Articolo metodologico

Un modello di ratto di occlusione/riperfusione dell'arteria cerebrale media senza danneggiare la struttura anatomica dei vasi cerebrali

DOI:

10.3791/66635

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17 maggio 2024

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1Department of Neurosurgery, The Third Hospital of Hebei Medical University, 2School of Pharmacy, Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation, Ministry of Education, Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong, Yantai University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo attuale descrive un modello di ratto di occlusione/riperfusione dell'arteria cerebrale media che preserva la struttura anatomica dei vasi cerebrali senza causare danni.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'ictus ischemico rappresenta la causa principale di disabilità e mortalità a lungo termine tra gli adulti in tutto il mondo. I modelli animali di ictus ischemico hanno contribuito in modo significativo alla nostra comprensione dei suoi meccanismi patologici e allo sviluppo di potenziali trattamenti. Attualmente, ci sono due metodi comuni che coinvolgono tecniche di filamento (sutura endovascolare) per indurre modelli animali di ischemia cerebrale. Tuttavia, questi metodi hanno limitazioni intrinseche, come la riduzione della perfusione sanguigna al cervello, il danno al sistema dell'arteria carotide esterna, la ridotta assunzione di cibo e/o acqua e la disfunzione sensoriale del viso. Questo articolo introduce un nuovo metodo per indurre un modello di ictus ischemico di ratto senza compromettere l'anatomia vascolare cerebrale. In questo studio, l'arteria carotide comune (CCA) dei ratti Sprague-Dawley è stata esposta ed è stata praticata un'incisione. Un filamento è stato quindi inserito attraverso l'incisione nell'arteria carotide interna per occludere l'arteria cerebrale media. Dopo 1,5 ore di ischemia indotta, il filamento occludente è stato completamente rimosso sia dall'arteria carotide interna che dal CCA. L'incisione nel CCA è stata successivamente suturata utilizzando suture microchirurgiche 11-0 al microscopio (ingrandimento 4x). Attraverso l'utilizzo di tecniche microchirurgiche per riparare il CCA, questo studio ha sviluppato con successo un metodo unico per indurre un modello di ictus ischemico nei ratti, preservando l'integrità anatomica dei vasi sanguigni cerebrali.

Introduzione

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L'ictus, la principale causa di morte e disfunzione neurologica a lungo termine negli adulti di tutto il mondo, comprende vari tipi, con l'ictus ischemico che rappresenta circa l'81,9% dei casi, mentre l'emorragia cerebrale e l'emorragia subaracnoidea rappresentano rispettivamente il 14,9% e il 3,11. L'ictus ischemico spesso deriva da aterosclerosi o occlusione dell'arteria cerebrale media (MCA), con conseguente riduzione del flusso sanguigno cerebrale locale e conseguente danno cerebrale. Questa riduzione dell'apporto di nutrienti alle cellule ischemiche innesca l'esaurimento dell'energia, causando la perdita di integrità della membrana, il rigonfiamento cellulare e l'eventuale lisi. Inoltre, fattori come l'aumento del calcio intracellulare, il rilascio eccitatorio di aminoacidi, l'aumento della produzione di radicali liberi e l'attivazione delle cellule infiammatorie contribuiscono al danno del tessuto cerebrale post-ictus2.

Gli obiettivi del trattamento per l'ictus ischemico sono molteplici: ridurre il danno neurologico in corso e ridurre la mortalità e la disabilità a lungo termine; prevenire le complicanze derivanti dall'immobilità e dalla disfunzione neurologica; e ridurre al minimo il rischio di recidiva dell'ictus. Data la complessità della fisiopatologia dell'ictus ischemico, un robusto modello di ictus è essenziale per la ricerca e lo sviluppo di trattamenti mirati all'ictus ischemico.

Attualmente, l'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAo) è un modello animale comune di ictus ischemico3. La MCAo viene tipicamente eseguita inserendo un monofilamento con punta in silicone o smussato con fiamma attraverso i vasi cervicali fino a raggiungere l'origine dell'arteria cerebrale media (MCA). Nel 1986, Koizumi e colleghi hanno sviluppato una tecnica che prevede l'inserimento di un monofilamento con punta in silicone attraverso un'incisione nell'arteria carotide comune (CCA), permettendogli di raggiungere l'ingresso dell'MCA e bloccarne il flusso sanguigno4. Nel 1989, il gruppo di Longa riportò un altro metodo MCAo che prevedeva l'introduzione di un monofilamento attraverso un'incisione nell'arteria carotide esterna (ECA). Il monofilamento attraversa quindi la biforcazione dell'arteria carotide interna (ICA) e dell'ECA prima di raggiungere il punto di partenza dell'MCA5.

I limiti dei due metodi esistenti per indurre MCAo sono evidenti. Il metodo di Koizumi richiede il blocco permanente del CCA omolaterale, portando a una ridotta perfusione MCA poiché la riperfusione si basa esclusivamente sul cerchio di Willis4. Al contrario, il metodo di Longa prevede il taglio dell'ECA, con conseguente danno al sistema ECA e conseguente compromissione della funzione dei muscoli facciali5. Questo danno può influire sull'assunzione di cibo e acqua, oltre a causare disfunzioni sensoriali del viso, influenzando la riabilitazione e la valutazione della funzione neurologica post-ictus ischemico6.

L'attuale protocollo cerca di affrontare queste limitazioni sviluppando un nuovo metodo per indurre un modello di ictus ischemico senza danneggiare la struttura anatomica dei vasi cerebrali. Questo nuovo approccio utilizza tecniche microchirurgiche per riparare il CCA, evitando così gli inconvenienti associati ai metodi precedenti.

Protocollo

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La procedura sperimentale ha ricevuto l'approvazione dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Yantai (Numero di Approvazione: YTDX20230410) e ha aderito alle Linee Guida del National Institutes of Health per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio. Per questo studio sono stati utilizzati ratti maschi di Sprague-Dawley di peso compreso tra 300 e 350 g. Un elenco completo degli animali, dei reagenti e delle attrezzature utilizzate è fornito nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione degli animali

  1. Alloggiare gli animali in un ambiente che mantenga un ciclo luce/buio di 12 ore, temperatura e umidità controllate. Assicurati che abbiano accesso illimitato a cibo e acqua.

2. Anestesia

  1. Anestetizzare i ratti mediante iniezione intraperitoneale con una miscela contenente ketamina (80 mg/kg) e xilazina (20 mg/kg).
    NOTA: Inclinare la testa e il corpo dei ratti verso il basso. Il sito di iniezione si trova nel quadrante inferiore destro dell'addome dell'animale. Tirare indietro lo stantuffo prima dell'iniezione. Il volume medio di iniezione è di 0,4 mL.
  2. Confermare l'induzione dell'anestesia valutando il riflesso di ritiro della zampa posteriore e il riflesso di ammiccamento. Se non si raggiunge un'adeguata profondità di anestesia, integrare con isoflurano durante la procedura chirurgica.

3. Procedura di modellazione ischemica

  1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici utilizzando un'autoclave. Disinfettare i tavoli operatori e le relative apparecchiature con etanolo al 70%.
  2. Preparare il sito chirurgico radendo il pelo attorno al sito di incisione previsto. Disinfettare la pelle nel sito chirurgico tre volte con betadina ed etanolo al 70%.
  3. Praticare un'incisione sulla linea mediana sul lato ventrale, lunga circa 1,5 cm, e aprire la fascia superficiale.
  4. Eseguire una dissezione acuta e smussata per esporre l'arteria carotide esterna (ECA), l'arteria carotide interna (ICA) e l'arteria carotide comune (CCA) secondo il metodo precedentemente descritto7.
  5. Posizionare tre suture di seta 4-0 attorno al CCA e un'altra sutura di seta attraverso l'ECA vicino alla biforcazione ICA. Fare un nodo scorsoio sganciabile sul CCA prossimale. Stringere la sutura sul CCA distale usando un emostatico per bloccare il flusso sanguigno. Legare liberamente un altro nodo scorsoio attorno al CCA durante la sutura per assicurarsi che il vaso non sia occluso.
    NOTA: Assicurarsi che il nodo scorsoio non sia eccessivamente stretto, ma solo sufficiente a bloccare il flusso sanguigno, poiché dovrà essere rilasciato durante la sutura vascolare.
  6. Praticare un'incisione di 0,5 mm tra la sutura di seta prossimale e la sutura centrale sul CCA usando le forbici.
    NOTA: Assicurarsi che l'incisione consenta al filamento (punta rivestita di silicone) di entrare nel CCA.
  7. Introdurre un filamento 4-0 lungo 3 cm (punta rivestita di silicone) nel CCA. Stringere le suture di seta attorno al CCA per fissare il filamento intraluminale e prevenire il sanguinamento; quindi, rimuovere la sutura dal CCA distale.
  8. Continuare a inserire il filamento nel lume dell'MCA, controllando le suture attorno all'ECA per assicurarsi che il filamento non entri nell'ECA. La lunghezza di inserimento è tipicamente compresa tra 18 mm e 20 mm.
  9. Avvia un timer e registra l'ora in cui inizia l'occlusione. Sutura l'incisione del collo con suture di seta 3-0 e posiziona con cura l'animale in una gabbia di recupero. Somministrare 0,5 mL di soluzione fisiologica normale per via intraperitoneale.

4. Sutura microchirurgica del CCA

  1. Anestetizzare nuovamente il ratto 1,5 ore dopo l'ischemia. Disinfettare il sito dell'incisione tre volte con etanolo al 70% e riaprire l'incisione.
  2. Ritirare delicatamente il filamento occludente fino a quando la punta bianca è chiaramente visibile vicino all'incisione CCA. Posizionare un micro morsetto orizzontalmente vicino al nodo di sutura intraluminale fissato vicino alla biforcazione CCA.
    NOTA: Evitare di bloccare la punta del filamento bianco per evitare il distacco del silicone e la conseguente trombosi.
  3. Rilasciare il nodo di sutura intraluminale fissato e rimuovere completamente il filamento.
  4. Posizionare un altro micro morsetto vicino al lato dell'estremità del cuore del nodo CCA prossimale. Successivamente, rimuovere il nodo di sutura attorno al CCA.
    prossimale NOTA: Il corretto posizionamento dei morsetti è fondamentale per sollevare i vasi fissi nelle fasi successive per facilitare la sutura microvascolare. Posizionare i morsetti orizzontalmente sui muscoli circostanti per evitare lo scivolamento.
  5. Sciacquare il sito dell'incisione con soluzione fisiologica normale e asciugare l'area con un batuffolo di cotone sterile per rimuovere il sangue e ottenere un campo chirurgico chiaro.
  6. Al microscopio (ingrandimento 4x), suturare l'incisione CCA utilizzando suture microchirurgiche 11-0 in uno schema interrotto, che in genere richiede due punti di sutura a seconda delle dimensioni dell'incisione.
  7. Dopo la sutura, rimuovere i micro morsetti da entrambe le estremità del CCA per ripristinare il flusso sanguigno.
  8. Applicare pressione con un batuffolo di cotone sterile sul sito di sutura CCA per 30 s. Osservare il CCA per 2 minuti per assicurarsi che non si verifichi sanguinamento. Sutura l'incisione del collo del ratto e metti l'animale in una scatola di cura a 35 °C per il recupero dell'anestesia prima di rimetterlo nella gabbia.
    NOTA: Somministrare per via intraperitoneale con meloxicam alla dose di 2 mg/kg per l'analgesia post-operatoria.

5. Colorazione con cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC)

  1. Tre giorni dopo l'ischemia-riperfusione, sopprimere gli animali in anestesia profonda con isoflurano al 4% e lussazione cervicale.
  2. Rimuovete i cervelli e tagliateli in sezioni coronali spesse 2 mm usando una lama di bisturi8.
  3. Incubare le sezioni cerebrali con TTC al 2% per 20 minuti a 37 °C.
  4. Sciacquare due volte le sezioni cerebrali con formalina al 10%, quindi fissarle con formalina al 10% per 30 minuti a temperatura ambiente.
  5. Cattura fotografie digitali di fette consecutive e misura quantitativamente le aree di infarto utilizzando il software Image J.

6. Test di funzionalità neurologica

NOTA: La funzione neurologica è stata valutata utilizzando il test di Garcia, a seguito di un precedente rapporto9.

  1. Valutare l'attività spontanea, la simmetria nel movimento di tutti e quattro gli arti, l'allungamento della zampa anteriore, l'arrampicata, la propriocezione del corpo e la risposta al tocco delle vibrisse. Assegna punteggi in base ai criteri del test di Garcia, con un punteggio massimo di 18 punti che indica una normale funzione neurologica.

7. Analisi statistica

  1. Utilizza GraphPad Prism per condurre analisi statistiche utilizzando il t-test di Student. Esprimere i dati come media ± deviazione standard. Considera le differenze tra le medie statisticamente significative se P < 0,05.

Risultati

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Il processo di microsutura
Il filamento è stato ritirato vicino all'incisione del CCA fino a quando la punta bianca del filamento era visibile (Figura 1A). I micro morsetti sono stati quindi posizionati sul CCA (Figura 1B). Al microscopio con ingrandimento 4x, l'incisione del CCA è stata suturata utilizzando suture microchirurgiche in uno schema interrotto (Figura 1C). Successivamente, i microclamps sono stati rimossi dal CCA, ripristinando la struttura anatomica e il flusso sanguigno (Figura 1D).

Colorazione TTC e tasso di mortalità
Un totale di 12 ratti maschi adulti sono stati divisi casualmente in due gruppi: sham e model (n = 6 in ciascun gruppo). Sfortunatamente, un animale del gruppo fittizio è morto per un'overdose di anestetico e un animale del gruppo modello è morto entro 24 ore. Gli infarti derivanti da ischemia cerebrale sono stati osservati sia nello striato che nella corteccia (Figura 2A). A 3 giorni dall'ictus ischemico, la percentuale totale di infarto è stata misurata tra il 29,3% ± l'1,6% dell'emisfero (Figura 2B), con un tasso di mortalità del 16,7% dopo l'intervento chirurgico.

Valutazione della funzione neurologica
A 1 e 3 giorni dopo l'ictus ischemico, i punteggi dei gruppi modello sono diminuiti significativamente rispetto a quelli dei gruppi fittizi (17,8 ± 0,4 vs. 8,2 ± 1,5, Figura 3A; 17,6 ± 0,9 vs. 9,6 ± 1,3, Figura 3B, rispettivamente).

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Figura 1: Il processo di microsutura. (A) Il filamento viene ritirato dal CCA. Le frecce blu indicano le pinze microvascolari. (B) La freccia nera indica l'incisione dopo che il filamento è stato completamente rimosso. Le frecce blu indicano le pinze microvascolari. (C) Al microscopio (ingrandito 4x), l'incisione CCA è stata suturata utilizzando suture microchirurgiche 11-0 in uno schema interrotto. Le frecce blu indicano le pinze microvascolari. La freccia nera indica l'incisione suturata. (D) I micro morsetti vengono rimossi e il flusso sanguigno del CCA viene ripristinato. La freccia nera indica il sito suturato del CCA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Risultati della colorazione TTC del modello di ischemia. (A) Immagini rappresentative di fette di cervello colorate con cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) dopo ischemia cerebrale. Nei tessuti viventi, il TTC è ridotto enzimaticamente dalle deidrogenasi a 1,3,5-trifenilformazano, che ha un colore rosso. I tessuti nelle aree necrotiche rimangono bianchi a causa dell'assenza di tale attività enzimatica. (B) Percentuale di area ischemica nei ratti a 3 giorni dall'ischemia cerebrale. Rispetto al gruppo Sham, **P < 0,01. I dati sono espressi come media ± deviazione standard. C'erano cinque ratti in ogni gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Valutazione della funzione neurologica. (A) Punteggio di Garcia 1 giorno dopo l'ischemia cerebrale. (B) Garcia segna 3 giorni dopo l'ischemia cerebrale. Rispetto al gruppo Sham, **P < 0,01. I dati sono espressi come media ± deviazione standard. C'erano cinque ratti in ogni gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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MCAo è un metodo ampiamente utilizzato per creare modelli animali di ictus, replicando efficacemente il processo di ictus osservato nei pazienti ripristinando il flusso sanguigno dopo l'ischemia 10,11,12. Il nostro laboratorio ha sviluppato un modello di ictus ischemico che consente la riperfusione dal CCA senza causare danni all'ECA. Dopo l'induzione dell'ischemia, viene eseguita la riparazione microchirurgica del CCA. Sebbene non sia stata condotta la misurazione diretta del flusso sanguigno del CCA, gli sperimentatori hanno osservato pulsazioni vascolari nel CCA prima di procedere con la riperfusione. Questa tecnica preserva l'integrità anatomica dei vasi del collo mentre assomiglia molto al processo di ictus nei pazienti. Inoltre, le valutazioni della funzione neurologica e dell'area di ischemia cerebrale hanno confermato la validità dell'ictus indotto da questo approccio chirurgico.

I modelli di ictus ischemico descritti in precedenza possono essere influenzati da vari fattori. Nel metodo di Koizumi et al.4, la riperfusione sanguigna si basa fortemente sul circolo di Willis a causa della legatura del CCA. Tuttavia, le variazioni della vascolarizzazione cerebrale possono influenzare il volume finale dell'infarto cerebrale, aumentando potenzialmente il tasso di mortalità del modello di ictus a causa della bassa perfusione sanguigna 13,14. Inoltre, l'ischemia dell'ECA può compromettere la funzione dei muscoli facciali e dei nervi, influenzando la valutazione di varie funzioni neurologiche15,16.

Il metodo attuale affronta queste sfide attraverso tre passaggi chiave: (1) Mantenere l'incisione CCA il più piccola possibile, solo quanto basta per l'inserimento del filamento, riducendo il tempo e i danni associati alla sutura vascolare. (2) Posizionare i morsetti microvascolari il più vicino possibile alla biforcazione del CCA durante il bloccaggio del CCA distale per evitare il bloccaggio della punta del filamento bianco, che potrebbe portare al distacco del silicone e alla trombosi. (3) Osservare il CCA per la ripresa della pulsazione e la mancanza di sanguinamento sostanziale prima di suturare l'incisione del collo della linea mediana dopo la riparazione vascolare.

Il metodo attuale presenta diverse limitazioni. In primo luogo, esiste la possibilità di formare emboli nel sito di sutura, che potrebbero portare a un'ulteriore ischemia cerebrale se si staccano. Questo rischio dovrebbe essere attentamente considerato e gestito in esperimenti futuri. In secondo luogo, lo studio non ha monitorato il peso corporeo dei ratti, il che rende difficile determinare se il metodo ha influenzato l'assunzione di cibo. L'assunzione di cibo è un indicatore diretto dei vantaggi del metodo e la sua valutazione potrebbe fornire informazioni preziose. Infine, il metodo attuale richiede competenze tecniche nelle operazioni microchirurgiche, che possono limitarne l'uso diffuso senza un'adeguata formazione e competenza.

In sintesi, sebbene il metodo di modellazione MCAo offra un'elevata rilevanza fisiologica e integrità strutturale, presenta limitazioni che devono essere affrontate per una sperimentazione più robusta. Preservare l'integrità anatomica dei vasi del collo e simulare da vicino i processi di ictus nei pazienti sono punti di forza significativi del metodo. Questo approccio contribuirà senza dubbio in modo significativo alla ricerca sull'ictus ischemico, migliorando l'affidabilità e l'accuratezza dei modelli sperimentali. In definitiva, questo può portare a un minor numero di gruppi sperimentali necessari per testare gli effetti terapeutici, con conseguenti risultati sperimentali più affidabili.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno alcun potenziale conflitto di interessi da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dal progetto di intelligence estera della provincia di Hebei nel 2023. Ringraziamo Lisa Kreiner, PhD, di Liwen Bianji, (Edanz) (www.liwenbianji.cn), per aver curato il testo inglese di una bozza di questo manoscritto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10% formalinaBeijing Labgic Technology Co., Ltd.BL913A
11-0 suture microchirurgicheNingbo Medical Suture Needle Co., Ltd.3/8 1&volte;
2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC)SIGMAT8877
3-0 sutura di setaNingbo Medical Suture Needle Co., Ltd.3-0
4% isoflurano   Fornitore verificato - Tianjin Ringpu Bio-Technology Co., Ltd.
6-0 sutura di setaNingbo Medical Suture Needle Co., Ltd.6-0
70% etanoloShandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd.
FilamentoXinong Technologies Co., Ltd.2838-A5
Ketamina   Fornitore verificato - Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd.230613BL
Maschio Sprague Dawley rattiJinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd.SCXK (Lu) 20190003
MicroclipShanghai Jinzhong Medical Device FactoryW40150
MicroscopioZEISSS100 OPMI pico
Scatola infermieristicaBeijing Fuyi Electrical Appliance Co., Ltd.FYL-YS-100L
XilazinaSIGMAPHR3263
52022110220230408

Riferimenti

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