Articolo metodologico

Isolamento delle cellule endoteliali pancreatiche di topo

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DOI:

10.3791/66690

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21 giugno 2024

 ,  ,  ,  , 
1Irell and Manella Graduate School, City of Hope, 2Department of Diabetes Complications and Metabolism, City of Hope

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive l'isolamento di cellule endoteliali di topo dall'intero pancreas.

Abstract

Il pancreas è un organo vitale per il mantenimento dell'equilibrio metabolico all'interno del corpo, in parte grazie alla sua produzione di ormoni metabolici come l'insulina e il glucagone, nonché di enzimi digestivi. Il pancreas è anche un organo altamente vascolarizzato, una caratteristica facilitata dall'intricata rete di capillari pancreatici. Questa vasta rete capillare è costituita da cellule endoteliali (EC) altamente fenestrate, importanti per lo sviluppo e la funzione del pancreas. Di conseguenza, la disfunzione delle EC può contribuire a quella del pancreas in malattie come il diabete e il cancro. Pertanto, la ricerca sulla funzione delle EC pancreatiche (pECs) è importante non solo per comprendere la biologia del pancreas, ma anche per sviluppare le sue patologie. I modelli murini sono strumenti preziosi per studiare le malattie metaboliche e cardiovascolari. Tuttavia, non esiste un protocollo stabilito con dettagli sufficienti per l'isolamento delle cellule ulcerogene di topo a causa della popolazione relativamente piccola di cellule endotiche e degli abbondanti enzimi digestivi potenzialmente rilasciati dal tessuto acinare che possono portare a danni cellulari e, quindi, a una bassa resa. Per affrontare queste sfide, abbiamo ideato un protocollo per arricchire e recuperare le pEC di topo, combinando una delicata dissociazione fisica e chimica e una selezione mediata da anticorpi. Il protocollo qui presentato fornisce un metodo robusto per estrarre EC intatte e vitali dall'intero pancreas del topo. Questo protocollo è adatto per più saggi a valle e può essere applicato a vari modelli murini.

Introduzione

Il pancreas, fondamentale per il controllo metabolico e l'omeostasi, è un organo altamente vascolarizzato. Il pancreas ha funzioni sia endocrine che esocrine, controllando rispettivamente la regolazione della glicemia e degli enzimi digestivi. Questi due compartimenti sono collegati tra loro da un'ampia rete di vasi sanguigni pancreatici, che facilitano lo scambio e il trasporto di ossigeno, ormoni ed enzimi. In modo critico, questa fitta rete capillare penetra nell'isolotto di Langerhans, un gruppo di cellule che regolano gli ormoni all'interno del pancreas responsabili della sua funzione endocrina, costituito dalle cellule alfa (α) secernenti glucagone, dalle cellule beta (β) secernenti insulina e dalle cellule delta (δ) secernenti somatostatina 1,2. Sebbene le isole costituiscano solo l'1-2% della massa pancreatica, ricevono il 20% del flusso sanguigno totale3, evidenziando l'importanza della vascolarizzazione delle isole. I capillari pancreatici sono costituiti principalmente da cellule endoteliali (EC) altamente fenestrate, circondate da periciti murali. Queste EC capillari svolgono un ruolo vitale nello sviluppo, nella maturazione e nella (dis)funzione delle isole e formano intime diatridi con varie cellule endo- ed esocrine4 (Figura 1).

La disfunzione endoteliale è stata osservata sia nel diabete di tipo 1 che in quello di tipo 2, le condizioni più comuni causate dalla disfunzione delle isole pancreatiche 5,6. Sia la densità microvascolare che la morfologia delle isole possono essere alterate nel diabete7. Inoltre, il cancro del pancreas, un tumore altamente aggressivo che può manifestarsi anche come diabete, è caratterizzato da un'elevata densità microvascolare con scarsa perfusione8. Dati i ruoli strutturali e funzionali fondamentali delle EC nel tessuto pancreatico normale e malato, vi è una pertinente necessità di studiare le EC nello sviluppo, nella fisiologia e nella patologia per svelare i meccanismi che guidano la salute o le malattie.

Sono stati sviluppati numerosi protocolli per l'isolamento di EC da diversi sistemi murini (ad es. cervello 9,10, polmone11, cuore12, fegato13, muscoli scheletrici14 e tessuti adiposi15) e umani (ad es. cervello16, tessuto adiposo viscerale17,18, nervi periferici19, polmone 20,21,22 e arteria mesenterica 23) tessuti. Questi protocolli prevedono tipicamente l'uso di digestioni enzimatiche (ad esempio, da collagenasi, tripsina24, dispasi 24,25 e liberasi26), seguite da una fase di arricchimento basata su anticorpi. Inoltre, questi protocolli tendono a fare affidamento su durate prolungate di digestioni ad alte concentrazioni di enzimi con agitazione vigorosa a 37 °C (Tabella 1). A causa delle caratteristiche uniche del pancreas, tra cui il fatto che ospita una pletora di enzimi digestivi endogeni, questi protocolli esistenti non possono essere applicati direttamente per isolare le pEC. In primo luogo, la composizione della matrice extracellulare (ECM) del pancreas è diversa da quella di altri tessuti. Sebbene la collagenasi sia comunemente usata per l'isolamento delle EC, esistono più sottotipi con diverse capacità di dissociazione tessuto-specifiche, che richiedono quindi un'ottimizzazione. In secondo luogo, e cruciale per l'isolamento della pEC, il rilascio e l'attivazione di enzimi endogeni pancreatici possono ostacolare significativamente il processo di isolamento. A tal fine, è necessario prestare attenzione per ridurre al minimo la rottura delle cellule acinose esocrine (la fonte primaria di zimogeni, proteasi eRNasi 27), che può indurre ulteriori danni cellulari e provocare una bassa vitalità cellulare e influenzare complessivamente il recupero 27,28,29.

Per affrontare queste sfide, abbiamo adattato i metodi dei protocolli di isolamento EC esistenti e stabilito un nuovo protocollo adatto all'isolamento EC dal pancreas di topo. In particolare, descriviamo qui un flusso di lavoro (Figura 2) che utilizza la collagenasi di tipo I (tipicamente implementata per l'isolamento della EC polmonare), temperature di digestione più basse e nessuna agitazione (per prevenire l'attivazione degli zimogeni pancreatici) e l'integrazione di DNasi 30,31,32 (per prevenire l'apoptosi indotta dal DNA e migliorare la vitalità cellulare) e un anticorpo per CD31 33 (PECAM1, un marcatore pan-EC). Il protocollo descritto produce popolazioni di EC isolate dal pancreas di topo che possono essere utilizzate per la profilazione dell'espressione genica e i saggi proteici.

Protocollo

L'isolamento dei tessuti è stato eseguito secondo il protocollo di studio approvato #17010 dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Beckman Research Institute, City of Hope (Duarte, California, USA). Qui, usiamo Tie-2CreERT2; Linea di topi Rosa26-TdTomato su sfondo C57BL/6 a 8 - 12 settimane di età. In questa linea, le EC sono marcate con TdTomato quando indotte con tamoxifene come precedentemente descritto34. Tuttavia, questo protocollo può essere adattato a tutte le età di topi adulti con diversi genotipi e background genetici.

1. Prelievo dei tessuti (tempo stimato: 1-2 ore)

NOTA: Il tempo stimato è di 15 minuti/animale, si consiglia un massimo di 3 animali raggruppati per campioni di dissociazione.

  1. Eutanasia degli animali per overdose di anidride carbonica (CO2), seguita da una conferma secondaria della morte. Prima della dissezione, spruzzare tutto il corpo con etanolo al 70% (EtOH), disinfettando completamente l'area operatoria.
  2. Allunga e fissa gli arti usando i perni. Usando le forbici chirurgiche, praticare una piccola incisione sulla linea mediana attraverso la pelle e il peritoneo partendo dalla zona addominale inferiore ed estendendosi verso la regione toracica.
  3. Esporre la gabbia toracica tagliando il diaframma e sollevare la gabbia toracica per esporre il cuore.
  4. Inserire un ago (25G-30G) collegato a una siringa contenente PBS sterile ghiacciato, nel ventricolo sinistro del cuore.
  5. Avviare la perfusione iniettando il PBS attraverso il cuore a una velocità di 5 - 10 ml/min. Interrompere dopo l'iniezione di 10 ml o fino a quando il fegato e i reni non si scoloriscono.
  6. Dopo la perfusione, localizzare il pancreas (sotto lo stomaco e attaccato al duodeno)35 (Figura 3A) e rimuoverlo con cura utilizzando forbici da dissezione e pinze.
  7. Una volta isolato, trasferire il pancreas in una provetta da 50 mL contenente 10 mL di PBS ghiacciato + 0,2 mg/mL di inibitore della tripsina, tenere in ghiaccio (Figura 3B).
    NOTA: In questa fase è possibile raggruppare il pancreas di un massimo di 3 topi e trasferirlo in 1 provetta. I campioni possono essere conservati in ghiaccio per un tempo massimo di 2 ore.

2. Preparazione della collagenasi (tempo stimato: 15-30 min)

  1. Preparare le soluzioni e i tamponi come descritto di seguito.
    1. Soluzione di dissociazione: aggiungere collagenasi di tipo I in provetta da 50 mL a una concentrazione finale di 1 mg/mL in soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS 1x (Ca2+, Mg2+; vedere la Tabella dei materiali) e 0,001 U/mL di DNasi I + 0,2 mg/mL di inibitore della tripsina.
    2. Soluzione di arresto della dissociazione: aggiungere soluzione salina tamponata con fosfato (PBS 1x, senza Ca2+, Mg2+; lo stesso per tutti gli altri PBS in questo protocollo; vedere la Tabella dei materiali), 5% di albumina sierica bovina (BSA), 0,001 U/mL di DNasi I o DMEM + 10% di FBS + 0,001 MU/mL di DNasi I.
    3. Tampone di lavaggio: aggiungere PBS 1x, 0,5% di albumina sierica bovina (BSA), 0,001 U/mL di DNasi I + 0,05 mg/mL di inibitore della tripsina.
  2. Sciogliere completamente i tamponi e filtrarli con un filtro da 0,22 μm. Mettere da parte e tenere in ghiaccio.

3. Digestione (tempo stimato: 40 min-1 h)

  1. Rimuovere il pancreas dal PBS ghiacciato e posizionarlo sulla piastra di Petri sopra il ghiaccio. Rimuovere con cura il tessuto in eccesso (ad es. milza, grasso, detriti) con forbici chirurgiche e pinzette (Figura 3C).
    NOTA: È fondamentale rimuovere il grasso, poiché l'eccesso di lipidi può interferire con la digestione dei tessuti.
  2. Trasferire il pancreas di topo tagliato in una provetta da 5 mL contenente 1 mL di soluzione di dissociazione.
  3. Tenere la provetta sul ghiaccio e tritare i tessuti pancreatici con le forbici da dissezione in pezzi sottili pipettabili, ad esempio 0,5 mm o 1 mm. Trasferire il lisato in una provetta da 50 ml e conservare in ghiaccio.
  4. Aggiungere altro pancreas alla provetta da 5 ml utilizzata per tritare inizialmente il tessuto pancreatico e aggiungere ulteriore 1 ml di collagenasi. Ripetere se necessario per più preparazioni del pancreas.
  5. Aggiungere 2 mL di soluzione di collagenasi alla provetta da 5 mL per rimuovere eventuali residui di tessuto pancreatico e trasferirla in una provetta da 50 mL. Il volume totale della collagenasi deve essere di 5 ml per 3 pancreas o 3 ml per un singolo pancreas.
  6. Una volta che tutti i campioni sono stati sottoposti a dissociazione meccanica, trasferire le provette da 50 mL contenenti i lisati tissutali omogeneizzati in un bagno d'acqua a 37 °C e incubare per 10 minuti.
    NOTA: Non agitare energicamente o agitare la miscela di tessuto durante questo processo in quanto ciò può causare la rottura dei tessuti acinari e il rilascio di abbondanti enzimi endogeni e DNA.
  7. Togliere i tubi dal bagnomaria e agitare delicatamente per mescolare bene, quindi lasciare a bagnomaria per altri 10 minuti (tempo totale: 20 minuti).
    NOTA: Non superare i 30 minuti in bagnomaria a 37 °C per evitare una digestione eccessiva.
  8. Posizionare le provette sul ghiaccio e lasciare che l'omogeneizzato si depositi per gravità. Una volta depositato, trasferire il surnatante attraverso un filtro da 70 μm e aggiungere 5 mL di soluzione di arresto della dissociazione.
  9. Aggiungere un ulteriore 1 mL di soluzione di dissociazione al pellet rimanente e triturare con un ago da 18G.
  10. Passare l'omogeneizzato rimanente attraverso il filtro e lavare con altri 5 mL di soluzione di arresto della dissociazione.
  11. Sospensione con cella di centrifuga a 300 x g per 10 min, a 4 °C. Rimuovere completamente il surnatante mediante aspirazione e mantenere il pellet cellulare sul ghiaccio.
  12. Risospendere il pellet cellulare con 1 mL di tampone di lavaggio e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
  13. Prelevare una piccola aliquota dal pellet di cella risoluta (10 μL) e mescolarla con il blu di tripano in un rapporto 1:1 per contare le cellule utilizzando un contatore di cellule e misurare la vitalità.

4. Arricchimento delle cellule endoteliali (EC) (tempo stimato: 2-3 h)

  1. Aggiungere 1 μL di anticorpo anti-CD31-biotina per ogni 1 x 107 cellule contate e incubare per 30 minuti a 4 °C su un rotatore (circa 5 μL per 3 pancreas).
  2. Aggiungere 20 μl di microsfere anti-biotina e incubare per 40 minuti a 4 °C su un rotatore di provette.
  3. Installare un supporto magnetico con il supporto del separatore della colonna e applicare la colonna. Equilibrare la colonna con 3 mL di tampone di lavaggio.
  4. Aggiungere il campione alla colonna e lavare con un totale di 9 mL di tampone di lavaggio.
    NOTA: Se la concentrazione di cellule è elevata, diluire le cellule con altri 2 mL di tampone di lavaggio in una provetta separata. Aggiungere 1 mL di campione alla volta nella colonna per evitare che la colonna si ostruisca.
  5. Rimuovere la colonna dal supporto della colonna e inserirla in una provetta da 15 mL. Aggiungere 5 mL di tampone di lavaggio alla colonna. Utilizzare lo stantuffo per spingere verso il basso le cellule nella colonna e raccogliere l'eluizione (che contiene EC arricchita).
  6. Centrifugazione a flusso continuo ed eluizione/frazione EC a 300 x g per 10 minuti a 4 °C. Contare le celle e misurare la vitalità come nel passaggio 3.13.
  7. Convalida l'arricchimento EC tramite qPCR di flow-through e frazioni EC. Utilizzare NK6 Homeobox 1 (Nkx6.1) come marcatore generale per le cellule endocrine e la molecola di adesione piastrinica e delle cellule endoteliali (Pecam1) come marcatore per EC33. Utilizzare 36B4 (Rplp0, fosfoproteina ribosomiale acida p0) come controllo interno per la normalizzazione dell'espressione genica.
    NOTA: In questa fase i campioni raccolti possono essere utilizzati per analisi di proteine o RNA.

5. Coltura di pEC

  1. Preparare M199 medio. Integrare M199 medio a una concentrazione finale del 20% di siero fetale bovino (FBS) e dello 0,1% di penicillina-streptomicina.
  2. Rivestire una piastra di coltura cellulare da 60 mm con collagene di tipo I (1 mg/mL in acido acetico 0,1 M) e lasciare riposare per 30 minuti a temperatura ambiente.
  3. Rimuovere il collagene di tipo I e risciacquare la piastra con 1X PBS, due volte. Aggiungere 2 mL di terreno M199 preparato e posizionare la piastra per colture cellulari nell'incubatore per colture cellulari standard (5% CO2, 37 °C) per 5 minuti.
  4. Una volta isolate le cellule, aggiungere le cellule isolate alla piastra di coltura cellulare M199 preriscaldata. Mantenere le cellule in condizioni di coltura per circa 14 giorni e cambiare i terreni ogni 2-3 giorni.

Risultati

Seguendo questo protocollo, è possibile ottenere circa 2 x 106 cellule vive quando si raggruppano 3 pancreas di topo e 750.000 cellule da un singolo pancreas di topo. Per convalidare l'arricchimento di EC, abbiamo eseguito le seguenti analisi: 1) PCR quantitativa: rispetto ai campioni flow-through (FT) (cioè le frazioni legate agli anticorpi non CD31), le frazioni EC avevano livelli significativamente più elevati di Pecam1 (codificante CD31) e Kdr (codificante VEGFR2), due geni marcatori EC33 e livelli più bassi di NK6 omeobox 1 (Nkx6.1), un fattore di trascrizione nelle cellule endocrine pancreatiche (Figura 4A); 2) Western blotting: campioni arricchiti di EC da tre preparazioni (pEC-1-3) hanno mostrato forti segnali di CD31 alla dimensione prevista (~130 kDa). In confronto, i campioni di input e FT hanno mostrato un segnale CD31 minimo. Come controllo positivo, anche i lisati delle cellule MS1, una linea cellulare pEC, hanno mostrato un forte segnale CD31 (Figura 4B); 3) colorazione con blu di tripano: abbiamo riscontrato che la vitalità delle cellule isolate era di circa il 50% (Figura 4C); 4) citometria a flusso seguendo un protocollo pubblicato15 : attraverso il gating sulla popolazione di cellule vive (Figura 4D), abbiamo riscontrato che le cellule CD31+ erano all'88% e le cellule TdTomato+ al 76%. Da notare che la maggior parte delle cellule isolate co-esprime CD31 e TdTomato (Figura 4E). Come controlli negativi, le cellule MS1 non colorate e MS1 incubate con IgG non hanno mostrato cellule vive come marcato da CD31. Come controllo positivo, cioè le cellule MS1 colorate per CD31 hanno mostrato quasi il 100% di cellule CD31+ vive (Figura 4F). Abbiamo anche coltivato le cellule isolate, eseguito la colorazione in immunofluorescenza di PECAM1 seguendo un protocollo36 pubblicato e analizzato TdTomato, che ha mostrato segnali robusti di entrambi i marcatori nelle cellule isolate, suggerendo la presenza di EC (Figura 4G).

Diagramma del pancreas che illustra le EC intra-insulari per lo studio della struttura vascolare e l'analisi dell'interazione cellulare.
Figura 1: Illustrazione della vascolarizzazione del pancreas e delle isole pancreatiche. Una rappresentazione pittorica delle cellule endoteliali pancreatiche (EC) e delle EC intra-insulari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Schema di preparazione del pancreas unicellulare; centrifugazione, marcatura della biotina CD31, analisi a flusso continuo.
Figura 2: Panoramica del flusso di lavoro. 1) Dissezione del pancreas, 2) digestione meccanica, 3) incubazione enzimatica, 4) centrifugazione, 5a) rimozione del surnatante e 5b) digestione secondaria della collagenasi dei pellet cellulari con triturazione per il filtraggio in 6), 7) e 8) ricostituzione del pellet e legame degli anticorpi, 9) incubazione delle microsfere, 10) arricchimento della colonna MACS, 11) conteggio delle cellule per la vitalità e 12) analisi a valle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dissezione tissutale che mostra il processo di raccolta, isolamento e rifilatura del pancreas nella ricerca biologica.
Figura 3: Fasi di lavorazione dei tessuti. Immagini di (A) la cavità addominale, (B) il pancreas di topo isolato e (C) il pancreas di topo tagliato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati dell'espressione genica, dell'analisi del CD31, DAPI, della selezione cellulare, della fluorescenza e della citometria a flusso.
Figura 4: Validazione di frazioni di EC isolate da pancreas di topo. (A) qPCR di campioni di FT e frazione di EC arricchita con CD31 per l'arricchimento. Pecam1 (CD31), Kdr (VEGFR2) e Nkx6.1 (fattore di trascrizione pancreatico specifico per β cellule)33. * indica p <0,05 rispetto a FT in base ai test t . n = 3-4 campioni aggregati, costituiti da 3 topi ciascuno. (B) Western blotting di CD31. pEC-1-3 indica EC arricchite da 3 campioni di topi aggregati separati. Su ciascuna corsia sono stati caricati lisati cellulari di 30 mg, seguiti dalla colorazione Ponceau S. (C) Conteggio cellulare e colorazione con blu di tripano di pEC arricchite per il saggio di vitalità. (D) Strategia di gating della citometria a flusso per pEC di topo colorate con anticorpi 4', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e CD31. (E) Istogrammi di citometria a flusso di MS1 non colorato (in alto a sinistra), MS1 colorato con anticorpo secondario AlexaFluor-488 (controllo IgG; in alto a destra), MS1 colorato con CD31 (in basso a sinistra) e le pEC isolate di topo colorate con CD31 (in basso a destra). (F) Percentuale di cellule vive quantificate mediante citometria a flusso. (G) Immunofluorescenza dell'espressione di CD31 (verde) con controcolorante DAPI (blu) e reporter fluorescente endogeno TdTomato (rosso). Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Microscopia a immunofluorescenza CD31/CD144/DAPI, analisi dell'espressione genica UMAP di Cdh5, Pecam1.
Figura 5: Specificità di CD31 e CD144 nel pancreas di topo. (A) Immunofluorescenza del pancreas di topo con CD31 (Magenta) e CD144 (ciano), con controcolorazione DAPI. Immagine acquisita utilizzando un obiettivo 10x con un microscopio invertito fluorescente a campo largo. Barra di scala = 100 μm. Le linee tratteggiate delimitano l'area dell'isolotto. (B) Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) che mostra l'espressione di Cdh5 e Pecam1 nelle EC delle isole da topi C57BL6 rilevata da scRNA-seq (GSE128565)37. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

EnzimaUsareTemperatura e tempoRiferimento
Collagenasi IDissociazione di singole cellule, arricchimento EC dell'intero pancreas37 °C, 20 minQuesto protocollo
Collagenasi IVIsolamento delle isole e dissociazione non enzimatica37 °C, 20 min46
Collagenasi + TripsinaEsame delle cellule duttali nel pancreas di topo37 °C, 30 min47
Collagenasi BSospensione a singola cellula del pancreas37 °C, 30 min48
Collagenasi NBIIsolamento delle isole37 °C, 30 min49
Collagenasi PSospensione praticabile Acinar37 °C, 15 min45
Collagenasi XIIsolamento delle isole37 °C, 15 min35
DispaseSospensione a cella singola37 °C, 45 min24
LiberateSospensione a cella singola37 °C, 10 min25, 48
TripsinaDissociazione di singole cellule, pancreas intero4 °C, O/N28

Tabella 1: Riepilogo dei vari protocolli utilizzati per elaborare campioni di pancreas di topo.

Discussione

In questo articolo, presentiamo un protocollo per l'arricchimento e l'isolamento dei pEC. Simile ai precedenti protocolli di isolamento delle EC da altri tessuti o organi, questo protocollo consiste in tre processi principali, vale a dire la dissociazione fisica, la digestione enzimatica e l'arricchimento EC basato su anticorpi. Per affrontare le sfide uniche nell'elaborazione del pancreas, abbiamo introdotto diversi adattamenti chiave e passaggi critici all'interno del nostro protocollo: 1) una delicata digestione della collagenasi in un solo passaggio con un breve tempo di incubazione, 2) integrazione di una maggiore concentrazione di DNasi e di un inibitore della tripsina per ridurre al minimo la contaminazione del DNA e la digestione endogena degli enzimi, che può interferire con il legame degli anticorpi e quindi diminuire l'arricchimento e la vitalità dell'EC e 3) conteggio delle cellule dopo la fase di digestione per regolare il modo in cui molti anticorpi vengono aggiunti al campione per ottimizzare l'arricchimento dell'EC. Nel processo di ottimizzazione di questo protocollo, abbiamo testato altri enzimi utilizzati in studi precedenti, ad esempio tripsina28, collagenasi di tipo IV31 e altre temperature di digestione, ad esempio 4°C, nonché diversi tempi di incubazione (Tabella 1). Abbiamo scoperto che la collagenasi di tipo I, 20 minuti, a 37 °C è la condizione ottimale per l'isolamento della pEC nel topo e l'abbiamo utilizzata qui. Mentre l'aggiunta di un anticoagulante durante la perfusione può migliorare la vitalità cellulare complessiva, l'agente anticoagulante tipico, ad esempio l'EDTA o l'eparina, può interferire con l'attività di alcuni enzimi, ad esempio la collagenasi per la dissociazione cellulare e la trascrittasi inversa utilizzata nella qPCR. Per prevenire l'effetto inaspettato/indesiderato di questi anticoagulanti, viene utilizzato il PBS (senza Ca2+ e Mg2+) per la perfusione.

Ci siamo concentrati sullo sviluppo di un protocollo per arricchire la popolazione di EC da pancreas di topo intero, che includesse sia le EC intra-isole che le EC nei tessuti esocrini, con conseguente maggiore resa. Nell'attuale protocollo, abbiamo raggruppato 3 animali durante la fase di dissociazione e in media abbiamo ottenuto una sospensione a singola cellula con circa 2,0 x 106 cellule vitali. Abbiamo anche testato campioni da un singolo pancreas di topo e si possono ottenere circa 750.000 cellule. Vale la pena notare che quando si regola per elaborare un singolo animale, è necessario utilizzare meno soluzione di dissociazione (3 ml di dissociazione per pancreas). Un passaggio cruciale del protocollo consiste nel tagliare e rimuovere completamente il grasso residuo attaccato al pancreas (Figura 3B). La contaminazione del tessuto adiposo nella digestione della collagenasi interferirà con la fase di dissociazione delle singole cellule pancreatiche, diminuendo la vitalità cellulare nelle successive fasi di arricchimento38. Inoltre, per arricchire i pEC abbiamo utilizzato un marcatore di superficie pan-EC, PECAM1/CD31. Utilizzando l'anticorpo PECAM1/CD31, siamo stati in grado di arricchire significativamente le frazioni EC, come evidenziato dall'analisi dell'espressione genica. Nello sviluppo di questo protocollo, abbiamo anche testato l'utilità dell'anticorpo CD144, che è stato anche comunemente usato per isolare le EC13. Tuttavia, non siamo stati in grado di arricchire i pEC (dati non mostrati). Curiosamente, la colorazione con immunofluorescenza ha rivelato che mentre CD31 è espresso in tutte le EC nel tessuto del pancreas, l'anticorpo CD144 sembra colorare solo le EC intra-isole (Figura 5A). Inoltre, abbiamo analizzato i dati di RNA-seq a singola cellula disponibili al pubblico provenienti da isole isolate da topi C57BL/6 (GSE128565)37 e abbiamo scoperto che circa il 50% delle EC delle isole mostra l'espressione sia di Cdh5 (VE-Cad) che di Pecam1, ma il resto delle EC delle isole esprime solo Cdh5 o Pecam1 (Figura 5B). Pertanto, ipotizziamo che gli anticorpi CD31 siano più appropriati per l'isolamento della pEC e l'utilità dell'anticorpo CD144 per questo scopo giustifica future indagini. Inoltre, sono disponibili in commercio anti-CD31 coniugati con biglie magnetiche che possono semplificare la fase di legame dell'anticorpo in due fasi a una singola fase.

Come dimostrato, abbiamo eseguito qPCR, immunoblotting, citometria a flusso e colorazione con immunofluorescenza per convalidare la frazione EC isolata. È ipotizzabile che queste frazioni possano essere sottoposte ad altri saggi, come la spettrometria di massa (sc)RNA-seq. Un limite di questo protocollo è che non siamo stati in grado di ottenere una sottocoltura robusta ed eseguire saggi funzionali. Dato che la sottocoltura di EC isolate di topi si è dimostrata impegnativa, questa è un'area che giustifica sforzi futuri. Un modo per affrontare questo problema potrebbe essere l'introduzione dell'antigene T grande, che è stato utilizzato per immortalizzare le cellule primarie39.

I recenti progressi e l'applicazione del sequenziamento degli scRNA hanno permesso la profilazione ad alta risoluzione delle cellule pancreatiche40 e in particolare delle cellule insulari41. Tuttavia, la maggior parte degli studi esistenti si è concentrata sulle popolazioni di cellule endocrine e ha utilizzato protocolli di dissociazione tissutale che non trattengono in modo efficiente le CE. Di conseguenza, le frazioni di EC spesso finiscono per scarseggiare, costituendo solo il 3%-5% nell'intera popolazione cellulare catturata 42,43,44. Un recente protocollo utilizza la digestione e la disattivazione enzimatica in due fasi e una fase di smistamento cellulare attivata in fluorescenza e recupera le EC al 12% dell'intera popolazione di cellule pancreatiche45. A complemento di questo protocollo, il nostro protocollo fornisce un flusso di lavoro semplificato, che potrebbe essere più conveniente e meno impegnativo dal punto di vista tecnico nel caso in cui le EC fossero al centro dello studio. Sebbene questo protocollo sia stato testato solo nel pancreas di topo, può essere ampliato e adattato per isolare le EC da altri organismi, incluso il pancreas umano.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano il Dr. Brian Armstrong di City of Hope e Mindy Rodriguez dell'Università della California, Riverside per l'assistenza tecnica. Questo studio è stato finanziato in parte da sovvenzioni del NIH (R01 HL145170 a ZBC), Ella Fitzgerald Foundation (a ZBC), City of Hope (Arthur Riggs Diabetes Metabolism and Research Institute Innovation Award) e California Institute of Regenerative Medicine grant EDU4-12772 (ad AT). La ricerca riportata in questa pubblicazione includeva lavori eseguiti nella microscopia ottica e nell'imaging digitale supportati dal National Cancer Institute del NIH con il numero di premio P30CA033572. Figure 1 e Figure 2 sono state realizzate con BioRender.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1,5 mL eppendorfUSA Scientific1615-5500
piatto da 10 cmGenesee Scientific25-202
aghi 25GBD305145
2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ712-03-AA
5 mL eppendorfThermo Fisher
piastra a 6 pozzettiGreiner Bio-One07-000-208
70 µ colinoFisher22-363-548
Anti-CD31-biotinaMiltenyi BiotechREA784
Siero bovino albumina trattato con shock termicoFisherBP1600-100
CaCl2FisherBP510
CentrifugaEppendorf
Collagene Tipo 1, da pelle di vitelloSigma Aldrich& nbsp;C9791Reagente di attacco nel protocollo
Collagenasi Tipo 1 Worthington BioLS004197
Countess Contatore automatico di celleThermo Fisher
DAPIThermo FisherD1306bisturi di sicurezza monouso per immunofluorescenza
Myco Instrumentation6008TR-10
DNAse I Roche260913 
D-PBS (Ca2+,Mg2+)ThermoFisher 
EthanolFisherBP2818-4
Siero fetale bovinoFisher10437028
IncubatriceMantenuto a 37 gradi C 5% CO2
LS ColonneMiltenyi Biotech130-042-401
M199SigmaM2520-1L
MACS MultiStand con il separatore QuadroMACS Miltenyi Biotech130-042-303
Medio 199Sigma Aldrich M2520-10X
Microsfere anti-biotinaMiltenyi Biotech130-090-485
MicroscopioLeicaPer valutare la morfologia cellulare
Grado molecolare AcquaCorning46-000-CM
NaClFisherS271-1
New Brunswick Innova 44/44R Agitatore orbitale Eppendorf
PECAM1 (CD31) AnticorpoAbcamab56299immunofluorescenza
PECAM1 (CD31) AnticorpoR& D SystemsAF3628
Soluzione salina tamponata con fosfato (10X) (no Ca2+, no Mg2+)Genesee Scientific25-507-XB
Primer 36B4 Forward mouseIDTAGATTCGGGATATGCTGTTGGC
Primer 36B4 Revese mouse IDTTCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
Primer Kdr Mouse in avanti IDTTCCAGAATCCTCTTCCATGC
Primer Kdr Reverse mouseIDTAAACCTCCTGCAAGCAAATG
Primer Nkx6.1 Reverse mouse IDTCACGGCGGACTCTGCATCACTC
Primer Nxk6.1 Mouse in avantiIDTCTCTACTTTAGCCCCAGCG
Primer PECAM1 Mouse in avantiIDTACGCTGGTGCTCTATGCAAG
Primer PECAM1 Reverse mouseIDTTCAGTTGCTGCCCATTCATCA
RNase ZAPThermo FisherAM9780
Acqua priva di RNasiTakaraRR036B
Pinza sterile lunga 12"F.S.T91100-16
Pinza fine sterileF.S.T11050-10
Forbici fine steriliF.S.T14061-11
Piastre per coltura tissutale 2cmReagente TRIzol Genesee Scientific25-260
Fisher15596018
Trypan BlueCorningMT25900CI
inibitore della tripsina Roche10109886001
Tween-20
VE-Caderrina AnticorpoAbcamab33168immunofluorescenza
Bagnomaria
1428230014080055

Riferimenti

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