Diagnostica point-of-care basata su CRISPR con reagenti premiscelati e liofilizzati

Sommario

Qui, presentiamo la preparazione passo dopo passo dell'amplificazione isotermica premiscelata e liofilizzata basata sulla ricombinasi e delle reazioni basate su CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), che possono essere utilizzate per il rilevamento di biomarcatori di acidi nucleici di patogeni di malattie infettive o altri marcatori genetici di interesse.

Abstract

La diagnostica molecolare basata su CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) ha un'elevata precisione diagnostica e attributi adatti per l'uso in ambienti point-of-care, come tempi di consegna rapidi per i risultati, comode letture semplici e nessuna necessità di strumenti complicati. Tuttavia, le reazioni possono essere ingombranti da eseguire presso il punto di cura a causa dei loro numerosi componenti e delle fasi di movimentazione manuale. In questo documento, forniamo un protocollo ottimizzato passo dopo passo per la rilevazione robusta di patogeni patogeni e marcatori genetici con amplificazione isotermica basata sulla ricombinasi e reagenti basati su CRISPR, che vengono premiscelati e quindi liofilizzati in formati facilmente conservabili e pronti all'uso. I reagenti premiscelati e liofilizzati possono essere reidratati per l'uso immediato e mantenere un'elevata efficienza di amplificazione e rilevamento. Forniamo anche una guida alla risoluzione dei problemi riscontrati comunemente durante la preparazione e l'utilizzo di reagenti premiscelati e liofilizzati per la diagnostica basata su CRISPR, per rendere la piattaforma di rilevamento più accessibile alle più ampie comunità di test diagnostici/genetici.

Introduzione

La diagnostica basata su CRISPR per il rilevamento di biomarcatori di acidi nucleici è stata segnalata per la prima volta nel 2017 1,2,3,4 e da allora è stata dimostrata come diagnostica di nuova generazione con test approvati dalla Food and Drug Administration (FDA), in particolare per il rilevamento dell'RNA del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) della sindrome respiratoria acuta grave, in più paesi 5,6,7,8 . Oltre alla malattia da coronavirus 2019 (COVID-19), le tecnologie si sono dimostrate efficaci per rilevare diversi virus e batteri 9,10,11,12,13, mutazioni e delezioni di malattie genetiche e possono essere ingegnerizzate per rilevare biomarcatori proteici e piccole molecole ^2,12. La diagnostica basata su CRISPR spesso combina metodi di amplificazione isotermica, come l'amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA) o l'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP)^14,15, con il rilevamento basato su CRISPR utilizzando enzimi associati a CRISPR (Cas) guidati da RNA con attività endonucleasica "collaterale" dopo il riconoscimento del bersaglio³. Il duplice uso dell'amplificazione isotermica e della rilevazione basata su CRISPR conferisce diversi attributi desiderabili alle tecnologie, in particolare un'elevata accuratezza diagnostica che si avvicina a quella della reazione a catena della polimerasi (PCR) gold standard e la capacità di multiplexare e rilevare piccole differenze di sequenza, inclusi i polimorfismi a singolo nucleotide ^1,9.

Le versioni più accurate della diagnostica basata su CRISPR, tuttavia, contengono più componenti e passaggi e possono essere complicate da eseguire con non esperti o presso il punto di cura (POC). Per affrontare la sfida di estendere l'uso di una diagnostica altamente accurata basata su CRISPR alle impostazioni POC, abbiamo sviluppato protocolli per preparare l'amplificazione isotermica premiscelata, liofilizzata, basata sulla ricombinasi e reazioni di rilevamento basate su CRISPR, che sono facili da usare e memorizzare⁷. Questi protocolli dovrebbero integrare gli eccellenti protocolli esistenti sulla diagnostica basata su CRISPR¹⁴, che contengono informazioni aggiuntive sulla produzione di componenti biochimici necessari per la diagnostica basata su CRISPR⁷, linee guida di progettazione¹ e formulazioni che utilizzano tecniche di amplificazione isoterma alternative 2,14,15,16 ed enzimi Cas ¹². In definitiva, speriamo che la diagnostica basata su CRISPR possa aiutare a realizzare un rilevamento nucleico rapido, economico e sensibile in ambienti in cui sono richieste analisi portatili e prive di strumenti ^1,9,17.

Nei nostri protocolli utilizziamo principalmente la combinazione di rilevamento basato su RPA e Cas13. L'RPA funziona a temperature prossime a quelle ambiente (37-42 °C) e, pertanto, ha bassi requisiti energetici e di apparecchiature. Altre reazioni di amplificazione isoterma richiedono temperature più elevate (LAMP, 60-65 °C; amplificazione a spostamento di filamento (SDA), 60 °C; reazione di amplificazione esponenziale (EXPAR), 55 °C; e amplificazione eliodipendente (HDA), 65 °C)². Anche il design dei primer RPA non è complesso, a differenza dei primer LAMP, e può essere esteso all'amplificazione multiplexata ^7,9,14. Anche se il multiplexing oltre due bersagli con RPA è difficile nella pratica, esistono linee guida chiare su come progettare primer RPA multiplex per ridurre al minimo l'interferenza¹⁸.

Sebbene la contaminazione da carryover rimanga un grosso problema nel flusso di lavoro in due fasi, gli ampliconi generati di RPA sono di piccole dimensioni e hanno meno probabilità di causare contaminazione da carryover rispetto ai grandi ampliconi concatemerici di LAMP¹⁴. I primer RPA possono essere progettati secondo le linee guida standard¹⁴: sono generalmente lunghi 25-35 nucleotidi con temperature di fusione comprese tra 54 e 67 °C. La dimensione dell'amplicone dovrebbe essere inferiore a 200 coppie di basi. L'enzima trascrittasi inversa (RT) può essere aggiunto all'RPA per consentire l'amplificazione dall'RNA, e nella trascrizione inversa-RPA (RT-RPA), un altro enzima Ribonucleasi H (RNasi H) viene tipicamente aggiunto in piccole quantità per aiutare a risolvere l'ibrido RNA: DNA risultante e promuovere la reazione di amplificazione ^5,19. Per consentire la trascrizione di T7 per il rilevamento basato su Cas13, il promotore della RNA polimerasi T7 può essere posizionato all'estremità 5' del primer RPA in avanti.

Dopo che gli ampliconi sono stati generati dall'RPA, possono essere rilevati con gli enzimi Cas programmati con crRNA. Tra i vari enzimi Cas che possono essere utilizzati per la rilevazione di ampliconi, preferiamo le varianti Cas13 che hanno come bersaglio l'RNA a causa della loro elevata attività di clivaggio¹ e delle preferenze di clivaggio polinucleotidico ben caratterizzate ^7,9, quest'ultima delle quali può essere utilizzata per la rilevazione multiplexata. La sequenza di crRNA per Cas13 è progettata per essere complementare (complemento inverso) al sito bersaglio nell'RNA prodotto con sequenze spaziatrici e ripetizioni dirette (DR). La sequenza di crRNA e i primer RPA non devono sovrapporsi, per evitare il rilevamento indesiderato basato su Cas di prodotti di amplificazione fuori bersaglio, che aumenta il fondo e i falsi positivi¹⁴.

Il rilevamento basato su Cas-based si basa su diverse modalità di rilevamento per monitorare la scissione delle molecole di acido nucleico reporter (RNA reporter per reazioni basate su Cas13)^1,2,14. Diverse modalità di rilevamento includono colorimetria, letture elettrochimiche, fluorescenza, letture di sequenziamento e strisce a flusso laterale². Ci concentriamo sulla lettura della fluorescenza data una varietà di fluorofori e reporter come la cianina 5 (Cy5), la rodamina X (ROX) e la carbossifluoresceina (FAM), che possono essere efficacemente eccitati utilizzando una singola sorgente di luce LED blu e la loro fluorescenza analizzata da un lettore di micropiastre o da un termociclatore in tempo reale ^7,14. Inoltre, la lettura della fluorescenza è facile da configurare e consente un monitoraggio continuo, che consente la quantificazione in tempo reale. La preamplificazione RPA multiplexata e la rilevazione multiplexata basata su Cas13 utilizzando enzimi Cas possono essere combinate con letture di fluorescenza multicolore per la rilevazione simultanea di più bersagli genetici ^2,7.

Nei nostri protocolli, prima amplifichiamo isotermicamente l'RNA con RT-RPA aggiungendo il campione di RNA alla forma liofilizzata del reagente RT-RPA (Figura 1). Durante la RT-RPA, il promotore T7 viene aggiunto all'amplicone di DNA a doppio filamento generato. Successivamente, i prodotti RPA vengono trasferiti alla rilevazione liofilizzata basata su Cas13, che contiene anche RNA polimerasi T7. Questa reazione di rilevamento convertirà gli ampliconi del DNA in RNA (tramite la RNA polimerasi T7), che può essere facilmente rilevata con Cas13 programmato con crRNA. Cas13 attivato dal bersaglio scinde le molecole reporter per produrre un segnale di fluorescenza rilevabile ^2,7,14. Sebbene i protocolli qui riportati riguardino la rilevazione da parte di Leptotrichia wadei (LwaCas13a), possono essere estesi alla rilevazione simultanea e multiplexata di un massimo di quattro bersagli utilizzando gli enzimi ortogonali Cas13 e Cas12 ^7,9. Le reazioni di rilevamento basate su RPA e Cas possono anche essere combinate in un'unica provetta, anche se con una perdita di sensibilità¹⁴.

Figura 1: Flusso di lavoro di rilevamento basato su CRISPR. Il flusso di lavoro illustra il rilevamento di due geni bersaglio. In primo luogo, le regioni di interesse all'interno del bersaglio del DNA vengono amplificate isotermicamente con RPA; la reazione può essere eseguita con la trascrizione inversa (RT-RPA) quando si rilevano bersagli di RNA. Successivamente, la trascrizione T7 converte gli ampliconi del dsDNA in RNA, che a loro volta sono riconosciuti dai complessi Cas13-crRNA in grado di suscitare l'attività collaterale della RNasi al momento del legame con il bersaglio. La scissione dei reporter di fluorescenza temprati produce segnali di fluorescenza che possono essere monitorati utilizzando un lettore di micropiastre, visualizzati da un transilluminatore a LED o utilizzati con un termociclatore in tempo reale. Abbreviazioni: CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; RT = trascrizione inversa; RPA = amplificazione della polimerasi ricombinasi; Cas = proteina associata a CRISPR; LED = diodo a emissione luminosa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le caratteristiche principali dei protocolli qui presentati sono le formulazioni di premiscelazione per la liofilizzazione. La premiscelazione semplifica l'uso della reazione e migliora la riproducibilità, ma molti componenti all'interno della rilevazione basata su RPA e Cas, in particolare la trascrizione inversa e alcuni cofattori labili come l'ATP, non sono stabili in soluzione. Pertanto, formuliamo le soluzioni premiscelate in modo tale che possano essere liofilizzate per lo stoccaggio a lungo termine e per un facile trasporto e distribuzione ^1,9,20. I reagenti premiscelati e liofilizzati contribuiscono anche a migliorare la sensibilità di rilevamento, poiché è possibile aggiungere un volume di campione più elevato (e quindi un maggiore input di DNA/RNA) per ricostituire la reazione¹⁰. Nelle nostre formulazioni, utilizziamo principalmente il trealosio²¹ come crioprotettore nelle reazioni di rilevamento basate su RPA liofilizzato e Cas⁷. Oltre alla conservazione del reagente, il trealosio promuove anche le reazioni aumentando la stabilizzazione enzimatica 16,22,23,24 e diminuendo le temperature di fusione del dsDNA 23. L'esplorazione di altri stabilizzanti 5,7,21,25,26 oltre al trealosio può produrre formulazioni ancora più ottimali per diversi scenari di utilizzo.

Protocollo

1. Preparazione di reagenti premiscelati RT-RPA liofilizzati

1. Preparazione dell'attrezzatura
   1. Preparare un dewar o un vassoio di azoto liquido per il congelamento rapido delle reazioni. Riempi il dewar o il vassoio con azoto liquido.
   2. Liofilizzatore
      1. Verificare la presenza di acqua di condensa nei tubi di scarico e all'interno della camera; Rimuovere l'acqua se necessario.
      2. Pulire l'interno della camera e il rack metallico della provetta per microcentrifuga da 1,5 mL con una soluzione di decontaminazione a base di RNasi, seguita da etanolo al 70%.
      3. Chiudere lo sportello della camera e la valvola di rilascio del vuoto.
      4. Accendi il liofilizzatore.
      5. Impostare manualmente la temperatura del ripiano a -30 °C.
   3. Apparecchiature per biologia molecolare
      1. Pulire quanto segue con la soluzione di decontaminazione RNasi: pipette, rack per puntali per pipette, un miscelatore a vortice, una minicentrifuga spin-down e un pennarello indelebile.
      2. Pulire quanto segue con acqua di rubinetto, quindi pulire con carta per salviette per la pulizia: griglie di plastica per provette da microcentrifuga e una scatola di schiuma per il ghiaccio.
      3. Preparare un blocco riscaldante (utilizzato per sciogliere/risolubilizzare la soluzione di triglicina) pulendolo con una soluzione di decontaminazione RNasi ed etanolo al 70%. Quindi, accenderlo e impostare la temperatura a 60 °C.
2. Preparazione di reazioni RPA premiscelate
   NOTA: Questa formulazione è per 10 reazioni (utilizzando tre pellet RPA).
   1. Controllare se c'è del precipitato nella soluzione di triglicina prima dell'uso. Se sono presenti precipitati, scioglierli incubandoli a 60 °C e mescolando accuratamente prima dell'uso. Raffreddare la soluzione di triglicina prima di aggiungere altri reagenti sensibili al calore.
      NOTA: I precipitati possono formarsi facilmente se il tubo viene lasciato a temperatura ambiente per un periodo prolungato.
   2. Rimuovere tre tubi di strisce di pellet RPA dal congelatore; Picchiettare i tubi della striscia battendoli delicatamente contro il banco del laboratorio per rimuovere i pellet bianchi.
   3. Trasferire tutti e tre i pellet in una provetta da microcentrifuga A da 1,5 mL.
   4. Pipettare 25 μl di acqua priva di nucleasi per sciacquare l'eventuale polvere di RPA residua nelle provette per strip e trasferire la soluzione di risciacquo in una nuova provetta per microcentrifuga B da 1,5 mL.
   5. Aggiungere 10 μl della soluzione di triglicina 0,57 M e 10 μl di miscela di primer (10 μM ciascuno) alla provetta master B della mastermix.
   6. Tubo Vortex-mix B; Quindi girare verso il basso e posizionare il tubo sul ghiaccio.
   7. Aggiungere 28,4 μl del tampone RPA 5x (preparato da 500 μl di PEG20000 al 50% (p/v), 250 μl di 1 M Tris pH 7,4 e 100 μl di 100 mM di ditiotreitolo (DTT)) alla provetta B della mastermix e mescolare accuratamente picchiettando o agitando più volte.
      NOTA: Produciamo la soluzione in questo modo per aiutare a diluire/diminuire la viscosità del PEG nella provetta mastermix, prima di aggiungere tutto per solubilizzare i pellet RPA.
   8. Trasferire i pellet raccolti nella provetta A dal passaggio 1.2.3 nella provetta Master B, quindi capovolgere più volte la provetta Mastermix per miscelare. Osservare se la soluzione appare omogenea e monofasica (sembrerà anche leggermente opaca) e poi, posizionare il tubo sul ghiaccio.
      NOTA: Se la miscelazione non è accurata, il PEG può causare la separazione di fase della soluzione/sospensione.
   9. Aggiungere 0,71 μL di 200 Unità/μL RT e 2,84 μL di 5 Unità/μL di RNasi H alla provetta mastermix. Picchiettare delicatamente o capovolgere il tubo mastermix su e giù molte volte. Girare verso il basso e posizionare il tubo sul ghiaccio.
      NOTA: Aggiungiamo questi enzimi dopo una forte miscelazione dei passaggi precedenti poiché RT e RNasi H sono sensibili al taglio a causa della miscelazione; niente più vortici dopo l'aggiunta di RT/RNasi H.
   10. Aliquotare 8,4 μl della soluzione mastermix in 10 provette preraffreddate da 1,5 mL e posizionare le provette sul ghiaccio. A tale scopo, immergere il puntale della pipetta nella soluzione mastermix e aspirare la soluzione mastermix nel puntale lentamente e costantemente per evitare la formazione di bolle d'aria e garantire una misurazione accurata del volume. Erogare la soluzione mastermix in una provetta preraffreddata da 1,5 ml.
       NOTA: Con 8,4 μL di aliquotato, secondo la nostra esperienza, ci sarà una sospensione di ~1-2 μL rimasta nella provetta mastermix. Lo sperimentatore può abbassare leggermente il volume di aliquotazione per garantire una quantità sufficiente di reagenti per tutte e 10 le reazioni. Utilizzare tecniche di pipettaggio adeguate quando si maneggiano soluzioni viscose.
   11. Al termine dell'aliquotazione, posizionare le provette in una rastrelliera metallica imbevuta di azoto liquido per prepararle alla liofilizzazione. Lasciare immergere le provette nell'azoto liquido per 5 minuti.
       NOTA: Poiché la liofilizzazione rimuove la soluzione in eccesso, ci consente di aggiungere più input di DNA/RNA, il che aiuta ad aumentare la sensibilità. Le reazioni RPA premiscelate liofilizzate possono essere conservate a -20 °C per 8 mesi. La liofilizzazione aiuta con la riproducibilità se un determinato esperimento viene eseguito utilizzando mastermix RPA preparati nello stesso lotto, quindi anche la creazione di un lotto più grande aiuta.
3. Liofilizzazione
   1. Al liofilizzatore, controllare le temperature del collettore e del ripiano. Se necessario, attendere che la temperatura del collettore raggiunga i -75 ± 5 °C e la temperatura del ripiano raggiunga i -30 ± 1 °C.
   2. Coprire le provette aperte nella rastrelliera metallica con un foglio di carta per salviette per la pulizia, posizionare la rastrelliera metallica insieme alle provette aperte nel ripiano del liofilizzatore e chiudere lo sportello del ripiano.
   3. Selezionare il programma mostrato nella Tabella 1 e premere start. Dopo 30 minuti dalla fase di asciugatura secondaria (20 °C, <0,1 mbar; la temperatura viene mantenuta all'infinito impostando il tempo della fase su "infinito"), premere stop il programma.
      NOTA: Lasciamo che i tubi si riscaldino nel liofilizzatore per evitare la condensa dell'acqua.
   4. Rilasciare la pressione aprendo la valvola di rilascio del vuoto, quindi rimuovere la griglia dal ripiano. Tappare immediatamente le provette e conservare le reazioni liofilizzate a -20 °C.
      NOTA: Le reazioni premiscelate RPA liofilizzate e CRISPR-Cas13a possono essere conservate a -20 °C per 8 mesi.

2. Preparazione di reagenti di rilevazione premiscelati liofilizzati CRISPR-Cas13a

NOTA: Seguire il passaggio 1.1 per la preparazione dell'attrezzatura.

1. Preparazione della reazione premiscelata CRISPR-Cas13a (10 reazioni)
   1. Rimuovere i seguenti elementi dal deposito e metterli sul ghiaccio: 10 μL di LwaCas13a (prodotto internamente ^7,8,14) (2 mg/mL), tampone di conservazione Cas, 10 ng/μL (225 nM) di crRNA, 25 mM di rNTP, 50 Unit/μL di RNA polimerasi T7, 2 μM di reporter di fluorescenza FAM.
   2. Preparare una soluzione di lavoro di LwaCas13a a 126 μg/mL (900 nM) aggiungendo 148,8 μL di tampone di conservazione Cas (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,6 M NaCl, 5% Glicerolo, 2 mM DTT) a 10 μL di 2 mg/mL di LwaCas13a.
   3. Preparare la reazione mastermix CRISPR-Cas13a come segue: 71 μL di acqua priva di RNasi, 20 μL di Tris pH 7,4 da 400 mM, 20 μL di trealosio al 60% (p/v), 10 μL di crRNA da 10 ng/μL (225 nM) (qui, mirato ai geni s e n di SARS-CoV-2), 8 μL di miscela rNTP da 100 mM (25 mM ciascuno), 6 μL di RNA polimerasi T7 da 50 unità/μL, 25 μL di reporter di fluorescenza FAM da 2 μM e 10 μL di 126 μg/mL (900 nM) LwaCas13a. Mescolare bene capovolgendo il tubo mastermix; Quindi, gira verso il basso.
   4. Aliquotare 17 μl della mastermix in 10 provette da 1,5 mL poste su ghiaccio. Collocare le provette in una griglia imbevuta di azoto liquido e lasciare che le provette siano immerse nell'azoto liquido per 5 minuti.
2. Liofilizzazione
   1. Al liofilizzatore, controllare le temperature del collettore e del ripiano e attendere che la temperatura del collettore raggiunga i -75 ± 5 °C e la temperatura del ripiano raggiunga i -30 ± 1 °C.
   2. Posizionare i tubi nel liofilizzatore. Selezionare il programma mostrato nella Tabella 1 e premere start. Dopo 30 minuti dalla fase di asciugatura secondaria (25 °C, <0,1 mbar; la temperatura viene mantenuta all'infinito impostando il tempo della fase su "infinito"), interrompere il programma.
   3. Rilasciare la pressione aprendo la valvola di rilascio del vuoto e rimuovere la griglia dal ripiano. Tappare immediatamente le provette e conservare le reazioni liofilizzate a -20 °C.
      NOTA: I reagenti premiscelati RPA liofilizzati e CRISPR-Cas13a possono essere conservati a -20 °C per 8 mesi.

3. Amplificazione degli acidi nucleici RT-RPA

NOTA: Per evitare la contaminazione incrociata, le aree del luogo di lavoro e i pipettatori devono essere separati per la preamplificazione, l'aggiunta del campione e la post-amplificazione. Si consiglia di utilizzare puntali per pipette filtrati.

1. Preriscaldare un incubatore a scuotimento termico a 42 °C.
2. Aggiungere 1 μL di miscela di soluzione di acetato di magnesio (Mg(OAc)₂) e acetato di potassio (KOAc) (composta da 196 mM di Mg(OAc)₂ e 1,5 M di KOAc) sul lato della provetta contenente il pellet di RT-RPA liofilizzato e premiscelato (dalla sezione 1).
   NOTA: Un trucco per aggiungere la miscela di Mg(OAc)₂ e KOAc: la goccia deve essere posizionata a circa 1 mL di volume della provetta. In questo caso, la goccia sarà chiaramente visibile e non è probabile che vada persa a causa della chiusura del tubo o di altre azioni. L'amplificazione inizierà dopo aver girato verso il basso per raccogliere la goccia sul fondo del tubo. Quando si elabora più di una reazione alla volta, l'amplificazione può essere avviata contemporaneamente.
3. Risospendere il pellet RT-RPA aggiungendo 12,4 μl del campione di RNA (o dei campioni di controllo).
   NOTA: La sequenza di addizione è campione negativo/controllo negativo, RNA/DNA da testare, campione positivo/controllo positivo.
4. Per avviare la reazione RT-RPA, far girare brevemente la soluzione aggiunta dai passaggi 3.2 e 3.3 utilizzando una minicentrifuga spin-down a temperatura ambiente per 3 s.
5. Mescolare picchiettando con cura il tubo e poi fare un altro breve spin-down per 3 s.
6. Incubare la reazione a 42 °C per 60 minuti ponendola in un blocco riscaldante preriscaldato o in un incubatore ad agitazione termica.
7. Al termine della reazione, estrarre i tubi di reazione e metterli sul ghiaccio prima di procedere alla fase di rilevamento CRISPR-Cas (sezione 4).
   NOTA: Il prodotto amplificato con RPA può essere utilizzato immediatamente nella reazione di rilevamento o può essere conservato a 4 °C per diversi giorni o a -20 °C per diversi mesi.

4. Rilevamento dell'acido nucleico CRISPR-Cas13

1. Accendere un lettore di micropiastre a fluorescenza, impostare e preriscaldare la temperatura di riscaldamento a 37 °C e selezionare il programma mostrato nella Tabella 2.
2. Posizionare una piastra a 384 pozzetti sul ghiaccio.
3. Risospendere la reazione di rivelazione premiscelata CRISPR-Cas liofilizzata (dalla sezione 2) aggiungendo 17 μl di soluzione di cloruro di magnesio 8 mM. Mescolare picchiettando con cura il tubo; Quindi girare brevemente per 3 s e posizionare il tubo sul ghiaccio.
4. Trasferire 18 μl della miscela di reazione risospesa in ciascun pozzetto della piastra preraffreddata a 384 pozzetti su ghiaccio.
5. Aggiungere 2 μl del prodotto RPA preparato nella sezione 3 a ciascun pozzetto di reazione.
6. Rimuovere la piastra dal ghiaccio, inserirla rapidamente in un lettore di micropiastre a fluorescenza preriscaldato e premere start.
   NOTA: Una piastra da 384 pozzetti è stata posizionata sul ghiaccio per consentire la sincronizzazione dell'inizio della reazione quando la piastra da 384 pozzetti viene trasferita in un lettore di micropiastre a fluorescenza preriscaldato.

Risultati

Evidenziamo la cinetica della generazione del segnale di fluorescenza FAM dal rilevamento combinato dei geni s e n di SARS-CoV-2 e il modo in cui le informazioni sono state utilizzate per determinare le condizioni ottimali per le formulazioni di reazioni premiscelate liofilizzate. In tutti i casi, abbiamo incluso campioni con valori di C_t ben al di sotto del limite di rilevamento determinato (LoD) (C_t ~31-33), così come quelli con C_t al LoD (C_t ~35-37)⁷, per consentire la differenziazione dei protocolli con una migliore sensibilità.

Per l'RT-RPA liofilizzato e premiscelato, abbiamo scoperto che l'inclusione di KOAc nella reazione premiscelata ha influenzato negativamente la sensibilità della reazione (Figura 2A). Abbiamo quindi omesso KOAc dalla reazione premiscelata e l'abbiamo aggiunto con l'iniziatore di reazione, Mg(OAc)₂, una volta aggiunto il campione di RNA. Abbiamo anche utilizzato saggi simili per determinare la concentrazione ottimale di un trealosio crioprotettore (Figura 2B) e gli effetti della triglicina⁷ nella reazione RT-RPA liofilizzata (Figura 2C). Pertanto, le reazioni RT-RPA liofilizzate e premiscelate ottimali sono state preparate con trealosio al 6%, senza KOAc (ma è stato aggiunto successivamente dopo il campione di RNA) e integrate con triglicina, come descritto nella sezione 1 del protocollo.

Figura 2: Ottimizzazione delle reazioni RT-RPA liofilizzate e premiscelate. La reazione RT-RPA è stata preparata utilizzando primer che hanno come bersaglio il gene n di SAR-CoV-2. Il Mg(OAc)₂ è stato escluso da tutte le reazioni premiscelate. Sono stati valutati gli effetti di (A) KOAc, (B) trealosio e (C) triglicina aggiunti alle reazioni premiscelate. Il monitoraggio della reazione tramite fluorescenza FAM generata è stato effettuato utilizzando un termociclatore in tempo reale o un lettore di micropiastre a fluorescenza. Vengono mostrati i dati individuali delle misurazioni in triplice copia. Abbreviazioni: RT = trascrizione inversa; RPA = amplificazione della polimerasi ricombinasi; CRISPR = brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate; Cas = proteina associata a CRISPR; SAR-CoV-2 = Sindrome respiratoria acuta grave Coronavirus 2; C_t = soglia del ciclo; FAM = carbossifluoresceina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per le reazioni liofilizzate e premiscelate a base di Cas13a, abbiamo verificato l'importanza di avere il crioprotettore corretto: il 6% di trealosio o il 2% di saccarosio¹⁹ hanno funzionato bene, mentre un saccarosio inferiore all'1% o al 5% p/v PEG20000 non ha preservato l'efficienza della reazione dopo la liofilizzazione (Figura 3). MgCl₂ è stato omesso da tutte le reazioni ed è stato aggiunto nella fase di reidratazione. La reazione di rilevamento ottimale basata su Cas13 liofilizzata è stata preparata con trealosio al 6%, come mostrato nella sezione 2 del protocollo.

Figura 3: Ottimizzazione delle reazioni di rilevamento basate su Cas13 liofilizzate e premiscelate. La reazione di rilevamento è stata eseguita a 37 °C utilizzando il prodotto RPA del gene SARS-CoV-2 n . I test sono stati eseguiti prima e dopo la liofilizzazione. MgCl₂ è stato escluso da tutte le reazioni premiscelate. Sono state valutate le capacità di (A) trealosio, (B) PEG20000 e (C) saccarosio nel preservare l'efficienza della reazione dopo la liofilizzazione. Il monitoraggio della reazione tramite fluorescenza FAM generata è stato effettuato utilizzando un termociclatore in tempo reale. Vengono mostrati i dati individuali delle misurazioni in triplicato per le condizioni "dopo la liofilizzazione" e una replica delle condizioni "prima della liofilizzazione". La Figura 3A, B è stata presa da Patchsung et ^al.7. Abbreviazioni: RPA = amplificazione della polimerasi ricombinasi; SAR-CoV-2 = sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2; FAM = carbossifluoresceina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I reagenti liofilizzati e premiscelati per le reazioni a base di RT-RPA e Cas13 sono stabili a -20 °C per almeno 8 mesi [Figura 4].

Figura 4: Prove di stabilità di reagenti RPA liofilizzati, premiscelati e CRISPR-Cas13a a -20 °C. Test di stabilità a (A) 30 giorni, (B) 45 giorni, (C) 3 mesi, (D) 5 mesi, (E) 8 mesi. Vengono mostrati i dati individuali delle misurazioni in triplice copia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il LoD delle reazioni liofilizzate basate su RT-RPA e Cas13 per il rilevamento dei geni s e n di SARS-CoV-2 è mostrato nella Figura 5. La cinetica di generazione del segnale può essere migliorata con il rilevamento di un doppio gene rispetto a quando viene rilevato un solo gene.

Figura 5: Sensibilità analitica della rilevazione di un singolo gene rispetto a un gene doppio. (A) Il LoD della rilevazione liofilizzata di RT-RPA a singolo plex e di Cas mirata al gene s di SAR-CoV-2. (B) Il LoD della RT-RPA a plex singolo liofilizzato e la rilevazione basata su Cas mirata al gene n di SAR-CoV-2. (C) Il LoD della RT-RPA multiplex liofilizzata e del rilevamento basato su doppio Cas mirato ai geni s e n . Il LoD è stato determinato utilizzando RNA SARS-CoV-2 diluiti in serie, i cui valori di C_t sono stati determinati utilizzando un test RT-qPCR mirato al gene n . Vengono mostrati i dati individuali di 3-6 misurazioni replicate. Abbreviazioni: LoD = limite di rilevabilità; RT = trascrizione inversa; RPA = amplificazione della polimerasi ricombinasi; CRISPR = brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate; Cas = proteina associata a CRISPR; SAR-CoV-2 = Sindrome respiratoria acuta grave Coronavirus 2; C_t = soglia del ciclo; qPCR = reazione quantitativa della polimerasi a catena. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Oltre al rilevamento del virus, presentiamo un prototipo di uno strumento di genotipizzazione POC basato sulla diagnostica CRISPR, per aiutare a identificare le specie di serpenti velenosi endemiche della Thailandia (Figura 6). Un'identificazione più rapida e accurata delle specie di serpenti attraverso campioni di DNA raccolti da ferite da morso può aiutare nella pronta somministrazione di antidoti, migliorando le possibilità di sopravvivenza del paziente. Abbiamo preso di mira le regioni all'interno del gene del citocromo b mitocondriale (cytb) di otto specie di serpenti, tra cui Ophiophagus hannah (cobra reale) (Figura 6A) e abbiamo dimostrato che il rilevamento di surrogati di DNA sintetico del gene cytb di O. hannah può raggiungere il livello di sensibilità attomolare (Figura 6B, C).

Figura 6: Un prototipo per il rilevamento basato su CRISPR per identificare le specie di serpenti dall'avvelenamento da morso di serpente. (A) Primer RPA e design di crRNA LwaCas13a per il rilevamento del gene cytb di Ophiophagus hannah. Il promotore T7 (sporgenza T7) è stato posizionato all'estremità 5' dell'innesco RPA in avanti. (B) Cinetica della generazione del segnale FAM in 60 minuti e (C) fluorescenza FAM endpoint dal rilevamento mediato da LwaCas13a di input sintetici di dsDNA corrispondenti ai segmenti del gene cytb di O. hannah. Sono state utilizzate diverse concentrazioni di input (0, ^10-9, ^10-12, ^10-15 e ^10-18 M). I dati sono medi ± s.d. da misure in triplice copia. Abbreviazioni: RPA = amplificazione della polimerasi ricombinasi; CRISPR = brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate; Cas = proteina associata a CRISPR; FAM = carbossifluoresceina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Liofilizzazione di reagenti di rivelazione premiscelati CRISPR-Cas13a
Passo	Velocità di rampa	Temperatura scaffale	Tempo (hh:mm)	Vuoto
	(°C/min)	(°C)		(mbar)
Congelare 1	3	-30	spento	-
Secco 1	3	-30	spento	0
Secco 2	3	4	01:00	0
Secco 3	3	20	∞	0

Tabella 1: Impostazioni del liofilizzatore dei reagenti di rilevamento RT-RPA e CRISPR-Cas13a premiscelati. Abbreviazioni: RT = trascrizione inversa; RPA = amplificazione della polimerasi ricombinasi; CRISPR = brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate; Cas = proteina associata a CRISPR.

Parametro		Impostazione
Temperatura		37 °C
Ciclo cinetico	Durata	02:00 (mm:ss)
	Intervallo di tempo	02:30 (mm:ss)
Tremante	Durata	1 secondo
	Modo	Lineare
	Ampiezza	1 millimetro
Intensità della fluorescenza	Lunghezza d'onda di eccitazione	488 nm
	Lunghezza d'onda di emissione	520 nm
	Modo	In alto
	Posizione Z	24470
	Guadagnare	71
	Tempo di integrazione	20 μs
	Numero di lampeggi	25

Tabella 2: Programma di lettura di micropiastre a fluorescenza per la rilevazione di acidi nucleici.

Discussione

Ci sono passaggi critici in questo protocollo. Per la segregazione dell'area, si consiglia di utilizzare spazi separati per l'estrazione dell'acido nucleico, la preparazione del mastermix (area di preamplificazione), l'aggiunta del campione e il rilevamento dell'amplicone (area di post-amplificazione). Ogni area deve essere impostata utilizzando un set separato di strumenti e attrezzature. Non portare gli strumenti da un'area all'altra, in particolare dall'area di post amplificazione all'area di preamplificazione. La pulizia delle aree di lavoro è necessaria: si dovrebbero pulire le aree di lavoro, le pipette, i vortex e i marcatori permanenti con RNasi/soluzione di decontaminazione DNasi/Clorox al 3% seguita da etanolo al 70% o acqua deionizzata autoclavata. È necessario lavare gli strumenti di laboratorio di base e le parti rimovibili degli strumenti, come i rack di plastica per provette da 1,5 ml e l'adattatore del rotore di una minicentrifuga. L'acqua priva di nucleasi viene utilizzata come componente di controllo negativo e di reazione, ed è quindi un reagente sensibile che può essere contaminato se non maneggiato con cura. Quindi, si consiglia di fare piccole aliquote d'acqua da utilizzare una sola volta.

Eseguire sempre una reazione di controllo negativa utilizzando i primer del saggio per verificare la presenza di contaminazione. Inoltre, per evitare problemi di contaminazione, si consiglia di preparare la reazione di controllo negativo aggiungendo acqua priva di nucleasi nell'area di preamplificazione anziché nella sala di aggiunta del campione. La miscela di acetato di magnesio e acetato di potassio deve essere aliquotata in piccoli volumi (~20 μL/provetta) che vengono utilizzati una sola volta per evitare la contaminazione del reagente con ampliconi di carryover. Quando si aggiunge la miscela di acetato di magnesio e potassio alle reazioni RPA premiscelate liofilizzate, si consiglia di cambiare il puntale della pipetta ogni volta. Per il flusso di lavoro degli esperimenti, mantenere il flusso di lavoro unidirezionale, dagli esperimenti di preamplificazione a quelli di post-amplificazione. Passa da spazi di lavoro più "puliti" (pre amplificazione) a quelli più "sporchi" (post amplificazione).

Per le modifiche e la risoluzione dei problemi del metodo per evitare la contaminazione da carryover degli ampliconi, si consiglia di separare spazialmente le tre fasi principali dell'esperimento: preparazione della reazione RPA; aggiunta di campioni; e le fasi di amplificazione e rilevamento. Il mastermix deve essere preparato in un'area del laboratorio priva di modelli. Durante gli spogliatoi, cambiare anche guanti e camici da laboratorio. Lavorare in modo unidirezionale dalla pre alla post amplificazione. Evitare di utilizzare la stessa pipetta per passaggi diversi. È meglio se sono predisposti diversi set di pipette per questi passaggi: preparazione di mastermix; aggiunta del DNA/RNA stampo; e il trasferimento del prodotto amplificato. Utilizzare puntali filtrati, cercare di prevenire il più possibile la formazione di aerosol ed evitare di toccare l'interno del tubo quando lo si apre. Se gli esperimenti di amplificazione mostrano contaminazione, tutti i reagenti devono essere sostituiti. Se possibile, recati in un altro laboratorio con reagenti freschi e controlla se la contaminazione persiste. A parte i reagenti, non portare nient'altro, comprese le pipette. Provare a sterilizzare in autoclave le pipette se sono autoclavabili.

Per migliorare la velocità di amplificazione (ottimizzazione del saggio), consultare innanzitutto le istruzioni del produttore, come il manuale RPA di TwistDx, per garantire un design ottimale. Successivamente, prova ottimizzazioni empiriche delle reazioni come l'aggiunta di additivi di reazione noti per aumentare le reazioni RPA e CRISPR⁷; aumento dei tempi di reazione (es. tempo di reazione RPA fino a 60 min); o variando le sequenze e le concentrazioni dei primer. Si consiglia inoltre di aggiungere il maggior volume di campione possibile; L'uso di reagenti liofilizzati consente di aggiungere un volume di campione maggiore. Per ridurre la fluorescenza di fondo, si può eseguire una fase di inattivazione del calore (75 °C per 5 minuti) dopo che l'RPA è terminata, prima di passare al rilevamento, o ottimizzare la concentrazione del reporter. Troppi giornalisti daranno un background più alto. Inoltre, l'aggiunta di inibitori della RNasi aiuta a prevenire la degradazione indipendente da Cas del reporter.

Oltre a ottimizzare le condizioni di reazione basate su (RT)-RPA e CRISPR e le relative procedure di manipolazione, è necessario assicurarsi che i reagenti utilizzati siano di buona qualità e che la fase di estrazione dell'acido nucleico che precede tutte le reazioni abbia successo. I reagenti liofilizzati offrono un'elevata sensibilità di rilevamento, sono portatili, consentono il test POC e possono essere applicati a diversi campioni clinici. Inoltre, l'RPA liofilizzato (RT) può essere reidratato istantaneamente aggiungendo l'estratto di acido nucleico da campioni clinici. Uno studio precedente ha mostrato una maggiore sensibilità quando si immette un volume maggiore di acido nucleico in ingresso senza volume limitato, aumentando efficacemente la quantità totale di acido nucleico target.

La diagnostica basata su CRISPR è stata adattata per rilevare gli agenti patogeni raccogliendo campioni clinici come tamponi nasofaringei e faringei, urine e siero ^7,8,11. È stato anche applicato per distinguere le varianti a singolo nucleotide, identificare i geni di resistenza agli antibiotici negli organismi resistenti agli antimicrobici e rilevare le mutazioni associate al cancro. L'utilità della tecnologia può essere maggiore nelle applicazioni sul campo, dove le reazioni biochimiche ingegnerizzate per l'amplificazione isotermica e il rilevamento basato su CRISPR possono essere combinate con dispositivi e letture pronte per il campo come un fluorimetro portatile o strisce a flusso laterale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiale
Soluzione di betaina	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
Acqua trattata con DEPC	Invitrogen	AM9915G
Ditiotreitolo (DTT)	Merck	3870-25GM
EpiScript trascrittasi inversa	Lucigen	ERT12925K
Gly-Gly-Gly& nbsp;	Sigma-Aldrich	SIA-50239-1G
LwaCas13a	Produzione interna		Nome ceppo: Leptotrichia wadei, Abbreviazione: Lwa, Nome della proteina: LwaCas13a
Soluzione di cloruro di magnesio, 1M	Sigma-Aldrich	M1028-10X1ML
NxGenT7 RNA polimerasi	Lucigen	30223-2
Poli(glicole etilenico)	Sigma-Aldrich	81300-1KG
Soluzione di acetato di potassio, 5M	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
Soluzione di riobnucleotide Miscela	NEB	N0466L
RNasi H	NEB	M0297L
Saccarosio	TCI	TCI-S0111-500G
Trealosio Diidrato	Sigma-Aldrich	SIA-90210-50G
Soluzione di Trizma cloridrato, 1M, pH 7,4	Sigma-Aldrich	T2194-100ML
TwistAmp Kit di base	TwistDx	TABAS03KIT
Equipment
BluPAD Transilluminatore a luce blu/bianca Dual LED	Bio-Helix	BP001CU
Dry Bath Dual Block	ELITE	4-2-EL-02-220	Modello: EL-02
Micropiastra a fluorescenza lettore	Tecan	30050303	Modello: Infinite 200 Pro
Liofilizzatore	LABCONCO	794001030	FreeZone Triad Liofilizzatore da banco
Greiner	a 384 pozzetti	GDE0784076	F-Bottom, piccolo volume, Hibase, Med. Binding, Nero
Termociclatore in tempo reale (CFX Connect Real-Time PCR System)	Bio-Rad	185-5201	Modello: CFX Connect Optics Module
Oligonucleotide
s-gene forward RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA
s-gene reverse RPA primer	IDT		TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG
n-gene forward RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG
primer RPA inverso n-gene	IDT		CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA per il gene s	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA per il gene n	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAAAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ reporter	IDT		56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA primer	IDT		AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah	IDT		GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC