Qui, presentiamo un protocollo che combina l'elettroporazione e la denervazione in vivo del muscolo elevatore cranico auris longus (LAL). Questa procedura consente lo studio del potenziale ruolo delle proteine di derivazione muscolare nella rigenerazione della sinapsi neuromuscolare.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Elettroporazione combinata in vivo e reinnervazione a breve termine del muscolo scheletrico elevatore cranico Auris Longus
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La giunzione neuromuscolare (NMJ) è la sinapsi periferica che controlla la contrazione delle fibre muscolari scheletriche per consentire il movimento coordinato di molti organismi. Al NMJ, un terminale dell'assone motorio presinaptico entra in contatto con un dominio postsinaptico muscolare ed è coperto da cellule di Schwann terminali. L'integrità e la funzione dell'NMJ sono compromesse in diverse condizioni, tra cui l'invecchiamento, le malattie neuromuscolari e le lesioni traumatiche. Per analizzare il potenziale contributo delle proteine di derivazione muscolare al mantenimento e alla rigenerazione della NMJ, è stata combinata una strategia di trasferimento genico in vivo con la denervazione del muscolo elevatore cranico auris longus (LAL) dopo una lesione meccanica del nervo. Risultati precedenti hanno dimostrato che l'espressione forzata delle proteine fluorescenti di controllo non altera l'organizzazione o la neurotrasmissione dell'NMJ. Questa procedura ha lo scopo di descrivere un metodo dettagliato di elettroporazione in vivo del muscolo LAL seguita da transezione o schiacciamento del ramo specifico del nervo facciale che innerva i muscoli cranici, portando rispettivamente alla denervazione e alla reinnervazione NMJ. La combinazione di queste strategie sperimentali nel muscolo LAL conveniente costituisce un metodo efficiente per studiare il potenziale contributo della sovraespressione o del silenziamento delle proteine muscolari nel contesto della reinnervazione NMJ a breve termine.
Introduzione
La giunzione neuromuscolare (NMJ) è la sinapsi periferica che controlla la contrazione muscolare e, indirettamente, il movimento coordinato degli organismi1. È formato da un terminale dell'assone motorio presinaptico, un dominio postsinaptico muscolare arricchito in recettori dell'acetilcolina (AChR) e cellule di Schwann terminali non mieliniche che coprono il terminale dell'assone 2,3,4. Dopo denervazione NMJ dovuta a lesione traumatica del nervo periferico, malattia o intervento farmacologico, l'attività muscolare
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono approvate dal Comitato di Bioetica dell'Universidad Austral de Chile, Cile (protocollo n. 503/2023), e hanno seguito le norme imposte dal Comitato di Bioetica dell'Agenzia Nazionale di Ricerca e Sviluppo del Cile (ANID), nonché le linee guida della Direttiva del Consiglio Europeo per la Cura degli Animali da Laboratorio. Il presente studio ha utilizzato topi adulti (3-6 mesi) CF-1 di entrambi i sessi (30-45 g). L'eutanasia è stata realizzata con un'overdose di anestetico inalante seguita da dissanguamento. I reagenti e le attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
L'elevata resa quantica in fluorescenza della proteinatdTomato 20 la rende un tracciante appropriato per l'efficienza dell'elettroporazione. Pertanto, è stata valutata l'espressione della proteina tdTomato nei muscoli LAL mediante elettroporazione in vivo (Figura 1). I muscoli LAL sono stati sezionati 21 giorni dopo l'elettroporazione. Le preparazioni a montatura intera mostrano la sottile banda caudale (cLAL, poligono ciano) del muscolo LAL con le sue due re.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La combinazione di elettroporazione muscolare in vivo e denervazione è un valido approccio sperimentale per studiare una nicchia rigenerativa presso l'NMJ4. Poiché il muscolo LAL è esposto superficialmente, queste procedure combinate possono essere facilmente integrate con la somministrazione di sonde o farmaci che potrebbero influenzare l'espressione o l'attività proteica12. Inoltre, l'elettroporazione dei geni reporter nel muscol.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo l'ambiente altamente collaborativo e stimolante dei membri del NeSt Lab per le utili discussioni e commenti su questo lavoro. Il lavoro presso il NeSt Lab è attualmente finanziato da FONDECYT 1221213. Lo schema nella Figura 1A è stato creato con BioRender.com.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| #5/45 Pinze Dumont | Strumenti di Fine Science | 11251-35 | Sterilizzare prima dell'uso |
| anti 2H3 | DSHB | Diluire 1 : 300 | |
| anti S100 Pronto all'uso | Dako | IR504 | Diluire 1 : 5 |
| anti SV2 | DSHB | Diluire 1 : 50 | |
| Clorexidina gluconato 2% | DifenPharma | ||
| Stereomicroscopio per dissezione a luce fredda | Motic | Model SMZ-171 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Diluire 1 : 100 |
| Dumont #5SF Pinze | Strumenti di Fine Science | 11252-00 | Sterilizzare prima dell'uso |
| Dumont Mini Pinze – Stile 5 | Strumenti di Fine Science | 11200-14 | Sterilizzare prima dell'uso |
| ECM 830 elettroporatore | BTX Harvard Apparecchio | ||
| Elettrodi ad ago in oro | Genetrodes, BTX | 45-0114 | Hamilton diritta da 10 mm |
| Hamilton | 80400 | ||
| Ialuronidasi | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| Macchina per anestesia per inalazione | SciVerma Scientific | M3000 Table Top | |
| Isoflurane | Baxter | 218-082 | |
| Topi Instituto | de Salud Publica - Cile | Topi adulti (3-6 mesi) CF-1, di entrambi i sessi (30-45 g) | |
| Lamette | da barba Schick | ||
| Suture Glicosorb 5/0 | TAGUM | GS0812. J | Filo di acido poliglicolico assorbibile |
| tdPlasmide di pomodoro | Addgene | 54642 | tdPlasmide di pomodoro sotto il controllo del promotore CMV |
| Tramadol cloridrato 5% (Triamcol) | Drag Pharma | ||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | Sterilizzare prima dell'uso |
| WGA Alexa Fluor 488 | Invitrogen | W7024 | Diluire |
| α-BTX Alexa Fluor 488 | Invitrogen | B13422 | Diluire 1 : 500 |
Riferimenti
- Slater, C. R. The functional organization of motor nerve terminals. Prog Neurobiol. 134, 55-103 (2015).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robi....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
