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Articolo metodologico

Un modello di ratto di pouchite dopo proctocolectomia e anastomosi anale con destrano solfato

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DOI:

10.3791/66623

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31 maggio 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Surgery, Tianjin Medical University General Hospital, 2Tianjin General Surgery Institute, 3Department of General Surgery, Zibo Municipal Hospital, 4Department of General Surgery, Binzhou Medical University Hospital

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive il metodo per stabilire un modello di acacite nel ratto. Il modello della sacca ileale è stato creato eseguendo un intervento chirurgico di anastomosi anale della sacca ileale (IPAA) utilizzando tecniche microchirurgiche. Dopo l'intervento chirurgico, il ratto è stato trattato con destrano solfato di sodio (DSS) al 4% per 4 giorni.

Abstract

La colite ulcerosa (CU) è una malattia cronica immuno-mediata che colpisce l'intero colon e il retto con un decorso recidivante e recessivo, causando morbilità per tutta la vita. Quando il trattamento medico è inefficace, soprattutto in caso di sanguinamento gastrointestinale massivo, perforazione, megacolon tossico o cancerogenesi, la chirurgia diventa l'ultima linea di difesa per curare la colite ulcerosa. La resezione totale del colon-retto e l'anastomosi ileale-tasca (IPAA) offrono le migliori possibilità di trattamento a lungo termine. La bachite è la complicanza postoperatoria più comune e problematica. In questa indagine, la microchirurgia viene impiegata per creare un modello di sacca ileale in ratti sperimentali tramite chirurgia IPAA. Successivamente, viene stabilito un modello di pouchite di ratto sostenuto inducendo l'infiammazione della sacca ileale con destrano solfato di sodio (DSS). Il successo dell'instaurazione della pouchite di ratto è convalidato dall'analisi dello stato generale postoperatorio, del peso, dell'assunzione di cibo e acqua, dei dati fecali, nonché della patologia tissutale della sacca, dell'immunoistochimica e dell'analisi dei fattori infiammatori. Questo modello animale sperimentale di pouchite fornisce una base per lo studio della patogenesi e del trattamento della condizione.

Introduzione

La pouchite è un'infiammazione aspecifica che colpisce la sacca ileale ed è una complicanza prevalente dopo proctocolectomia totale e anastomosi ileale-anale (IPAA) in individui con colite ulcerosa (UC)1,2,3. Questa condizione ha un tasso di occorrenza relativamente alto, fino al 50%, e può causare varie manifestazioni cliniche, tra cui diarrea, dolore addominale, perdita di sangue fecale e febbre. La causa esatta della pouchite rimane sfuggente, anche se alcuni ricercatori ritengono che un cambiamento nella flora della pouch possa innescare l'attivazione immunitaria e la conseguente infiammazione 4,5,6,7.

A causa delle sfide associate alla conduzione di studi clinici sulla pouchite, i modelli animali possono fungere da strumenti preziosi per lo studio dei farmaci e dei meccanismi della pouchite. Ci sono crescenti preoccupazioni per quanto riguarda la creazione di sacche ileali di ratto, con rapporti che indicano una possibile infiammazione8. Tuttavia, la ricerca in questo campo rimane scarsa a causa della natura complessa del processo di produzione, che manca di linee guida chiare 9,10. Nel 1998, Lichtman è stato il primo a stabilire un modello di sacca ileale nei ratti Lewis e nei ratti Sprague-Dawley (SD) eseguendo la colectomia totale11. Hanno osservato l'infiltrazione di macrofagi, l'ulcerazione della mucosa e un aumento della flora batterica anaerobica all'interno dell'intestino di questi ratti, fornendo una solida base per ulteriori ricerche sull'infiammazione della sacca ileale. Questo modello sperimentale di pouchite di ratto imita da vicino i segni fisici e i meccanismi sottostanti osservati nella pouchite umana.

I modelli preclinici di colite ulcerosa comunemente applicati includono i modelli DSS e TNBS. L'acido chimico 2,4,6-trinitrobenzensolfonato (TNBS) simula tipicamente la malattia di Crohn12. Il modello DSS, rispettato per la sua efficacia, profilo di sicurezza e convenienza, è spesso utilizzato come strumento affidabile per l'induzione della CU a causa degli evidenti sintomi osservati. Data la colonizzazione del tessuto della sacca, abbiamo indotto con successo un modello di pouchite utilizzando DSS13,14.

Nel presente studio, la microchirurgia è stata utilizzata per creare con successo un modello di sacca ileale in ratti sperimentali tramite chirurgia IPAA. Successivamente, è stato stabilito un modello di pouchite di ratto sostenuta inducendo l'infiammazione della sacca ileale con DSS. L'accuratezza durante l'intervento chirurgico è essenziale per il successo della formazione del modello e anche l'assistenza postoperatoria è fondamentale. Questo modello può essere utilizzato per studiare la patogenesi della pouchite, valutare potenziali agenti terapeutici e approfondire la nostra comprensione di questa complessa condizione. Lo studio semplifica la procedura di produzione della sacca ileale, riducendo la durata dell'operazione e aumentando l'efficienza, stabilendo così una solida base per la ricerca fondamentale sui disturbi post-chirurgici della sacca.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le politiche dei comitati etici dell'Ospedale Generale dell'Università di Medicina di Tianjin. Per questo studio sono stati utilizzati ratti maschi di Sprague-Dawley di età compresa tra 9 e 12 settimane, del peso di circa 320-360 g. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Selezione e mantenimento degli animali

  1. Seleziona un animale sano (peso corporeo di ~220-240 g).
  2. Assicurarsi che soddisfino i criteri del livello di assenza di agenti patogeni specifici (SPF)15 e che siano allevati in modo adattivo per un minimo di 2 settimane in un ambiente con ventilazione adeguata (da 8 a 12 ricambi d'aria all'ora), una temperatura confortevole (20-25 °C), un'umidità adeguata (40%-70%), un rumore minimo (inferiore a 70 decibel) e un ciclo di luce naturale (12 ore di luce e 12 ore di buio).
  3. Durante questo periodo, alloggiali in gabbie pulite standard a una densità da tre a cinque per gabbia e cambia la lettiera due volte alla settimana. Fornire l'accesso ad libitum a cibo e acqua, nonché mangimi di manutenzione standard per ratti da laboratorio.

2. Preparazione preoperatoria

  1. Seleziona un ratto sano con un peso corporeo approssimativo compreso tra 320 g e 360 g. Digiunare il ratto per 8-12 ore prima dell'operazione e fornire l'accesso a una soluzione di soluzione fisiologica salina e glucosio al 5% in un rapporto 1:1 per il consumo volontario.
  2. Preparare gli strumenti microchirurgici autoclavati (immersione preoperatoria in alcool per 1 ora), un microscopio, un tavolo da dissezione per ratti, 8-0 sutura ad alto peso molecolare non assorbibile, sutura 4-0 non assorbibile, garza sterile, tamponi di cotone sterili, ecc.

3. Istituzione del modello di sacca ileale per ratti

  1. Iniettare intraperitonealmente una soluzione di pentobarbital sodico all'1% alla dose di 6 ml/kg e l'infiltrazione incisionale dell'anestesia locale con ropivacaina allo 0,5% per anestetizzare il ratto. Mantenere il ratto a una temperatura confortevole durante l'anestesia con una lampada elettrica.
  2. Eseguire la resezione colorettale totale seguendo i passaggi seguenti:
    1. Fissare il ratto in decubito dorsale su un banco anatomico seguendo un protocollo anestetico soddisfacente. Confermare la profondità dell'anestesia con un pizzico di dito del piede. Utilizzare un tagliacapelli da barba per eliminare i detriti di capelli e applicare due volte la soluzione di iodoforo per la sterilizzazione sul campo chirurgico.
    2. Praticare un'incisione sulla linea mediana, lunga circa 6 cm, per sezionare la pelle, la fascia bianca e il peritoneo, fornendo l'ingresso nella cavità addominale. Utilizzare un divaricatore per esporre la superficie peritoneale e coprirla con una garza sterile imbevuta di soluzione fisiologica batteriostatica.
    3. Isolare il flusso vascolare del digiuno terminale, legare la sua origine utilizzando un 8-0 filo di sutura e successivamente reciderlo. Posizionare il moncone cecale, situato a 1-2 cm dalla valvola ileocecale, a riposo, quindi recidirlo.
    4. Iniziare la resezione dell'emicolo destro, legando conservativamente l'emicolo destro e la vena colica media.
    5. Segregare ulteriormente l'arteria mesenterica inferiore e isolare l'arteria rettale inferiore. Continuare l'isolamento lungo il retto fino a un intervallo pari a due centimetri dal bordo anale. Resecare obliquamente il retto distale a circa 45 gradi per evitare la stenosi postoperatoria.
  3. Eseguire la costruzione della sacca a J.
    1. Utilizzare un bisturi al microtomo per separare la sezione trasversale dell'ileo terminale dall'intestino del mesentere, che dovrebbe misurare circa 6-7 cm.
    2. Piega l'ileo terminale a forma di J per creare una sacca per l'ileo. Eseguire l'anastomosi della parete posteriore tramite un punto ad incastro. Aumentare la parete anteriore utilizzando un punto di Connell modificato e mantenere un intestino appropriato per corrispondere alle dimensioni della sezione trasversale del moncone rettale distale.
    3. Rinforza la sacca a forma di J con 8-0 cucitura se necessario. La lunghezza della sacca J deve essere compresa tra 2,5 cm e 3,5 cm.
  4. Eseguire l'anastomosi anale della sacca ileale, IPAA.
    1. Confermare l'assenza di torsione nel mesentere e suturare le pareti laterali della formica dell'apertura della sacca e la parete laterale del moncone rettale a intervalli con un 8-0 filo di sutura per trazione.
    2. Infine, applicare una sutura a blocco continuo a strato intero sia sulla parete anteriore che su quella posteriore.
    3. Verificare l'assenza di sanguinamento attivo e detergere fisiologicamente la cavità addominale con soluzione fisiologica. Chiudere in sequenza la fascia muscolare addominale e la pelle con suture 4-0.
  5. Eseguire la gestione postoperatoria.
    1. Somministrare ketoprofene come analgesia postoperatoria (40 mg/kg, per via sottocutanea) a tutti i ratti dopo la chiusura addominale. Assicurarsi che il ratto sia riscaldato utilizzando una lampada elettrica fino a quando non si verifica il ripristino.
    2. Limitare il consumo di cibo all'animale per un periodo minimo di 72 ore dopo l'intervento per ridurre il rischio di ostruzione intestinale. Consentire l'accesso a una dieta a base di glucosio al 5% ad libitum per reintegrare rapidamente energia e liquidi corporei e regolare la frequenza di alimentazione in base ai modelli di defecazione.
    3. Una settimana dopo l'intervento, iniziare con un'alimentazione limitata e aumentare gradualmente la quantità consumata. Quindi, fornisci ai ratti mangime regolare per roditori da consumare liberamente, tenendo un registro giornaliero della loro assunzione alimentare, dell'assunzione di acqua e del peso corporeo.

4. Definizione del modello di pouchite ileale di ratto con DSS

  1. Eseguire il raggruppamento sperimentale.
    1. Assegnare in modo casuale 12 ratti che sono stati sottoposti a resezione colorettale totale e chirurgia IPAA al gruppo IPAA (Gruppo A, n = 6) e al gruppo pouchite (Gruppo B, n = 6).
    2. Preparare una soluzione di DSS al 4% aggiungendo 4 g di DSS a 100 ml di acqua pura, preparata al momento ogni giorno.
    3. Somministrare il gruppo IPAA e il gruppo pouchite con acqua pura o DSS al 4% rispettivamente dal giorno 31 al giorno 35 postoperatorio. Consentire ai ratti di bere e mangiare liberamente cibo per topi durante i quattro giorni consecutivi di somministrazione.
  2. Eseguire il campionamento della busta.
    1. La mattina del giorno 35, dopo l'operazione, anestetizzare i ratti con un'iniezione intraperitoneale di soluzione di pentobarbital sodico all'1%, somministrando una dose di 6 ml/kg (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati).
    2. Recidere la sacca perpendicolarmente dallo stoma della sacca alla giunzione delle sacche di ingresso e di uscita in ciascun gruppo. Procurarsi il campione della sacca.
    3. Aprire la sacca lungo la linea di sutura della parete anteriore e lavare il canale intestinale con soluzione fisiologica.
    4. Mettere un frammento di tessuto pouch in una provetta da microcentrifuga e refrigerarlo prontamente a -80 °C. Utilizzare questa parte per il rilevamento ELISA di indicatori infiammatori. Fissare la sezione rimanente della busta con il 10% di formaldeide per il punteggio istopatologico e la colorazione immunoistochimica.
    5. Infine, sopprimere il ratto mediante embolia aerea in anestesia profonda (seguendo protocolli istituzionalmente approvati).

5. Analisi istologica

  1. Dopo aver acquisito il tessuto della sacca dal ratto, immergerlo in paraformaldeide al 4% per 24 ore. Successivamente, procedere con i protocolli di disidratazione e incorporamento. Sezione del tessuto processato per l'esame istologico16.
  2. Applicare la colorazione con ematossilina ed eosina per identificare le differenze istopatologiche tra i gruppi. Esamina i campioni al microscopio e scatta fotografie per la documentazione.

6. Dosaggio immunoistochimico

  1. Decerare e disidratare accuratamente le sezioni di tessuto. Quindi, eseguire il recupero dell'antigene raffreddando le sezioni in una soluzione di citrato di sodio e bloccandole con siero bloccante per 20 minuti.
  2. Successivamente, esporre le fette all'anticorpo primario anti-occludina e incubarle per una notte a 4 °C. Successivamente, trattarli con anticorpi secondari per 30 minuti prima della controcolorazione con ematossilina16.
  3. Una volta che le fette si sono asciugate, osservatele e fotografatele al microscopio ottico.

7. Test ELISA

  1. 7.1 Tritare e omogeneizzare i frammenti di tessuto nel tampone di lisi utilizzando la sonicazione per garantire un'omogeneizzazione completa. Utilizzare il surnatante risultante per il rilevamento.
  2. Assegnazione di pozzetti per bianchi, campioni e repliche per gruppo. Determinare la concentrazione proteica leggendo l'assorbanza a 450 nm (valore OD) e conducendo un'analisi di regressione lineare16.

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Risultati

Valutazione delle condizioni generali dei ratti modello di sacca ileale dopo l'insediamento
Dopo che l'operatore ha superato la curva di apprendimento chirurgico IPAA, i ratti hanno tollerato bene l'intervento chirurgico, con una durata chirurgica di 192,94 minuti ± 27,15 minuti, e si sono verificate meno complicanze postoperatorie. Durante il primo periodo postoperatorio, i ratti hanno sperimentato una diminuzione dell'assunzione con la dieta, ma il loro appetito preoperatorio è stato ripristinato en...

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Discussione

La colite ulcerosa (CU) è un'infiammazione intestinale cronica caratterizzata da dolore epigastrico ricorrente, diarrea e feci sanguinolente mucose. Colpisce principalmente il retto e può coinvolgere il colon in progressione a vari livelli. La chirurgia svolge un ruolo cruciale nella gestione dell'UC 17,18,19. Da quando Parks et al.20 hanno introdotto la colectomia totale...

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Etanolo anidroTianjin Fengchuan Chemical Reagent Technology Co., LtdCinaEmatossina-eosina Colorazione
destrano solfato di sodio  Yeasen 60316ES76Utilizzato per indurre l'infiammazione della sacca
Soluzione di formaldeideTianjin Zhiyuan Reagent CompanyCinacolorazione dell'ematossina-eosina
Jiangxi Zhonggan Medical Equipment CompanyCinaUtilizzato per la microchirurgia animale
EmatossilinaPechino Zhongshan Jinqiao CompanyCinaColorazione dell'ematossina-eosina
Interferone e gamma;   Kit di reagenti per la rilevazioneCloud-cloneSEA049RaRilevamento di fattori infiammatori
Kit per la rilevazione di interleuchina-10Cloud-cloneSEA056RaRilevamento di fattori infiammatori
Kit di rilevamento di interleuchina-17Cloud-cloneSEA063RaRilevamento di fattori infiammatori
Kit di rilevamento di interleuchina-6Cloud-cloneSEA079RaRilevamento di fattori infiammatori
IodophorTangpai Medical Equipment Co., LtdCinaUtilizzato per la microchirurgia animale
Strumenti di manipolazione microscopicaAesculapGermaniaUtilizzato per la microchirurgia animale
Occludinaabcam ab216327Test immunoistochimici
Ago da cucitoYangzhou Fuda Medical Equipment Co., LtdCinaUtilizzato per la microchirurgia animale
fattore di necrosi tumorale & alfa; Kit di reagenti di rilevamentoCloud-cloneSEA133RaRilevamento di fattori infiammatori
Microscopio chirurgico binoculare per due personeOPTONGermaniaUtilizzato per la microchirurgia animale
XileneTianjin Yingda Fabbrica di reagenti rari e preziosiCinaColorazione con ematossina-eosina
Garza per

Riferimenti

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