Qui, presentiamo un modello di dolore infiammatorio modificato con l'iniezione di carragenina su entrambe le zampe posteriori per valutare l'effetto analgesico.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Un modello modificato di dolore infiammatorio per studiare l'effetto analgesico nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il test della piastra calda è ampiamente utilizzato per valutare gli effetti analgesici sul dolore infiammatorio nei topi. Un modello comunemente usato di dolore infiammatorio è stato indotto con un'iniezione intraplantare di carragenina in una zampa posteriore. Tuttavia, i risultati del nostro laboratorio hanno mostrato che i topi con un'iniezione di carragenina con una sola zampa posteriore hanno sollevato le zampe per evitare la nocicezione termica durante il test della piastra calda. A causa di questa risposta, il metodo di iniezione precedente non può riflettere accuratamente la soglia del dolore termico. Pertanto, abbiamo studiato un nuovo metodo per evitare questo problema. Nel presente studio, abbiamo modificato il metodo precedente iniettando carragenina in entrambe le zampe posteriori per stabilire il modello del dolore infiammatorio. I risultati hanno dimostrato che l'iniezione di entrambe le zampe posteriori con carragenina era sensibile e un metodo migliore per indurre dolore infiammatorio quando si utilizzava il test della piastra calda rispetto all'iniezione di una singola zampa posteriore. Sulla base di questi risultati, abbiamo progettato ulteriori esperimenti in cui topi con iniezione di carragenina sia a zampa posteriore che a zampa posteriore singola sono stati trattati per via intragastrica con celecoxib (30 mg/kg). I risultati del test della piastra calda hanno mostrato che il celecoxib ha aumentato la soglia del dolore termico nei topi con iniezione di carragenina, ma non nei topi con iniezione di carragenina. In sintesi, abbiamo sviluppato un metodo superiore per indurre un modello di dolore infiammatorio per valutare l'effetto analgesico.
Introduzione
Il dolore è un problema di salute pubblica in tutto il mondo. È innescato da una stimolazione termica, meccanica o chimica nociva. È difficile eseguire studi sul dolore negli esseri umani a causa di preoccupazioni etiche. Pertanto, l'utilizzo di modelli animali del dolore è un approccio chiave per comprendere i meccanismi del dolore e i trattamenti di ricerca1. Il test della piastra calda è stato ampiamente utilizzato per la valutazione della nocicezione termica e dell'iperalgesia2. Attualmente, il modello di dolore infiammatorio utilizzato per il test della piastra calda è indotto con un'iniezione intraplantare di carragenina in una zampa posteriore. Ad esempio, per studiare l'effetto antinocicettivo delle microsfere caricate con rotigotina, è stato preparato un modello animale di dolore infiammatorio mediante un'iniezione di una singola zampa posteriore3. Per valutare gli effetti degli inibitori della catecol-o-metil-transferasi sulla nocicezione termica nei topi, la carragenina è stata somministrata nella regione plantare della zampa posteriore destra4. Per studiare il ruolo analgesico dell'estratto di Posidonia oceanica (L.) Delile, è stato preparato un modello di dolore infiammatorio nei topi mediante iniezione intraplantare di carragenina nella zampa posteriore destra5. Tuttavia, i risultati del nostro laboratorio hanno dimostrato che un topo con l'iniezione di carragenina con una sola zampa posteriore solleverebbe la zampa per evitare la nocicezione termica, che estende in modo impreciso la risposta dell'animale a uno stimolo termico nel test della piastra calda. Pertanto, abbiamo ipotizzato che il modello del dolore infiammatorio con l'iniezione di carragenina a zampa singola non potesse riflettere accuratamente la soglia del dolore termico. Pertanto, abbiamo ottimizzato il metodo iniettando carragenina in entrambe le zampe posteriori per stabilire un modello di dolore infiammatorio modificato.
I topi sottoposti a iniezione di carragenina su entrambe le zampe posteriori non avevano modo di evitare lo stimolo termico per entrambe le zampe posteriori allo stesso tempo. La soglia del dolore è stata definita come il tempo che intercorre tra il posizionamento del topo sulla piastra calda e la leccata di una zampa posteriore da parte del topo. I risultati hanno confermato che il modello di dolore infiammatorio modificato è più adatto per valutare la soglia della temperatura nocicettiva. Ciò può migliorare l'efficacia del test della piastra calda per la ricerca e lo sviluppo di farmaci analgesici.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Yantai (n. YTDX20220425). Le procedure hanno seguito le linee guida del National Institutes of Health per l'uso degli animali da laboratorio.
1. Animali
- Utilizzare topi femmina ICR del peso di 20-25 g per gli esperimenti.
- Lasciare che gli animali si acclimatino all'ambiente della sala sperimentale per 3 giorni prima di iniziare gli esperimenti.
- Mantieni la stanza sperimentale con un ciclo luce-buio di 12 ore e fornisci ai topi libero accesso all'acqua e al cibo.
2. Preparazione della soluzione di carragenina
- Pesare 0,1 g di carragenina. Aggiungere 10 mL di soluzione fisiologica normale sterilizzata in una provetta.
- Aggiungere 0,1 g di carragenina al tubo e agitare il tubo per 30 s.
- Raccogliere la soluzione di carragenina sterilizzata all'1%.
- Preparare la soluzione di carragenina prima degli esperimenti.
3. Iniezione intraplantare di carragenina
- Utilizzare una siringa (0,05 mL, 29 G x 1/2 pollice, 0,33 mm × 12,7 mm) per iniettare la soluzione di carragenina all'1%.
- Agitare la soluzione di carragenina prima di aspirarla nella siringa. Assicurarsi che non vi siano bolle nella siringa.
- Disinfettare il sito di iniezione (zampa posteriore) con alcol al 75%.
- Iniettare 30 μl 6,7 di soluzione di carragenina all'1% per via sottocutanea nella superficie plantare della zampa posteriore. Per i topi del gruppo di controllo, iniettare 30 μL di soluzione fisiologica normale.
- Inserisci l'ago in diagonale verso l'alto nel cuscinetto del piede della zampa posteriore. Mantenere la stabilità della siringa.
- Dopo l'iniezione, estrarre lentamente la siringa e premere sul sito di iniezione per 2 secondi per evitare perdite.
4. Test della piastra riscaldante
- Eseguire il test della piastra calda 3 ore dopo l'iniezione intraplantare.
- Pulire e disinfettare la superficie della piastra riscaldante.
- Avviare l'apparecchio della piastra riscaldante. Fare clic sul pulsante Modalità temperatura . Fare clic su COSTANTE per impostare la temperatura su 55 ± 0,2 °C.
- Fai clic sul pulsante Avvia esperimento e poi su REACH. Prendi un topo dal contenitore dell'alloggio. Afferra delicatamente il suo tronco. Posiziona il mouse al centro della piastra riscaldante. Fare clic su AVVIA.
- Osservare e registrare il tempo di leccare la zampa posteriore sinistra (per i topi con iniezione di una sola zampa posteriore) o la zampa posteriore (per i topi con iniezione di entrambe le zampe posteriori) in risposta alla stimolazione termica. Premere il pedale della piastra riscaldante per vedere l'ora sullo schermo della piastra riscaldante. Definisci la soglia del dolore come il tempo che intercorre tra il posizionamento del mouse sulla piastra calda e la leccata della zampa posteriore.
- Impostare un limite di 60 s per il test della piastra calda 4,8,9. Registrare una soglia del dolore di 60 s se il limite viene raggiunto.
NOTA: Pulire l'apparecchio con piastra riscaldante con alcool al 75% prima di posizionare il mouse successivo per evitare possibili distorsioni dovute all'odore residuo del mouse precedente.
5. Preparazione di 1,5 mg/mL di sospensione di celecoxib
- Assumere 1 capsula contenente 200 mg di celecoxib. Prendi il contenuto della capsula e macinala in polvere.
- Aggiungere lo 0,5% di carbossimetilcellulosa sodica. Il volume finale è di 13,3 mL. Questa è la sospensione del negozio di celecoxib.
- Assumere 1 ml di celecoxib in sospensione da negozio. Aggiungere 9,0 mL di carbossimetilcellulosa sodica allo 0,5% per ottenere 1,5 mg/mL di sospensione di celecoxib.
- Somministrare 0,2 ml/10 g della sospensione di celecoxib per via intragastrica ai topi.
NOTA: Selezionare un ago per sonda gastrica con 4,0-4,5 cm di lunghezza per topi di peso compreso tra 20 e 25 g.
6. Valutazione del modello di dolore infiammatorio modificato
- Dividi casualmente i topi femmine ICR in tre gruppi: gruppi di controllo, modello e celecoxib.
- Iniettare 30 μL di soluzione di carragenina all'1% per via sottocutanea nella superficie plantare della zampa posteriore (zampa posteriore singola o zampa posteriore entrambe). Per i topi del gruppo di controllo, iniettare 30 μL di soluzione fisiologica normale.
- Dopo l'iniezione di carragenina o soluzione fisiologica, eseguire immediatamente il trattamento. Somministrare celecoxib per via intragastrica alla dose di 30 mg/kg per i topi del gruppo celecoxib. Per i topi nei gruppi di controllo e modello, somministrare per via intragastrica carbossimetilcellulosa sodica allo 0,5%.
- Eseguire il test su piastra riscaldante (sezione 2) 3 ore dopo l'iniezione di carragenina.
7. Metodi statistici
- Presentare i risultati sperimentali come media ± deviazione standard. Condurre un test di distribuzione di normalità con il test statistico di bontà dell'adattamento di Kolmogorov-Smirnov.
- Analizza il confronto tra i due gruppi utilizzando un t-test non appaiato. Esegui confronti di più gruppi utilizzando un'analisi unidirezionale della varianza seguita dal test di Dunnett. Considera il valore di p < 0,05 statisticamente significativo.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La soglia del dolore nei modelli di dolore infiammatorio
La soglia del dolore del modello del dolore infiammatorio con iniezione di carragenina con una sola zampa posteriore era di 32,23 ± 11,11 s, mentre la soglia del dolore del gruppo di controllo era di 27,73 ± 7,08 s. Rispetto al gruppo di controllo, la soglia del dolore del modello di iniezione a zampa posteriore singola non ha mostrato una riduzione significativa (p > 0,05, Figura 1A). La soglia del dolore del mo...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il dolore è una risposta protettiva innescata da un danno tissutale o da una lesione. Tuttavia, ha anche un impatto negativo sulla qualità della vita10. Pertanto, lo sviluppo di analgesici efficaci e l'esplorazione dei meccanismi del dolore rimangono aree di ricerca attive. I metodi per la valutazione del dolore svolgono un ruolo chiave nello sviluppo di farmaci analgesici. L'iniezione di carragenina con una sola zampa posteriore è un metodo classico per il test d...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcun potenziale conflitto di interessi da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Lesley McCollum, PhD, di Liwen Bianji (Edanz) (www.liwenbianji.cn), per aver curato il testo inglese di una bozza di questo manoscritto.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Bilancia elettronica AL204 | Yuheng Battery Co., Ltd | YH-400A | |
| Carbossimetilcellulosa | Tianjin Chemical Co., Ltd | ||
| Carragenina | Sigma, MO, Stati Uniti | 29H0715 | |
| Celecoxib | Pfizer Inc. | ||
| Piastra riscaldante | UGO Ltd. Co., Italia | PB-200 | |
| ICR femmine di topi | Jinan Pengyue Co., Ltd. | ||
| soluzione salina normale | Kelun Pharmaceutical Co., Ltd |
Riferimenti
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Front Mol Neurosci. 10, 284(2017).
- Menéndez, L., Lastra, A., Hidalgo, A., Baamonde, A. Unilateral hot plate test: a simple and sensitive method for detecting central and peripheral hyperalgesia in mice. J Neurosci Methods. 113 (1), 91-97 (2002).
- Li, T., et al. Rotigotine-loaded microspheres exerts the antinociceptive effect via central dopaminergic system. Eur J Pharmacol. 910, 174443(2021).
- Kambur, O., et al. Inhibitors of catechol- O -methyltransferase sensitize mice to pain. Br J Pharmacol. 161 (7), 1553-1565 (2010).
- Micheli, L., et al. Efficacy of Posidonia oceanica extract against inflammatory pain: In vivo studies in mice. Mar Drugs. 19 (2), 48(2021).
- McCarson, K. E. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Curr Protoc Pharmacol. 70, 5.4.1-5.4.9 (2015).
- Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of Inflammation: Carrageenan- or Complete Freund's Adjuvant (CFA)-Induced Edema and Hypersensitivity in the Rat. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 5 (Unit 5.4), (2012).
- Asl, M. K., Nazariborun, A., Hosseini, M. Analgesic effect of the aqueous and ethanolic extracts of clove. Avicenna J Phytomed. 3 (2), 186-912 (2013).
- Wang, Y. Analgesic effects of glycoproteins from Panax ginseng root in mice. J Ethnopharmacol. 148 (3), 946-950 (2013).
- Zia, F. Z., et al. Are psychedelic medicines the reset for chronic pain? Preliminary findings and research needs. Neuropharmacology. 233, 109528(2023).
- Sałat, K., Furgała, A., Sałat, R. Evaluation of cebranopadol, a dually acting nociceptin/orphanin FQ and opioid receptor agonist in mouse models of acute, tonic, and chemotherapy-induced neuropathic pain. Inflammopharmacology. 26 (2), 361-374 (2018).
- Wang, J., et al. Anti-inflammatory and analgesic actions of bufotenine through inhibiting lipid metabolism pathway. Biomed Pharmacother. 140, 111749(2021).
- Gong, L., et al. Antinociceptive and anti-inflammatory potentials of Akebia saponin D. Eur J Pharmacol. 845, 85-90 (2019).
- Deng, J., et al. Comparison of analgesic activities of aconitine in different mice pain models. PloS One. 16 (4), e0249276(2021).
- Penn, N. W. Potentiation of morphine analgesic action in mice by beta-carotene. Eur J Pharmacol. 284 (1-2), 191-193 (1995).
- Akkol, E. K., Güvenç, A., Yesilada, E. A comparative study on the antinociceptive and anti-inflammatory activities of five Juniperus taxa. J Ethnopharmacol. 125 (2), 330-336 (2009).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
