderson è stato mostrato sia per le particelle trattenute da CryoSieve che per l'insieme completo di particelle nelle pile finali. L'asse y rappresenta il numero di particelle utilizzate e l'asse x rappresenta il reciproco del quadrato della risoluzione. Spostandosi dall'alto verso il basso, ogni punto rappresenta la metà delle particelle del precedente. Le risoluzioni sono state determinate dal perfezionamento. I fattori B sono stati determinati utilizzando un'approssimazione dei minimi quadrati dei punti misurati, come mostrato dalle curve di adattamento. I fattori B stimati di Rosenthal e Henderson sono indicati nelle legende: l'arancione rappresenta le particelle trattenute da CryoSieve, mentre il blu indica tutte le particelle nella pila finale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Confronto di varie metriche di mappe di densità. (A) Confronto delle mappe di risoluzione locale prima e dopo l'utilizzo di CryoSieve ottenute da CryoSPARC. La risoluzione locale varia tra 7 Å (rosso) e 3,5 Å (blu). (B) Confronto delle mappe di densità prima e dopo l'uso di CryoSieve, colorate con la mappa del fattore B locale ottenuta da LocBFactor utilizzando un intervallo di risoluzione di [20-3,5] Å. (C), Confronto dei grafici ResLog prima e dopo l'uso di CryoSieve ottenuti da CryoSPARC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 1 supplementare: Utilizzo dei comandi nvidia-smi e conda -V per verificare i prerequisiti. Se i prerequisiti sono soddisfatti, digitando il comando nvidia-smi verranno visualizzati la versione del driver GPU, la versione CUDA e lo stato delle schede GPU. Allo stesso modo, l'immissione del comando conda -V dovrebbe visualizzare correttamente la versione installata di Conda. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 2 supplementare: Il processo di creazione di nuovi ambienti di accelerazione GPU. Nella schermata viene visualizzato l'output generato dal comando utilizzato per creare l'ambiente Conda. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 3 supplementare: Installazione di CryoSieve nell'ambiente di accelerazione GPU. Dopo aver attivato l'ambiente Conda appena creato, lo schermo visualizza l'output risultante dall'esecuzione del comando per installare CryoSieve utilizzando Pip. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura 4 supplementare: Informazioni della Guida. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 5: Processo in corso. Dopo aver eseguito CryoSieve tramite la riga di comando, lo schermo visualizza le informazioni relative al processo in esecuzione. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 6 supplementare: La configurazione dei lavori di CryoSPARC. (A) Importa pila di particelle. (B) Importazione di volumi 3D. (C-D) Affinamento omogeneo. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 1: Opzioni di CryoSieve. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Tempo di elaborazione e requisiti minimi per l'esecuzione di Cryosieve. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: Generazione del modello iniziale da parte di CryoSPARC. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 4: Motivazione per disabilitare la ripetizione forzata della divisione GS. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 5: Opzioni di criosieve-csrefine. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 6: Opzioni di cryosieve-csrhbfactor. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

La crio-EM rappresenta una tecnica fondamentale per chiarire le strutture delle molecole biologiche. In questo processo, dopo la raccolta dei dati tramite microscopia, è essenziale l'estrazione delle particelle dalle micrografie, seguita dalla loro classificazione in più fasi per compilare lo stack finale. Una sfida comune è la predominanza di particelle danneggiate o non conformate in modo indesiderabile, sottolineando la necessità di una selezione ripetuta delle particelle per ottenere mappe di densità ad alta risoluzione. Ciò rende la selezione delle particelle un passaggio fondamentale nella cryo-EM SPA per ottenere mappe di densità di alta qualità. Le tecniche di selezione delle particelle esistenti includono l'algoritmo di convalida statistica non-tilt²², l'approccio basato sullo z-score²³ e il metodo di stima dell'accuratezza angolare²⁴.

CryoSieve emerge come uno strumento prezioso in questo contesto, abile nell'eliminare un numero significativo di particelle estranee dalla pila finale. Questa riduzione non solo migliora l'efficienza computazionale della ricostruzione, ma semplifica anche il processo. Offre una suite completa per la selezione delle particelle, in cui l'entità degli scarti di particelle e il conseguente miglioramento della risoluzione dipendono in gran parte dalla qualità iniziale dei dati e dalle metodologie impiegate nell'elaborazione dei dati.

In questo manoscritto, abbiamo presentato un flusso di lavoro completo di setacciatura delle particelle utilizzando il set di dati del caso reale del trimero dell'emoagglutinina dell'influenza (voce EMPIAR: 10097). I passaggi trattati e discussi qui possono essere riassunti come setacciatura delle particelle e ri-stima della posa. Il volume finale ricostruito in 3D ha raggiunto una risoluzione di 3,62 Å e le catene laterali nelle alfa-eliche erano più chiare nel volume post-elaborato rispetto alla mappa di densità pubblicata.

CryoSieve è un metodo open source disponibile su GitHub (https://github.com/mxhulab/cryosieve). Un tutorial dettagliato è disponibile anche sulla sua homepage. Gli utenti possono installarlo e utilizzarlo seguendo il tutorial. Inoltre, vengono forniti due moduli, cryosieve-csrefine e cryosieve-csrhbfactor. Il modulo cryosieve-csrefine è stato creato appositamente per automatizzare l'esecuzione sequenziale di varie operazioni all'interno di CryoSPARC (Supplementary File 5). Queste operazioni includono l'importazione di pile di particelle e l'esecuzione di lavori di ab initio, raffinazione omogenea o raffinazione non uniforme. D'altra parte, il modulo cryosieve-csrhbfactor è progettato per automatizzare la determinazione del fattore B di Rosenthal-Henderson sfruttando le capacità di cryosieve-csrefine (File supplementare 6).

Attualmente, l'applicazione di questo metodo è limitata a scenari di singola conformazione. Di conseguenza, nei casi in cui le particelle rappresentano più conformazioni, le loro capacità sono limitate. Si consiglia agli utenti di impegnarsi inizialmente nella classificazione 3D per segregare le particelle di conformazioni disparate prima di utilizzarla per una selezione raffinata delle particelle. Inoltre, sebbene il metodo dimostri competenza nel filtrare oltre il 50% delle particelle dalla pila finale, le origini di queste particelle scartate e le ragioni alla base del loro trascurabile contributo alla qualità della ricostruzione rimangono poco chiare. Questa lacuna nella comprensione richiede ulteriori ricerche per affrontare in modo completo e potenzialmente correggere questa limitazione.

Esistono tre possibili metodi di selezione delle particelle o setacciamento delle particelle. Prima di tutto, cisTEM⁴ può riportare un punteggio per ogni singola immagine di particella dopo il raffinamento 3D. Gli utenti potevano ordinare le particelle utilizzando il punteggio cisTEM per scartare le particelle. L'approccio di coerenza angolare del grafo (AGC)¹⁷ è anche un metodo per scartare le particelle disallineate. Inoltre, la classificazione di non allineamento⁵ è un modo tradizionale per scartare le particelle utilizzando la classificazione 3D. Abbiamo confrontato la qualità delle particelle trattenute con questi metodi con CryoSieve e abbiamo scoperto che le particelle trattenute di CryoSieve sono di qualità superiore¹⁵. Il metodo qui presentato supera significativamente i metodi alternativi e raggiunge il minor numero di particelle alla stessa risoluzione.

Come dimostrato nel risultato, la maggior parte delle particelle in una pila finale di crio-EM non contribuisce alla ricostruzione della mappa di densità. In altre parole, tra tutte le particelle raccolte durante l'acquisizione dell'immagine, solo poche selezionate, vale a dire il sottoinsieme più fine, contribuiscono effettivamente alla ricostruzione finale. Di conseguenza, il rapporto tra questo sottoinsieme finale e il numero totale di particelle raccolte potrebbe fungere da metrica quantitativa per valutare la qualità del campione. Più alto è questo rapporto, migliore è la qualità del campione. Nonostante i progressi tecnici che hanno reso la crio-EM più accessibile ai biologi strutturali, la preparazione dei campioni rimane un grosso collo di bottiglia nel flusso di lavoro. Scienziati e ingegneri stanno quindi concentrando i loro sforzi su questa sfida²⁵. Nell'analisi di singole particelle (SPA), la preparazione del campione consiste in due fasi cruciali: l'ottimizzazione del campione e la preparazione della griglia. Il primo consiste nel purificare il campione mantenendo il suo stato biochimico ottimale. Quest'ultimo comporta la preparazione del campione per l'analisi al microscopio, compreso il trattamento chimico o al plasma della griglia, la deposizione del campione e la vetrificazione. Sono state proposte numerose tecniche per affrontare l'instabilità macromolecolare, ma l'efficacia di un approccio rispetto ad un altro dipende dalle caratteristiche del campione ^25,26. Attualmente, i risultati della preparazione della rete sono fortemente influenzati dalla competenza e dall'esperienza dell'utente, il che può rendere il processo lungo e impegnativo^27,28. Le numerose variabili incontrate nella preparazione del campione e della griglia pongono sfide nello stabilire relazioni di causa-effetto, poiché i ricercatori possono valutare il campione solo a livello molecolare utilizzando il microscopio. Di conseguenza, mancano ancora statistiche quantitative derivanti dal confronto di diversi protocolli di preparazione del campione e della griglia ed è necessario un approccio sistematico per indagare le tendenze e comprendere i meccanismi fondamentali del comportamento del campione²⁹.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CryoSPARC	Structura Biotechnology Inc. Toronto, Canada		CryoSPARC (Cryo-EM Single Particle Ab-Initio Reconstruction and Classification) è una soluzione software HPC all'avanguardia per l'elaborazione completa di dati di microscopia crioelettronica a singola particella (cryo-EM). CryoSPARC è utile per risolvere strutture crio-EM di proteine di membrana, virus, complessi, molecole flessibili, piccole particelle, dati di piastre di fase e dati di colorazione negativi.
EMPIAR-10097 Set di dati		https://ftp.ebi.ac.uk/empiar/world_availability/10097/data/Particle-Stack/T40_HA_130K-Equalized-Particle-Stack.mrcs	Questo set di dati comprende dati crio-EM a singola particella del trimero dell'emoagglutinina dell'influenza, caratterizzati dal suo orientamento altamente preferito, raccolti utilizzando una strategia di raccolta inclinata di 40 gradi.
initial.mrc		https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097
mask.mrc		https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097
RELION		4.0-beta-2	RELION (REgularised LIkelihood OptimisatioN) è un software open-source per l'elaborazione di dati di microscopia crioelettronica (cryo-EM), in particolare per la raffinazione di macromolecole. Strutture. Utilizzando un approccio bayesiano, eccelle nella separazione del segnale dal rumore, consentendo la determinazione della struttura ad alta risoluzione. RELION supporta l'analisi di singole particelle, la tomografia e la media dei sottotomogrammi ed è diventato ampiamente utilizzato in biologia strutturale grazie alla sua efficacia e all'interfaccia user-friendly.
T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star		https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097	File di metadati per la pila finale di particelle da EMPIAR-10097