I batteri colonizzano i tessuti dell'ospite che variano in termini di ossigeno e biodisponibilità del ferro, ma la maggior parte degli approcci allo studio dei batteri utilizza terreni aerati e ricchi. Questo protocollo descrive la coltura del patogeno umano Yersinia pseudotuberculosis al variare delle concentrazioni di ferro e della tensione di ossigeno, e la quantificazione dell'attività del sistema di secrezione di Yersinia di tipo III, che è un importante fattore di virulenza.
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Articolo metodologico
Quantificazione dell'attività del sistema di secrezione di Yersinia pseudotuberculosis di tipo III dopo carenza di ferro e crescita anaerobica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un meccanismo di virulenza chiave per molti patogeni Gram-negativi è il sistema di secrezione di tipo III (T3SS), un'appendice aghiforme che trasloca proteine effettrici citotossiche o immunomodulatorie nelle cellule ospiti. Il T3SS è un bersaglio per le campagne di scoperta antimicrobica poiché è accessibile extracellulare e in gran parte assente da batteri non patogeni. Studi recenti hanno dimostrato che i T3SS di Yersinia e Salmonella sono regolati da fattori sensibili al ferro e all'ossigeno, che sono importanti segnali specifici di nicchia incontrati durante l'infezione dei mammiferi. Qui descritto è un metodo per la carenza di ferro di Yersinia pseudotuberculosis, con successiva integrazione opzionale di ferro inorganico. Per valutare l'impatto della disponibilità di ossigeno, questo processo di carenza di ferro è dimostrato sia in condizioni aerobiche che anaerobiche. Infine, l'incubazione delle colture alla temperatura dell'ospite mammifero di 37 °C induce l'espressione di T3SS e consente la quantificazione dell'attività di Yersinia T3SS visualizzando le proteine effettrici rilasciate nel surnatante. I passaggi qui descritti offrono un vantaggio rispetto all'uso di chelanti del ferro in assenza di carenza di ferro, che è insufficiente per indurre una robusta carenza di ferro, presumibilmente a causa dell'efficiente assorbimento del ferro di Yersinia e dei sistemi di evacuazione. Allo stesso modo, la vetreria da laboratorio con lavaggio acido è dettagliata per garantire la rimozione del ferro residuo, che è essenziale per indurre una robusta carenza di ferro. Inoltre, l'uso di un agente chelante è descritto per rimuovere il ferro residuo dai terreni e coltivare i batteri per diverse generazioni in assenza di ferro per esaurire le riserve di ferro batterico. Incorporando protocolli standard di precipitazione proteica indotta da acido tricloroacetico, SDS-PAGE e colorazione con argento, questa procedura dimostra modi accessibili per misurare l'attività di T3SS. Sebbene questa procedura sia ottimizzata per Y. pseudotuberculosis, offre un quadro di riferimento per studi su patogeni con sistemi di assorbimento del ferro simili e robusti. Nell'era della resistenza agli antibiotici, questi metodi possono essere ampliati per valutare l'efficacia di composti antimicrobici che prendono di mira il T3SS in condizioni rilevanti per l'ospite.
Introduzione
Molti patogeni Gram-negativi clinicamente rilevanti come Yersinia, Vibrio, Escherichia, Pseudomonas e Shigella codificano il sistema di secrezione di tipo III (T3SS) per iniettare proteine effettrici nelle cellule ospiti1. In molte specie batteriche, il T3SS è sotto stretto controllo normativo2. Ad esempio, la traslocazione delle proteine effettrici Yersinia T3SS nelle cellule ospiti bersaglio è fondamentale per sovvertire i meccanismi di difesa dell'ospite e consentire la colonizzazione batterica dei tessuti ospiti. Tuttavia, l'attività di Yersinia T3SS è metabolicamente onerosa e può innescare il riconoscimento da parte dei recettori immunitari dell'ospite3. Di conseguenza, i regolatori che rilevano specifici segnali ambientali controllano l'espressione dei geni T3SS in molte specie batteriche. Poiché i patogeni come la Yersinia subiscono cambiamenti ambientali durante il loro ciclo di infezione che influiscono sull'espressione dei fattori critici di virulenza, è importante sviluppare condizioni di laboratorio che imitino le caratteristiche salienti delle nicchie ospiti occupate da patogeni batterici. In particolare, la tensione di ossigeno e la disponibilità di ferro differiscono tra i vari siti tissutali in modo spazio-temporale e influenzano l'espressione di geni di virulenza come il T3SS 4,5,6. Pertanto, l'obiettivo di questo metodo è valutare come l'ossigeno e il ferro influenzino l'espressione di Yersinia T3SS. Ciò fornirà informazioni sulle dinamiche dell'interazione ospite-patogeno.
Il metodo qui descritto descrive in dettaglio come coltivare la Yersinia pseudotuberculosis in modo aerobico e anaerobico, nonché come esaurire le riserve di ferro di Yersinia durante la crescita aerobica o anaerobica. Ci sono alcune considerazioni importanti evidenziate qui riguardo al successo della coltura dei batteri in queste condizioni variabili. In primo luogo, la coltura anaerobica richiede un'ulteriore integrazione di glucosio, una modifica che viene annotata nella ricetta dei terreni. In secondo luogo, poiché Y. pseudotuberculosis impiega siderofori e altri sistemi di assorbimento del ferro in grado di eliminare in modo robusto il ferro dall'ambiente, viene prestata particolare attenzione a garantire che i terreni di coltura e la vetreria di laboratorio siano il più possibile privi di ferro7. Studi precedenti hanno utilizzato chelanti del ferro come il dipiridile per esaurire il ferro da colture batteriche ricche di terreni per imitare la carenza di ferro 8,9. Tuttavia, l'esaurimento delle riserve di ferro di Yersinia per indurre la carenza di ferro richiede la rimozione del ferro residuo nella vetreria e nei mezzi, nonché una crescita prolungata in assenza di ferro. Questo protocollo descrive in dettaglio come lavare con acido la vetreria e chelare i terreni per rimuovere il ferro residuo, oltre a coltivare i batteri per diverse generazioni per garantire una completa carenza di ferro. La carenza di ferro può essere assicurata misurando i livelli relativi di trascrizione di geni ben caratterizzati che rispondono al ferro in tutte le condizioni, come dimostrato qui con yfeA e bfd.
Il culmine di questo protocollo dimostra come precipitare le proteine effettrici T3SS secrete da ciascuna di queste condizioni trattando il surnatante di coltura con acido tricloroacetico (TCA) e visualizzando le proteine secrete attraverso SDS-PAGE. Infine, l'attività relativa di T3SS viene valutata visualizzando le proteine secrete tramite colorazione con argento e quantificando i livelli relativi di proteine effettrici di T3SS, denominate proteine esterne di Yersinia (Yops)10.
I saggi di attività T3SS generalmente utilizzano anticorpi specifici per rilevare i livelli di proteina effettrice T3SS nel surnatante di coltura. Tuttavia, gli anticorpi western blotting per le proteine effettrici T3SS spesso non sono disponibili in commercio. Pertanto, è stata prestata particolare attenzione per garantire che la visualizzazione finale dell'attività di T3SS in questo metodo non richieda anticorpi specifici e possa invece sfruttare la colorazione con argento, che consente la visualizzazione di tutte le proteine secrete. Sebbene questo metodo sia specificamente adattato e ottimizzato per Y. pseudotuberculosis, può essere adattato ad altre specie batteriche, anche se le condizioni esatte del terreno e i tempi di incubazione variano.
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Protocollo
I dettagli dei reagenti, la composizione dei terreni, le sequenze di primer e l'attrezzatura sono elencati nella Tabella dei materiali. La Figura 1 illustra il flusso di lavoro sperimentale complessivo.
1. Preparazione di vetreria lavata con acido e terreni M9 chelati
NOTA: Prima di iniziare, fare riferimento alla sezione dei materiali per i reagenti e le ricette esatte che verranno utilizzate. Il terreno M9 è stato utilizzato per la prima volta per i saggi Yersinia T3SS in Cheng et al.11.
- Versare 100 mL di HCl 6 N in un matraccio di vetro da 250 mL.
ATTENZIONE: L'HCl è estremamente pericoloso; Assicurarsi che vengano prese le precauzioni appropriate quando si maneggia questa sostanza. - Sigillare l'imboccatura del contenitore di vetro con un tappo di vetro e agitare con cura il pallone per 1 minuto per distribuire accuratamente l'HCl, cambiando di tanto in tanto direzione.
- Smaltire il 6 N HCl in modo appropriato.
- Sciacquare il contenitore di vetro aggiungendo 100 mL di H2O deionizzato, sigillare la bocca, agitare per 20 s, quindi scaricare l'acqua.
- Ripetere la fase di risciacquo per un totale di 3 volte.
- Lasciare asciugare all'aria. Autoclave per sterilizzare.
- Per chelare i terreni, mescolare i componenti M9 insieme al reagente chelante e mescolare con un'ancoretta magnetica a temperatura ambiente per ~18 ore. Filtrare-sterilizzare e aggiungere MgSO4 a una concentrazione finale di 1 mM.
2. Coltura di Y. pseudotuberculosis al variare dei livelli di ferro e della tensione di ossigeno
- Streak Y. pseudotuberculosis (in questo studio viene utilizzato il ceppo IP2666pIB1) su piastre di agar Lysogeny Broth (LB) e incubare a temperatura ambiente.
NOTA: L'incubazione di Yersinia a 37 °C, in particolare in un terreno a basso contenuto di calcio, porta all'attività di T3SS, all'arresto della crescita e, infine, seleziona per la perdita del plasmide per la rulenza di Yersinia vi(pYV) che codifica per il T3SS12. Pertanto, questo protocollo utilizza l'incubazione a 26 °C di Yersinia fino a quando non è necessario misurare l'attività di T3SS. - Dopo 48 ore, una volta che si formano colonie visibili, inoculare 4 mL di terreno M9 contenente lo 0,2% di glucosio, 1 mg/L di FeSO4,7H 2O e integrato con casamminoacidi (qui indicati come terreni M9) da una singola colonia isolata e coltura per una notte a 26 °C con aerazione a 250 giri/min per circa 18 ore.
NOTA: Utilizzare vetreria lavata con acido iniziando con il passaggio successivo e proseguendo. - Sottocultura in media M9 chelati seguendo i passaggi seguenti.
NOTA: Per tutte le fasi successive, viene utilizzato un terreno M9 con lo 0,9% di glucosio anziché lo 0,2% di glucosio standard.- Utilizzando uno spettrofotometro, misurare la densità ottica (OD600) della coltura notturna.
- Diluire la coltura durante la notte a un valore OD600 di 0,1 in un totale di 14 mL di terreno M9 chelato sterile contenente lo 0,9% di glucosio e senza FeSO 4,7H 2O in un pallone lavato con acido da 250 mL senza integrazione di ferro.
- Incubare per 8 ore a 26 °C con aerazione a 250 giri/min.
- Sottocultura in culture aerobiche e anaerobiche in parallelo.
- Misurare l'OD600 delle colture in crescita.
- Per l'incubazione aerobica continua, la sottocoltura delle colture in crescita a un valore OD600 di 0,1 in 14 mL di terreno M9 chelato sterile contenente lo 0,9% di glucosio e l'assenza di FeSO4,7H 2O in un pallone lavato con acido da 250 mL e la coltura con aerazione a 26 °C per 12 ore senza supplementazione di ferro.
- Per la coltura anaerobica, sottocoltura a un valore OD600 di 0,1 in 14 mL di terreno sterile chelato M9 in due provette di vetro lavate con acido. Nella prima provetta, aggiungere FeSO4.7H 2O sterilizzato con filtro (utilizzando una membrana in polietersulfone da 0,22 μm) per una concentrazione finale di 1 mg/L (denominata "alto contenuto di ferro"). Nella seconda provetta, aggiungere FeSO4.7H 2O per una concentrazione finale di 0,01 mg/L (indicata come "a basso contenuto di ferro"). Questo può essere fatto utilizzando una soluzione madre di FeSO4.7H 2O da 10 mg/mL. Incubare entrambe le provette in modo anaerobico in una camera anaerobica a temperatura ambiente per 12 ore.
NOTA: 1 mg/L di FeSO4.7H 2O fornisce le condizioni di piena di ferro per una robusta crescita di Yersinia. Al contrario, l'aggiunta di soli 0,01 mg/L di FeSO 4.7H2O alle colture anaerobiche garantisce una crescita sufficiente in condizioni anaerobiche, ma consente comunque risposte di carenza di ferro, mentre le colture aerobiche vengono coltivate per 12 ore in assenza di ferro aggiunto per stimolare le risposte di carenza di ferro prima della stimolazione dell'attività di T3SS.
- Induce l'attività del sistema di secrezione di tipo III.
- Spostare le colture anaerobiche a 37 °C e continuare l'incubazione anaerobica per 4 ore per indurre il T3SS.
- Misurare l'OD600 della coltura in crescita aerobica.
- In due matracci lavati con acido, sottocolture le colture in crescita aerobica fino a un valore OD600 di 0,2 in 14 mL di terreno sterile Chelato M9. Nel primo pallone, aggiungere FeSO4.7H 2O sterilizzato con filtro per una concentrazione finale di 1 mg/L. Nel secondo pallone, aggiungere FeSO 4.7H2O per una concentrazione finale di 0,01 mg/L. Incubare entrambi i palloni con aerazione a 26 °C a 250 giri/min per 2 ore.
- Dopo 2 ore, spostare le colture aerobiche a 37 °C con aerazione a 250 giri/min e incubare per 4 ore per indurre il T3SS.
3. Precipitazione dell'acido tricloroacetico (TCA) di proteine effettrici T3SS
- Una volta completata l'incubazione anaerobica, misurare l'OD600 delle colture.
- Normalizzare tutti i campioni anaerobici per ottenere la stessa massa cellulare (fare riferimento all'esempio fornito nella Tabella 1). Per la coltura anaerobica, generalmente ci si aspetta un valore OD600 di ~0,5 nelle colture affamate di ferro e ~1 per le colture piene di ferro. In questo caso, utilizzare 6 ml di colture affamate di ferro e 3 ml di colture piene di ferro.
NOTA: La coltura rimanente può essere utilizzata per altri scopi, come la raccolta di RNA totale e l'utilizzo della PCR quantitativa per misurare i livelli allo stato stazionario dell'mRNA target (non descritto qui). - Trasferire i volumi normalizzati di ciascuna coltura in provette da 15 mL.
- Per controllare l'efficienza della precipitazione delle proteine secrete, aggiungere 4 μL di albumina sierica bovina (BSA) da 0,5 mg/mL in ciascuna provetta.
- Colture di pellet a 3200 x g per 15 min a 4 °C.
- Collegare un filtro PVDF da 0,22 μm a una siringa da 10 mL e filtrare il surnatante di ciascuna coltura pellettata in una provetta fresca da 15 mL.
NOTA: Questa fase di filtrazione riduce al minimo le possibilità di trasferimento di intere cellule batteriche, che si tradurrebbero in proteine citoplasmatiche indesiderate nel campione. - Aggiungere il 10% del volume del surnatante di 6,1 N TCA a ciascun campione.
- Agitare energicamente per 1 min. Incubare le provette con ghiaccio in una cella frigorifera a 4 °C per una notte.
NOTA: La durata dell'incubazione può essere ottimizzata in base alle necessità. Anche solo un'incubazione di 1 ora può funzionare per condizioni o ceppi in cui la secrezione è robusta. - Ripetere le fasi di raccolta dei pellet e precipitazione del TCA con le colture aerobiche una volta completate le 4 ore di incubazione.
NOTA: Normalizzare le colture aerobiche pellettando volumi con massa cellulare equivalente. - Aggiungere 2 mL di ciascun campione in una provetta fresca da 2 mL e centrifugare a 21.000 x g per 15 min a 4 °C.
- Aspirare il surnatante utilizzando un accessorio per il vuoto e fare attenzione a non toccare il fondo o i lati del tubo.
NOTA: Il pellet può essere difficile da visualizzare e può apparire come una foschia lungo la lunghezza del tubo. - Ripetere i passaggi 3.10 e 3.11 fino a quando tutto il contenuto di ciascuna reazione di precipitazione non viene precipitato in un'unica provetta da 2 mL. Questa operazione può richiedere tre o quattro fasi di centrifugazione sequenziale, ma consente la concentrazione di tutte le proteine secrete da ciascun campione in una provetta da 2 mL.
- Per lavare i pellet, aggiungere delicatamente 1 ml di acetone ghiacciato al 100% in ogni provetta. Per evitare la perdita di campione, non risospendere e non toccare i lati della provetta.
- Centrifugare i campioni a 21.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
- Aspirare il surnatante e fare attenzione a non toccare il fondo o i lati del tubo.
- Ripetere i passaggi 3.13 e 3.14 del lavaggio con acetone ghiacciato.
- Dopo aver aspirato il surnatante per l'ultima volta, aprire i tubi e lasciare asciugare completamente il pellet sul banco per circa 1 ora.
- Aggiungere 50 μl della soluzione FSB: DTT a ciascun campione essiccato. Per evitare la perdita di proteine, non risospendere.
- Agitare accuratamente ogni campione per 1 minuto, assicurandosi che la soluzione FSB: DTT ricopra le pareti dell'intera provetta. Questo può essere ottimizzato utilizzando un attacco a vortice in grado di contenere più tubi contemporaneamente.
- Far bollire i campioni a 95 °C per 15 minuti.
- Centrifugare brevemente i campioni per 30 s alla massima velocità a temperatura ambiente.
- Conservare a -80 °C fino a un futuro utilizzo.
4. SDS-PAGE e colorazione con argento per visualizzare le proteine effettrici T3SS
- Caricare 15 μl di ciascun campione anaerobico e 10 μl di ciascun campione aerobico in un gel SDS-PAGE al 12,5%, insieme a 3 μl di uno standard non colorato disponibile in commercio come scala.
- Far funzionare il gel per circa 90 minuti a 100 V. Queste impostazioni possono variare a seconda dell'apparecchio utilizzato.
- Seguire il protocollo di colorazione dell'argento seguendo le istruzioni del produttore, ottenendo un gel, come mostrato nella Figura 2.
5. Quantificazione dell'attività relativa di T3SS
- Posizionare il gel nel sistema di imaging, assicurandosi che tutte le bande destinate alla quantificazione siano nel fotogramma dell'immagine.
NOTA: Il peso molecolare di BSA è ~66 kDa, mentre il peso molecolare della proteina effettrice T3SS YopE è ~23 kDa. - Nel software, selezionare tutte le bande YopE in tutti i pozzetti.
- Impostare la banda YopE di riferimento sul campione appropriato.
- Esporta i valori di quantificazione relativi calcolati dal software per tutte le bande YopE.
- Tornando al software, selezionare tutte le bande BSA in tutti i pozzetti.
- Impostare la banda BSA di riferimento per assicurarsi che provenga dallo stesso campione della banda YopE di riferimento.
- Esporta i relativi valori di quantificazione calcolati dal software per tutte le bande BSA.
- Per calcolare i livelli di espressione relativi di YopE, dividere il valore della quantità relativa YopE per il valore della quantità relativa BSA per ciascun campione.
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Risultati
Questo metodo consente il confronto relativo degli Yop secreti in varie condizioni rispetto a una condizione di riferimento di interesse. Il flusso di lavoro sperimentale complessivo è illustrato nella Figura 1. La Tabella 1 illustra una rappresentazione di come la normalizzazione delle colture cellulari si verificherebbe tipicamente nell'istanza di ciascuna condizione di coltura e il volume di TCA che verrebbe aggiunto a ciascun surnatante. Qui, i risultati rappresentativi ...
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Discussione
Il T3SS è un importante fattore di virulenza in molti batteri patogeni; Pertanto, lo sviluppo di tecniche di laboratorio per studiarne la regolazione è importante per comprendere la patogenesi e sviluppare potenziali terapie1. Il ferro e l'ossigeno sono noti per essere importanti segnali dell'ospite rilevati dai patogeni batterici per regolare l'espressione di T3SS5; pertanto, questo metodo presenta una strategia per la coltura di Y. ps...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Immagini grafiche create utilizzando BioRender.com. Questo studio è stato supportato dalla sovvenzione del National Institutes of Health (www.NIH.gov) R01AI119082.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa con punta Luer-Lok da 10 ml | BD | 301029 | |
| 10x SDS Running Buffer | Base | Tris 0,25 M fatta in casa, 1,92 M Glicina, 1% SDS in volume 12,5 | |
| Provette Falcon da 15 mL | Falcom 352196 | Per la raccolta del surnatante | |
| Pallone di coltura da 250 mL | Belco | 251000250 | |
| Sistema di filtraggio da 500 mL | Corning | 431097 | |
| Soluzione di acido cloridrico 6 N | Fisher Scientific | 7732185 | |
| Acetone | Fisher Chemical | A949-4 | 4 |
| L Bio Rad ChemiDoc MP Imaging Sistema | Bio Rad | Numero di modello: Universal Hood III | |
| Provette per coltura in vetro borosilicato | Fisherbrand | 14-961-34 | Per la coltura anaerobica |
| Chelex 100 Resina | Bio Rad | 142-1253 | |
| Chelex M9 +0,9% Glucosio media | Fatto in | casa6 g/L Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0,5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 1% casamino acidi, 0,9% destrosio, 0,0005% tiamina, 5 g/L di resina Chelex 100. Agitare il terreno per 18 ore a temperatura ambiente, filtrare con un'unità di filtrazione Corning da 500 mL, quindi aggiungere MgSO4 per 1 mM di MgSO4 soluzione finale | |
| campione (FSB) | Tris-HCl 0,1 M fatto in casa, 4% SDS, 20% glicerolo, 0,2% di blu di bromofenolo | ||
| Soluzione DTT | Fatto | FSB+0.2M DTT | |
| Image Lab Software | Bio Rad | https://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8Z | Software |
| Isotemp Heat Block | Fisher Scientific 88860021 | ||
| LB Agar Piastre | fatte in casa | 10 g di triptone, 5 g di estratto di lievito, 10 g di NaCl, 15 g di agar in 1 L di volume totale. Terreni di glucosio autoclavati | |
| M9+0,2% Fatti | in | 6 g/L Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0,5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 1 mM di MgSO4, 1 mg/L di FeSO47H2O, 1% di casamminoacidi, 0,2% destrosio, 0,0005% di tiamina | |
| Attacco filtro Millex-GP PES 0,22um per siringa | Millipore | SLGPR33RS | Per filtrazione FeSO47H2O |
| Millex-GV PVDF 0,22um Attacco filtro per siringa | Millipore | SLGVR33RS | Per filtrazione surnatante |
| Precision Plus Protein Unstained Standard | Bio Rad | 1610363 | |
| SDS-PAGE Gel Apparatus | Bio Rad | Numero di modello: Mini PROTEAN Tetra Cell | |
| Kit di colorazione dell'argento SilverXpress | Invitrogen | LC6100 | |
| The BellyDancer Shaker | IBI Scientific BDRAA1155 | ||
| Soluzione di acido tricloroacetico 6.1N | Sigma Aldrich | T0699 | |
| Camera anaerobica in vinile | Coy Lab Prodotti | https://coylab.com/products/anaerobic-chambers/vinyl-anaerobic-chambers/#details | |
| qPCR Sequenze di primer | |||
| yfeA avanti - CAC AGT CAG CAG ACC TTA TCT T | |||
| yfeA inverso - GGC AGA CGG GAC ATC TTT AAT A | |||
| bfd avanti - ccagcatcagccccatacag | |||
| bfd inverso - tggcttgtcggatgcacttc | |||
| yopE avanti - CCATAAACCGGTGGTGAC | |||
| yopE inverso - CTTGGCATTGAGTGATACTG |
Riferimenti
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