Method Article

Metodi alternativi per la rilevazione della generazione di anioni superossido nelle piastrine

DOI:

10.3791/66647

⸱

March 29th, 2024

 ,  ,  , 
1Medicines and Healthcare Regulatory Agency, South Mimms laboratories, 2Hull York Medical School, University of Hull

In This Article

Summary

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La generazione di anione superossido è essenziale per la stimolazione delle piastrine e, se disregolata, fondamentale per le malattie trombotiche. Qui, presentiamo tre protocolli per la rilevazione selettiva di anioni superossido e lo studio della regolazione piastrinica redox-dipendente.

Abstract

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Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono molecole altamente instabili contenenti ossigeno. La loro instabilità chimica li rende estremamente reattivi e conferisce loro la capacità di reagire con importanti molecole biologiche come proteine, acidi nucleici e lipidi. Gli anioni superossido sono importanti ROS generati dalla riduzione della riduzione molecolare dell'ossigeno (cioè l'acquisizione di un elettrone). Nonostante le loro implicazioni iniziali esclusivamente nei processi di invecchiamento, degenerativi e patogeni, la loro partecipazione a importanti risposte fisiologiche è recentemente diventata evidente. Nel sistema vascolare, è stato dimostrato che gli anioni superossido modulano la differenziazione e la funzione delle cellule muscolari lisce vascolari, la proliferazione e la migrazione delle cellule endoteliali vascolari nell'angiogenesi, la risposta immunitaria e l'attivazione delle piastrine nell'emostasi. Il ruolo degli anioni superossido è particolarmente importante nella disregolazione delle piastrine e nelle complicanze cardiovascolari associate a una pletora di condizioni, tra cui cancro, infezioni, infiammazioni, diabete e obesità. È quindi diventato estremamente rilevante nella ricerca cardiovascolare essere in grado di misurare efficacemente la generazione di anioni superossido da parte delle piastrine umane, comprendere i meccanismi redox-dipendenti che regolano l'equilibrio tra emostasi e trombosi e, infine, identificare nuovi strumenti farmacologici per la modulazione delle risposte piastriniche che portano a trombosi e complicanze cardiovascolari. Questo studio presenta tre protocolli sperimentali adottati con successo per la rilevazione di anioni superossido nelle piastrine e lo studio dei meccanismi redox-dipendenti che regolano l'emostasi e la trombosi: 1) rivelazione di anioni superossido a base di diidroetidio (DHE) mediante citometria a flusso; 2) Visualizzazione e analisi di anioni superossido basati su DHE mediante imaging di singole piastrine; e 3) quantificazione basata su sonda di spin dell'output di anioni superossido nelle piastrine mediante risonanza paramagnetica elettronica (EPR).

Introduction

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L'anione superossido (O2•-) è il ROS più rilevante dal punto di vista funzionale generato nelle piastrine1. O2•- è il prodotto della riduzione dell'ossigeno molecolare ed è il precursore di molti ROS 2 diversi. La dismutazione di O2•- porta alla generazione di perossido di idrogeno (H2O2) tramite reazioni spontanee in soluzione acquosa o reazioni catalizzate da superossido dismutasi (SODs3). Sebbene siano state suggerite diverse fonti enzimatiche (ad esempio, xantina ossidasi4, lipossigenasi5, cicloossigenasi6 e ossido nitrico sintasi7), la respirazione mitocondriale 8,9 e la nicotinammide adenina dinucleotide fosfato-ossidasi (NOX)10 sono le fonti più importanti di anione superossido nelle cellule eucariotiche. Questo sembra essere anche il caso delle piastrine, dove la perdita di elettroni dalla respirazione mitocondriale 11,12 e l'attività enzimatica dei NOX13,14 sono stati descritti come i principali contributori all'output di anione superossido.

Sebbene diversi studi si siano concentrati sulla regolazione delle piastrine da parte di O2•-, non c'è consenso riguardo ai meccanismi molecolari responsabili. La modulazione dell'attività dei recettori di superficie attraverso l'ossidazione diretta e la formazione di legami disolfuro è stata proposta per diversi recettori piastrinici. E' stata suggerita la regolazione positiva dell'integrina αIIbβ3 da parte dei ROS attraverso l'ossidazione diretta dei residui di cisteina 15,16,17. Allo stesso modo, poiché le risposte piastriniche al collagene dipendono dalla dimerizzazione disolfuro-dipendente e dalla conseguente dimerizzazione della glicoproteina VI (GPVI)18, è stato proposto il potenziamento dell'attività del recettore mediante ossidazione ROS-dipendente19, sebbene non completamente dimostrato sperimentalmente. Infine, è stato dimostrato che l'ossidazione indotta da ROS dei gruppi sulfidrilici della glicoproteina Ib (GPIb) promuove l'adesione piastrinica e l'interazione piastrina-leucocitaria durante l'infiammazione20. Al contrario, come possibile conseguenza della diminuzione dell'ossidazione del gruppo sulfidrilico e dell'attivazione del recettore, la perdita dell'ectodominio sia di GPVI che di GPIb è diminuita dalle condizioni riducenti21.

Sono stati proposti anche modi di azione indipendenti da un'ossidazione diretta dei recettori di superficie piastrinica. È stato dimostrato che i ROS, incluso l'O2•-, modulano positivamente il recettore del collagene GPVI attenuando l'attività della proteina tirosina fosfatasi 2 (SHP-2) contenente la regione di omologia Src, che regola negativamente la cascata di segnalazione di questo recettore22. Inoltre, l'O2•- può generare ONOO- (perossinitrito) mediante una rapida reazione con l'ossido nitrico (NO), che normalmente inibisce le piastrine attraverso la guanilil ciclasi NO-sensibile (NO-GC) e la generazione del regolatore piastrinico negativo GMP ciclico (cGMP)23,24. La conseguente diminuzione dei livelli di NO può portare al potenziamento piastrinico. In alternativa, è stato suggerito che la generazione di O2•- da parte di NOX2 contribuisca alla perossidazione lipidica e alla formazione di isoprostano, che è essenziale per l'attivazione e l'adesione piastrinica25. Infine, la chinasi 5 regolata dal segnale extracellulare della proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPK), una proteina chinasi proposta come sensore di stress redox nelle piastrine26, è attivata da O2•- e induce un fenotipo procoagulante nelle piastrine (come stimato dalla misurazione basata sulla citometria a flusso dell'esternalizzazione della fosfatidilserina)27.

La disregolazione dell'O2•- e di altre generazioni di ROS nelle piastrine è stata associata all'esagerata risposta emostatica che porta a complicanze cardiovascolari trombotiche associate ad aterosclerosi, diabete mellito, ipertensione, obesità e cancro28,29. In questi contesti patologici, l'emissione di ROS da parte delle piastrine è aumentata, il che porta ad un potenziamento delle loro risposte adesive e aggregatorie. Oltre all'effetto sulle risposte piastriniche, l'emissione di radicali liberi delle piastrine può avere conseguenze su altre cellule del sangue e strutture vascolari, che è un'area della salute cardiovascolare poco compresa e poco studiata30. Nonostante la nostra limitata comprensione dei meccanismi molecolari che legano lo stress ossidativo alle condizioni trombotiche, la rilevanza clinica degli antiossidanti per la protezione contro le malattie cardiovascolari ha ricevuto notevole attenzione. È stato dimostrato che i livelli plasmatici di antiossidanti sono inversamente correlati al rischio di sviluppare condizioni cardiovascolari e il consumo di antiossidanti alimentari ha dimostrato di proteggere dalla malattia coronarica31,32. Di conseguenza, l'uso di antiossidanti alimentari è stato sostenuto come un approccio promettente per la prevenzione delle malattie cardiovascolari 33,34,35. Tra gli effetti della generazione di ROS nelle piastrine, l'aumento dell'apoptosi può avere importanti effetti fisiopatologici36,37. Nel complesso, protocolli affidabili per rilevare e quantificare l'output di O2•- da parte delle piastrine sono sempre più rilevanti nella ricerca cardiovascolare.

Attualmente, le tecniche disponibili per la rilevazione dei ROS presentano importanti limitazioni di specificità (ad esempio, la natura chimica delle molecole ossidanti rilevate è sconosciuta) e di affidabilità (ad esempio, l'interazione indesiderata con molecole biologiche e reagenti sperimentali porta a risultati non fisiologici distorti)38,39. L'approccio più comunemente utilizzato per la rilevazione di ROS nelle piastrine si basa sull'uso del diclorodiidrofluoresceina diacetato (DCFDA), che viene convertito in diclorodiidrofluoresceina (DCFH) dalle esterasi intracellulari e di conseguenza in diclorofluoresceina altamente fluorescente (DCF) dagli ossidanti cellulari, inclusi i radicali ossidrilici e gli intermedi della perossidasi-H2O2 40,41. Nonostante il suo ampio utilizzo, sono stati sollevati seri dubbi sull'affidabilità di questo approccio per la misurazione del ROS38 intracellulare. L'ossidazione del DCFH a DCF può essere, infatti, indotta da ioni metalli di transizione (ad esempio, Fe2+) o enzimi contenenti eme (ad esempio, citocromi) invece che da ROS42. Inoltre, il DCFDA viene convertito dalle perossidasi cellulari nella sua forma di radicale libero semichinone (DCF•-), che a sua volta viene ossidato a DCF per reazione con l'ossigeno molecolare (O2) con il rilascio di O2•-, che porta all'amplificazione artificiale delle risposte ossidative 41,43,44. Pertanto, la rilevazione di ROS intracellulari mediante DCFDA è utile per ottenere informazioni iniziali, ma richiede un'attenta considerazione e ampi controlli sperimentali38,39.

Questo studio presenta tre tecniche alternative per il rilevamento e la misurazione del regolatore chiave della funzione piastrinica O2•-1. La prima tecnica è la rilevazione mediante DHE e citometria a flusso, che offre vantaggi di affidabilità e specificità rispetto alla DCFDA. La seconda tecnica qui proposta utilizza anche il DHE, ma il metodo di rilevamento è l'imaging a fluorescenza piastrinica dal vivo, che consente lo studio della generazione di O2•- sulla segnalazione piastrinica con cinetica rapida e risoluzione di singole cellule. Infine, un protocollo basato sull'utilizzo della sonda di spin idrossilammina 1-idrossi-3-metossicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina (CMH) in esperimenti di risonanza EPR offre la possibilità di quantificare il tasso di generazione di O2•- da parte delle piastrine e confrontarlo in diverse condizioni.

Protocol

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La raccolta di sangue periferico da volontari consenzienti è approvata dal Comitato Etico locale e dall'Autorità per la Ricerca Sanitaria Nazionale (riferimento REC: 21/SC/0215; ID IRAS: 283854).

1. Metodo 1: Rilevazione dell'anione superossido mediante DHE mediante citometria a flusso

  1. Preriscaldare (37 °C) la soluzione di citrato di sodio (4% p/v) e utilizzarla come anticoagulante aggiungendola direttamente nel sangue al momento della puntura venosa in un rapporto di 1:7 (0,5% p/v finale).
  2. Prelevare sangue umano periferico da volontari sani mediante puntura venosa della vena cubitale mediana.
  3. Ottenere plasma ricco di piastrine (PRP) da sangue intero mediante una fase iniziale di centrifugazione a 200 x g per 20 minuti.
  4. Centrifugare il PRP a 500 x g per 10 minuti con gli inibitori piastrinici reversibili indometacina (10 μM) e PGE1 (40 ng/mL).
  5. Risospendere il pellet piastrinico risultante in tampone di Tyrode modificato (145 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetano acido solfonico (HEPES), 1 mM MgCl2, 5 mM glucosio, pH 7,3) (37 °C) a una densità di 2 x 108 piastrine/mL.
  6. Dopo l'isolamento, far riposare le piastrine per 30 minuti a 37 °C.
  7. Preparare il DHE in dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione madre di 5 mM.
  8. Aggiungere DHE alla sospensione piastrinica alla concentrazione finale di 5 μM (diluire la soluzione madre da 1 a 1.000, con concentrazione finale di DMSO 0,1% v/v) e incubare per 15 minuti a 37 °C.
  9. Trattare le piastrine con agenti farmacologici e/o scavenger di ROS per 15 minuti prima della stimolazione con gli stimoli fisiologici e le concentrazioni desiderate (ad esempio, 0,1 unità/mL di trombina o 3 μg/mL di collagene).
  10. Dopo la stimolazione, diluire le sospensioni piastriniche da 1 a 10 in tampone HEPES modificato ghiacciato.
  11. Per la citometria a flusso, il set side scattering (SSC) e lo scattering diretto (FSC) guadagnano rispettivamente a 40 mV e 220 mV e utilizzano grafici di dispersione su scala logaritmica per visualizzare la popolazione di particelle nella sospensione (esempio nella Figura 1A).
  12. (FACOLTATIVO) Immunocolorare un'aliquota di sospensione piastrinica utilizzando un anticorpo anti-CD41 per identificare la popolazione di eventi corrispondenti alle piastrine (esempio nella Figura 1B).
  13. Analizzare i campioni mediante citometria a flusso utilizzando l'eccitazione a 405 nm (laser viola) e l'emissione a 580 nm di lunghezza d'onda, che rileva selettivamente il prodotto specifico dell'anione superossido 2-idrossi-etidio (2OH-Et+) (Figura 2).
    NOTA: Si sconsiglia la fissazione con paraformaldeide e la conservazione a lungo termine del campione.

2. Metodo 2: Rilevazione dell'anione superossido mediante DHE mediante imaging a fluorescenza piastrinica singola

  1. Il giorno dell'esperimento, rivestire un μ-vetrino a 8 pozzetti con 0,1 mg/mL di collagene fibrillare I da tendini equini (collagene Horm), 0,2 mg/mL di fibrinogeno o 1 mg/mL di poli-L-lisina (PLL) in tampone di Tyrode modificato per 2 ore a 37 °C.
  2. Lavare due volte con tampone di Tyrode modificato (10 minuti ciascuno).
  3. Estinguere l'adesione aspecifica mediante incubazione nel tampone di Tyrode modificato più 5 mg/mL di albumina sierica bovina (BSA) per un minimo di 30 minuti (o fino all'esperimento).
  4. Preriscaldare (37 °C) la soluzione di citrato di sodio (4% p/v) e utilizzarla come anticoagulante aggiungendola direttamente nel sangue al momento della puntura venosa in un rapporto di 1:7 (0,5% p/v finale).
  5. Prelevare sangue umano periferico da volontari sani mediante puntura venosa della vena cubitale mediana.
  6. Ottenere plasma ricco di piastrine (PRP) da sangue intero mediante una fase iniziale di centrifugazione a 200 x g per 20 minuti.
  7. Centrifugare il PRP a 500 x g per 10 minuti con gli inibitori piastrinici reversibili indometacina (10 μM) e PGE1 (40 ng/mL).
  8. Risospendere il pellet piastrinico risultante in tampone di Tyrode modificato (145 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM glucosio, pH 7,3) (37 °C) a una densità di 4 x 107 piastrine/mL.
  9. Dopo l'isolamento, far riposare le piastrine per 30 minuti a 37 °C.
  10. Preparare DHE in dimetilsolfossido (DMSO) a una concentrazione madre di 10 mM.
  11. Aggiungere DHE alla concentrazione finale di 10 μM alla sospensione piastrinica (diluire la soluzione madre da 1 a 1.000, con concentrazione finale di DMSO 0,1% v/v) e incubare per 1 minuto (37 °C).
  12. Dopo 1 minuto di incubazione con DHE, rimuovere la soluzione bloccante dai pozzetti scelti, posizionare il vetrino da μ sul tavolino del microscopio pronto per l'imaging ed erogare delicatamente le piastrine.
  13. Monitora la conversione del DHE in 2OH-Et+ mediante imaging confocale invertito per 10 minuti (405/580 nm ex/em), con immagini raccolte ogni 10 s con una lente a immersione in olio 40x.
  14. (FACOLTATIVO) Per i pozzetti rivestiti con PLL, monitorare la generazione di anioni superossido in risposta a un agonista solubile (ad es. 0,1 unità/mL di trombina o 3 μg/mL di collagene) aggiungendo l'agonista 10 minuti dopo la dispensazione delle piastrine e la raccolta delle immagini di fluorescenza per altri 10 minuti, come descritto al punto 2.13.
  15. (FACOLTATIVO) Se necessario, aggiungere scavenger di anioni superossido o inibitori selettivi (ad esempio, inibitore di NOX) erogando delicatamente a lato del pozzetto durante il decorso temporale e raccogliere immagini a fluorescenza come descritto in 2.13 per altri 10 minuti.
  16. Quantifica l'analisi della fluorescenza di una singola cellula selezionando la regione di interesse (ROI) contenente singole piastrine rappresentative e analizzando l'intensità della fluorescenza in diversi frame con lo strumento di misurazione della suite di imaging ImageJ 1.53t.

3. Metodo 3: Rivelazione dell'anione superossido da parte delle piastrine mediante risonanza paramagnetica elettronica (EPR)

  1. Preriscaldare (37 °C) la soluzione di citrato di sodio (4% p/v) e utilizzarla come anticoagulante aggiungendola direttamente nel sangue al momento della puntura venosa in un rapporto di 1:7 (0,5% p/v finale).
  2. Prelevare sangue umano periferico da volontari sani mediante puntura venosa della vena cubitale mediana.
  3. Ottenere plasma ricco di piastrine (PRP) da sangue intero mediante una fase iniziale di centrifugazione a 200 x g per 20 minuti.
  4. Centrifugare il PRP a 500 x g per 10 minuti con gli inibitori piastrinici reversibili indometacina (10 μM) e PGE1 (40 ng/mL).
  5. Risospendere il pellet piastrinico risultante in tampone di Tyrode modificato (145 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM glucosio, pH 7,3) (37 °C) a una densità di 2 x 108 piastrine/mL.
  6. Dopo l'isolamento, far riposare le piastrine per 30 minuti a 37 °C.
  7. Aggiungere 5 μM di dietilditiocarbammato (DETC) e 25 μM di deferoxammina alla sospensione piastrinica.
  8. Senza incubazione, aggiungere 200 μM di 1-idrossi-3-metossicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina (CMH).
  9. Caricare i campioni sull'aggregometro all'interno di cuvette di aggregazione (compresi i magneti di agitazione rivestiti in teflon).
  10. Dopo 1 minuto, aggiungere gli stimoli alla concentrazione desiderata (ad esempio, 1 unità/mL di trombina o 3 μg/mL di collagene). Incubare per 10 min.
  11. (FACOLTATIVO) Ottenere la generazione di anioni superossido in diversi punti temporali procedendo al passaggio 3.12 al momento desiderato.
  12. Trasferire la sospensione piastrinica dalla cuvetta di aggregazione a una provetta da microcentrifuga e centrifugare rapidamente a 6.000 x g per 10 s.
  13. Caricare 50 μl di surnatante in micropipette capillari e sigillare con ceralacca EPR.
  14. Trasferire i campioni allo scanner EPR.
  15. Impostare lo scanner EPR come segue: campo centrale 3.492,5 G, scansione di campo 60 G, ampiezza di modulazione 2 G, tempo di scansione 10 s, numero di scansioni 10, frequenza microonde 9,39 GHz, potenza microonde 20 mW, tempo di conversione 327,68 ms, costante di tempo 5242,88 ms.
  16. Stimare l'ossidazione del CMH a CM● come l'area sotto la curva (AUC) dei picchi EPR registrati utilizzando i parametri di cui sopra.
  17. Costruire una curva di calibrazione tracciando l'intensità EPR misurata come descritto al punto 3.16 sull'asse y e le concentrazioni del CM● disponibile in commercio sull'asse x (ad esempio, 0, 0,3, 1, 3, 10 e 30 μM).
  18. Dalla concentrazione di CM● nei campioni, ottenere la quantità di anione superossido generata dalle piastrine nei campioni utilizzando le formule descritte nella sezione Risultati rappresentativi.

Results

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Per la rilevazione della fluorescenza DHE con citometria a flusso, mostriamo risultati rappresentativi per le piastrine a riposo (Figura 3A) o stimolate con 0,1 unità/mL di trombina (Figura 3B). L'output di O2•- è stato quantificato come intensità media di fluorescenza piastrinica (MFI), come mostrato per la stimolazione con 0,1 unità/mL di trombina (Figura 3C) o 3 μg/mL di peptide correlato al collagene (CRP) (Figura 3D). È stato osservato un aumento di due/tre volte della colorazione del DHE a seguito della stimolazione piastrinica. Per confermare che l'O2•- viene misurato, suggeriamo l'uso della O2•- scavenger pegilato superossido dismutasi dismutasi permeabile alle cellule (PEG-SOD, 100 unità/mL), mentre per identificare la fonte di O2•- abbiamo utilizzato l'inibitore NOX VAS2870 (10 μM). Sia per il collagene che per la trombina, PEG-SOD e VAS2870 hanno abolito l'aumento della fluorescenza del DHE causato dall'attivazione piastrinica, confermando che la misura è specifica per l'O2•- e che le loro fonti in queste condizioni sono gli enzimi NOX.

Per la rilevazione di fluorescenza DHE, presentiamo i dati di esperimenti che valutano la generazione di O2•- al momento dell'adesione al collagene o al fibrinogeno (e i successivi 10 minuti) (Figura 4A) o da esperimenti che mirano a valutare la generazione di O2•- da piastrine precedentemente aderite a PLL dopo stimolazione con trombina (Figura 4B). Come previsto, l'adesione al PLL non innesca una robusta produzione di O2•-. Molto probabilmente perché questa forma di adesione dipende dall'interazione elettrostatica senza l'inizio di alcuna risposta di segnalazione45, il che rende questo approccio adatto a misurare l'output di O2•- in risposta all'aggiunta di agonisti solubili. Per confermare che questo protocollo consente la rilevazione di O2•-, è possibile utilizzare scavenger o inibitori selettivi. Abbiamo dimostrato in studi precedenti che la N-acetil-cisteina (NAC) può eliminare l'O2•- e abolire la fluorescenza piastrinica in questi esperimenti46. Qui, dimostriamo che l'inibitore selettivo degli NOX VAS2870 efficacemente e istantaneamente la fluorescenza nelle piastrine che aderiscono al collagene o al fibrinogeno (Figura 4A) o che rispondono alla trombina (Figura 4B). Ciò suggerisce che gli NOX sono la fonte di O2•- in queste condizioni sperimentali. I film rappresentativi della fluorescenza del DHE (eccitazione a 405 nm) in risposta all'adesione al collagene o al fibrinogeno o alla stimolazione da parte della trombina delle piastrine che aderiscono al PLL sono inclusi rispettivamente come File supplementare 1, File supplementare 2 e File supplementare 3. Da notare che PEG-SOD, che è stato utilizzato con successo in altre configurazioni sperimentali come scavenger di O2•-, non è efficace in questo tipo di esperimento. Al momento non abbiamo una spiegazione chiara per questo. Possiamo ipotizzare che la PEG-SOD raggiunga i compartimenti cellulari in cui O2•- induce un aumento della fluorescenza nei saggi basati sull'imaging, sia con scarsa efficienza che con cinetica lenta. Potrebbero essere necessarie ulteriori indagini mirate per chiarire questo punto.

Abbiamo applicato la misurazione di O2•- mediante EPR nelle piastrine in diversi studi precedentemente pubblicati 1,13,47,48,49,50. Un passaggio cruciale per questa tecnica è la preparazione di una curva di calibrazione utilizzando CM● disponibile in commercio (cioè il prodotto della reazione tra la sonda di spin CMH e O2•- e le specie risonanti misurate mediante EPR). La reazione di CMH e O2•- è mostrata nella Figura 5A, ed esempi rappresentativi del segnale EPR indotto da diverse concentrazioni di CM● sono mostrati nella Figura 5B. I dati provenienti da diverse concentrazioni di CM● sono stati utilizzati per costruire una curva di calibrazione che descrive la correlazione lineare tra la quantità di CMH ossidato e l'intensità del segnale EPR nei campioni (Figura 5C). L'equazione seguente descrive la correlazione tra la concentrazione di CM● e l'intensità del segnale EPR ed è il punto di partenza per il calcolo della curva di calibrazione per gli esperimenti di questo studio (Equazione 1):

figure-results-1

Poiché sia le concentrazioni di CM● che la loro corrispondente intensità EPR sono state ottenute sperimentalmente, è possibile calcolare la pendenza e l'intercetta dell'asse Y della curva di calibrazione. Nell'esempio mostrato nella Figura 5C, Pendenza = 1.002.169 e Intercetta = 596.383. Pertanto, l'equazione per la curva di calibrazione può essere riscritta come:

figure-results-2

Riorganizzando l'equazione di cui sopra, è possibile calcolare la concentrazione di CM● per diversi campioni in base ai loro valori di intensità EPR (Equazione 2):

figure-results-3

Una volta nota la concentrazione di CM● nei campioni, è possibile calcolare il suo tasso di generazione per piastrina e unità di tempo con l'equazione seguente (Equazione 3):

figure-results-4

Utilizzando l'equazione 2, l'equazione 3 può essere riscritta come (equazione 4):

figure-results-5

Che nell'esempio mostrato nella Figura 5C può essere riscritto come:

figure-results-6

Il tasso di ossidazione della CMH sarà espresso come attomoli di CM● generati per piastrina al minuto. Questo valore può essere utilizzato per confrontare il tasso di generazione di O2•- tra esperimenti e donatori, cosa che non è possibile con sonde fluorescenti come DHE (o DCFDA). Le sonde fluorescenti generalmente consentono solo una stima dell'effetto di diverse condizioni sulla generazione di O2•- come variazioni dell'intensità della fluorescenza all'interno dello stesso esperimento. Come per tutte le tecniche descritte in questo articolo, la specificità di rilevamento è stata confermata con scavenger di ROS (ad esempio, PEG-SOD, NAC) o inibitori selettivi di enzimi che generano anione superossido (ad esempio, VAS2870 per inibire gli NOX). Qui, presentiamo i dati per la stimolazione piastrinica (Figura 6) con trombina (Figura 6A, C, E) o collagene (Figura 6B, D, F). Per entrambi gli agonisti, la PEG-SOD è stata utilizzata per confermare che l'O2•- è stato rilevato, mentre la mancanza di effetto per la pegilata-catalasi (PEG-Cat.) suggerisce che il perossido di idrogeno non è rilevato con questa tecnica (Figura 6C, D, rispettivamente). VAS2870 abolisce i segnali EPR indotti dalla trombina (Figura 6E) e dal collagene (Figura 6F), suggerendo che gli NOX sono la principale fonte di O2•- piastrinico in risposta a entrambi questi agonisti.

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Figura 1: analisi in citometria a flusso di sospensioni piastriniche. (A) Presentazione tipica dei grafici forward (FSC) e side scattering (SSC) per piastrine isolate. (B) L'immunocolorazione della sospensione piastrinica con un anticorpo anti-CD41 conferma il >98% delle particelle nel preparato come piastrine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Reazione chimica del DHE con l'anione superossido e altri ROS e le proprietà spettrali dei suoi prodotti. Struttura e proprietà spettrali del DHE e dei suoi due prodotti di ossidazione 2-idrossi-etidio (2OH-Et+), generato dalla reazione con gli anioni superossido, e l'etidio (Et+), generato dalla reazione con altri tipi di ROS (ad esempio, radicale ossidrile e perossido di idrogeno). Il picco di eccitazione a 405 nm, evidenziato da un rettangolo blu tratteggiato nella figura, è specifico per 2OH-Et+ e può, quindi, essere utilizzato per rilevare/misurare O2•-. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Generazione di anioni superossido dipendenti da trombina e collagene rilevata mediante DHE e citometria a flusso. Istogrammi rappresentativi per la colorazione DHE di (A) piastrine a riposo e (B) stimolate da trombina. La barra indica valori di colorazione DHE inferiori a 500, che è rispettivamente del 70,7% e del 16,1% per le piastrine a riposo e stimolate dalla trombina. Questa tecnica è stata utilizzata per stimare la generazione di anioni superossido in (C) 0,1 unità/mL di trombina e (D) 3 μg/mL di piastrine stimolate con collagene. PEG-SOD (100 unità/mL) è stato utilizzato per confermare che gli anioni superossido sono stati misurati in questo esperimento, mentre 10 μM VAS2870 è stato utilizzato per identificare gli enzimi NOX come fonte di anioni superossido. Ogni punto dati è stato calcolato come intensità media di fluorescenza (MFI) da 50.000 piastrine e ogni esperimento è stato ripetuto cinque volte indipendenti (n = 5), con il SEM medio ± mostrato nei grafici. La significatività statistica è stata valutata mediante ANOVA a una via con Tukey post-test per confronti a coppie (** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Generazione di anioni superossido dipendenti da collagene, fibrinogeno e trombina rilevata dall'imaging a fluorescenza DHE. (A) La cinetica di generazione di anioni superossido è stata valutata per le piastrine che aderiscono al collagene o al fibrinogeno. Le piastrine sono state dispensate su vetrini di μ rivestiti 1 minuto dopo l'inizio dell'imaging, mentre il VAS2870 10 μM è stato aggiunto 5 minuti dall'inizio della raccolta delle immagini. (B) Cinetica di generazione di anioni superossido per piastrine dopo stimolazione con trombina. Le piastrine sono state lasciate aderire ai vetrini di μ rivestiti di PLL per 10 minuti prima dell'inizio della raccolta delle immagini. Dopo 2 minuti, è stata aggiunta 0,1 unità/mL di trombina e dopo altri 5 minuti è stata aggiunta una VAS2870 di 10 μM (cioè 7 minuti dall'inizio dell'imaging). Lo schema sperimentale è presentato nella parte superiore dei pannelli, mentre le immagini rappresentative di 0 min, 1 min, 3 min, 6 min e 9 min sono mostrate al centro dei pannelli. La quantificazione della fluorescenza DHE a piastrina singola è mostrata nella parte inferiore dei pannelli ed è stata ottenuta mediante analisi dell'intensità della fluorescenza utilizzando ImageJ. I dati sono medi ± SEM da 8-12 piastrine per condizione in 4 esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Calcoli della curva di calibrazione e del tasso di ossidazione del CMH. (A) Struttura chimica e proprietà EPR di CMH e CM●. (B) Esempi rappresentativi di dati EPR per diverse concentrazioni di CM● (da 100 nM a 10 μM). (C) Curva di calibrazione dell'intensità EPR rispetto alla concentrazione di CM● . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Rilevamento della produzione di anioni superossido da parte delle piastrine in seguito alla stimolazione della trombina o del collagene. L'uscita di anione superossido è stata misurata mediante EPR con la sonda di spin CMH in piastrine stimolate con (A) 0,1 unità/mL di trombina o (B) 3 μg/mL di collagene. (C, D) Una concentrazione di 100 unità/mL di scavenger di anioni superossidi PEG-SOD o 100 unità/mL di scavenger di perossido di idrogeno catalasi pegilata (PEG-Cat.) è stata inclusa nelle condizioni testate per entrambi gli agonisti. La fonte dell'anione superossido è stata studiata mediante co-incubazione con l'inibitore NOX VAS2870 (10 μM). Sia la trombina (E) che il collagene (F) dipendono dall'attività degli NOX per la generazione dell'anione superossido. In tutta la figura, la velocità di reazione CMH/anione superossido è stata calcolata dalle tracce EPR, come descritto nel manoscritto (Equazione 4). I dati sono medi ± SEM da 5 (C,D) e 4 esperimenti indipendenti (E,F). La significatività statistica è stata valutata mediante ANOVA a una via con Tukey post-test per confronti a coppie (** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fascicolo supplementare 1: Film rappresentativo per la fluorescenza DHE (eccitazione a 405 nm) in risposta all'adesione al collagene. Clicca qui per scaricare questo file.

Fascicolo supplementare 2: Film rappresentativo per la fluorescenza DHE (eccitazione a 405 nm) in risposta al fibrinogeno di adesione. Clicca qui per scaricare questo file.

Fascicolo supplementare 3: Film rappresentativo della fluorescenza DHE (eccitazione a 405 nm) in risposta alla stimolazione da parte della trombina delle piastrine aderenti alla PLL. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

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In questo manoscritto, presentiamo tre diverse tecniche con il potenziale di migliorare la capacità di studiare la regolazione redox-dipendente della funzione piastrinica attraverso la rilevazione selettiva di O2•-. I primi due metodi sono un miglioramento rispetto alle tecniche esistenti grazie alla sonda redox utilizzata (DHE invece della più comune ma meno affidabile DCFDA). Queste tecniche sono, quindi, facilmente accessibili e la maggior parte dei laboratori può adottarle efficacemente senza particolari attrezzature o costi di formazione. La terza tecnica si basa sull'utilizzo di apparecchiature specializzate per l'analisi dell'ossidazione della sonda di spin CMH mediante EPR. Questa tecnica richiede l'acquisto di attrezzature e reagenti specializzati e la formazione dedicata dell'utente del laboratorio. Di conseguenza, sembra adatto per i laboratori che si concentrano specificamente sullo studio degli eventi redox-dipendenti nelle piastrine (o in altre cellule).

Per le tecniche che utilizzano il DHE, la selezione della lunghezza d'onda per l'eccitazione è fondamentale per ottenere la rivelazione specifica di O2•-. Il 2-idrossi-etidio (2OH-Et+) generato dalla reazione del DHE con O2•- è eccitato a 405 nm, mentre l'etidio (Et+) generato dalla reazione generale del DHE con i ROS (ad esempio, radicale ossidrile e perossido di idrogeno) ha un picco di eccitazione intorno a 520 nm ma nessuna eccitazione a 405 nm (Figura 1)51. L'uso del DHE al posto del DCFDA protegge dagli artefatti causati dalla reazione diretta di questa sonda con componenti cellulari come perossidasi, altri enzimi contenenti eme e agenti riducenti di ioni metallici 42,43,44. Il DHE è stato suggerito come uno strumento più sicuro per gli studi di ossidoriduzione cellulare38,39. Qui, proponiamo l'uso del DHE con due diverse tecniche di lettura: 1) citometria a flusso e 2) imaging a fluorescenza.

La citometria a flusso è generalmente una tecnica che consente la gestione simultanea di più campioni con una produttività medio-bassa52. Sfortunatamente, l'approccio utilizzato in questo studio non consente la fissazione del campione. Sebbene la diluizione dei campioni con il tampone di Tyrode modificato a freddo come ghiaccio stabilizzi la fluorescenza nei campioni per un massimo di 30 minuti, l'analisi di tutti i campioni deve essere eseguita in questo lasso di tempo. Ciò limita significativamente il numero di campioni per esperimento. Sono possibili più esecuzioni sperimentali controllate internamente nello stesso giorno e utilizzando la stessa preparazione piastrinica, anche se i risultati devono essere normalizzati ai controlli e non considerati come esperimenti indipendenti. Questa tecnica è stata utilizzata dagli autori di questo manoscritto per evidenziare il ruolo della modulazione piastrinica redox-dipendente nelle risposte a diversi agonisti e modulatori46,50. Questo metodo può essere modificato adottando l'uso di una versione chimicamente modificata del DHE che consente di colpire i mitocondri (ad esempio, Mitosox)53, che è stato utilizzato per studi piastrinici incentrati su NOX254. Si tratta di un'opportunità interessante che non è stata ancora perseguita dai nostri laboratori.

La tecnica di imaging a fluorescenza che utilizza DHE qui proposta ha il vantaggio di determinare l'andamento temporale della generazione di O2•- nelle piastrine in seguito all'adesione (agonisti assorbiti sulla superficie del pozzetto di imaging) o alla stimolazione (agonisti in sospensione). Ciò consente l'interpretazione dell'interazione di diverse fasi del processo di attivazione piastrinica e la valutazione del contributo di diverse fonti di O2•- (ad esempio, diversi enzimi che generano ROS, ad esempio NOX). Nessuna tecnica esistente consente questo tipo di indagine. Ciò ha un costo in termini di produttività del saggio, con ogni condizione testata che richiede 30 minuti (che include l'impostazione del μ-vetrino, la messa a fuoco e la selezione del campo, l'imaging e il salvataggio dei dati). Pertanto, questa tecnica consente di testare un numero ridotto di condizioni per giorno lavorativo (cioè meno di 10). Sebbene sia stato utilizzato un microscopio confocale per i dati qui mostrati, abbiamo confermato che risultati altrettanto buoni possono essere ottenuti con un microscopio a epifluorescenza con capacità di eccitazione di 405 nm. Ciò riduce la necessità di costose configurazioni di microscopia confocale e rende questa tecnica più conveniente.

Il protocollo EPR è stato sviluppato sulla base di studi precedenti in diversi tipi di cellule55. Questa tecnica è ampiamente riconosciuta come lo strumento più affidabile per lo studio della generazione di ROS e lo studio di eventi redox-dipendenti nelle cellule38. Oltre all'affidabilità superiore rispetto ad altre tecniche grazie alla specificità della reazione delle sonde di spin idrossilammina con i radicali liberi dell'ossigeno56, l'EPR consente la quantificazione del tasso di generazione di O2•- e il suo confronto tra diversi individui ed esperimenti. Questo non è possibile con le tecniche basate sulla fluorescenza, che ci permettono solo di stimare l'effetto di condizioni selezionate sull'intensità della fluorescenza all'interno di un singolo esperimento e preparazione piastrinica. Sebbene questo protocollo EPR sia stato sviluppato come tecnica da combinare con l'aggregazione piastrinica per il monitoraggio parallelo dell'attivazione piastrinica e della generazione 1 di O2•, questi esperimenti possono essere eseguiti senza l'analisi parallela dell'aggregazione. Anche senza un'analisi parallela dell'aggregazione piastrinica, suggeriamo di eseguire l'incubazione in un aggregometro per garantire un'efficace stimolazione piastrinica, che richiede lo sforzo di taglio fornito dall'agitazione continua. Se gli esperimenti devono essere eseguiti in provette da microcentrifuga da 1,5 mL senza agitazione, i livelli di produzione di O2•- sono significativamente più bassi. Pertanto, se si sceglie questo approccio sperimentale, si consiglia di eseguire l'incubazione CMH su una ruota rotante e con piastrine più densamente concentrate (es. 1 x 109/mL), che porta ad un segnale sufficientemente forte per la rilevazione da parte dello spettrometro EPR.

In sintesi, qui presentiamo tre tecniche convalidate per la rilevazione di O2•- nelle piastrine. Offrono diversi vantaggi e possono essere scelti in base agli obiettivi e alle priorità sperimentali. La prima tecnica basata sull'uso del DHE mediante citometria a flusso è la meno laboriosa e dispendiosa in termini di tempo e può, quindi, essere scelta come analisi entry-level. La seconda tecnica, basata sull'uso del DHE mediante microscopia a fluorescenza, consente di valutare la cinetica veloce della generazione di O2•- e lo studio di come diverse cascate di segnalazione possano influenzare la risposta ossidativa nella scala temporale dei secondi (mentre altre tecniche consentono solo l'indagine finale di eventi che si verificano entro pochi minuti dalla stimolazione). Infine, l'EPR consente la quantificazione del tasso di generazione di O2•- e il suo confronto tra esperimenti e individui. Per questo motivo, quest'ultima tecnica è particolarmente utile per gli studi clinici volti a caratterizzare la risposta ossidativa nelle piastrine di individui diversi (ad esempio, il confronto tra pazienti o pazienti rispetto a controlli sani). Nel complesso, queste tre tecniche offrono vantaggi significativi rispetto ai metodi esistenti e rappresentano un progresso significativo negli strumenti sperimentali a nostra disposizione per lo studio degli eventi redox-dipendenti nelle piastrine.

Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato finanziato dalla British Heart Foundation (PG/15/40/31522), dall'Alzheimer Research UK (ARUK-PG2017A-3) e dalle sovvenzioni dell'European Research Council (#10102507) a G. Pula.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-idrossi-3-metossicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina (CMH)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgReagente per EPR (sonda di rotazione)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NACitometro a flusso
Siero bovino Albumina Merck/SigmaA7030Per rivestimento μ-slide
Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH  NOX-E.11-BES spettrometro EPR
Catalasi– polietilenglicole (PEG-Cat.)Merck/SigmaC4963Scavenger di perossido di idrogeno (controllo della specificità)
ChronoLog Model 490+4Labmedics/ChronologNAAggregometro
CMradicale Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg Reagente per EPR (controllo della calibrazione)
deferoxamina Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-09.1-100mg Reagente per EPR
dietilditiocarbammato (DETC) Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g Reagente per EPR
DiidroetidioThermo Fisher ScientificsD11347Sonda anionica superossido
DimetilsolfossidoMerck / Sigma34869Per la preparazione della soluzione madre 
Piastre di ceralacca EPRNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMMateriale di consumo per acqua EPR
di grado EPRNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L Reagente per EPR
Fibrinogeno da plasma umanoMerck/SigmaF4883Per rivestimento in vetrino
FITC Anticorpo CD41 anti-umanoBioLegend303704Colorazione piastrinica specifica per citometria a flusso
Cuvette di vetro Labmedics/ChronologP/N 312Materiale di consumo per incubazione in aggregometro
Horm CollagenLabmedics/ChronologP/N 385Per la stimolazione piastrinica
ImageJ National Institutes of Health (NIH)NAImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
IndometacinaMerck/SigmaI7378Per l'isolamento piastrinico
Micropipette DURAN 50µ lNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-G.6.1-50µ LMateriale di consumo per EPR
Poli-L-lisina cloridratoMerck/SigmaP2658Per rivestimento μ-slide
Prostaglandina E1 (PGE1)Merck/SigmaP5515Per l'isolamento piastrinico
Citrato di sodio (soluzione al 4% p/v)Merck/SigmaS5770Per l'isolamento piastrinico
Barre di agitazione (rivestite in teflon)Labmedics/ChronologP/N 313Materiale di consumo per l'incubazione in aggregometro
Superossido dismutasi... polietilenglicole (PEG-SOD)Merck/SigmaS9549Scavenger di anioni superossido (controllo della specificità)
Trombina da plasma umanoMerck/SigmaT6884Per la stimolazione piastrinica e il rivestimento di μ-vetrini
VAS2870Enzo Life ScienceBML-EI395Inibitore NOX
Zeiss 510 LSM Microscopio confocaleZeissNA

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