Articolo metodologico

Applicazioni della cromatografia liquida Spettrometria di massa tandem nella ricerca sui prodotti naturali: alcaloidi tropanici come caso di studio

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DOI:

10.3791/66620

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8 marzo 2024

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1Department of Chemistry, Northern Michigan University

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un metodo per l'annotazione e la classificazione rapida basata sulla spettrometria di massa (MS) e sulla spettrometria di massa (MS) degli alcaloidi tropanici, utile sia per la dereplicazione preliminare di campioni contenenti tropani che per la scoperta di nuovi alcaloidi per l'isolamento.

Abstract

Sebbene molti farmaci utilizzati oggi siano di origine sintetica, i prodotti naturali forniscono ancora una ricca fonte di nuova diversità chimica e bioattività e possono produrre spunti promettenti per malattie resistenti o emergenti. La sfida, tuttavia, è duplice: non solo i ricercatori devono trovare prodotti naturali e chiarire le loro strutture, ma devono anche identificare ciò che vale la pena isolare e analizzare (e ciò che è già noto - un processo noto come dereplicazione). Con l'avvento della moderna strumentazione analitica, il ritmo della scoperta e della dereplicazione dei prodotti naturali è accelerato. La cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) è diventata una tecnica particolarmente preziosa per identificare e classificare le strutture chimiche. Gli alcaloidi tropanici (TA) sono composti di origine vegetale di grande importanza medicinale e tossicologica. In questo studio, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro di screening basato su LC-MS/MS utilizzando le molteplici configurazioni MS/MS disponibili su uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo (QQQ) per annotare e classificare le strutture TA in base ai loro distinti modelli di frammentazione. Utilizzando una combinazione di scansioni ioniche del prodotto dipendenti dai dati (DD), scansioni ioniche precursori (PrIS) e scansioni con perdita neutra (NLS), abbiamo applicato questo metodo agli estratti ricchi di TA della belladonna Datura stramonium e Datura metel. Questo metodo è rapido, sensibile ed è stato impiegato con successo sia per la dereplicazione preliminare di campioni complessi contenenti TA sia per la scoperta di un nuovo candidato per l'isolamento, la purificazione (e l'eventuale biodosaggio).

Introduzione

Sebbene le molecole completamente sintetiche siano diventate più importanti nella scoperta di farmaci negli ultimi decenni, quasi due terzi di tutti i farmaci approvati negli ultimi 39 anni sono prodotti naturali o ispirati a prodotti naturali,1,2  sottolineando la continua importanza della ricerca sui prodotti naturali. Gli alcaloidi, alcuni prodotti naturali contenenti azoto, sono particolarmente apprezzati per le loro proprietà medicinali. Alcaloidi tropanici (TA) contenenti il [3.2.1.]-sistema biciclico contenente azoto, sono prodotti principalmente da piante delle famiglie delle Solanaceae (belladonna), Erythroxylaceae e Convolvulaceae. Gli esempi includono atropina, scopolamina e cocaina; Più tropani semisintetici o sintetici sono utilizzati anche clinicamente3. Gli AT e i loro derivati sono usati per trattare molte condizioni 3,4 e molti di questi farmaci compaiono nell'elenco dei medicinali essenziali 2023 dell'OMS5. A causa delle loro potenti attività, gli TA sono anche usati a scopo ricreativo (come stimolanti o deliranti) e possono causare avvelenamento in caso di ingestione di piante (o preparati) che li contengono 6,7. Gli TA sono indesiderabili nell'alimentazione umana e animale8 e possono contaminare tè, spezie, cereali, miele e integratori a base di erbe 9,10. A causa sia della loro promessa medicinale che della capacità di avvelenare, sono utili metodi analitici che possono aiutare nella scoperta di nuovi TA (e nell'identificazione di TA noti).

Nella spettrometria di massa tandem (MS/MS), i "filtri di massa" (ad esempio, quadrupoli, tubi a tempo di volo) sono accoppiati insieme fisicamente ("nello spazio"), oppure uno strumento impiega ulteriori fasi di reazione/separazione "in tempo". La MS/MS nello spazio utilizza diverse modalità per selezionare e frammentare diversi ioni ai diversi filtri di massa (ad esempio, i quadrupoli di uno strumento a triplo quadrupolo o QQQ). Queste diverse modalità possono essere utilizzate per determinare quali frammenti specifici sono prodotti da un dato ione (scansione ionica del prodotto), quali ioni in un campione producono determinati frammenti (scansione ionica precursore o PrIS) o subiscono perdite di una massa caratteristica (scansione a perdita neutra o NLS) o quali composti specifici possiedono quali frammenti specifici (monitoraggio a reazione multipla). MS/MS, quindi, fornisce frammenti utili per proporre strutture per nuovi composti o confermare la presenza di un composto esistente. La MS/MS è sempre più utilizzata nei campi della scoperta di farmaci, della chimica dei prodotti naturali e della metabolomica11,12 ed è stata utilizzata per profilare specie contenenti alcaloidi (per la caratterizzazione fitochimica o l'analisi chemiotassonomica) e per rilevare e quantificare alcaloidi specifici in alimenti o piante medicinali 10,13,14,15,16.

Nonostante le numerose tecniche di spettrometria di massa disponibili, ci sono sfide nella ricerca di nuovi alcaloidi. Oltre a trovare un organismo candidato da selezionare, una conferma strutturale completa di un alcaloide è un processo arduo che può includere molte tecniche analitiche diverse. Inoltre, i ricercatori potrebbero isolare un composto già noto, sprecando lavoro, tempo e risorse. Ciò è particolarmente difficile per gli AT, dove vengono segnalati centinaia, se non migliaia, di TA, molti dei quali sono isomerici tra loro. Il processo di "identificare i noti e distinguerli dagli sconosciuti" è noto come dereplicazione. I database dei tempi di ritenzione (r.t.s) e i frammenti di massa di diversi TA e altri composti sono pubblicati per aiutare in questo processo 17,18. Ciononostante, la dereplicazione è laboriosa; La semplice annotazione (cioè l'assegnazione di strutture putative a) gli alcaloidi nell'intero cromatogramma LC-MS/MS di un campione richiede molto tempo. Recentemente, sia la rete molecolare1 9,20 che la dereplicazione manuale 18,21,22 sono state utilizzate per la benzilisochinolina, l'indolo monoterpenico e gli alcaloidi tropanici, e i Pris sono stati utilizzati per il "filtraggio strutturale" degli spettri per identificare alcaloidi di tipo pirrolizidina e solanina23,24. Tuttavia, non sono disponibili metodi o flussi di lavoro specifici per la dereplicazione rapida basata su LC-MS/MS di campioni contenenti TA, anche se gli AT possiedono frammenti comuni e facilmente identificabili (Figura 1). Il metodo qui descritto utilizza una combinazione di scansioni ioniche del prodotto dipendenti dai dati (DD), PrIS e NLS per annotare e classificare le strutture TA nelle piante in base sia ai distinti modelli di frammentazione per tropani mono-, di- e trisostituiti (Figura 1A) sia alle perdite di gruppi estere comuni presenti in questi alcaloidi (Figura 1B). Gli organismi oggetto dello studio sono diverse specie del genere Datura. Una ricca fonte di diversi TA, la Datura è stata utilizzata nel corso della storia del mondo per scopi medicinali e culturali17- ed è una matrice difficile da dereplicare a causa dei suoi numerosi TA strutturalmente simili, fornendoci campioni interessanti su cui testare il nostro metodo.

Protocollo

ATTENZIONE: Consultare tutte le schede di sicurezza dei materiali (MSDS) pertinenti prima di utilizzare le sostanze chimiche elencate.

1. Preparazione del campione

ATTENZIONE: L'azoto liquido può causare ustioni da criogeno. Utilizzare guanti criogenici e protezione per gli occhi in un'area ben ventilata. I campioni di piante contenenti alcaloidi possono essere irritanti per la pelle; Maneggiarli sempre con i guanti. Il metanolo è tossico e infiammabile e deve essere maneggiato in una cappa aspirante lontano da potenziali fonti di accensione.

NOTA: In teoria, possono essere utilizzati tessuti vegetali coltivati o selvatici (essiccati o macinati freschi); La procedura seguente è proprio quella utilizzata durante lo sviluppo del metodo.

  1. Se il tessuto vegetale di interesse è fresco, congelarlo mettendolo in una provetta conica di polipropilene e immergendolo in azoto liquido per 2-3 minuti.
  2. Metti il tessuto vegetale congelato in un mortaio pre-raffreddato (in un refrigeratore di polistirolo con azoto liquido) e, usando un pestello pre-raffreddato, macina il tessuto fino a ottenere una polvere uniforme.
  3. Pesare rapidamente la quantità desiderata di tessuto in una provetta da microcentrifuga in polipropilene tarato utilizzando una spatola pre-raffreddata e aggiungere immediatamente il 20% di metanolo (a temperatura ambiente [RT]) a una concentrazione di 1 mL per ogni 100 mg di tessuto.
    NOTA: Il metanolo (20%) è comunemente usato per estrarre gli AT25. Occasionalmente, viene aggiunto lo 0,1% di acido formico, sebbene non sia stata osservata alcuna differenza nell'efficienza di estrazione durante lo sviluppo di questo metodo e di altri.
  4. Posizionare i tubi tappati su uno shaker oscillante (velocità media) per un minimo di 3 ore a RT.
  5. Centrifugare le provette a 9464 x g per 10 min. Pipettare il surnatante in una fiala dell'autocampionatore LC-MS o, se ancora torbido, filtrare prima attraverso un filtro per siringa da 0,45 μm.
    NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui, anche se i campioni e gli estratti di piante fresche lavorati devono essere conservati in un congelatore a -80 °C prima dell'analisi per evitare qualsiasi potenziale degradazione degli alcaloidi.

2. Configurazione dello strumento LC-MS e raccolta dati

ATTENZIONE: L'acetonitrile è tossico e infiammabile; Tenere lontano da fonti di accensione e controllare i vapori utilizzando una cappa aspirante. L'acido formico è corrosivo; Evitare il contatto con la pelle e gli occhi e indossare dispositivi di protezione individuale adeguati.

  1. Utilizzare uno strumento LC-MS con una sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI) e una colonna HPLC a fase inversa (C18, 4,6 x 100 mm).
  2. Per l'HPLC, utilizzare lo 0,1% di acido formico in H2O come solvente A e lo 0,1% di acido formico in acetonitrile come solvente B; equilibrare la colonna con 99% A e 1% B. Configurare un gradiente di 30 minuti di 1%-50% B su 26 minuti, tornando all'1% B a 26,01 minuti e mantenendo l'1% B per 4 minuti. Utilizzare una temperatura del forno a colonna di 45 °C e una portata di 0,5 mL/min.
  3. Nel metodo LC-MS, utilizzare i seguenti parametri operativi per lo spettrometro di massa: tensione di interfaccia: 4,0 kV, flusso di gas di nebulizzazione: 3 L/min, flusso di gas di riscaldamento: 10 L/min, temperatura DL: 250 °C, temperatura di blocco termico: 400 °C, temperatura di interfaccia: 300 °C, flusso di gas di essiccazione: 10 L/min e pressione del gas di dissociazione indotta da collisione (CID) (argon) di 17 kPa.
  4. Costruisci un metodo MS in modalità positiva ESI che include sia una scansione Q3 che una scansione Q1 (100-1000 Da) che funziona come un evento di indagine (impostato sulla lunghezza del metodo LC), con l'esclusione automatica degli isotopi abilitata. Includere una scansione ionica del prodotto come evento dipendente della scansione Q1 (analisi DD), con una finestra di massa di 50-1000 Da, un'energia della cella di collisione di -20 V e un tempo dell'evento di <0,2 s.
    NOTA: La soglia di conteggio per l'attivazione della scansione ionica del prodotto DD di Q1 può essere variabile, ma in genere viene utilizzato un livello di 7.000-10.000 conteggi. Su alcuni strumenti, come quello utilizzato per sviluppare il metodo, la scansione Q3 fornisce una maggiore precisione e sensibilità di massa rispetto a Q1 ed è inclusa per confermare gli ioni osservati nella scansione Q1, sebbene possa essere omessa dal passaggio 2.4 senza problemi.
  5. Al metodo MS di cui sopra, aggiungere PrIS in modalità positiva pari alla lunghezza del metodo LC con energie della cella di collisione di -20 V e tempi di evento di 0,75 s. Assicurarsi che in tutti i casi, le funzioni di esclusione automatica degli isotopi o di deisotopo siano abilitate. Assicurarsi che i valori m/z di interesse per i frammenti di TA (in Da, vedi Figura 1A) siano 124.1 (per TA monosostituiti, finestra di massa di 125-1000 Da), 122.1 e 140.1 (per TA disostituiti, finestre di massa a partire da 123 e 141 Da, rispettivamente) e 156.1 e 138.1 (per TA trisostituiti, finestre di massa a partire da 157 e 139 Da, rispettivamente).
    NOTA: Durante lo sviluppo del metodo, i PrIS sono stati suddivisi in due metodi diversi, uno per gli TA mono- e disostituiti e uno per gli TA trisostituiti, sebbene possano essere divisi o combinati in qualsiasi modo.
  6. Compilare un secondo metodo MS che includa i parametri nel passaggio 2.4.
    1. A questo metodo MS/MS, aggiungere NLS in modalità positiva uguale alla lunghezza del metodo LC, con energie della cella di collisione di -20 V e tempi di evento di 0,75 s. Assicurarsi che in tutti i casi le funzioni di esclusione automatica degli isotopi o di de-isotopo siano abilitate.
    2. Assicurarsi che le masse neutre di perdita di interesse per gli esteri sugli AT (in Da, vedere la Figura 1B) siano 100,05 (per gli esteri derivati dall'acido tiglico, finestra di massa di 110-1000 Da), 60,03 (per i gruppi acetilici, finestra di massa di 100-1000 Da) e 166,06 (esteri fenillattici o di acidi tropici, finestra di massa di 170-1000 Da).
  7. Scarica il metodo LC-MS e crea i file di dati per i campioni di interesse. Una volta che la colonna HPLC è stata bilanciata a 45 °C, analizzare i campioni di interesse in un batch o in un file di progetto con opportuni bianchi di solvente di estrazione tra diverse specie o tipi di tessuto. Un volume di iniezione tipico è di 10-20 μl.
    NOTA: A volumi particolarmente elevati, il rivelatore dello spettrometro di massa può essere saturo. Se si eseguono campioni molto concentrati, assicurarsi che la sorgente ESI sia pulita e che lo strumento sia accordato regolarmente. Il protocollo può essere messo in pausa dopo la raccolta di tutti i dati.

3. Analisi dei dati

  1. Esaminare il cromatogramma ionico totale delle scansioni Q1 e Q3 (e la scansione ionica del prodotto DD) e annotare la massa madre di tutti gli ioni abbondanti che hanno caratteristiche simili a TA: a) massa <500 Da per lo ione [M+H]+ , di solito una massa pari, b) r.t.s tipica tra 2-22 min utilizzando il metodo LC di cui sopra, e c) frammenti dal seguente elenco: m/z 93, 124, 142, 140, 122, 138, 156, 174, 110 o 128 Da.
  2. Esaminare il cromatogramma/canale PrIS per m/z 124 e notare quali picchi/ioni sono i quali r.t.s (registrati nel passaggio 3.1) producono questo frammento. Fare clic scansione per scansione attraverso il cromatogramma ed esaminare gli spettri MS/MS completi ottenuti nella scansione ionica del prodotto DD, in particolare per le specie a bassa abbondanza.
    NOTA: Una vera specie contenente questo frammento esisterà per più scansioni e apparirà sia nelle scansioni Q1 che Q3 (se quest'ultima viene utilizzata). Un foglio di calcolo è allegato alle informazioni di supporto (file supplementare 1) per facilitare le annotazioni.
  3. Ripetere il passaggio 3.2 con gli altri cromatogrammi PrIS. Poiché sia m/z 122 che 140 sono indicativi di TA disostituiti e sia m/z 138 che 156 sono indicativi di TA trisostituiti, esaminare questi cromatogrammi/canali insieme.
  4. Esaminare il cromatogramma/canali NLS per m/z 100, 60 e 166 e annotare quali picchi/ioni in cui r.t.s (registrati nel passaggio 3.1) producono queste perdite neutre. Come per la PrIS, fare clic scansione per scansione attraverso il cromatogramma e confrontare con la frammentazione ottenuta nella scansione ionica del prodotto DD, in particolare per le specie a bassa abbondanza.
  5. Utilizzando la combinazione di dati PrIS e NLS, supportati dai risultati della scansione ionica del prodotto DD, effettuare annotazioni putative degli alcaloidi osservati aggiungendo la massa di tropane più piccola (ad esempio, 124, 122 o 138) e la perdita neutra e quindi tenendo conto della massa rimanente rimanente.
    NOTA: I gruppi tipici che sostituiscono gli TA (e le loro masse in Da) sono l'ossidrile (18), l'acetil (60), il propionile (74), l'isobutirrile (88), il tigloil (100), il tigloile/2-metilbutirrile saturo (102) o il fenillattato/acido tropicale (166).
  6. Confrontare le annotazioni per gli alcaloidi con quelle riportate in letteratura17 e nei database (ad esempio, MoNA)26 per determinare quali modelli di sostituzione TA sono riportati (e quali sono potenzialmente nuovi). Inoltre, utilizzare gli standard di alcuni alcaloidi tropanici comuni (ad esempio, atropina, littorina, scopolamina) che sono disponibili in commercio per la conferma.
  7. Per ulteriori informazioni strutturali per campioni a bassa abbondanza (PrIS e NLS possono rilevare ioni al di sotto delle soglie di eventi dipendenti), raccogliere una scansione ionica specifica del prodotto (utilizzando la massa di interesse come ione precursore) su un campione più concentrato.
    NOTA: Questo metodo è stato sviluppato su uno strumento QQQ a bassa risoluzione. Per tutti i nuovi composti putativi, dovrebbe essere utilizzato uno strumento MS ad alta risoluzione per ottenere spettri di massa accurati.

Risultati

Per dimostrare l'efficacia del metodo, è stata analizzata come controllo positivo una miscela standard di TA (10 μg/mL ciascuno di una miscela di acetiltropina/acetilpseudotropina [monosostituita], 10 μg/mL di una miscela di due isomeri anisodamina [disostituiti], insieme a iosciamina [monosostituita], littorina [monosostituita] e scopolamina [trisostituita]) (Figura 2). Nella Figura 2A è mostrato un cromatogramma a scansione Q1 completo (visualizzato nella vista del cromatogramma di picco di base), con le strutture standard TA indicate dai picchi corrispondenti. Il PrIS per m/z 124 (Figura 2B) mostra i picchi nel suo cromatogramma per gli TA monosostituiti; ergo, vengono visualizzati il mix acetiltropina/pseudotropina, iosciamina e littorina. I picchi corrispondenti all'acetiltropina e alla pseudotropina nel cromatogramma m/z 124 sono piccoli (probabilmente perché sono a una concentrazione inferiore rispetto agli altri standard e forse perché potrebbero produrre un frammento m/z 124 meno abbondante rispetto agli altri TA monosostituiti). Ciononostante, sono ancora rilevabili sia in questo cromatogramma che nel corrispondente canale PrIS. La Figura 2C e la Figura 2D sono cromatogrammi PrIS rispettivamente per m/z 122 e 140. Rilevando frammenti di TA disostituiti, entrambi segnalano i due isomeri dell'anisodamina, con un segnale più forte visibile sul canale m/z 140. Poiché diversi TA possono possedere frammenti di intensità diverse, i canali m/z 122 e 140 devono essere esaminati insieme. Infine, i canali m/z 156 (Figura 2E) e m/z 138 (Figura 2F), diagnostici per TA trisostituiti, mostrano entrambi un picco per la scopolamina (l'unico TA trisostituito nella miscela standard).

I cromatogrammi NLS sono stati quindi utilizzati per assegnare i gruppi estere presenti. La Figura 2G mostra il cromatogramma NLS per 60 Da (perdita di acido acetico dagli esteri dell'acetato): sono visibili i due isomeri TA acetilati monosostituiti. Il cromatogramma NLS per 166 Da (Figura 2I), destinato a identificare gli esteri fenillattici o tropici, identifica correttamente tutti gli alcaloidi contenenti uno di questi gruppi (iosciamina, littorina, i due isomeri dell'anisolamina e scopolamina). Infine, come previsto, il cromatogramma (Figura 2H) per la perdita di 100 Da (diagnostica degli esteri tigloilici) è in bianco per l'eccezione di un'impurità minore a r.t. 1,75 min, poiché nessuno degli alcaloidi standard contiene questo gruppo.

Il metodo è stato quindi testato per verificare la presenza di falsi positivi. Un estratto di acqua/metanolo di foglia di pomodoro (Solanum lycopersicum) è servito come controllo negativo. Nonostante siano belladonna, i pomodori non producono TA. Nella Figura 3A è mostrato un cromatogramma base-picco completo con scansione Q1. Il PrIS per m/z 124 (Figura 3B) è per lo più vuoto, con piccole fluttuazioni di base che sono probabilmente rumore del rivelatore (nessun segnale corrispondeva a quelle masse nelle scansioni Q1 o Q3). Due caratteristiche con r.t.s di 2,6 e 3,4 min producono un frammento di 124, ma l'esame della scansione ionica del prodotto DD rivela che queste caratteristiche non producono altri frammenti di tropanico monosostituiti (m/z 93 o 142), suggerendo che non sono TA. Questo esempio evidenzia anche l'utilità di includere la scansione ionica del prodotto DD in questo metodo per escludere i falsi positivi. Allo stesso modo, anche il canale m/z 122 per TA disostituiti (Figura 3C) mostra solo rumore. I cromatogrammi PrIS per m/z 140, m/z 138 e m/z 156 e i tre NLS, che suggeriscono solo caratteristiche non TA nelle scansioni DD, sono mostrati nella Figura supplementare 1A-F.

Per dimostrare gli usi di questo metodo nella dereplicazione di un campione contenente TA, è stato analizzato un estratto di radice di D. metel var. Le radici sono il sito principale della biosintesi dell'AT nelle belladonna e si prevede che siano presenti molti TA diversi. Il cromatogramma a scansione Q1 completo è mostrato nella Figura 4A. Come previsto, numerose caratteristiche di varia abbondanza sono state rilevate sui Pris per m/z 124 (Figura 4B), m/z 122 (Figura 4C), m/z 140 (Figura 4D), m/z 156 (Figura 4E) e m/z 138 (Figura 4F). Molti di questi TA erano anche acetilati o tigloilati, o derivati dall'acido fenillattico/tropico, come mostrato dai numerosi segnali nei cromatogrammi NLS nella Figura 4G-I, rispettivamente.

Un foglio di calcolo, fornito come file .xls (un foglio vuoto per l'uso da parte del lettore è il File Supplementare 1, D. metel root è nel File Supplementare 2), è stato utilizzato per documentare per la prima volta quali caratteristiche (masse o r.t.s) apparivano simili a TA (utilizzando i criteri del passaggio 3.1). Successivamente, sono stati notati frammenti e perdite neutre appartenenti a queste caratteristiche. Il metodo è estremamente sensibile: i canali PrIS hanno persino rilevato facilmente TA a bassa abbondanza che non hanno prodotto picchi visibili sui cromatogrammi corrispondenti. Utilizzando i frammenti e le perdite neutre, è stato possibile proporre una struttura per l'alcaloide seguendo il passaggio 3.5.

Un esempio di utilizzo dei dati spettrali per annotare gli alcaloidi è fornito nella Figura 5. Il cromatogramma a scansione Q1 completo per la radice di D. metel si trova nella Figura 5A. È stata selezionata una funzione a 14,4 minuti; lo spettro di scansione Q1 (Figura 5B) mostra una massa madre di m/z 224 per questo picco. Lo spettro di scansione ionica del prodotto DD è mostrato nella Figura 5C. Il canale PrIS per m/z 124 (Figura 5D) indica che lo ione 224 produce questo frammento (visibile anche nella scansione ionica del prodotto DD). Il canale NLS per 100 Da (per rilevare i TA tigloilati) contrassegna anche m/z 224 (confermato anche dalla scansione ionica del prodotto DD). Sommando la perdita neutra e il frammento TA di massa più bassa (100 + 124 Da) si ottiene la massa originaria, 224, confermando che il gruppo tigloil è l'unica sostituzione; una struttura probabile per questo alcaloide è indicata nella Figura 5C. Per gli TA di- e tri-sostituiti, le masse di perdita neutre osservate sono state aggiunte alla massa TA più bassa, e poi è stata proposta un'altra sostituzione per tenere conto della massa rimanente: ad esempio, m/z 222, con frammenti di TA disostituiti di 140 e 122 e una perdita neutra di 100 Da, ha una massa residua di 100 (222-122 = 100), probabilmente un secondo gruppo di tigloili. Questo flusso di lavoro può essere utilizzato in modo intuitivo per il processo di eliminazione: una funzione priva di frammenti di tropane (anche se può perdere 60, 100 o 166 Da) è improbabile che sia un TA. In un esempio di dereplicazione completa e rapida utilizzando questo flusso di lavoro, sono stati identificati 71 TA distinti di varia abbondanza e polarità nella radice di D. metel , inclusi più composti isomerici (File supplementare 2). Alcuni di questi composti avevano gruppi estere che non potevano essere facilmente assegnati e alcuni composti aggiuntivi erano contrassegnati come potenziali TA, ma non potevano essere annotati con elevata sicurezza.

È stato analizzato anche un estratto di metanolo/acqua di semi macinati di D. stramonium . Il cromatogramma base-picco a scansione Q1 completo per la radice di D. metel è mostrato nella Figura 6A. Il PrIS per m/z 124 è mostrato nella Figura 6B e il PrIS per m/z 122 è mostrato nella Figura 6C; gli altri cromatogrammi sono mostrati nelle figure supplementari 2A-F. La Figura 6B indica un alcaloide tropanico monosostituito molto abbondante a r.t. = 12,6 min, probabilmente iosciamina. Il foglio di calcolo che mostra le annotazioni TA iniziali è incluso nel file supplementare 3. Le prestazioni del metodo sembravano inferiori con questo particolare campione: due caratteristiche molto abbondanti con un m/z di 259 a r.t.s di 8,5 e 10,2 minuti hanno prodotto picchi sui cromatogrammi NLS per 60 e 100 Da (Figura supplementare 2 D,E) con una massa di m/z 260 (un isotopo M+1) indicata sugli spettri corrispondenti. Questi composti non sono TA, ma frammenti formati coerenti con gli alcaloidi beta-carbolina 27. Non sono acetilati o tigloilati, ma perdono 60 o 100 dal loro isotopo M+1, rendendo la loro comparsa su questi due canali NLS errata. Inoltre, la scopolamina (r.t. = 10,5 min) ha prodotto un frammento m/z 122 dal suo picco isotopico m/z 305 M+1, un isotopo del frammento m/z 121 atteso dalla scopolamina. Anche se questi metodi impiegano funzioni di deisotopo, è possibile una certa "perdita" isotopica a queste alte concentrazioni del campione. Sebbene questo possa essere un evento unico per lo strumento utilizzato in questo studio o in questo campione, vale la pena notarlo.

Quaranta TA sono stati annotati nei semi di D. stramonium utilizzando questo metodo, inclusi diversi che sembrano essere glicosilati, perdendo masse di 162 (esoso), 146 (deossiesoso) o 132 Da (xilosio o uno zucchero simile). Mentre gli TA contenenti esoso sono stati riportati in Merremia (Convolvulaceae)28, Duboisia29 e Atropa25, questa è la prima segnalazione di TA contenenti deossiesoso o xilosio. Un TA aveva una r.t. di 13,8 min (Figura 7A) e una massa di m/z 436 (scansione Q1 in Figura 7B). Questa caratteristica produceva un segnale sul canale m/z 124, indicando un TA monosostituito (Figura 7D), ma non produceva segnali su nessun altro canale PrIS o NLS. La scansione ionica del prodotto DD (Figura 7C) ha indicato l'atteso m/z 124, una perdita di 312 Da, forse 166 + 146 Da, dallo ione genitore. La MS/MS ad alta risoluzione è stata ottenuta su uno strumento a tempo di volo a quadrupolo (spettro in Figura 7E), che indicava un frammento m/z 290, suggerendo iosciamina o littorina glicosilata sulla porzione di estere ossidrile con ramnosio o uno zucchero simile; la massa accurata misurata era anche molto vicina alla massa esatta calcolata per la ramnosil-iosciamina o la littorina (struttura in Figura 7E). A causa della sua struttura e abbondanza senza precedenti, questo alcaloide merita di essere isolato dai semi di D. stramonium , un esempio che dimostra l'uso di questo metodo nella scoperta di nuovi alcaloidi.

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Figura 1: Frammenti rilevanti e perdite osservate negli MS di TA. (A) Frammenti caratteristici (e le loro masse diagnostiche) formati da TA monosostituiti, disostituiti e trisostituiti, nonché esempi rappresentativi di alcaloidi in ciascuna classe. (B) Perdite neutre comuni osservate dai gruppi estere negli AT (e le loro masse diagnostiche). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Scansioni di controllo positivo dello ione precursore e della perdita neutra. Per tutti i cromatogrammi, l'asse X è il tempo di ritenzione e l'asse Y è il conteggio (abbondanza di ioni). (A) Il cromatogramma ionico totale, nella vista del cromatogramma base-picco, della miscela standard di alcaloidi. Sono indicate le strutture delle norme; I picchi corrispondenti sono indicati da frecce rosse. (B-F) sono cromatogrammi PrIS per (B) m/z 124, (C) 122, (D) 140, (E) 156 e (F) 138. (G-I) Cromatogrammi NLS per 60 Da (acetile, G), 100 Da (tigloil, H) e 166 Da (acido fenillattico/tropico, I). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Scansioni con controllo negativo di ioni precursori e perdite neutre. Per tutti i cromatogrammi, l'asse X è il tempo di ritenzione e l'asse Y è il conteggio (abbondanza di ioni). (A) Il cromatogramma ionico totale, in vista del cromatogramma base-picco, di un estratto di metanolo/acqua di foglia di S. lycopersicum . (B) Il cromatogramma PrIS per m/z 124 che mostra solo due caratteristiche non tropaniche a r.t. 2,6 e 3,4 min. (C) Il cromatogramma PrIS per m/z 122, bianco tranne che per il rumore del rivelatore. Le scale utilizzate sono le stesse della Figura 2; i restanti cromatogrammi sono riportati nella Figura 1 supplementare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Applicazione del metodo MS/MS alle radici di D. metel var. Per tutti i cromatogrammi, l'asse X è il tempo di ritenzione e l'asse Y è il conteggio (abbondanza di ioni). (A) Il cromatogramma ionico totale, in vista del cromatogramma base-picco, di un estratto di metanolo/acqua di radici di D. metel var. (B-F) sono cromatogrammi PrIS per m/z (B) 124, (C) 122, (D) 140, (E) 156 e (F) 138. (G-I) sono cromatogrammi NLS per 60 Da (acetile, G), 100 Da (tigloil, H) e 166 Da (acido fenillattico/tropico, I). Si notino gli abbondanti segnali su ciascun cromatogramma corrispondenti a numerosi TA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Applicazione del metodo combinato di scansione ionica del prodotto DD, scansione ionica precursore e scansione a perdita neutra per proporre la struttura di un TA. (A) Il cromatogramma ionico totale, nella vista del cromatogramma base-picco, di un estratto metanolo/acqua di radici di D. metel var. Un picco a r.t. = 14,4 min è indicato da una freccia rossa. (B) Il Q1 (scansione dell'indagine), con una massa abbondante di m/z 224 per questo picco. Per tutti gli spettri, l'asse X è la massa e l'asse Y è l'intensità. (C) La scansione ionica del prodotto DD, che mostra la frammentazione dello ione m/z 224, indicando una perdita di 100 Da e un frammento m/z 124 (frecce rosse). Questo composto appare sia sul canale (D) m/z 124 PrIS che (E) sul canale NLS 100 Da, indicando che è sia monosostituito che tigloilato (struttura nel pannello C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Applicazione del metodo MS/MS ai semi di D. stramonium . Per tutti i cromatogrammi, l'asse X è il tempo di ritenzione e l'asse Y è il conteggio (abbondanza di ioni). (A) Il cromatogramma ionico totale, nella vista del cromatogramma base-picco, di un estratto di metanolo/acqua di semi di D. stramonium. (B) Il cromatogramma PrIS per m/z 124; (C) raffigura il cromatogramma PrIS per m/z 140. I cromatogrammi rimanenti sono riportati nella Figura 2 supplementare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Annotazione di un nuovo alcaloide nei semi di D. stramonium . Per tutti i cromatogrammi, l'asse X è il tempo di ritenzione e l'asse Y è il conteggio (abbondanza di ioni). (A) Il cromatogramma ionico totale, in vista del cromatogramma base-picco, di un estratto di metanolo/acqua di semi di D. stramonium. Viene indicata una funzione a r.t. = 13,7 min. (B) Il Q1 (scansione dell'indagine) che mostra una massa di m/z 436 per questo picco. Per tutti gli spettri, l'asse X è la massa e l'asse Y è l'intensità. (C) La scansione ionica del prodotto DD che mostra la frammentazione dello ione m/z 436. (D) Questo composto TA monosostituito appare sul canale m/z 124 PrIS. (E) Lo spettro MS/MS ad alta risoluzione per questo nuovo TA, insieme alle strutture proposte e alla massa esatta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 1 supplementare: Scansioni aggiuntive di controllo negativo dello ione precursore e della perdita neutra. (A-C) Cromatogrammi PrIS per m/z (A) 140, (B) 156 e (C) 138. (D-F) Cromatogrammi NLS per 60 Da (acetile, D), 100 Da (tigloil, E) e 166 Da (acido fenillattico/tropico, F). Le scale utilizzate sono le stesse della Figura 2. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 2 supplementare: Applicazione del metodo MS/MS ai semi di D. stramonium; cromatogrammi supplementari. (A-C) sono cromatogrammi PrIS per m/z (A) 140, (B) 156 e (C) 138. (D-F) Cromatogrammi NLS per 60 Da (acetile, D), 100 Da (tigloil, E) e 166 Da (acido fenillattico/tropico, F). Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 1: foglio di calcolo vuoto utilizzato per le annotazioni sugli alcaloidi. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Foglio di calcolo delle annotazioni e delle strutture degli alcaloidi per le radici di D. metel var. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: Foglio di calcolo delle annotazioni e delle strutture degli alcaloidi per i semi di D. stramonium. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Sebbene i parametri dello strumento forniti nel protocollo consentano prestazioni soddisfacenti, l'uso efficace di questo metodo può richiedere un'attenta attenzione o l'ottimizzazione di diversi passaggi critici. Sebbene il gradiente di solvente HPLC fornito nella fase 2.2 sia generalmente appropriato per gli alcaloidi tropanici, potrebbe essere necessario modificarlo a seconda del profilo alcaloide tropanico del campione o della specie vegetale esaminata. Il volume di iniezione del campione può anche essere modificato a seconda della sensibilità dello strumento e di come viene utilizzato il metodo. La profilazione metabolica "profonda" o la dereplicazione dovrebbero utilizzare un volume di iniezione maggiore (in questo studio sono stati utilizzati 15-20 μL), mentre la semplice rilevazione di alcaloidi potrebbe utilizzare volumi più piccoli. Quando si utilizzano grandi volumi di campione, è necessario prestare attenzione per (a) mantenere regolarmente pulita la sorgente ionica, (b) monitorare la colonna HPLC per verificare la presenza di variazioni di pressione o ostruzioni (è necessario utilizzare sempre una colonna di protezione appropriata), (c) prevenire il carry-over tra i campioni e (d) esaminare i cromatogrammi per individuare potenziali "perdite di isotopi" come descritto sopra. Le temperature e le tensioni dell'interfaccia non devono essere modificate in modo significativo rispetto a quelle specificate nel metodo per evitare una frammentazione prematura all'interno della sorgente. Inoltre, sebbene sia consigliata una tensione della cella di collisione di 20 V, potrebbe non fornire un segnale cromatografico ottimale (o frammenti di scansione ionica del prodotto DD diagnostico) per tutti gli TA. Alcuni strumenti e funzioni MS hanno una funzione di "rampa dell'energia di collisione", o la capacità di raccogliere scansioni a energie di collisione multiple o ottimizzate, che potrebbero anche trovare utilità in un metodo come questo30.

Questo metodo MS è anche facilmente modificabile: mentre gli esteri degli acidi tiglici, acetici e fenillattici/tropici sono comuni nelle specie di Datura, i modelli di sostituzione degli esteri TA possono essere diversi in altre piante o campioni. Le masse NLS possono essere modificate per rilevare altri gruppi estere (ad esempio, una perdita di 74 Da per gli esteri propionici) o potenzialmente rilevare glicosilazioni (ad esempio, una perdita di 162 Da per gli esosi). Anche le masse PrIS possono essere modificate. Ad esempio, un TA in entrambi i campioni di Datura (r.t. = 12,5 min; vedi File supplementare 1 e File supplementare 2) è stato annotato come noriosciamina o norlittorina (iosciamina/littorina meno il gruppo N-metile tropanico) in base ai frammenti di scansione ionica del prodotto DD (m/z 110 e 93) e corrisponde agli spettri di letteratura31; questo TA non è apparso su nessuno dei canali PrIS del frammento di tropane. Potrebbe essere aggiunto un canale per queste due masse per rilevare i nortropane. Il frammento m/z 93 è presente anche nella maggior parte degli TA17 monosostituiti; l'aggiunta di questo canale potrebbe fornire un'ulteriore conferma della presenza di un TA monosostituito e contribuire a ridurre i falsi positivi.

Oltre alla sua adattabilità a diversi tipi di TA, uno dei principali vantaggi di questo protocollo (rispetto ai metodi di annotazione degli alcaloidi esistenti) è la sua velocità. A seconda della configurazione del metodo MS (e del tempo di esecuzione HPLC utilizzato), tutti i dati MS/MS per un campione possono essere raccolti entro 60-90 minuti. Ad esempio, durante i nostri studi, i TA Pris mono- e di-sostituiti sono stati integrati in un metodo, i TA Pris trisostituiti in un altro metodo e gli NLS erano in un terzo (tutti i metodi contenevano la scansione ionica del prodotto DD), per un totale di tre iniezioni a trenta minuti ciascuno. L'annotazione completa del campione utilizzando i dati MS/MS combinati è molto più veloce rispetto all'esame manuale di ogni picco o alla raccolta di scansioni ioniche di singoli prodotti per numerosi picchi di interesse. Questo metodo può essere eseguito su qualsiasi strumento con scansione ionica del prodotto, modalità PrIS e NLS e può essere utilizzato per una rapida valutazione qualitativa (ad esempio, gli AT sono presenti o assenti?), per distinguere o "fingerprinting" diversi generi di piante, specie, varietà o cultivar, organi o stadi di crescita e per confrontare gli AT osservati con quelli riportati (come parte di un flusso di lavoro di dereplicazione). Come dimostrato, il protocollo può essere utilizzato anche per la scoperta di nuovi TA come lead per l'isolamento, la purificazione o il biodosaggio, nonché per l'identificazione di specie e tessuti candidati da cui isolarli. Questo metodo potrebbe essere utilizzato nei campi dei prodotti naturali e della metabolomica, anche per aiutare a comprendere la biochimica delle piante e per la ricerca di farmaci in fase iniziale. Ulteriori applicazioni potrebbero essere trovate nella sicurezza alimentare o nella medicina legale (ad esempio, rilevamento di TA negli alimenti, negli integratori o nei biofluidi).

Il metodo presenta diversi inconvenienti che meritano di essere discussi. Innanzitutto, a seconda dello strumento utilizzato e dello scopo dell'utilizzo del protocollo, potrebbe essere necessario un volume di iniezione del campione elevato, che potrebbe causare problemi di prestazioni dello strumento e il potenziale di falsi positivi in alcuni casi (come descritto sopra). In secondo luogo, questo metodo è stato sviluppato su uno strumento QQQ a bassa risoluzione e dalla bassa risoluzione potrebbero derivare falsi positivi (ad esempio, la caratteristica contenente un frammento m/z 124 nel controllo negativo che non è un TA). Uno strumento a risoluzione più elevata fornirebbe una migliore capacità diagnostica e si dovrebbero ottenere spettri MS/MS di massa accurati per ogni nuovo alcaloide proposto. Ulteriori svantaggi di questo metodo sono semplicemente gli svantaggi dell'analisi MS/MS nel suo complesso. Sebbene la MS/MS sia utile per proporre strutture ("annotazione" come designato dalla Metabolomics Standards Initiative32), non fornisce assegnazioni concrete di connettività molecolare ("identificazione"). Ad esempio, in entrambi i campioni di Datura, abbiamo trovato diversi isomeri di un m/z 306 TA, che sembravano avere sia m/z 124 che m/z 140 frammenti (File supplementare 2), rendendo così difficile l'assegnazione definitiva del modello di sostituzione. Questo potrebbe rappresentare un meccanismo di frammentazione non ancora scoperto, e un'altra tecnica (come la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare) potrebbe essere utile per risolvere le ambiguità. I metodi basati su MS/MS spesso lottano con l'isomeria: l'estere dell'acido fenillattico littorina (o suoi derivati) è difficile da distinguere dalla iosciamina (estere dell'acido tropico) e altre piante solanacee contengono TA sostituite con i gruppi isomerici tigloile, senenecioil e angeloil33,34; In assenza di standard, questi composti potrebbero essere difficili, se non impossibili, da distinguere. Il metodo inoltre non differenzia gli enantiomeri (ad esempio, 3,6- vs. 3,7-diidrossitropane; vedi Figura 1 per la numerazione) o i regioisomeri (ad esempio, distinguendo il 3-acetil dal 7-acetil senza uno standard). Abbiamo assegnato la maggior parte dei tropani monosostituiti come 3-sostituiti sulla base di modelli precedenti riportati nel genere Datura e in altre piante solanacee17,35. Ergo, qualsiasi conoscenza biochimica o letteratura sull'organismo studiato (se disponibile) dovrebbe sempre essere consultata insieme a qualsiasi analisi strumentale.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato da una borsa di ricerca della facoltà (Northern Michigan University, assegnata a M.A.C.), da una borsa di ricerca universitaria (Northern Michigan University, assegnata a J.C) e dal Dipartimento di Chimica. Gli autori desiderano ringraziare John Berger (NMU) per l'assistenza nella preparazione dei tessuti vegetali, Hannah Hawkins (NMU) per la manutenzione della LC-MS e l'assistenza nella risoluzione dei problemi, e il Dr. Ryan Fornwald e i suoi studenti CH 495 (Natural Products Synthesis) per la loro preparazione della miscela di acetiltropina. Gli autori desiderano anche ringraziare il Dr. Daniel Jones (Michigan State University) per l'acquisizione di spettri MS/MS ad alta risoluzione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acetonitrile, per UHPLC, adatto per spettrometria di massaSigma-Aldrich900667Solvente HPLC
Gas argonAirGasAR UHP300CID gas
Acido formico, 99% per analisiThermo ScientificAC270480010Additivo HPLC
Supporto colonnadi protezione Restek25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D PlusShimadzu228-65802-58Colonna HPLC
LCMS, Shimdazu LCMS-8045Shimadzu225-31800-44Spettrometro di massa; abbiamo eseguito il software LabSolutions, che è standard per gli strumenti Shimadzu
Azoto liquidoAirGasNI 180LT22
Metanolo, per HPLC/UHPLC/LCMSVWRBDH 85800.400Per la produzione di solventi di estrazione
Microcentrifuga VWR2400-37
Provette per microcentrifuga, 1,5 mLFisher Scientific05-408-129
Mortaio Fisher ScientificFB961CPer la macinazione di tessuti vegetali
PestelloFisher ScientificFB961MPer la macinazione di tessuti vegetali
Pipetta 1000 mLGilson 
Puntale per pipetta 1000 mLFisher scientific02-707-404
Tessuti vegetaliVarie fontiN/APuò essere qualsiasi cosa selvatica o coltivata
Provette coniche in polipropilene, 15 mLFisher Scientific05-539-4
Refrigeratore in polistireneULINES-18312Il tipo di refrigeratori in cui vengono spediti i reagenti per la biologia molecolare sarebbe
appropriato Roc C18 3 µ m, 100 mm x 4,6 mmColonna HPLCRestek9534315
Roc C18, 10 mm x 4 mmColonna Restek953450210Guard
Agitatore a dondoloThemo Scientific11-676-680
Kit convenienza per fiale con filettatura a vite (9 mm)Fisher scientific13-622-190Fiale per autocampionatore LCMS
Siringa, 3 mLFisher Scientific03-377-27
Filtro per siringa 0,45 & micro; m Avantor/VWR76479-008
Acqua, per l'uso in cromatografia liquida e spettrometria di massaJT Baker9831-03Per la produzione di solvente da estrazione
Soluzione acquosa, contiene lo 0,1% v/v di acido formico, Per UHPLC, adatto per spettrometria di massaSolvente HPLCSigma-Aldrich900687-1L
F144059M

Riferimenti

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