Articolo metodologico

Imaging dal vivo per quantificare la radiosensibilità cellulare negli organoidi tumorali derivati da pazienti

DOI:

10.3791/66680

⸱

5 aprile 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, Weill Cornell Medical College, 2Sandra and Edward Meyer Cancer Center, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, 4Caryl and Israel Englander Institute for Precision Medicine, 5Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medical College

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, descriviamo in dettaglio un semplice approccio di imaging dal vivo per quantificare la sensibilità degli organoidi tumorali derivati da pazienti alle radiazioni ionizzanti.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La radioterapia (RT) è uno dei pilastri della moderna gestione clinica del cancro. Tuttavia, non tutti i tipi di cancro sono ugualmente sensibili all'irradiazione, spesso (ma non sempre) a causa delle differenze nella capacità delle cellule maligne di riparare il danno ossidativo al DNA provocato dai raggi ionizzanti. I saggi clonogenici sono stati impiegati per decenni per valutare la sensibilità delle cellule tumorali in coltura alle radiazioni ionizzanti, in gran parte perché le cellule tumorali irradiate spesso muoiono in modo ritardato che è difficile da quantificare con tecniche di citometria a flusso a breve termine o tecniche assistite da microscopia. Sfortunatamente, i saggi clonogenici non possono essere impiegati come tali per modelli tumorali più complessi, come gli organoidi tumorali derivati da pazienti (PDTO). Infatti, l'irradiazione di PDTO stabiliti potrebbe non necessariamente abrogare la loro crescita come unità multicellulari, a meno che il loro compartimento simile a uno stelo non sia completamente sradicato. Inoltre, l'irradiazione di sospensioni di singole cellule derivate da PDTO potrebbe non ricapitolare correttamente la sensibilità delle cellule maligne alla RT nel contesto di PDTO stabiliti. Qui, descriviamo in dettaglio un adattamento dei saggi clonogenici convenzionali che prevede l'esposizione di PDTO stabiliti a radiazioni ionizzanti, seguita da dissociazione di singole cellule, replating in condizioni di coltura adeguate e imaging dal vivo. Le cellule staminali non irradiate (di controllo) derivate da PDTO riformano i PDTO in crescita con un'efficienza PDTO-specifica, che è influenzata negativamente dall'irradiazione in modo dose-dipendente. In queste condizioni, l'efficienza e il tasso di crescita della PDTO possono essere quantificati come misura della radiosensibilità su immagini time-lapse raccolte fino a quando i PDTO di controllo non raggiungono un'occupazione di spazio predefinita.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La radioterapia a fasci esterni (RT) è uno dei pilastri dell'oncologia moderna, che riflette non solo una pronunciata attività antitumorale associata a uno spettro ben definito di effetti collaterali generalmente gestibili1, ma anche una disponibilità clinica eccezionalmente diffusa (la maggior parte dei centri oncologici nei paesi sviluppati è dotata di moderni acceleratori lineari per RT a fascio esterno)2. In linea con questa nozione, la RT è impiegata con successo a livello globale sia per scopi curativi, generalmente nel contesto della malattia in stadio iniziale 3,4, sia per applicazioni palliative, per contenere i sintomi (ad esempio, il dolore) dei tumori metastatici5. Detto questo, non tutte le neoplasie maligne sono ugualmente sensibili alla RT, riflettendo una serie di caratteristiche intrinseche delle cellule tumorali e microambientali 6,7,8,9. Come esempio autonomo, varie alterazioni genetiche ed epigenetiche associate al cancro che influenzano la riparazione del DNA e l'omeostasi redox sono state associate a un aumento o una diminuzione della radiosensibilità intrinseca, riflettendo in gran parte la capacità della RT di uccidere le cellule tumorali causando danni diretti e reattivi dipendenti dalle specie dell'ossigeno (ROS) al DNA e ad altre macromolecole 10,11,12,13.

Negli ultimi decenni, i saggi clonogenici sono stati impiegati di routine per valutare la radiosensibilità di cellule tumorali umane e murine in coltura 14,15,16. Infatti, mentre i chemioterapici e altri fattori di stress spesso uccidono le cellule maligne in modo abbastanza rapido, la RT impiegata a dosi clinicamente rilevanti il più delle volte suscita una forma ritardata di morte cellulare che non può essere semplicemente quantificata con tecniche di citometria a flusso a breve termine o assistite da microscopia, come la misurazione dell'assorbimento cellulare di coloranti vitali (che colorano selettivamente le cellule morte) 24-72 ore dopo l'esposizione a uno stimolo citotossico17. Oltre ad essere semplici e a fare affidamento su reagenti piuttosto economici, i saggi clonogenici sono stati particolarmente convenienti in quanto consentono l'implementazione del cosiddetto modello "quadratico lineare", che è uno strumento matematico abbastanza semplice per l'analisi quantitativa della risposta alla dose di RT18,19. Analogamente, le cellule tumorali in coltura (comprese le linee cellulari consolidate e le cellule primarie derivate da pazienti) hanno fornito una piattaforma conveniente per testare vari aspetti della biologia del cancro, tra cui (ma non solo) la sensibilità al trattamento in modo piuttosto semplice ma semplificato, una delle principali limitazioni è l'assenza di un microambiente tumorale strutturato (TME)20, 21. Infatti, le colture di cellule tumorali bidimensionali sono intrinsecamente incapaci di ricapitolare le comunicazioni cellula-cellula e le interazioni con la matrice extracellulare e come si verificano nel cancro22,23. Gli organoidi tumorali derivati da pazienti (PDTO) sono emersi come modelli tumorali che almeno in parte eludono tale limitazione 24,25,26.

Purtroppo, i saggi clonogenici convenzionali non possono essere impiegati per valutare la radiosensibilità dei PDTO. Da un lato, l'irradiazione di PDTO stabiliti potrebbe non compromettere necessariamente la loro crescita come unità multicellulare, a meno che il loro compartimento staminale - che è responsabile della formazione e della maturazione dei PDTO ma mostra una maggiore resistenza al danno del DNA rispetto alle cellule che compongono PDTO27 più differenziate - non sia completamente sradicato. D'altra parte, l'irradiazione di sospensioni di singole cellule derivate da PDTO potrebbe non ricapitolare correttamente la radiosensibilità delle cellule che compongono PDTO (comprese le cellule staminali) come mostrato nel contesto dei PDTO formati. Qui, descriviamo in dettaglio una tecnica che sfrutta l'imaging dal vivo dei PDTO del cancro al seno per monitorare l'efficacia della formazione di PDTO e il tasso di crescita delle cellule derivate da PDTO precedentemente esposte a radiazioni ionizzanti rispetto alle loro controparti non irradiate. Poiché le variazioni richieste riflettono in gran parte la biologia differenziale dei singoli PDTO (ad esempio, requisiti di terreni di coltura, tasso di crescita), ci aspettiamo che questo protocollo sia adatto per lo studio della radiosensibilità in un ampio pannello di PTDO di origine sia mammaria che non mammaria.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I reagenti e le attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Coltura di organoidi

NOTA: I PDTO TNBC#1 sono stati stabiliti nel nostro laboratorio sulla base di tessuto tumorale rimosso chirurgicamente da una paziente con carcinoma mammario triplo negativo (TNBC) che ha fornito il consenso informato a partecipare a un protocollo di biobanca (IRB21-06023682). Dopo la convalida mediante istologia e sequenziamento dell'RNA (RNAseq), i PDTO TNBC#1 vengono coltivati in gocce matrigel al 66% (le cosiddette "cupole") in terreno di coltura arricchito DMEM/F12 (Tabella 1) e fatti passare ogni 2-3 settimane con un rapporto 1:2-1:1028.

  1. Seminare PDTO con un rapporto 1:2-1:10 circa 2 settimane prima dell'irradiazione in piastre separate a 6 pozzetti non aderenti, una per ogni dose di radiazioni testata (più controlli negativi, che saranno forniti da PDTO non esposti a radiazioni ionizzanti).
  2. Aggiungere 3 mL di terreno di coltura DMEM/F12 fresco arricchito ai PDTO ogni 3-4 giorni.
    NOTA: Le condizioni di semina e coltura possono richiedere alcuni adattamenti per evitare che i PDTO acquisiscano un aspetto molto riconoscibile, simile ad un anello, indicativo di necrosi del nucleo al microscopio e per garantire una vitalità ottimale all'irradiazione.

2. Radiazioni

  1. I PDTO sono pronti per l'irradiazione una volta raggiunta la dimensione media (circa 100 μm, come determinato preliminarmente al microscopio a campo chiaro con un riferimento di scala) e l'occupazione della cupola (circa l'80%). Passare i PDTO in questa fase per evitare il sovraffollamento.
  2. Irradiare le cupole contenenti PDTO utilizzando l'irradiatore SARRP (Small Animal Research Radition Platform) (o un irradiatore alternativo per applicazioni in vitro o in vivo ) in modalità campo aperto (senza collimatore), erogando dosi singole di 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy e 10 Gy. I PDTO non irradiati forniscono condizioni di controllo negativo appropriate.
    NOTA: La calibrazione dei test dosimetrici deve essere eseguita prima di ogni esperimento per garantire che i PDTO racchiusi in Matrigel ricevano la dose di radiazioni pianificata. Queste dosi sono state scelte sulla base di valutazioni preliminari della radiosensibilità dei PDTO TNBC#1 e, pertanto, possono richiedere aggiustamenti per altri PDTO.

3. Dissociazione

  1. Immediatamente dopo l'irradiazione, lavare ciascuna cupola matrigel contenente PDTO con 2 mL di terreno di coltura arricchito di DMEM/F12 e risospenderla in 1-3 mL di TrypL-E utilizzando una micropipetta p1000. Ripetere circa 30 volte per ogni pozzetto.
  2. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 50 mL e incubare per ~5 minuti in un bagno d'acqua a 37 °C.
  3. Pellettare le celle centrifugandole a 800 x g per 5 min a temperatura ambiente.
  4. Rimuovere l'eccesso di TrypL-E per lasciare ~1 mL nella provetta e aggiungere 3 volte il volume enzimatico originale (vedere passaggio 3.1) di terreno arricchito DMEM/F12 per lavare le cellule.
  5. Filtrare la sospensione cellulare utilizzando un filtro a rete da 40 μm. Questo passaggio garantisce che non rimangano cluster di cellule durante la placcatura e che ogni nuovo PDTO provenga da una singola cellula.
  6. Contare le cellule in un contatore di cellule automatizzato dopo la colorazione con il 10% di blu di tripano in PBS e risospenderle per ottenere 800 cellule in 50 μl di terreno DMEM/F12 arricchito più il 66% di matrigel a 4 °C (condizioni per 1 cupola).
  7. Piastra ogni cupola in un singolo pozzetto da una piastra di coltura a 48 pozzetti compatibile con l'imaging dal vivo, evitando la formazione di bolle. Si raccomandano triplicati tecnici per ogni dose di radiazioni.
  8. Mettere le piastre in un incubatore per colture cellulari (37 °C, 5% CO2) per 30 minuti per solidificare il matrigel.
  9. Aggiungere 0,5-1 mL di terreno DMEM/F12 arricchito, rimuovere potenziali bolle e posizionare le piastre nel sistema di imaging dal vivo all'interno di un incubatore per colture cellulari. Lasciare che la lastra si equilibri alla temperatura impostata per circa 30 minuti prima di eseguire l'imaging.
    NOTA: Matrigel solidifica a temperature >4 °C, il che implica che questa temperatura deve essere conservata fino a quando non è necessaria la solidificazione.

4. Imaging dal vivo

  1. Nel software Incucyte selezionare Pianifica per acquisire.
  2. Fai clic sul segno più nell'angolo in alto a sinistra di Launch Add Vessel.
  3. Per eseguire la scansione più volte o una volta, selezionare Scansione su pianificazione, quindi fare clic su Avanti.
  4. Per creare o ripristinare l'imbarcazione, selezionare Crea imbarcazione nuova, quindi fare clic su Avanti.
  5. Per selezionare il tipo di scansione, selezionare Organoide, quindi fare clic su Avanti.
  6. Impostazioni di scansione: scegliere QC < ' Phase + Canali immagine in campo chiaro. 'Obiettivo 4x' viene selezionato automaticamente. Quindi fare clic su Avanti.
  7. Selezione della nave: Scegliere la piastra convalidata dal software appropriata in base al numero di catalogo.
  8. Posizione della nave: Selezionare la posizione della piastra sullo strumento in base al layout, quindi fare clic su Avanti.
  9. Modello di scansione: Selezionare i pozzetti in base al layout della piastra, quindi fare clic su Avanti.
  10. Quaderno della nave: Targhetta (opzionale: nome Tipo di cella e Passaggio). Crea una mappa delle placche facendo clic sul segno più nell'angolo in alto a destra del layout delle targhe, 'Crea mappa delle piastre'.
  11. Nell'editor della mappa delle piastre, indicare il tipo di cella facendo clic sull'icona Crea nuova cella nella sezione Celle, applicare ai pozzetti appropriati facendo clic sull'icona più e selezionare i pozzetti appropriati. Facoltativo: è possibile indicare il numero di celle seminate e i passaggi. Ripetere per ogni linea cellulare.
  12. Indicare il trattamento facendo clic sull'icona Crea nuova cella nella sezione Condizioni di crescita , applicare ai pozzetti appropriati facendo clic sull'icona più e selezionare i pozzetti appropriati. Ripetere per ogni condizione sperimentale. Quindi, fai clic su OK > Avanti.
  13. Configurazione analisi: viene selezionata automaticamente l'opzione 'Posticipa l'analisi a un momento successivo'; fare clic su Avanti.
  14. Pianificazione scansione: Scegli di eseguire la scansione due volte al giorno, a tempo indeterminato. Fare clic su Avanti. Monitora l'oscurità dei PDTO di controllo per il punto finale ideale, poiché tendono a collassare quando vengono ricoperti di vegetazione.
  15. Sommario: Controlla il riepilogo e fai clic su Aggiungi alla pianificazione.
    NOTA: Le proprietà di scansione possono essere visualizzate e, se necessario, la pianificazione può essere modificata facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla sequenza temporale di scansione.

5. Analisi

  1. Sul software compatibile, selezionare Visualizza. Questo può essere gestito anche da un computer collegato al sistema tramite intranet.
  2. Seleziona l'esperimento desiderato facendo doppio clic su di esso.
  3. Seleziona l'icona Avvia analisi .
  4. Selezionare Crea nuova definizione di analisi, quindi fare clic su Avanti.
  5. Tipo di analisi: Seleziona Organoid e fai clic su Avanti.
  6. Canali immagine: 'Fase + Campo chiaro' è selezionato per impostazione predefinita, fare clic su 'Avanti'.
  7. Selezionare un set di immagini rappresentative per l'analisi. Fare clic su Avanti. Si consiglia di scegliere i punti temporali precoci e tardivi e le diverse condizioni di trattamento, ad esempio il controllo e le diverse dosi di radiazioni.
  8. Eseguire la definizione dell'analisi per TNBC#1 seguendo i passaggi seguenti:
    1. Sull'immagine: selezionare Anteprima corrente o "Anteprima tutto" per visualizzare la maschera predefinita delle immagini correnti o selezionate. Ripetere l'operazione man mano che i parametri di analisi vengono modificati per aggiornare la maschera.
    2. Segmentazione: imposta il raggio su 300, la sensibilità di sfondo su 80, la divisione dei bordi su ON e la sensibilità dei bordi su 70.
    3. Pulizia: Imposta il riempimento del foro su 5E+05 μm2 e regola le dimensioni su 0 pixel.
    4. Filtri: Non impostare l'area minima o massima, l'eccentricità minima impostata su 0,19 e l'eccentricità massima. Fare clic su Avanti.
  9. Tempi e pozzetti di scansione: selezionare tutti i punti temporali e i pozzetti di scansione desiderati. Fare clic su Avanti. Facoltativo: selezionare Analizza scansioni future.
  10. Salva e applica la definizione dell'analisi: inserisci il nome della definizione e fai clic su Avanti.
  11. Visualizza il riepilogo e fai clic su Fine.
  12. Viene visualizzata una finestra pop-up per informare l'utente che l'analisi è entrata nella coda di analisi. Fare clic su Va bene. Una volta aperta la finestra Coda di analisi, è possibile visualizzare le attività rimanenti.
  13. Se necessario, recuperate l'analisi completata in Vista selezionando la freccia blu nella colonna Analisi , accanto al Nome imbarcazione, e facendo clic con il pulsante destro del mouse sul Nome definizione analisi. Successivamente, visualizza i dati grezzi sul software facendo clic su Metriche di analisi grafica o esporta per ulteriori analisi selezionando Esporta definizione analisi.
    NOTA: L'esportazione dei dati grezzi può essere personalizzata nella finestra Metriche di analisi del grafico . Il conteggio degli organoidi, l'area totale, l'eccentricità media e l'oscurità possono essere esportati separatamente e i dati organizzati nel menu a discesa Seleziona raggruppamento facendo clic su Nessuno, Colonne, Righe o Repliche mappa piastra. Per TNBC#1, per l'esportazione di dati grezzi, le metriche di analisi dei grafici e per l'opzione di roll-down Seleziona raggruppamento , è stata scelta l'opzione Nessuno . Questi parametri di importazione sono stati scelti sulla base di valutazioni preliminari con PDTO TNBC#1. Potrebbero quindi richiedere regolazioni per altri PDTO, il che è possibile sul software in base alle funzioni di "Anteprima". Si consiglia di adattare i parametri di importazione su (1) immagini precoci che contengono per lo più singole cellule o piccoli PDTO e (2) immagini raccolte in punti temporali tardivi per garantire che anche i PDTO di grandi dimensioni vengano acquisiti sia in condizioni di controllo che trattate.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I PDTO TNBC#1 sono stati esposti a una singola dose di radiazioni di 0 (controlli non irradiati), 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy o 10 Gy il giorno 0. Subito dopo, i PDTO sono stati dissociati per ottenere una sospensione a singola cellula per ogni condizione sperimentale. Le cellule derivate da PDTO sono state successivamente seminate in piastre da 48 pozzetti all'interno del 66% di cupole matrigel (50 μL ciascuna) depositate al centro dei pozzetti, in 3 repliche tecniche per condizione. Le piastre sono state inserite in un sistema di imaging dal vivo e sottoposte a imaging ogni 6 ore utilizzando l'obiettivo 4X del modulo organoide per un totale di 30 giorni. L'irradiazione dei PDTO TNBC#1 con RT in una singola dose di 2 Gy ha ritardato significativamente la ricrescita dei PDTO, mentre le dosi di radiazioni ≥4 Gy (fino a 10 Gy) completate hanno impedito la rigenerazione dei PDTO in crescita (Figura 1).

figure-results-1
Figura 1: Imaging dal vivo di organoidi tumorali derivati da pazienti (PDTO). Gli organoidi tumorali (PDTO) derivati da pazienti con TNBC#1 per il carcinoma mammario non sono stati trattati o esposti alla dose di radiazioni indicata, seguiti a breve distanza dalla dissociazione, dal replating e dall'imaging con un sistema di imaging di cellule vive. Vengono riportate immagini rappresentative in seguito alla regolazione del contrasto (A) e alle valutazioni quantitative (B, media ± SEM). Scala dell'immagine: 1,19 x 1,16 mm (1,38 mm2). Barra di scala: 400 μm; inserti: 200 μm. ****p < 0,001 (ANOVA a due vie, rispetto a 0 Gy); ####p < 0,001 (ANOVA a due vie, rispetto a 2 Gy). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

ComponenteConcentrazione
DMEM F/121X
GlutaMax1X
Hepes10 mM
PenStrep100 U/mL
B271X
Nac1,25 mM
Nicotinammide10 mM
inibitore del recettore del TGFbeta A83-010,5 μM
Inibitore della MAP p38 p38i SB2021901 μM
Zucca10%
Rspondin Media10%
FGF1020 ng/mL
FGF75 ng/mL
NR (Heregulin)5 nM
Primocina100 μg/mL
Y-27632 (RhoKi)5 μM
Fattore di crescita epidermico hEGF5 ng/mL

Tabella 1: Composizione del terreno di coltura PDTO.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, descriviamo un adattamento di saggi clonogenici convenzionali che sfrutta i PDTO del cancro al seno e l'imaging dal vivo per quantificare la radiosensibilità al PDTO in base a (1) la persistenza di cellule staminali che formano PTDO dopo l'irradiazione PDTO in vitro e (2) il tasso di crescita dei PDTO che queste cellule (possono) generare. Le fasi critiche di questo protocollo includono (1) l'istituzione di PDTO per l'occupazione di una cupola che consenta una buona vitalità, (2) l'esposizione del PDTO a radiazioni ionizzanti a diverse dosi, comprese le condizioni di controllo irradiato simulato; (3) dissociazione PDTO in singole cellule; (4) replating di singole cellule derivate da PDTO; e (5) imaging dal vivo fino a un'occupazione predefinita della cupola in condizioni di controllo.

Con modifiche minime, per lo più legate all'efficienza di formazione della PDTO e al tasso di crescita della PDTO in condizioni di controllo (che probabilmente variano considerevolmente tra i diversi PDTO), ci aspettiamo che questo protocollo sia adattabile a più piattaforme di imaging dal vivo disponibili in commercio, nonché a numerosi PDTO, sia di derivazione mammaria che non mammaria. Da un lato, si prevede che l'efficienza di formazione del PDTO al basale dopo la dispersione di una singola cellula influenzi il numero di singole cellule da riseminare per ottenere nuovi PDTO a una densità che consenta non solo la quantificazione del PDTO basata su immagini, ma anche la normale crescita di PDTO non trattati. D'altra parte, si prevede che il tasso di crescita della PDTO influenzi la durata del saggio, poiché la fusione di PDTO adiacenti dovrebbe essere evitata per preservare le capacità analitiche ottimali. Pertanto, determinare l'efficienza di formazione del PDTO e il tasso di crescita del PDTO in condizioni di controllo per ogni singolo PDTO è fondamentale per la corretta implementazione di questo protocollo.

Sebbene questo metodo sia abbastanza semplice, presenta alcune limitazioni. In primo luogo, un numero eccessivamente basso di cellule che formano PDTO può compromettere la rigenerazione di PDTO in crescita normale dopo dissociazione di singole cellule. Infatti, mentre il passaggio di routine della PDTO può essere ottenuto mediante dissociazione incompleta, le valutazioni quantitative, come offerte da questo protocollo, si basano sulla generazione di una sospensione a singola cellula (che può essere confermata visivamente durante il conteggio). In secondo luogo, un tasso di crescita eccessivamente lento può prolungare considerevolmente la durata del test e potenzialmente portare a una stima imprecisa della radiosensibilità. È infatti concepibile che un tempo di coltura prolungato, come richiesto per i PDTO a crescita lenta per raggiungere una dimensione compatibile con il punto finale, possa offrire ulteriori possibilità per le cellule che formano PDTO irradiate in modo subletale di riprendersi dallo stress e ripristinare PDTO rilevabili (anche se a crescita lenta). Infine, si prevede che la dissociazione dei PDTO poco dopo l'irradiazione imponga un ulteriore stress sulle cellule che formano PDTO, aumentando potenzialmente la radiosensibilità a causa di comunicazioni cellula-cellula alterate nelle prime fasi del recupero. Ritardare la dissociazione di 24-72 ore può fornire informazioni sul contributo relativo delle comunicazioni cellula-cellula conservate alla capacità delle cellule che formano PDTO di riprendersi dal danno macromolecolare imposto dalla RT.

Mentre le piattaforme di imaging dal vivo offrono un metodo conveniente per monitorare longitudinalmente la formazione e la crescita della PDTO, le immagini a singolo punto finale possono essere utilizzate anche per lo stesso obiettivo. In questo caso, è necessario prestare attenzione per garantire che i PDTO adiacenti non si fondano prima dell'imaging e che il tasso di crescita possa essere valutato in funzione della dimensione del PDTO normalizzata alla durata del test.

Nell'era della medicina oncologica personalizzata, valutare la sensibilità dei singoli tumori al trattamento è della massima importanza in quanto fornisce alcuni suggerimenti per la progettazione di strategie terapeutiche individualizzate con una migliore efficacia29. Il protocollo qui descritto si inserisce in questo sforzo fornendo un approccio conveniente per stimare la sensibilità cellulare dei singoli PDTO alle radiazioni ionizzanti (da soli o in combinazione con altre modalità terapeutiche). Detto questo, resta da dimostrare se la misurazione della radiosensibilità delle cellule tumorali dai PDTO predice con precisione la risposta dei singoli pazienti con cancro alla RT focale. Correlare la radiosensibilità di PDTO distinti all'irradiazione con la risposta clinica alla RT dei rispettivi donatori fornirà importanti informazioni su questa possibilità.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Indipendentemente da questo lavoro, SCF ha/ha stipulato contratti di ricerca con Merck, Varian, Bristol Myers Squibb, Celldex, Regeneron, Eisai ed Eli-Lilly, e ha ricevuto onorari di consulenza/consulenza da Bayer, Bristol Myers Squibb, Varian, Elekta, Regeneron, Eisai, AstraZeneca, MedImmune, Merck US, EMD Serono, Accuray, Boehringer Ingelheim, Roche, Genentech, AstraZeneca, View Ray e Nanobiotix. Indipendentemente da questo lavoro, SD ha ricevuto onorari di consulenza da Lytix Biopharma, EMD Serono, Ono Pharmaceutical, Genentech e Johnson & Johnson Enterprise Innovation Inc., ed è in possesso di contratti di ricerca con Lytix Biopharma, Nanobiotix e Boehringer-Ingelheim. Indipendentemente da questo lavoro, LG ha/ha avuto contratti di ricerca con Lytix Biopharma, Promontory e Onxeo, ha ricevuto onorari di consulenza/consulenza da Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, OmniSEQ, Onxeo, The Longevity Labs, Inzen, Imvax, Sotio, Promontory, Noxopharm, EduCom e Luke Heller TECPR2 Foundation, e detiene stock option su Promontory.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo Raymond Briones e Wen H. Shen (Weill Cornell Medical College, New York, NY, USA) per il loro aiuto nello sviluppo di questo protocollo. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del Transformative Breast Cancer Consortium del DoD BCRP degli Stati Uniti (#W81XWH2120034, PI: Formenti).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
40 & micro; m filtro a reteThomasScientific 1164H35
B27Invitrogen17504-044
Cellometro Auto T4 Contatore di celle a campo chiaroNexcelom
DMEM F/12Corning 12634-010
Fattore di crescita epidermico hEGFPeprotechAF-100-15
EVOS FL Microscopio digitale a fluorescenza invertita Thermo Fisher Scientific12-563-460
FGF10Peprotech100-26
FGF7Peprotech 100-19
GlutaMaxInvitrogen 
HepesInvitrogen 15630-080
Software IncuCyte 2021ASartorius: 2021A
Incucyte SX1Sartoriusmodello SX1
Piastra a 48 pozzetti convalidata IncucyteCorning 3548
MatrigelDiscovery Labware354230
nAcSigma Aldrich A9165-5G
NicotinamideSigma-AldrichN0636
NogginAcquistato dall'Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Piastra a 6 pozzetti non trattataCellstar657 185
NR (Heregulin)Peprotech100-03
p38 Inibitore MAP p38i SB202190Sigma Aldrich S7067
PBSCorning 21-040-CV
PenStrepInvitrogen15140-122
PrimocinInvivogenant-pm-1
Rspondin MediaAcquistato dall'Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Piattaforma di ricerca sulle radiazioni per piccoli animali (SARRP) Xstrahl Ltd
Inibitore del recettore TGFbeta A83-01Tocris2939
Tripano blu Macchia (0,4%)Gibco15250-61
TrypLEGibco112605-028
Y-27632 (RhoKi)SelleckS1049
35050061 Versione

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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