Articolo metodologico

Il lievito di fissione come piattaforma per lo screening di farmaci antibatterici mirati alle proteine del citoscheletro batterico

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DOI:

10.3791/66657

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26 aprile 2024

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1School of Biological Sciences, National Institute of Science Education and Research, 2Homi Bhabha National Institutes

In questo articolo

Sommario

Il lievito di fissione viene utilizzato qui come ospite eterologo per esprimere proteine citoscheletriche batteriche come FtsZ e MreB come proteine di fusione traduzionali con GFP per visualizzare la loro polimerizzazione. Inoltre, i composti che influenzano la polimerizzazione vengono identificati mediante imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Abstract

Le proteine del citoscheletro batterico come FtsZ e MreB svolgono funzioni essenziali come la divisione cellulare e il mantenimento della forma cellulare. Inoltre, FtsZ e MreB sono emersi come obiettivi importanti per la scoperta di nuovi antimicrobici. Sono stati sviluppati diversi saggi per identificare composti che hanno come bersaglio il legame nucleotidico e la polimerizzazione di queste proteine del citoscheletro, principalmente focalizzati su FtsZ. Inoltre, molti dei test sono laboriosi o costosi e l'accertamento di queste proteine come bersaglio cellulare del farmaco richiede spesso più metodi. Infine, anche la tossicità dei farmaci per le cellule eucariotiche pone un problema. Qui, descriviamo un saggio basato su cellule in un'unica fase per scoprire nuove molecole che prendono di mira il citoscheletro batterico e ridurre al minimo i colpi che potrebbero essere potenzialmente tossici per le cellule eucariotiche. Il lievito di fissione è suscettibile di screening ad alto rendimento basati sulla microscopia e uno screening visivo può facilmente identificare qualsiasi molecola che altera la polimerizzazione di FtsZ o MreB. Il nostro test utilizza la piastra standard a 96 pozzetti e si basa sulla capacità delle proteine del citoscheletro batterico di polimerizzare in una cellula eucariotica come il lievito di fissione. Sebbene i protocolli qui descritti siano per il lievito di fissione e utilizzino FtsZ da Staphylococcus aureus e MreB da Escherichia coli, sono facilmente adattabili ad altre proteine citoscheletriche batteriche che si assemblano facilmente in polimeri in qualsiasi ospite di espressione eucariotica. Il metodo qui descritto dovrebbe aiutare a facilitare l'ulteriore scoperta di nuovi antimicrobici che prendono di mira le proteine del citoscheletro batterico.

Introduzione

La diffusa resistenza a quasi tutti gli antibiotici attualmente impiegati per combattere le infezioni batteriche ha creato un'immediata necessità di nuove categorie di antibiotici. Un rapporto del 2019 ha indicato che le infezioni resistenti agli antibiotici hanno provocato la perdita di 1,27 milioni di vite, contribuendo a un conteggio complessivo di 4,95 milioni di decessi se si considerano le complicanze delle infezioni batteriche resistenti1. Sebbene sia ancora efficace nella pratica clinica, l'attuale arsenale di antibiotici si rivolge prevalentemente a uno spettro ristretto di processi cellulari, concentrandosi principalmente sulla parete cellulare, sul DNA e sulla sintesi proteica. Nell'ultimo mezzo secolo, meno di 30 proteine sono state sfruttate commercialmente come bersagli per lo sviluppo di nuovi antibatterici 2,3. Questa gamma limitata di bersagli praticabili crea in modo significativo vincoli alla scoperta di nuovi antibiotici o dei loro derivati per combattere i batteri resistenti agli antibiotici. Pertanto, per superare il problema emergente della resistenza agli antibiotici, è necessario lo sviluppo di nuovi antibiotici con nuovi bersagli e meccanismi d'azione.

Un bersaglio antibatterico dovrebbe idealmente essere una componente essenziale della crescita delle cellule batteriche, essere conservato in tutte le specie filogeneticamente diverse, mostrare meno omologia eucariotica ed essere accessibile agli antibiotici4. Dalla scoperta delle proteine del citoscheletro batterico coinvolte nella divisione cellulare e nel mantenimento della forma cellulare, sono emerse come un promettente punto focale per lo sviluppo di composti antibatterici5. Queste proteine sono essenziali per la vitalità batterica e svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento della forma cellulare (MreB, CreS), della divisione (FtsZ, FtsA) e della segregazione del DNA (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), simili al citoscheletro nelle cellule eucariotiche. In particolare, FtsZ mostra un livello notevolmente elevato di conservazione in un'ampia gamma di organismi procarioti, mentre MreB si trova in quasi tutti i batteri a forma di bastoncello. Una distribuzione così ampia e rilevante nella vitalità cellulare rendono queste proteine un bersaglio affascinante nella ricerca sugli antibiotici 5,6,7.

È fondamentale adottare un approccio su più fronti che combini osservazioni in vivo, interazioni in vitro ed esperimenti enzimatici per convalidare a fondo le proteine del citoscheletro batterico come bersaglio primario di un potenziale inibitore7. Procedure laboriose o sostanziali implicazioni di costo gravano su molti test disponibili per questo scopo. Questi sono notevoli ostacoli al loro utilizzo diffuso nello screening di composti guida che potrebbero avere un impatto sul citoscheletro batterico. Tra questi, la microscopia si distingue come un metodo eccezionalmente efficiente e rapido per valutare l'efficacia dei composti esaminando direttamente i cambiamenti nella morfologia cellulare. Tuttavia, l'etero-associazione della proteina bersaglio con altri complessi del citoscheletro, gli effetti indiretti dovuti al legame off-target e ai cambiamenti nel potenziale di membrana, la difficoltà a penetrare efficacemente nella cellula e la presenza di pompe di efflusso, specialmente nei batteri Gram-negativi, rendono collettivamente complesso individuare la causa precisa della deformazione della cellula batterica 8,9,10.

Lo Schizosaccharomyces pombe, o lievito di fissione come è comunemente noto, è un organismo eucariotico unicellulare a forma di bastoncello. Il lievito di fissione è ampiamente utilizzato come organismo modello in biologia cellulare e molecolare a causa della straordinaria conservazione nei processi cellulari come il ciclo e la divisione cellulare, l'organizzazione cellulare e la replicazione cromosomica con eucarioti superiori, compresi gli esseri umani11,12. Inoltre, Errington e colleghi hanno espresso una proteina citoscheletrica batterica localizzata ai poli DivIVA nel lievito di fissione per dimostrare che DivIVA si accumulava su superfici curve negativamente13. Ancora una volta, Balasubramanian e il gruppo avevano stabilito per la prima volta il lievito di fissione come sistema modello cellulare per portare nuove intuizioni sul meccanismo, l'assemblaggio e la dinamicità della proteina del citoscheletro di actina di E. coli come MreB14 e l'omologo della tubulina FtsZ15. Dimostrano anche la capacità di A22 di impedire efficacemente la polimerizzazione di MreB attraverso la microscopia a epifluorescenza quando espresso nel lievito14. In seguito, anche altri gruppi hanno impiegato con successo il lievito di fissione per studiare le proprietà di assemblaggio delle proteine FtsZ1 e FtsZ2 dei cloroplasti16. Più recentemente, abbiamo stabilito una prova di concetto della fattibilità dell'uso del lievito di fissione come piattaforma cellulare per lo screening specifico degli inibitori del citoscheletro batterico conducendo una valutazione completa dell'impatto di tre noti inibitori di FtsZ: sanguinarina, berberina e PC190723-on proteine FtsZ derivate da due batteri patogeni, vale a dire Staphylococcus aureus e Helicobacter pylori17. Inoltre, questo test basato su cellule in un'unica fase si rivela fondamentale per ridurre al minimo il rischio di identificare composti che potrebbero essere potenzialmente tossici per le cellule eucariotiche.

In questo rapporto, utilizzando il sistema del lievito di fissione, proponiamo un flusso di lavoro sistematico utilizzando la piastra standard a 96 pozzetti per lo screening semiautomatico e la quantificazione dell'effetto di inibitori di piccole molecole che prendono di mira FtsZ da Staphylococcus aureus e MreB da Escherichia coli. Qui, abbiamo impostato e ottimizzato il flusso di lavoro semi-automatizzato utilizzando gli inibitori consolidati PC190723 e A22 che mirano specificamente rispettivamente a FtsZ e MreB. Questo flusso di lavoro utilizza un microscopio a epifluorescenza dotato di un tavolino motorizzato ad alta precisione e l'acquisizione automatizzata delle immagini in una piastra standard a 96 pozzetti per migliorare l'attuale standardizzazione. Pertanto, può essere applicato a schermi a medio e alto rendimento di librerie chimiche sintetiche e aggira alcune delle sfide sopra elencate.

Protocollo

1. Espressione di proteine del citoscheletro batterico marcate con GFP in S. pombe

NOTA: Si prega di consultare la Tabella 1 per informazioni su tutti i plasmidi e i ceppi utilizzati qui. Si prega di consultare la Tabella 2 per tutte le composizioni multimediali.

  1. Eseguire il clonaggio di MreB di E. coli con una fusione GFP N-terminale (GFP-MreB) e FtsZ di S. aureus che trasporta una GFP C-terminale (SaFtsZ-GFP) nel vettore di espressione di S. pombe, pREP42 con un promotore repressibile di tiamina di media potenza, nmt4118,19 come descritto in precedenza14,15. Mantenere, amplificare e isolare i plasmidi dai ceppi di E. coli (DH10β) come descritto in20,21.
    NOTA: Possono essere utilizzati anche altri ceppi di E. coli come DH5α, XL1Blue, TOP10, ecc. o altre cellule competenti disponibili in commercio utilizzate abitualmente per la clonazione molecolare.
  2. Trasformazione dei plasmidi pREP42-GFP-EcMreB e pREP42-SaFtsZ-GFP in S. pombe
    1. Trasformare i plasmidi pCCD3 (pREP42-GFP-EcMreB) e pCCD713 (pREP42-SaFtsZ-GFP) nel ceppo di S. pombe (h-leu1-32 ura4-D18) utilizzando il metodo22 dell'acetato di litio, come indicato nei passaggi seguenti.
    2. Giorno 1 - Coltura primaria: inoculare un anello di coltura di S. pombe appena striato in 3 ml di estratto di lievito autoclavato e integratori (YES) brodo. Incubarlo in un agitatore orbitale a 30 °C per una notte (O/N).
    3. Giorno 2:
      1. Coltura secondaria: aggiungere circa 500 μL di coltura primaria a 30 ml di brodo YES autoclavato. Incubare a 30 °C per 3 - 4 ore agitando fino a quando l'OD600 raggiunge 0,4 - 0,6.
        NOTA: Per ogni trasformazione vengono utilizzati 30 ml.
      2. Pellettare la coltura da 30 ml a 2.500 x g per 6-8 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante e lavare le cellule con 50 ml di acqua distillata sterile (D/W). Pellettare di nuovo e scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 1 mL di D/W sterile e trasferirle in una provetta da centrifuga da 2 mL. Centrifugare come sopra e scartare il surnatante.
      3. Aggiungere 1 mL di acetato di litio 0,1 M, soluzione di Tris-EDTA (LiAc-TE) e centrifugare come sopra. Eliminare il surnatante e risospendere in 1 mL di LiAc-TE 0,1 M. Centrifugare e scartare il surnatante, lasciando 100 μL di soluzione.
      4. Aggiungere 10 - 20 μg di DNA vettore (DNA spermatico di salmone; denaturato e raffreddato a flash su ghiaccio) e 2 - 3 μg di DNA plasmidico, che deve essere trasformato. Mescolare delicatamente. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
      5. Aggiungere 260 μl di PEG/LiAc-TE al 40 %; mescolare delicatamente. Incubare per 60 minuti nell'agitatore o in un termomiscelatore a 30 °C mescolando delicatamente. Aggiungere 43 μL di DMSO; mescolare delicatamente.
      6. Shock termico a 42 °C per 10 min nel termomiscelatore. Pellettare a 2.500 x g per 6-8 min e scartare il surnatante. Lavare il pellet 1 volta con 1 mL di D/W sterile.
      7. Pellettare, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 200 μL di D/W. Piastra sterile 100 μL su piastre Edinburgh minimal medium (EMM) contenenti 5 μg/mL di tiamina (per reprimere il promotore nmt41 ) e integratori di aminoacidi adenina (0,225 mg/mL), istidina (0,225 mg/mL) e leucina (0,225 mg/mL) ma privi di uracile (marcatore di selezione per il plasmide pREP42).
        NOTA: In alternativa, piastra da 70 μl e 130 μl in due piastre diverse. Due diversi volumi (70 μL e 130 μL) vengono piastrati per ottenere colonie isolate su almeno una delle piastre a seconda delle efficienze di trasformazione, che possono variare da esperimento a esperimento.
      8. Incubare le piastre a 30 °C per 2-3 giorni fino alla comparsa delle colonie. Miscelare una singola colonia con 100 μL di D/W sterile e stenderla su una piastra EMM fresca contenente tiamina ma priva di uracile come descritto sopra.
      9. Incubare a 30 °C per 2-3 giorni fino a quando non appare un prato completo. Raschiare il prato coltivato di cellule utilizzando un anello di inoculazione e risospenderlo in 1 ml di terreno YES contenente il 30% di glicerolo in una fiala criogenica.
      10. Congelare rapidamente la crio-fiala in azoto liquido e conservarla a -80 °C per conservare le scorte di lievito congelate.
  3. Espressione di proteine del citoscheletro batterico nel lievito di fissione
    1. Striare asetticamente un cerotto dal brodo di glicerolo su una piastra fresca specifica per il lievito per ottenere una coltura sufficiente per ulteriori esperimenti.
      NOTA: Nel caso di pREP42, abbiamo utilizzato una piastra di agar EMM (terreno minimo) contenente adenina, istidina e leucina (come utilizzando il ceppo di S. pombe (h-leu1-32 ura4-D18)) senza uracile (uracile presente in pREP42 come marcatore di selezione). Aggiungiamo 15 - 20 μM di tiamina alle piastre di agar (poiché pREP42 ha un promotore nmt41 repressibile di tiamina) per reprimere l'espressione del gene di interesse durante la crescita sulla piastra.
    2. Inoculare una piccola ansa dell'inoculo dal cerotto striato in 5 mL di terreno EMM specifico per il lievito privo di tiamina e incubarlo per 10-12 ore a 30 °C.
      NOTA: L'espressione di FtsZ e MreB di specie diverse sotto il promotore nmt41 in S. pombe può variare, tipicamente da 16 a 30 ore. Il momento ottimale per l'espressione proteica di GFP-EcMreB e SaFtsZ-GFP in S. pombe è di 20 - 24 ore e 16 - 20 ore a 30 °C, rispettivamente, senza tiamina.

2. Trattamento di colture di S. pombe che esprimono proteine citoscheletriche batteriche marcate con GFP

NOTA: Un certo numero di diverse molecole di farmaci vengono testate sulla coltura di lievito coltivata durante la notte in una piastra a 96 pozzetti.

  1. Inoculare una coltura fresca trasferendo 50 μl della coltura notturna in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti contenente 150 μl di terreno EMM di lievito fresco utilizzando lo strumento di pipettaggio multicanale semiautomatico a 96 pozzetti.
  2. Durante il pipettaggio in entrata e in uscita per una corretta miscelazione utilizzando una pipetta multicanale semiautomatica a 96 pozzetti, introdurre lentamente diverse concentrazioni crescenti di farmaci nella coltura in crescita, ciascuna eseguita in triplice copia, come rappresentato nello schema nella Figura 1.
  3. Come controllo positivo, utilizzare i farmaci già noti, PC190723 per (S. aureus FtsZ) e A22 (per E. coli MreB) in duplice copia.
    NOTA: Come riportato in precedenza, PC190723 e A22 sono stati utilizzati rispettivamente a una concentrazione di 56,2 μM17 e 72,6 μM 14,17. Nel frattempo, il trattamento A22 di SaFtsZ e il trattamento PC190723 di EcMreB sono serviti rispettivamente come controlli negativi.
  4. Utilizzare il DMSO come controllo del solvente a tre diverse concentrazioni in base alle concentrazioni più basse e più alte di farmaci.
    NOTA: Il solvente in cui sono disciolti i farmaci viene utilizzato come controllo del solvente.
  5. Incubare le colture di controllo e trattate a 30 °C per 6-10 ore (fino a quando le cellule mostrano l'espressione di proteine fluorescenti batteriche) e quindi eseguire l'imaging utilizzando la microscopia a epifluorescenza.

3. Visualizzazione dei polimeri

  1. Applicare un rivestimento di 20 μL di 1 mg/mL di concanavalina A su ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti inferiore otticamente trasparente (con pareti nere per l'imaging a fluorescenza) e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il liquido e lasciarlo asciugare all'aria per 10 min.
  2. Trasferire 20 μL di cellule dalla piastra di coltura in ciascun pozzetto e lasciare riposare per 10 minuti. Lavare la cella 3x-4x con il terreno sterile EMM.
  3. Con la lente dell'obiettivo da utilizzare in posizione (vedere il passaggio 3.6), utilizzare la modalità navigatore nel pannello di acquisizione del software di acquisizione delle immagini per l'allineamento della piastra a 96 pozzetti e la copertura del pozzetto. Allineare i bordi del pozzetto sul navigatore.
  4. Quindi, selezionare i parametri di copertura del pozzetto, che includono una selezione multiposizione della regione di interesse nel pozzetto, e utilizzare il controllo adattivo della messa a fuoco automatica con la modalità on-demand per mantenere il campione a fuoco durante l'imaging.
  5. Acquisizione di immagini utilizzando il contrasto interferenziale differenziale (DIC) e la fluorescenza. Impostare filtri di eccitazione ed emissione di 475/28 nm e 525/48 nm, rispettivamente, per visualizzare le proteine batteriche marcate con GFP espresse nel lievito. Ottenere Z-stack con una dimensione del passo di 0,2 μm attraverso lo spessore delle cellule di lievito (5 μm).
  6. Cattura immagini utilizzando un microscopio a epifluorescenza invertito dotato di un obiettivo a immersione in olio 100x da 1,4 NA e una fotocamera sCMOS da 2.000 x 2.000 (dimensione pixel 6,5 μm x 6,5 μm). Utilizzare un sistema di illuminazione a LED per l'eccitazione del fluoroforo.
    NOTA: Qualsiasi sistema di microscopio a epifluorescenza dotato di un tavolino motorizzato per una piastra a 96 pozzetti con un posizionamento multipunto preciso dovrebbe essere adatto. Acquisire tutte le immagini cellulari di controllo e trattate con farmaci con un tempo di esposizione simile (di solito nell'intervallo 0,3 - 0,5 s) con un binning di 1 x 1 e illuminazione al 15% - 20% per ridurre al minimo le variabili dell'esperimento e mantenere la coerenza.

4. Quantificazione delle immagini utilizzando ImageJ

  1. Elabora le immagini delle cellule e misura il numero di spot per cella e la densità per FtsZ17. Nel caso di MreB, misurare la densità e l'anisotropia23 e confrontare tra cellule di controllo e trattate utilizzando Fiji (v2.0.0-rc-69/1.52p)24.
  2. Utilizzando le immagini del canale DIC, delineare prima le singole cellule di lievito utilizzando lo strumento di disegno a mano libera e salvarle come regione di interesse (ROI) nel ROI manager. Questo passaggio non è ancora automatizzato, ma strumenti sviluppati di recente utilizzando l'apprendimento automatico25,26 potrebbero essere tentati e incorporati nel prossimo futuro.
  3. Mascherare l'area esterna della cella e riempire di nero come descritto in27.
  4. Utilizzare la macro di analisi OPS threshold IJ1, una funzione integrata nelle Figi, per contare il numero di punti24.
  5. Utilizzare il metodo otsu per la soglia automatica e mascherare le particelle segmentate. Eseguire il plug-in analizza le particelle utilizzando una macro.
  6. Per misurare la densità del polimero (quantità di citoscheletro per unità di area in una cellula), elaborare le immagini come descritto, comprese le fasi di mascheramento e scheletratura27,28. Usa il filtro 2D Lpx nel plug-in lpx per scheletrare le immagini.
  7. Per i dettagli, controlla questa recente pubblicazione17. Eseguire la quantificazione del polimero EcMreB come menzionato inprecedenza in 23, utilizzare l'anisotropia per quantificare l'organizzazione spaziale utilizzando FibrilTool29 come descritto in precedenza23.
    NOTA: Questi metodi di analisi possono essere utilizzati per quantificare qualsiasi altra proteina del citoscheletro batterico trattata o non trattata dai farmaci.

Risultati

Allestimento della piastra a 96 pozzetti per lo screening dei farmaci
L'uso di S. pombe per esprimere una GFP C-terminale marcata con S. aureus FtsZ da un vettore (pREP42) contenente il promotore repressibile della tiamina nmt41a media forza è stato precedentemente stabilito17 e, analogamente, anche l'MreB di E. coli marcato con GFP N-terminale è stato espresso in S. pombe14. Abbiamo anche dimostrato che PC190723, un inibitore specifico di SaFtsZ e A22, un inibitore di MreB, possono esercitare i loro effetti sulle rispettive proteine del citoscheletro batterico in modo specifico quando espresse nel lievito14,17.

Qui, proponiamo di utilizzare il sistema di espressione del lievito per sviluppare uno screening a medio o alto rendimento di farmaci antibatterici che hanno come bersaglio le proteine del citoscheletro batterico. Un microscopio a epifluorescenza con un tavolino motorizzato può essere automatizzato per visualizzare una piastra a 96 pozzetti e anche le librerie di farmaci commerciali sono prontamente disponibili in formati di piastre a 96 pozzetti. Pertanto, preferiamo utilizzare una piastra a 96 pozzetti per lo screening proposto dei farmaci. Le piastre sono impostate come mostrato nella Figura 1. La prima fila (Figura 1A) è costituita da colture di lievito che esprimono SaFtsZ-GFP. La seconda riga (Figura 1B) è costituita da colture di lievito che esprimono GFP-EcMreB. Le prime due colonne delle prime due righe (A1:B2) vengono impostate come supporti vuoti. Le seguenti sei colonne delle prime due righe (A3:B12) sono impostate come controllo DMSO con tre diverse concentrazioni in base alle diluizioni del farmaco in duplicato. Successivamente, PC190723 (56,2 μM) e A22 (72,6 μM) vengono aggiunti alle cellule di lievito che esprimono SaFtsZ-GFP o GFP-EcMreB. PC190723 e A22 fungono da controlli positivi rispettivamente per FtsZ e MreB. Tutti gli altri pozzetti (C1:F12) sono utilizzati per l'aggiunta di vari farmaci (a tre diverse concentrazioni e in duplicato) utilizzati nello screening per identificare gli effettori delle proteine del citoscheletro batterico, SaFtsZ o EcMreB. Le colture di lievito che esprimono SaFtsZ o MreB marcate con GFP vengono dispensate in queste piastre a 96 pozzetti e coltivate fino a visualizzare gli effetti dei farmaci sull'assemblaggio dei polimeri.

Valutazione degli effetti della crescita sulle cellule di lievito
Dopo aver incubato le cellule sottocoltivate a 96 pozzetti a 30 °C per 6-10 ore, la densità ottica (OD) della coltura di lievito viene misurata utilizzando un lettore di micropiastre. La misurazione dell'OD aiuta a valutare qualsiasi effetto inibitorio della crescita dei farmaci contro le cellule di lievito eucariotiche e possibilmente effetti deleteri sulle cellule umane. Pertanto, questo test può essere utilizzato per escludere più farmaci in base alla loro tossicità nel sistema del lievito. Tuttavia, né PC190723 né A22 mostrano effetti di crescita o tossicità per le cellule di lievito e OD600 delle colture che esprimono SaFtsZ-GFP trattate con DMSO, PC190723 o A22 erano rispettivamente 0,38 ± 0,03, 0,44 ± 0,02 e 0,43 ± 0,06 (N ≥ 4). Allo stesso modo, l'OD600 delle colture che esprimevano GFP-EcMreB e trattate con DMSO, PC190723 o A22 erano rispettivamente 0,38 ± 0,04, 0,44 ± 0,07 e 0,41 ± 0,08 (N ≥ 4).

Visualizzazione dell'effetto dei farmaci sulle strutture polimeriche assemblate da SaFtsZ ed EcMreB espresse in S. pombe
Al fine di valutare l'effetto dei farmaci sulla polimerizzazione di SaFtsZ o EcMreB, un'aliquota delle cellule di lievito dalla suddetta piastra a 96 pozzetti contenente farmaci viene trasferita in un'altra piastra a 96 pozzetti con fondo in vetro otticamente trasparente a 96 pozzetti adatta per l'imaging a fluorescenza. Questa piastra a 96 pozzetti è anche rivestita con concanavalina A per consentire l'adesione delle cellule di lievito che esprimono SaFtsZ o EcMreB marcate con GFP. La piastra a 96 pozzetti viene visualizzata utilizzando un microscopio a epifluorescenza che copre tutti i 96 pozzetti della piastra nelle posizioni predeterminate controllate dal software di acquisizione delle immagini (Figura 2). Nei pozzetti di controllo (trattati con DMSO), le cellule di lievito che esprimono SaFtsZ-GFP hanno mostrato strutture polimeriche sotto forma di macchie o chiazze distribuite in tutte le cellule, dopo 16 - 18 ore di crescita in assenza di tiamina. Tuttavia, a 10-12 ore dopo la crescita in mancanza di tiamina, le cellule mostravano solo fluorescenza diffusa o poche chiazze, suggerendo che l'espressione di FtsZ-GFP non aveva raggiunto la concentrazione critica richiesta per la polimerizzazione (Figura 3A). Al contrario, il farmaco stabilizzante FtsZ, PC190723, ha mostrato un notevole aumento delle strutture polimeriche (macchie o patch) di SaFtsZ-GFP rispetto al controllo DMSO dopo 12 ore di crescita (Figura 3B), fungendo da controllo positivo. Al contrario, le cellule trattate con A22 non hanno mostrato differenze nelle strutture SaFtsZ-GFP assemblate (Figura 3C). Tuttavia, a differenza delle colture trattate con PC190723, SaFtsZ-GFP si è assemblato in chiazze in colture non trattate solo se indotto per periodi più lunghi, dimostrando che PC190723 agito per ridurre la concentrazione critica di polimerizzazione di SaFtsZ (Figura 3D). Allo stesso modo, GFP-EcMreB espresso in S. pombe ha formato array lineari di lunghi filamenti lungo l'asse longitudinale del lievito di fissione (Figura 4A). Mentre PC190723 non ha alcun effetto sulla polimerizzazione di EcMreB (Figura 4B), il trattamento delle cellule con A22 ha provocato una fluorescenza diffusa in tutto il citoplasma delle cellule di lievito (Figura 4C). Le immagini del resto delle piastre a 96 pozzetti vengono ispezionate visivamente per eventuali effetti di stabilizzazione o inibitori dei farmaci su SaFtsZ o EcMreB, a seconda dei casi.

L'impatto dei farmaci sull'assemblaggio delle proteine del citoscheletro batterico può quindi essere quantificato utilizzando strumenti di analisi delle immagini e plug-in in ImageJ o Fiji, come precedentemente riportato per SaFtsZ17 ed EcMreB21. L'acquisizione automatizzata delle immagini in formato piastra a 96 pozzetti e l'implementazione di macro e script personalizzati per l'elaborazione delle immagini possono accelerare i tempi di imaging e la quantificazione degli effetti dei farmaci. Pertanto, utilizzando il lievito eucariotico unicellulare, S. pombe, come sistema ospite, proponiamo che uno screening a medio o alto rendimento per piccole molecole che prendono di mira le proteine del citoscheletro batterico possa essere effettuato con successo, portando eventualmente alla scoperta di nuovi antibiotici.

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Figura 1: Schema che mostra l'uso di cellule di lievito a fissione per lo screening di farmaci mirati all'assemblaggio delle proteine del citoscheletro batterico SaFtsZ o EcMreB. FtsZ da S. aureus e MreB da E. coli sono stati clonati nel vettore di espressione del lievito, pREP42 con tag GFP rispettivamente all'estremità C e N- e trasformati in S. pombe per lo studio fenotipico e farmacologico. Le colture sono state coltivate per 8-12 ore. Successivamente, le colture sono state sottocoltivate in piastre a 96 pozzetti con controlli appropriati e i diversi farmaci sottoposti a screening. Inoltre, la piastra è stata incubata a 30 °C per 6 - 8 ore fino a quando l'OD600 raggiunge 0,5-0,6 e la densità ottica viene misurata utilizzando un lettore di micropiastre per valutare la tossicità dei farmaci nei confronti delle cellule di lievito. Un'altra piastra a 96 pozzetti con fondo in vetro otticamente trasparente è stata pre-rivestita con concanavalina A, per far aderire le cellule di lievito. Questa piastra a 96 pozzetti è stata utilizzata per la visualizzazione e l'acquisizione di immagini con un microscopio a epifluorescenza. Le immagini ottenute sono state quindi analizzate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Schema del software di acquisizione delle immagini per l'imaging automatizzato di una piastra a 96 pozzetti. Utilizzando il navigatore nel software di acquisizione delle immagini, una piastra a 96 pozzetti è stata allineata segnando i bordi. I parametri di copertura del pozzo come il numero di immagini che devono essere prese da ciascun pozzo e la sua posizione (casuale o dal centro del pozzo) sono stati selezionati come desiderato. Infine, i parametri dell'immagine come il set di filtri da utilizzare (DIC e FITC-filter; Ex 475/28 nm e Em 525/48 nm), sono stati impostati l'intensità percentuale della luce di illuminazione, l'autofocus e il tempo di esposizione per l'acquisizione dell'immagine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Visualizzazione dell'effetto dei farmaci PC190723 e A22 su SaFtsZ-GFP espresso in S. pombe. La coltura di S. pombe che esprime SaFtsZ-GFP è stata coltivata in assenza di tiamina per 8 - 9 ore a 30 °C prima del DMSO e del trattamento farmacologico. La coltura è stata ulteriormente coltivata in una piastra a 96 pozzetti per 7 - 9 ore a 30 °C in presenza o assenza dei farmaci. (A) Nel controllo del DMSO, dove è stata aggiunta una quantità equivalente di DMSO, le cellule hanno mostrato alcune strutture polimeriche. (B) In presenza di PC190723 (56,2 μM), SaFtsZ esprime cellule di lievito che mostrano un notevole aumento delle strutture polimeriche rispetto a quello del controllo DMSO. (C) L'inibitore MreB, A22 (72,6 μM), non ha influenzato le strutture SaFtsZ-GFP. (D) Sono state necessarie ore più lunghe di espressione proteica per l'assemblaggio di SaFtsZ-GFP in assenza di PC190723 e, pertanto, le colture di controllo coltivate a 30 °C per 12 - 15 ore dopo la sub-coltura in una piastra a 96 pozzetti contenente DMSO mostrano anche polimeri FtsZ. La barra della scala è di 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Visualizzazione dell'effetto dei farmaci PC190723 e A22 sulla GFP-EcMreB espressa in S. pombe. La coltura di S. pombe che esprime GFP-EcMreB è stata coltivata in assenza di tiamina per 9 - 11 ore a 30 °C prima di aggiungere DMSO o i farmaci (A22 o PC190723). La coltura è stata ulteriormente coltivata in una piastra a 96 pozzetti per 8-10 ore a 30 °C con e senza farmaci come controllo. (A) Nelle colture in cui è stata aggiunta una quantità equivalente di DMSO come controllo, le cellule hanno mostrato filamenti lineari di EcMreB orientati lungo l'asse longitudinale delle cellule di lievito. (B) L'assemblaggio di GFP-EcMreB non è stato influenzato nelle colture trattate con PC190723 (56,2 μM). (C) La piccola molecola A22 (72,6 μM), un noto inibitore della polimerizzazione MreB, ha impedito l'assemblaggio di GFP-EcMreB nelle cellule di lievito a fissione. La barra della scala è di 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Ceppi e plasmidi utilizzati in questo studio. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Composizione dei terreni e dei tamponi utilizzati in questo studio. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Discussione

La resistenza antimicrobica (AMR) è una grave minaccia per la salute globale e c'è un urgente bisogno di nuovi antibiotici con nuovi bersagli. Il citoscheletro batterico è emerso come un bersaglio interessante per lo sviluppo di nuovi antibiotici, con inibitori di piccole molecole della proteina di divisione cellulare FtsZ, come TXA709, già in studi clinici di fase I30. Sono stati sviluppati diversi metodi per identificare gli inibitori della polimerizzazione di FtsZ 7,31. Recentemente abbiamo utilizzato il lievito di fissione eucariotico in un saggio basato su cellule per dimostrare che il farmaco stabilizzante FtsZ, PC190723, può colpire HpFtsZ17. Inoltre, abbiamo anche dimostrato che, sebbene farmaci come la berberina e la sanguinarina influenzino la polimerizzazione di FtsZ, influenzano anche la morfologia delle cellule di lievito17. Spinti da questi studi e osservazioni, abbiamo deciso di sviluppare un saggio basato su cellule in un'unica fase per lo screening di modulatori di piccole molecole del citoscheletro batterico utilizzando la piattaforma di espressione del lievito di fissione. Poiché lo screening si basa sull'inibizione dell'assemblaggio di proteine citoscheletriche marcate con GFP, piccole molecole che condividono proprietà fluorofore simili possono dare origine a falsi positivi. Evitare i filtri passa-lungo e scegliere filtri passa-banda stretti può aiutare a ridurre questi falsi positivi derivanti da piccole molecole fluorescenti. Qui, mostriamo i passaggi necessari per impostare uno screening a media produttività utilizzando un microscopio a epifluorescenza dotato di un supporto per tavolino a 96 pozzetti che può essere utilizzato per lo screening di farmaci mirati a SaFtsZ o EcMreB. Il flusso di lavoro prevede l'acquisizione e l'analisi semi-automatizzate delle immagini, che in futuro potranno essere facilmente scalate su schermi ad alta produttività utilizzando sistemi robotizzati di manipolazione dei liquidi e pipeline di elaborazione delle immagini.

Inoltre, lo schermo dovrebbe essere utile per altre proteine del citoscheletro batterico, come la proteina di mantenimento del plasmide ParM32 contenente actina e contro qualsiasi proteina che si assembla in strutture polimeriche nel lievito di fissione. Tuttavia, i livelli di espressione ottimali per ciascuna proteina di interesse dovranno essere standardizzati prima dell'uso in qualsiasi screening farmacologico. Mentre per le FtsZ, abbiamo trovato che nmt41 è un promotore ottimale, per altre proteine di interesse, una versione più forte o più debole del promotore nmt1 (forza del promotore (e permeabilità): nmt1 > nmt41 > nmt81) o altri promotori costitutivi come il lievito adh1 o act118,33 possono essere provati per ottenere livelli ottimali di espressione e assemblaggio di strutture polimeriche. Inoltre, durante l'utilizzo di plasmidi episomiali, le variazioni del numero di copie da cellula a cellula pongono anche problemi per l'espressione genica uniforme. Per aggirare questi problemi, sono stati recentemente sviluppati diversi vettori che possono essere integrati nel genoma del lievito di fissione (SIV per vettori di integrazione stabile) che trasportano promotori di vari punti di forza34. L'uso di questi vettori può offrire risultati più uniformi e quantitativi rispetto ai vettori episomiali utilizzati in questo studio qui. L'uso di SIV potrebbe evitare la grande eterogeneità nei livelli di espressione, vista come una variazione nelle intensità di fluorescenza tra le cellule e dovrebbe essere più adatto per screening ad alto rendimento.

Inoltre, farmaci come PC190723 agiscono per stabilizzare i polimeri FtsZ, con conseguente assemblaggio precoce dei filamenti FtsZ rispetto alle cellule non trattate. Mentre lo screening è adatto per lo screening di farmaci che inibiscono la polimerizzazione delle proteine del citoscheletro batterico, a causa della valutazione visiva della fluorescenza diffusa all'endpoint, lo screening di farmaci che stabilizzano i polimeri FtsZ richiede un'ulteriore ottimizzazione dei livelli di espressione proteica e del tempo necessario per ottenere il numero massimo di cellule con polimeri. È quindi fondamentale avere una stima ragionevole del tempo necessario all'espressione proteica per raggiungere la concentrazione critica richiesta per l'assemblaggio e decidere di conseguenza l'endpoint per il saggio. Nel caso di farmaci che potrebbero agire per ridurre la concentrazione critica richiesta per la polimerizzazione della proteina, la scelta dell'end-point sarebbe in genere un momento in cui una popolazione considerevole di cellule non trattate mostra fluorescenza diffusa, ma le colture trattate con farmaci mostrerebbero assemblaggi polimerici.

Una delle limitazioni, che è anche una fase dispendiosa in termini di tempo del flusso di lavoro, è la necessità di identificare e segmentare le singole cellule per l'analisi quantitativa delle immagini. Attualmente, nello schema proposto, si tratta di un passaggio manuale per identificare le singole cellule di lievito e assegnare la regione di interesse (ROI) per la quantificazione dell'effetto dei farmaci. Tuttavia, prevediamo che gli algoritmi di apprendimento automatico recentemente sviluppati che utilizzano set di addestramento come quelli implementabili in ilastik35 dovrebbero ridurre al minimo la necessità di intervento manuale.

Mentre il nostro approccio qui utilizzando la piattaforma del lievito è utile per identificare i risultati e le potenziali piccole molecole che colpiscono il citoscheletro batterico, alla fine sarà necessario testare la loro attività antibatterica utilizzando i test standard di concentrazione inibitoria minima e l'efficacia nei modelli animali. Tuttavia, la sfida più grande per l'aumento globale della resistenza antimicrobica (AMR) risiede ancora nella permeabilità della membrana esterna dei batteri Gram-negativi e nelle numerose pompe di efflusso in molte specie batteriche patogene. Inoltre, anche le pompe di efflusso nel lievito di fissione possono porre problemi simili e potrebbero essere necessarie concentrazioni di farmaco più elevate per il processo di screening. In alternativa, i ceppi di lievito di fissione ipersensibili ai farmaci (S. pombe MDR-supML), a seguito della delezione dei sette geni di resistenza ai farmaci, inclusi quattro geni trasportatori e un fattore di trascrizione, possono essere utilizzati come ospiti per lo screening32,33. Per affrontare la crescente resistenza antimicrobica saranno necessari sviluppi futuri nelle tecnologie che combinano la scoperta antibatterica mirata e affrontano la resistenza dovuta a fenomeni generali come la permeabilità della membrana.

Dichiarazioni

Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

SMP, SR e AKS riconoscono le borse di studio ricevute dal National Institute of Science Education and Research, Dipartimento di Energia Atomica. RS riconosce il sostegno finanziario intramurale del Dipartimento di Energia Atomica e questo lavoro è supportato da una sovvenzione di ricerca a RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) dal Dipartimento di Biotecnologia (DBT). Gli autori ringraziano anche V Badireenath Konkimalla per i suoi commenti, suggerimenti e discussioni durante lo sviluppo del protocollo.

Materiali

Sali x 50  forte
Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
96 pozzetti CC2 ottico CVG sterile, con coperchio. NeroThermo Scientific™
piastra a 96 pozzettiCorning  
A22 cloridratoSigmaSML0471Disciolto in DMSO
AdeninaFormediumTMDOC0229225 mg/L di terreno 
Concanavalin ASigma C5275-5MG
DMSOSigma
Edinburg minimo medium (EMM Agar o EMM Broth)FormediumTMPMD0210Vedi sotto per la composizione
EDTA Sigma EDS-500G
epMotion® 96 con cursore a 2 posizioniEppendorf5069000101
IstidinaFormediumTMDOC0144225 mg/L di terreno 
Microscopio a fluorescenza invertita Leica DMi8Leica MicrosystemsAzienda tedesca
LeucineFormediumTMDOC0157225 mg/L di terreno 
Acetato di litio Sigma 517992-100G
PC190723Merck344580Disciolto in DMSO
Polietilenglicole (PEG)Sigma 
Filtro TiaminaSigmaT4625sterilizzato
Tris-cloridratoMP194855
UracilFormediumTMDOC0214225 mg/L di terreno, Conservare la soluzione a 36 gradi; C
SÌ (Estratto di lievito + integratori) AgarFormediumTMPCM0410Vedi sotto per la composizione
SÌ (Estratto di lievito + integratori) BrodoFormediumTMPCM0310Vedi sotto per la composizione
Lievito (S. pombe) media 
Estratto di lievito + integratori (YES)
Composizioneg/L
Estratto di lievito5
Destrosio30
Agar17
Adenina0,05
L-Istidina0,05
L-Leucina0,05
L-Lisina HCl0,05
Uracile0,05
Edinburg medio minimo (EMM)
Composizioneg/Lconcentrazione
ftalato di idrogeno di potassio 314,7 mM
Na2HPO4 2,215,5 mM
NH4Cl 593,5 mM
di glucosio2% (p/v) o 20 g/L 111 mM
Sali (stock x 50)20 mL/L (v/v)
52,5 g/l MgCl2,6H20 (0,26 M) 52,50,26 M
0,735 mg/l CaCl2,2H20 (4,99 mM) 0,0007354,99 mM
50 g/l KCl (0,67 M) 500,67 M
2 g/l Na2SO4 (14,l mM)214,1 mM
Vitamine x 1000  1 g/l di acido pantotenico 14,20 mM
10 g/l di acido nicotinico 1081,2 mM
10 g/l di inositolo1055,5 mM
10 mg/l di biotina 0,0140,8 µ M
Minerali x 10.000  borico580,9 mM
MnSO4   423,7 mM
ZnSO4,7H2O413,9 mM
FeCl2,6H2O   27,40 mM
di acido molibdico 0,42,47 mM
KI 16,02 mM
di CuSO4,5H2O0,41,60 mM
di acido citrico1047,6 mM
Ceppi/ Plasmidi
StrainsDescriptionReference
CCD190Escherichia coli DH10β  Invitrogen
CCDY4 MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreBSrinivasan et al., 2007
CCDY340CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFPSharma et al., 2023
CCDY346MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmidi
pCCD3pREP42-GFP-EcMreBSrinivasan et al., 2007
pCCD713pREP42-SaFtsZ-GFPSharma et al., 2023
160376CLS3370317275202398Vitamine (stock x 1000)1 mL/L (v/v)Minerali (Stock x 10.000)0,1 mL/L (v/v)

Riferimenti

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