Method Article

Quantificazione dell'attività del sistema di secrezione di Yersinia pseudotuberculosis di tipo III dopo carenza di ferro e crescita anaerobica

DOI:

10.3791/66642

⸱

May 31st, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Environmental Toxicology, University of California, Santa Cruz

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I batteri colonizzano i tessuti dell'ospite che variano in termini di ossigeno e biodisponibilità del ferro, ma la maggior parte degli approcci allo studio dei batteri utilizza terreni aerati e ricchi. Questo protocollo descrive la coltura del patogeno umano Yersinia pseudotuberculosis al variare delle concentrazioni di ferro e della tensione di ossigeno, e la quantificazione dell'attività del sistema di secrezione di Yersinia di tipo III, che è un importante fattore di virulenza.

Abstract

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Un meccanismo di virulenza chiave per molti patogeni Gram-negativi è il sistema di secrezione di tipo III (T3SS), un'appendice aghiforme che trasloca proteine effettrici citotossiche o immunomodulatorie nelle cellule ospiti. Il T3SS è un bersaglio per le campagne di scoperta antimicrobica poiché è accessibile extracellulare e in gran parte assente da batteri non patogeni. Studi recenti hanno dimostrato che i T3SS di Yersinia e Salmonella sono regolati da fattori sensibili al ferro e all'ossigeno, che sono importanti segnali specifici di nicchia incontrati durante l'infezione dei mammiferi. Qui descritto è un metodo per la carenza di ferro di Yersinia pseudotuberculosis, con successiva integrazione opzionale di ferro inorganico. Per valutare l'impatto della disponibilità di ossigeno, questo processo di carenza di ferro è dimostrato sia in condizioni aerobiche che anaerobiche. Infine, l'incubazione delle colture alla temperatura dell'ospite mammifero di 37 °C induce l'espressione di T3SS e consente la quantificazione dell'attività di Yersinia T3SS visualizzando le proteine effettrici rilasciate nel surnatante. I passaggi qui descritti offrono un vantaggio rispetto all'uso di chelanti del ferro in assenza di carenza di ferro, che è insufficiente per indurre una robusta carenza di ferro, presumibilmente a causa dell'efficiente assorbimento del ferro di Yersinia e dei sistemi di evacuazione. Allo stesso modo, la vetreria da laboratorio con lavaggio acido è dettagliata per garantire la rimozione del ferro residuo, che è essenziale per indurre una robusta carenza di ferro. Inoltre, l'uso di un agente chelante è descritto per rimuovere il ferro residuo dai terreni e coltivare i batteri per diverse generazioni in assenza di ferro per esaurire le riserve di ferro batterico. Incorporando protocolli standard di precipitazione proteica indotta da acido tricloroacetico, SDS-PAGE e colorazione con argento, questa procedura dimostra modi accessibili per misurare l'attività di T3SS. Sebbene questa procedura sia ottimizzata per Y. pseudotuberculosis, offre un quadro di riferimento per studi su patogeni con sistemi di assorbimento del ferro simili e robusti. Nell'era della resistenza agli antibiotici, questi metodi possono essere ampliati per valutare l'efficacia di composti antimicrobici che prendono di mira il T3SS in condizioni rilevanti per l'ospite.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Molti patogeni Gram-negativi clinicamente rilevanti come Yersinia, Vibrio, Escherichia, Pseudomonas e Shigella codificano il sistema di secrezione di tipo III (T3SS) per iniettare proteine effettrici nelle cellule ospiti1. In molte specie batteriche, il T3SS è sotto stretto controllo normativo2. Ad esempio, la traslocazione delle proteine effettrici Yersinia T3SS nelle cellule ospiti bersaglio è fondamentale per sovvertire i meccanismi di difesa dell'ospite e consentire la colonizzazione batterica dei tessuti ospiti. Tuttavia, l'attività di Yersinia T3SS è metabolicamente onerosa e può innescare il riconoscimento da parte dei recettori immunitari dell'ospite3. Di conseguenza, i regolatori che rilevano specifici segnali ambientali controllano l'espressione dei geni T3SS in molte specie batteriche. Poiché i patogeni come la Yersinia subiscono cambiamenti ambientali durante il loro ciclo di infezione che influiscono sull'espressione dei fattori critici di virulenza, è importante sviluppare condizioni di laboratorio che imitino le caratteristiche salienti delle nicchie ospiti occupate da patogeni batterici. In particolare, la tensione di ossigeno e la disponibilità di ferro differiscono tra i vari siti tissutali in modo spazio-temporale e influenzano l'espressione di geni di virulenza come il T3SS 4,5,6. Pertanto, l'obiettivo di questo metodo è valutare come l'ossigeno e il ferro influenzino l'espressione di Yersinia T3SS. Ciò fornirà informazioni sulle dinamiche dell'interazione ospite-patogeno.

Il metodo qui descritto descrive in dettaglio come coltivare la Yersinia pseudotuberculosis in modo aerobico e anaerobico, nonché come esaurire le riserve di ferro di Yersinia durante la crescita aerobica o anaerobica. Ci sono alcune considerazioni importanti evidenziate qui riguardo al successo della coltura dei batteri in queste condizioni variabili. In primo luogo, la coltura anaerobica richiede un'ulteriore integrazione di glucosio, una modifica che viene annotata nella ricetta dei terreni. In secondo luogo, poiché Y. pseudotuberculosis impiega siderofori e altri sistemi di assorbimento del ferro in grado di eliminare in modo robusto il ferro dall'ambiente, viene prestata particolare attenzione a garantire che i terreni di coltura e la vetreria di laboratorio siano il più possibile privi di ferro7. Studi precedenti hanno utilizzato chelanti del ferro come il dipiridile per esaurire il ferro da colture batteriche ricche di terreni per imitare la carenza di ferro 8,9. Tuttavia, l'esaurimento delle riserve di ferro di Yersinia per indurre la carenza di ferro richiede la rimozione del ferro residuo nella vetreria e nei mezzi, nonché una crescita prolungata in assenza di ferro. Questo protocollo descrive in dettaglio come lavare con acido la vetreria e chelare i terreni per rimuovere il ferro residuo, oltre a coltivare i batteri per diverse generazioni per garantire una completa carenza di ferro. La carenza di ferro può essere assicurata misurando i livelli relativi di trascrizione di geni ben caratterizzati che rispondono al ferro in tutte le condizioni, come dimostrato qui con yfeA e bfd.

Il culmine di questo protocollo dimostra come precipitare le proteine effettrici T3SS secrete da ciascuna di queste condizioni trattando il surnatante di coltura con acido tricloroacetico (TCA) e visualizzando le proteine secrete attraverso SDS-PAGE. Infine, l'attività relativa di T3SS viene valutata visualizzando le proteine secrete tramite colorazione con argento e quantificando i livelli relativi di proteine effettrici di T3SS, denominate proteine esterne di Yersinia (Yops)10.

I saggi di attività T3SS generalmente utilizzano anticorpi specifici per rilevare i livelli di proteina effettrice T3SS nel surnatante di coltura. Tuttavia, gli anticorpi western blotting per le proteine effettrici T3SS spesso non sono disponibili in commercio. Pertanto, è stata prestata particolare attenzione per garantire che la visualizzazione finale dell'attività di T3SS in questo metodo non richieda anticorpi specifici e possa invece sfruttare la colorazione con argento, che consente la visualizzazione di tutte le proteine secrete. Sebbene questo metodo sia specificamente adattato e ottimizzato per Y. pseudotuberculosis, può essere adattato ad altre specie batteriche, anche se le condizioni esatte del terreno e i tempi di incubazione variano.

Protocol

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I dettagli dei reagenti, la composizione dei terreni, le sequenze di primer e l'attrezzatura sono elencati nella Tabella dei materiali. La Figura 1 illustra il flusso di lavoro sperimentale complessivo.

1. Preparazione di vetreria lavata con acido e terreni M9 chelati

NOTA: Prima di iniziare, fare riferimento alla sezione dei materiali per i reagenti e le ricette esatte che verranno utilizzate. Il terreno M9 è stato utilizzato per la prima volta per i saggi Yersinia T3SS in Cheng et al.11.

  1. Versare 100 mL di HCl 6 N in un matraccio di vetro da 250 mL.
    ATTENZIONE: L'HCl è estremamente pericoloso; Assicurarsi che vengano prese le precauzioni appropriate quando si maneggia questa sostanza.
  2. Sigillare l'imboccatura del contenitore di vetro con un tappo di vetro e agitare con cura il pallone per 1 minuto per distribuire accuratamente l'HCl, cambiando di tanto in tanto direzione.
  3. Smaltire il 6 N HCl in modo appropriato.
  4. Sciacquare il contenitore di vetro aggiungendo 100 mL di H2O deionizzato, sigillare la bocca, agitare per 20 s, quindi scaricare l'acqua.
  5. Ripetere la fase di risciacquo per un totale di 3 volte.
  6. Lasciare asciugare all'aria. Autoclave per sterilizzare.
  7. Per chelare i terreni, mescolare i componenti M9 insieme al reagente chelante e mescolare con un'ancoretta magnetica a temperatura ambiente per ~18 ore. Filtrare-sterilizzare e aggiungere MgSO4 a una concentrazione finale di 1 mM.

2. Coltura di Y. pseudotuberculosis al variare dei livelli di ferro e della tensione di ossigeno

  1. Streak Y. pseudotuberculosis (in questo studio viene utilizzato il ceppo IP2666pIB1) su piastre di agar Lysogeny Broth (LB) e incubare a temperatura ambiente.
    NOTA: L'incubazione di Yersinia a 37 °C, in particolare in un terreno a basso contenuto di calcio, porta all'attività di T3SS, all'arresto della crescita e, infine, seleziona per la perdita del plasmide per la rulenza di Yersinia vi(pYV) che codifica per il T3SS12. Pertanto, questo protocollo utilizza l'incubazione a 26 °C di Yersinia fino a quando non è necessario misurare l'attività di T3SS.
  2. Dopo 48 ore, una volta che si formano colonie visibili, inoculare 4 mL di terreno M9 contenente lo 0,2% di glucosio, 1 mg/L di FeSO4,7H 2O e integrato con casamminoacidi (qui indicati come terreni M9) da una singola colonia isolata e coltura per una notte a 26 °C con aerazione a 250 giri/min per circa 18 ore.
    NOTA: Utilizzare vetreria lavata con acido iniziando con il passaggio successivo e proseguendo.
  3. Sottocultura in media M9 chelati seguendo i passaggi seguenti.
    NOTA: Per tutte le fasi successive, viene utilizzato un terreno M9 con lo 0,9% di glucosio anziché lo 0,2% di glucosio standard.
    1. Utilizzando uno spettrofotometro, misurare la densità ottica (OD600) della coltura notturna.
    2. Diluire la coltura durante la notte a un valore OD600 di 0,1 in un totale di 14 mL di terreno M9 chelato sterile contenente lo 0,9% di glucosio e senza FeSO 4,7H 2O in un pallone lavato con acido da 250 mL senza integrazione di ferro.
    3. Incubare per 8 ore a 26 °C con aerazione a 250 giri/min.
  4. Sottocultura in culture aerobiche e anaerobiche in parallelo.
    1. Misurare l'OD600 delle colture in crescita.
    2. Per l'incubazione aerobica continua, la sottocoltura delle colture in crescita a un valore OD600 di 0,1 in 14 mL di terreno M9 chelato sterile contenente lo 0,9% di glucosio e l'assenza di FeSO4,7H 2O in un pallone lavato con acido da 250 mL e la coltura con aerazione a 26 °C per 12 ore senza supplementazione di ferro.
    3. Per la coltura anaerobica, sottocoltura a un valore OD600 di 0,1 in 14 mL di terreno sterile chelato M9 in due provette di vetro lavate con acido. Nella prima provetta, aggiungere FeSO4.7H 2O sterilizzato con filtro (utilizzando una membrana in polietersulfone da 0,22 μm) per una concentrazione finale di 1 mg/L (denominata "alto contenuto di ferro"). Nella seconda provetta, aggiungere FeSO4.7H 2O per una concentrazione finale di 0,01 mg/L (indicata come "a basso contenuto di ferro"). Questo può essere fatto utilizzando una soluzione madre di FeSO4.7H 2O da 10 mg/mL. Incubare entrambe le provette in modo anaerobico in una camera anaerobica a temperatura ambiente per 12 ore.
      NOTA: 1 mg/L di FeSO4.7H 2O fornisce le condizioni di piena di ferro per una robusta crescita di Yersinia. Al contrario, l'aggiunta di soli 0,01 mg/L di FeSO 4.7H2O alle colture anaerobiche garantisce una crescita sufficiente in condizioni anaerobiche, ma consente comunque risposte di carenza di ferro, mentre le colture aerobiche vengono coltivate per 12 ore in assenza di ferro aggiunto per stimolare le risposte di carenza di ferro prima della stimolazione dell'attività di T3SS.
  5. Induce l'attività del sistema di secrezione di tipo III.
    1. Spostare le colture anaerobiche a 37 °C e continuare l'incubazione anaerobica per 4 ore per indurre il T3SS.
    2. Misurare l'OD600 della coltura in crescita aerobica.
    3. In due matracci lavati con acido, sottocolture le colture in crescita aerobica fino a un valore OD600 di 0,2 in 14 mL di terreno sterile Chelato M9. Nel primo pallone, aggiungere FeSO4.7H 2O sterilizzato con filtro per una concentrazione finale di 1 mg/L. Nel secondo pallone, aggiungere FeSO 4.7H2O per una concentrazione finale di 0,01 mg/L. Incubare entrambi i palloni con aerazione a 26 °C a 250 giri/min per 2 ore.
    4. Dopo 2 ore, spostare le colture aerobiche a 37 °C con aerazione a 250 giri/min e incubare per 4 ore per indurre il T3SS.

3. Precipitazione dell'acido tricloroacetico (TCA) di proteine effettrici T3SS

  1. Una volta completata l'incubazione anaerobica, misurare l'OD600 delle colture.
  2. Normalizzare tutti i campioni anaerobici per ottenere la stessa massa cellulare (fare riferimento all'esempio fornito nella Tabella 1). Per la coltura anaerobica, generalmente ci si aspetta un valore OD600 di ~0,5 nelle colture affamate di ferro e ~1 per le colture piene di ferro. In questo caso, utilizzare 6 ml di colture affamate di ferro e 3 ml di colture piene di ferro.
    NOTA: La coltura rimanente può essere utilizzata per altri scopi, come la raccolta di RNA totale e l'utilizzo della PCR quantitativa per misurare i livelli allo stato stazionario dell'mRNA target (non descritto qui).
  3. Trasferire i volumi normalizzati di ciascuna coltura in provette da 15 mL.
  4. Per controllare l'efficienza della precipitazione delle proteine secrete, aggiungere 4 μL di albumina sierica bovina (BSA) da 0,5 mg/mL in ciascuna provetta.
  5. Colture di pellet a 3200 x g per 15 min a 4 °C.
  6. Collegare un filtro PVDF da 0,22 μm a una siringa da 10 mL e filtrare il surnatante di ciascuna coltura pellettata in una provetta fresca da 15 mL.
    NOTA: Questa fase di filtrazione riduce al minimo le possibilità di trasferimento di intere cellule batteriche, che si tradurrebbero in proteine citoplasmatiche indesiderate nel campione.
  7. Aggiungere il 10% del volume del surnatante di 6,1 N TCA a ciascun campione.
  8. Agitare energicamente per 1 min. Incubare le provette con ghiaccio in una cella frigorifera a 4 °C per una notte.
    NOTA: La durata dell'incubazione può essere ottimizzata in base alle necessità. Anche solo un'incubazione di 1 ora può funzionare per condizioni o ceppi in cui la secrezione è robusta.
  9. Ripetere le fasi di raccolta dei pellet e precipitazione del TCA con le colture aerobiche una volta completate le 4 ore di incubazione.
    NOTA: Normalizzare le colture aerobiche pellettando volumi con massa cellulare equivalente.
  10. Aggiungere 2 mL di ciascun campione in una provetta fresca da 2 mL e centrifugare a 21.000 x g per 15 min a 4 °C.
  11. Aspirare il surnatante utilizzando un accessorio per il vuoto e fare attenzione a non toccare il fondo o i lati del tubo.
    NOTA: Il pellet può essere difficile da visualizzare e può apparire come una foschia lungo la lunghezza del tubo.
  12. Ripetere i passaggi 3.10 e 3.11 fino a quando tutto il contenuto di ciascuna reazione di precipitazione non viene precipitato in un'unica provetta da 2 mL. Questa operazione può richiedere tre o quattro fasi di centrifugazione sequenziale, ma consente la concentrazione di tutte le proteine secrete da ciascun campione in una provetta da 2 mL.
  13. Per lavare i pellet, aggiungere delicatamente 1 ml di acetone ghiacciato al 100% in ogni provetta. Per evitare la perdita di campione, non risospendere e non toccare i lati della provetta.
  14. Centrifugare i campioni a 21.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
  15. Aspirare il surnatante e fare attenzione a non toccare il fondo o i lati del tubo.
  16. Ripetere i passaggi 3.13 e 3.14 del lavaggio con acetone ghiacciato.
  17. Dopo aver aspirato il surnatante per l'ultima volta, aprire i tubi e lasciare asciugare completamente il pellet sul banco per circa 1 ora.
  18. Aggiungere 50 μl della soluzione FSB: DTT a ciascun campione essiccato. Per evitare la perdita di proteine, non risospendere.
  19. Agitare accuratamente ogni campione per 1 minuto, assicurandosi che la soluzione FSB: DTT ricopra le pareti dell'intera provetta. Questo può essere ottimizzato utilizzando un attacco a vortice in grado di contenere più tubi contemporaneamente.
  20. Far bollire i campioni a 95 °C per 15 minuti.
  21. Centrifugare brevemente i campioni per 30 s alla massima velocità a temperatura ambiente.
  22. Conservare a -80 °C fino a un futuro utilizzo.

4. SDS-PAGE e colorazione con argento per visualizzare le proteine effettrici T3SS

  1. Caricare 15 μl di ciascun campione anaerobico e 10 μl di ciascun campione aerobico in un gel SDS-PAGE al 12,5%, insieme a 3 μl di uno standard non colorato disponibile in commercio come scala.
  2. Far funzionare il gel per circa 90 minuti a 100 V. Queste impostazioni possono variare a seconda dell'apparecchio utilizzato.
  3. Seguire il protocollo di colorazione dell'argento seguendo le istruzioni del produttore, ottenendo un gel, come mostrato nella Figura 2.

5. Quantificazione dell'attività relativa di T3SS

  1. Posizionare il gel nel sistema di imaging, assicurandosi che tutte le bande destinate alla quantificazione siano nel fotogramma dell'immagine.
    NOTA: Il peso molecolare di BSA è ~66 kDa, mentre il peso molecolare della proteina effettrice T3SS YopE è ~23 kDa.
  2. Nel software, selezionare tutte le bande YopE in tutti i pozzetti.
  3. Impostare la banda YopE di riferimento sul campione appropriato.
  4. Esporta i valori di quantificazione relativi calcolati dal software per tutte le bande YopE.
  5. Tornando al software, selezionare tutte le bande BSA in tutti i pozzetti.
  6. Impostare la banda BSA di riferimento per assicurarsi che provenga dallo stesso campione della banda YopE di riferimento.
  7. Esporta i relativi valori di quantificazione calcolati dal software per tutte le bande BSA.
  8. Per calcolare i livelli di espressione relativi di YopE, dividere il valore della quantità relativa YopE per il valore della quantità relativa BSA per ciascun campione.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo metodo consente il confronto relativo degli Yop secreti in varie condizioni rispetto a una condizione di riferimento di interesse. Il flusso di lavoro sperimentale complessivo è illustrato nella Figura 1. La Tabella 1 illustra una rappresentazione di come la normalizzazione delle colture cellulari si verificherebbe tipicamente nell'istanza di ciascuna condizione di coltura e il volume di TCA che verrebbe aggiunto a ciascun surnatante. Qui, i risultati rappresentativi sono mostrati utilizzando il wildtype (WT) Y. pseudotuberculosis IP2666pIB1 e due mutanti congenici, ΔyscNU e ΔyopE. Il mutante ΔyopE è usato come controllo privo di YopE, mentre il mutante ΔyscNU è usato come un controllo T3SS negativo completo in quanto non è in grado di assemblare un T3SS13,14 funzionale. Un'immagine rappresentativa di un gel SDS-PAGE al 12,5% colorato con argento contenente le proteine secrete è raffigurata nella Figura 2. Come descritto in precedenza, ogni campione conteneva BSA addizionato come controllo dell'efficienza della precipitazione delle proteine. Nell'analisi dei dati, i set di dati anaerobici e aerobici devono essere trattati come set di dati indipendenti poiché ciascuno è stato normalizzato separatamente. Nei campioni anaerobici, ~38 volte più YopE era presente nei campioni a basso contenuto di ferro rispetto ai campioni ad alto contenuto di ferro, in linea con i risultati precedenti15,16. Nei campioni aerobici, una quantità simile di YopE secreta è stata osservata in campioni di ferro basso e alto, in linea con i risultati precedenti16. Generalmente, almeno tre repliche biologiche di ciascuna condizione vengono utilizzate per stabilire la significatività statistica.

Per confermare che questo protocollo provoca un'adeguata carenza di ferro, è stata condotta un'analisi qPCR sui geni responsivi al ferro yfeA e bfd nel ceppo wildtype in tutte le condizioni. YfeA è la proteina legante periplasmatica di un sistema di trasporto ABC responsabile del trasporto del ferro, mentre Bfd è una ferredossina associata alla batterioferritina coinvolta nella mobilizzazione delle riserve di ferro 17,18,19,20. L'RNA è stato isolato come descritto in precedenza21 e, come previsto, yfeA e bfd erano significativamente sovraregolati in condizioni di impoverimento di ferro rispetto a condizioni di abbondanza di ferro, sia aerobicamente che anaerobicamente, come mostrato nella Figura 3. Inoltre, abbiamo quantificato i livelli di mRNA di yopE allo stato stazionario utilizzando la qPCR per confermare che i risultati osservati per YopE relativo a livello proteico erano coerenti con i livelli di trascritto di yopE (vedi Figura 3).

Infine, poiché i batteri sono inclini a lisi in condizioni di coltura stressanti, era importante dimostrare che le fasi di questo protocollo non provocano lisi batterica che potrebbe potenzialmente confondere i risultati. A conferma di ciò, i campioni di surnatante precipitato con TCA sono stati sottoposti a western blotting e sondati per YopE e RpoA, una subunità della RNA polimerasi e una proteina citoplasmatica. Come mostrato nella Figura 4, mentre il modello di espressione di YopE seguiva quello mostrato nella Figura 3, non c'era evidenza di RpoA presente nei surnatanti del campione, suggerendo che non c'era alcuna lisi osservabile che rilasciasse RpoA citoplasmatica nel surnatante.

figure-results-1
Figura 1: Flusso di lavoro sperimentale per la crescita di Yersinia pseudotuberculosis in condizioni di disponibilità variabile di ferro e ossigeno. Rappresentazione grafica delle fasi di coltura. Si noti che la vetreria lavata con acido deve essere utilizzata a partire dal giorno 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Risultati del gel SDS-PAGE al 12,5% colorato con argento di proteina precipitata con TCA da surnatanti di coltura. I surnatanti di coltura precipitati sono stati caricati su un gel SDS-PAGE al 12,5% e colorati con argento. (A) Profilo di secrezione dei ceppi WT, ΔyscNU e ΔyopE cresciuti anaerobicamente. Valori relativi rappresentativi di YopE normalizzati al campione anaerobico WT pieno di ferro. (B) Profilo di secrezione dei ceppi WT, ΔyscNU e ΔyopE cresciuti aerobicamente. Valori relativi rappresentativi di YopE normalizzati al campione aerobico WT pieno di ferro. Le frecce bianche indicano YopE (~23 kDa). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: I livelli relativi di mRNA dei geni reattivi al ferro dimostrano la carenza di ferro. L'RNA è stato isolato da WT Y. pseudotuberculosis coltivato nelle condizioni descritte nella Figura 1. La qPCR è stata utilizzata per misurare l'espressione relativa dei livelli di yfeA, bfd e yopE normalizzati a 16S rRNA in condizioni anaerobiche (A-C) e aerobiche (D-F). ****p < 0,0001 come determinato da un t-test non appaiato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: La mancanza di RpoA citoplasmatica nei campioni di surnatante dimostra la mancanza di lisi cellulare in condizioni di coltura. 5 μL di surnatanti precipitati di (A) campioni anaerobici e (B) aerobici della Figura 3 sono stati analizzati su un gel SDS-PAGE al 12,5% insieme a un controllo a pellet. Le proteine sono state trasferite su una membrana in PVDF per il western blotting. La membrana è stata tagliata e la metà superiore è stata sondata per RpoA utilizzando un anticorpo anti-RpoA e la metà inferiore è stata sondata per YopE utilizzando un anticorpo anti-YopE. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

(A)
ANAEROBICO
CondizioneODVolume da raccogliere (mL)Volume di 6,1 N TCA aggiunto a Sup (mL)
WT Basso contenuto di ferro0.560.6
WT Alto Ferro130.3
(B)
AEROBICO
CondizioneODVolume da raccogliere (mL)Volume di TCA 6,1 N aggiunto a Sup (mL)
WT Basso contenuto di ferro0.960.6
WT Alto Ferro1.43.8570.386

Tabella 1: Flusso di lavoro rappresentativo per la raccolta dei campioni. Il giorno 5, (A), una volta completata l'incubazione di 4 ore a 37 °C per i campioni anaerobici, sono stati raccolti 6 mL del campione con il valore OD600 più basso e il resto dei volumi del campione è stato normalizzato di conseguenza. Dopo aver filtrato il surnatante, è stato aggiunto 6,1 N TCA. (B) Una volta completate le incubazioni aerobiche (2 ore a 26 °C e 4 ore a 37 °C), sono stati raccolti 6 ml del campione con il valore OD600 più basso e il resto dei volumi del campione è stato normalizzato di conseguenza. Dopo aver filtrato il surnatante, è stato aggiunto 6,1 N TCA.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il T3SS è un importante fattore di virulenza in molti batteri patogeni; Pertanto, lo sviluppo di tecniche di laboratorio per studiarne la regolazione è importante per comprendere la patogenesi e sviluppare potenziali terapie1. Il ferro e l'ossigeno sono noti per essere importanti segnali dell'ospite rilevati dai patogeni batterici per regolare l'espressione di T3SS5; pertanto, questo metodo presenta una strategia per la coltura di Y. pseudotuberculosis in condizioni anaerobiche o aerobiche, con carenza o replezione di ferro, e dimostra come quantificare l'attività relativa di T3SS in queste diverse condizioni valutando le quantità relative di livelli di proteina effettrice di YopE T3SS secreta.

Sebbene il flusso di lavoro per questo esperimento sia relativamente semplice, ci sono alcuni punti che devono essere attentamente considerati per ottimizzare i risultati. Durante la fase di precipitazione delle proteine mediata dal TCA, è importante evitare di aspirare il pellet proteico, che può essere difficile da vedere. È fondamentale prendere ulteriori precauzioni per evitare che la punta dell'aspiratore tocchi le pareti o il fondo del tubo. Inoltre, quando si ha a che fare con ceppi mutanti con un livello inferiore di attività T3SS, è consigliabile raccogliere un campione più grande da trattare. Infine, se le corsie appaiono macchiate dopo l'elaborazione del campione e la colorazione con gel invece di produrre bande distinte, ciò può essere dovuto alla lisi cellulare durante la coltura o al carry-over di batteri interi dal pellet nella frazione surnatante. In questo caso, l'esperimento deve essere ripetuto e si deve prestare maggiore attenzione per evitare di assorbire il pellet durante la rimozione del surnatante. È importante notare che questo protocollo potrebbe non essere abbastanza sensibile per rilevare le proteine secrete in quantità molto basse, nel qual caso potrebbe essere necessario impiegare altri metodi di rilevamento. Inoltre, poiché molti agenti chelanti rimuovono i cationi bivalenti diversi dal ferro e dal magnesio dal terreno, altri cationi bivalenti possono essere aggiunti nuovamente al terreno dopo la chelazione per determinare il loro effetto sulla secrezione.

Un altro punto importante da considerare in questi esperimenti è la propensione dei sali nel mezzo M9 a precipitare, con conseguente variabilità tra i lotti sperimentali. Per mitigare questo problema, è possibile aggiungere MgSO4 sterilizzato con filtro al terreno immediatamente prima della coltura.

Nel complesso, questi metodi forniscono un quadro solido per quantificare l'attività relativa di Yersinia T3SS misurando i livelli di proteine. Insieme agli approcci paralleli che mirano a valutare l'espressione di T3SS, i metodi qui presentati consentono una comprensione completa delle dinamiche di T3SS in risposta a segnali ambientali rilevanti per l'ospite. Questo protocollo può anche essere adattato ad altri batteri che possono essere coltivati in un terreno definito in cui una fonte di ferro può essere omessa e per applicazioni in cui la misurazione delle proteine secrete è pertinente alla questione scientifica.

Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immagini grafiche create utilizzando BioRender.com. Questo studio è stato supportato dalla sovvenzione del National Institutes of Health (www.NIH.gov) R01AI119082.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Siringa con punta Luer-Lok da 10 mlBD301029
10x SDS Running Buffer BaseTris 0,25 M fatta in casa, 1,92 M Glicina, 1% SDS in volume 12,5
Provette Falcon da 15 mLFalcom 352196Per la raccolta del surnatante
Pallone di coltura da 250 mLBelco251000250
Sistema di filtraggio da 500 mLCorning431097
Soluzione di acido cloridrico 6 NFisher Scientific7732185
AcetoneFisher ChemicalA949-44
L Bio Rad ChemiDoc MP Imaging SistemaBio RadNumero di modello: Universal Hood III
Provette per coltura in vetro borosilicatoFisherbrand14-961-34Per la coltura anaerobica
Chelex 100 ResinaBio Rad142-1253
Chelex M9 +0,9% Glucosio mediaFatto incasa6 g/L Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0,5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 1% casamino acidi, 0,9% destrosio, 0,0005% tiamina, 5 g/L di resina Chelex 100. Agitare il terreno per 18 ore a temperatura ambiente, filtrare con un'unità di filtrazione Corning da 500 mL, quindi aggiungere MgSO4 per 1 mM di MgSO4 soluzione finale
campione (FSB)Tris-HCl 0,1 M fatto in casa, 4% SDS, 20% glicerolo, 0,2% di blu di bromofenolo
Soluzione DTTFattoFSB+0.2M DTT
Image Lab SoftwareBio Radhttps://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8ZSoftware
Isotemp Heat BlockFisher Scientific 88860021
LB Agar Piastrefatte in casa10 g di triptone, 5 g di estratto di lievito, 10 g di NaCl, 15 g di agar in 1 L di volume totale. Terreni di glucosio autoclavati
M9+0,2% Fattiin6 g/L Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0,5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 1 mM di MgSO4, 1 mg/L di FeSO47H2O, 1% di casamminoacidi, 0,2% destrosio, 0,0005% di tiamina 
Attacco filtro Millex-GP PES 0,22um per siringaMilliporeSLGPR33RSPer filtrazione FeSO47H2O
Millex-GV PVDF 0,22um Attacco filtro per siringaMilliporeSLGVR33RSPer filtrazione surnatante
Precision Plus Protein Unstained StandardBio Rad1610363
SDS-PAGE Gel ApparatusBio RadNumero di modello: Mini PROTEAN Tetra Cell
Kit di colorazione dell'argento SilverXpress InvitrogenLC6100
The BellyDancer ShakerIBI Scientific BDRAA1155
Soluzione di acido tricloroacetico 6.1NSigma AldrichT0699
Camera anaerobica in vinileCoy Lab Prodottihttps://coylab.com/products/anaerobic-chambers/vinyl-anaerobic-chambers/#details
qPCR Sequenze di primer 
yfeA avanti - CAC AGT CAG CAG ACC TTA TCT T
yfeA inverso - GGC AGA CGG GAC ATC TTT AAT A
bfd avanti - ccagcatcagccccatacag
bfd inverso - tggcttgtcggatgcacttc
yopE avanti - CCATAAACCGGTGGTGAC
yopE inverso - CTTGGCATTGAGTGATACTG
% SDS-Page Gel Fatto in casa 15 mL provette per coltura Falcon 352059 Per la notte iniziale  del FSB: in casa casa

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function regulation of type III secretion systems. Nat Rev Microbiol. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Springer International Publishing. Bacterial Type III Protein Secretion Systems. 427, Springer International Publishing. Cham. (2020).
  3. Schubert, K. A., Xu, Y., Shao, F., Auerbuch, V. The Yersinia type III secretion system as a tool for studying cytosolic innate immune surveillance. Annu Rev Microbiol. 74, 221-245 (2020).
  4. Cassat, J. E., Skaar, E. P. Iron in infection and immunity. Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).
  5. Singhal, R., Shah, Y. M. Oxygen battle in the gut: Hypoxia and hypoxia-inducible factors in metabolic and inflammatory responses in the intestine. J Biol Chem. 295 (30), 10493-10505 (2020).
  6. Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).
  7. Rakin, A., Schneider, L., Podladchikova, O. Hunger for iron: the alternative siderophore iron scavenging systems in highly virulent Yersinia. Front Cell Infect Microbiol. 2, (2012).
  8. Lesic, B., Carniel, E. Horizontal Transfer of the high-pathogenicity island of Yersinia pseudotuberculosis. J Bacteriol. 187 (10), 3352-3358 (2005).
  9. Green, E. R., et al. Fis is essential for Yersinia pseudotuberculosis virulence and protects against reactive oxygen species produced by phagocytic cells during infection. PLOS Pathog. 12 (9), e1005898(2016).
  10. Cornelis, G. R. The Yersinia Ysc-Yop "Type III" weaponry. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 742-753 (2002).
  11. Cheng, L. W., Anderson, D. M., Schneewind, O. Two independent type III secretion mechanisms for YopE in Yersinia enterocolitica. Mol Microbiol. 24 (4), 757-765 (1997).
  12. Straley, S. C. The low-Ca2+ response virulence regulon of human-pathogenic yersiniae. Microbial Pathog. 10 (2), 87-91 (1991).
  13. Balada-Llasat, J. -M., Mecsas, J. Yersinia has a tropism for B and T cell zones of lymph nodes that is independent of the type III secretion system. PLoS Pathog. 2 (9), e86(2006).
  14. Adams, W., Morgan, J., Kwuan, L., Auerbuch, V. Yersinia pseudotuberculosis YopD mutants that genetically separate effector protein translocation from host membrane disruption: YopD central region promotes Yop translocation. Mol Microbiol. 96 (4), 764-778 (2015).
  15. Hooker-Romero, D., et al. Iron availability and oxygen tension regulate the Yersinia Ysc type III secretion system to enable disseminated infection. PLOS Pathog. 15 (12), e1008001(2019).
  16. Balderas, D., et al. Genome scale analysis reveals IscR directly and indirectly regulates virulence factor genes in pathogenic Yersinia. mBio. 12 (3), e00633-00721 (2021).
  17. Bearden, S. W., Perry, R. D. The Yfe system of Yersinia pestis transports iron and manganese and is required for full virulence of plague. Mol Microbiol. 32 (2), 403-414 (1999).
  18. Zhou, D., et al. Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis: Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis. FEMS Microbiol Lett. 258 (1), 9-17 (2006).
  19. Wijerathne, H., et al. a new class of [2Fe-2S] protein that functions in bacterial iron homeostasis, requires a structural anion binding site. Biochemistry. 57 (38), 5533-5543 (2018).
  20. Bearden, S. W., Staggs, T. M., Perry, R. D. An ABC transporter system of Yersinia pestis allows utilization of chelated iron by Escherichia coli SAB11. J Bacteriol. 180 (5), 1135-1147 (1998).
  21. Miller, H. K., et al. IscR is essential for Yersinia pseudotuberculosis type III secretion and virulence. PLoS Pathog. 10 (6), e1004194(2014).

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Type III SecretionYersinia PseudotuberculosisIron StarvationAnaerobic GrowthEffector Protein SecretionSDS PAGE AnalysisSilver StainingOxygen AvailabilityProtein PrecipitationBacterial Virulence

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