Articolo metodologico

Ottimizzazione del metodo di occlusione dell'arteria cerebrale media Longa per la riperfusione completa

DOI:

10.3791/66720

⸱

22 novembre 2024

 ,  , 
1Department of Histology and Embryology, University of Zagreb School of Medicine, 2Croatian institute for brain research, University of Zagreb School of Medicine

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo presenta una guida passo passo per i ricercatori per eseguire la procedura di occlusione dell'arteria cerebrale media sui topi utilizzando il metodo dell'arteria carotide esterna Longa modificata. Le modifiche presentate in questo articolo mirano ad aumentare l'accuratezza dell'occlusione dell'arteria cerebrale media e a garantire la completa riperfusione.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il modello di occlusione dell'arteria cerebrale media funge da modello animale primario per lo studio dell'ictus ischemico. Nonostante sia utilizzato nella ricerca da oltre tre decenni, la sua standardizzazione rimane inadeguata. Condotta prevalentemente su ratti e topi, la procedura pone sfide a causa della natura più piccola e fragile dei topi. A differenza del metodo dell'arteria carotide comune di Koizumi, l'arteria carotide esterna Longa è l'unico modello di corsa del filamento intraluminale che garantisce la completa riperfusione post-ischemia. Questo aspetto ha un'importanza critica per gli studi che indagano i fenomeni di riperfusione. Le modifiche chirurgiche dimostrate in questo articolo assicurano un flusso sanguigno continuo dall'arteria carotide comune durante tutta la fase ischemica e dopo l'insorgenza della riperfusione. L'obiettivo di queste modifiche è quello di occludere selettivamente l'arteria cerebrale media mantenendo la perfusione ininterrotta nei rami prossimali all'arteria cerebrale media durante il periodo di ischemia. Inoltre, l'insorgenza della riperfusione è improvvisa e può essere controllata con precisione, modellando così la trombectomia endovascolare in medicina umana in modo più accurato. Il nostro obiettivo nel presentare questo articolo video completo è quello di facilitare la formazione di nuovi chirurghi e promuovere la standardizzazione delle procedure chirurgiche all'interno della comunità scientifica.

Introduzione

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L'ictus è la seconda causa di morte e la terza causa di morte e disabilità combinate1. Per sua causa, l'ictus può essere ischemico o emorragico, con l'ictus ischemico che è significativamente più diffuso nella pratica clinica. L'ictus ischemico deriva da un blocco in un'arteria che fornisce sangue al tessuto cerebrale, portando a ischemia, morte cellulare e infiammazione. Dall'avvento delle terapie di riperfusione come la trombolisi e la trombectomia meccanica, sono stati fatti grandi progressi nel trattamento dell'ictus. Tuttavia, tutte le terapie di riperfusione comportano il rischio di esacerbare le condizioni del paziente causando quello che viene comunemente definito danno da riperfusione2. L'esatto meccanismo del danno da riperfusione rimane poco chiaro e spetta agli studi preclinici identificare le potenziali cause e le misure preventive. A tal fine, lo sviluppo di un modello animale pertinente per il danno da riperfusione che segue l'ictus ischemico diventa cruciale.

L'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) è il modello animale più comunemente usato per lo studio dell'ictus ischemico. È condotto prevalentemente nei roditori e finora ha molte varianti diverse descritte nella letteratura scientifica 3,4. I due tipi principali, Koizumi e Longa, noti come varianti dell'arteria carotide comune (CCA) e dell'arteria carotide esterna (ECA), differiscono tecnicamente per il sito dell'arteriotomia per l'inserimento del filamento 5,6. Nel nostro recente articolo, attraverso il monitoraggio in vivo della perfusione vascolare, abbiamo dimostrato che solo il metodo Longa può essere veramente considerato un modello di ischemia/riperfusione cerebrale7. La procedura prevede l'inserimento del filamento nell'ECA, l'avanzamento attraverso l'ICA e il fissaggio al punto di ramificazione dell'arteria cerebrale media (MCA) per indurre l'ischemia del tessuto cerebrale. Dopo un periodo predeterminato di ischemia, il ritiro del filamento consente la riperfusione, simulando un'ischemia cerebrale transitoria. Dopo l'insorgenza dell'ictus, la variabile di esito primaria utilizzata nella ricerca è il più delle volte il volume della lesione infartuata, che può essere misurato utilizzando l'istologia ex vivo o le scansioni cerebrali in vivo. Le sfide nei modelli MCAO ruotano attorno alla bassa riproducibilità attribuita a varianze intervarianti, interoperatori e intersoggetti, con quest'ultima che pone una limitazione significativa nella ricerca preclinica sull'ictus4.

Inoltre, le regioni infartuate che seguono MCAO nei roditori sono massicce rispetto alle dimensioni del cervello del roditore. Inoltre, le regioni posteriori del cervello dell'ippocampo vengono spesso reclutate nel volume dell'infarto, nonostante tali regioni dipendano principalmente dal flusso sanguigno dall'arteria cerebrale posteriore (PCA) e non dall'MCA8. Come in entrambi i metodi di Koizumi e Longa descritti in letteratura, il CCA viene mantenuto legato durante il periodo di ischemia a causa dell'incompleta pervietà del circolo di Willis nei topi, portando all'induzione dell'ischemia in una regione molto più ampia del previsto 5,6,9. Anche nei metodi in cui il CCA viene riaperto o riparato dopo il periodo di ischemia, i consueti 30-60 minuti di ischemia provocano un danno tissutale irreversibile nelle regioni non MCA10. Inoltre, contrariamente alle aspettative, ricerche precedenti hanno dimostrato che la lunghezza del rivestimento di silicone di un filamento non ha alcun impatto sulla dimensione della lesione11. Tuttavia, la scelta della lunghezza del rivestimento in silicone del filamento è stata affrontata esclusivamente nei modelli con CCA legato durante il periodo di occlusione.

L'obiettivo di questo metodo era quello di modificare il metodo Longa MCAO nei topi per consentire il flusso sanguigno ininterrotto dal CCA durante il periodo di ischemia, aumentando così la selettività di MCAO, oltre a garantire la completa riperfusione della regione infartuata dopo la procedura. Queste modifiche sarebbero di grande beneficio per gli studi longitudinali che ricercano il danno da ischemia-riperfusione nei topi, abbassando il tasso di mortalità e riducendo la varianza intersoggetto.

Protocollo

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Tutte le procedure e le procedure di gestione degli animali sono state approvate dal Comitato etico per le licenze della Scuola di medicina dell'Università di Zagabria e dal Comitato etico per la protezione degli animali utilizzati per scopi scientifici del Ministero dell'Agricoltura della Repubblica di Croazia. Le procedure sperimentali sono state condotte secondo la legge croata sulla protezione degli animali (NN 102/17, 32/19), le modifiche alla legge sulla protezione degli animali (NN 37/13) e le linee guida sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici (NN 55/13) che sono in linea con la Guida europea per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (direttiva 2010/63/UE).

1. Preparazione dell'animale e del sito chirurgico

  1. Posizionare l'animale in una scatola knock-out e indurre l'anestesia utilizzando il 5% in volume di isoflurano in una miscela di ossigeno/azoto (rapporto 1:2).
  2. Dopo aver ispezionato visivamente lo stato di coscienza e la frequenza respiratoria dell'animale, portarlo su una bilancia da laboratorio e pesarlo.
  3. Controllare il riflesso pizzicando la pelle interdigitale di un arto inferiore per garantire una corretta profondità dell'anestesia.
  4. Posizionare l'animale sul tavolo operatorio riscaldato e portare il naso nella maschera per anestesia. Impostare la temperatura iniziale del tavolo operatorio a 36 °C e regolarla per mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37 °C (misurata tramite una sonda rettale introdotta nei passaggi successivi). Durante tutte le fasi successive, regolare la frazione di volume dell'isoflurano per mantenere la frequenza respiratoria dell'animale a 100 respiri/min.
    NOTA: Tutte le superfici e i materiali a diretto contatto con l'animale devono essere disinfettati accuratamente prima della procedura.
  5. Applicare un unguento per gli occhi sugli occhi dell'animale per proteggerli dalla disidratazione e dal gas isoflurano.
  6. Gira l'animale sulla schiena e allunga il collo posizionando sotto di esso un piccolo cuscino fatto di nastro chirurgico.
  7. Fissare gli arti dell'animale in posizione utilizzando del nastro chirurgico. Fare attenzione a non estendere troppo gli arti anteriori per non causare inavvertitamente la lussazione dell'articolazione della spalla.
  8. Lubrificare la sonda rettale con vaselina e inserirla nel retto per la misurazione continua della temperatura corporea. Fissare la sonda in posizione insieme alla coda utilizzando del nastro chirurgico.
  9. Applicare un'iniezione preoperatoria di soluzione fisiologica e buprenorfina (0,5 mg/kg) per via intraperitoneale per mantenere l'animale ben idratato e sotto analgesia durante la procedura.
  10. Radere il pelo dell'animale nella regione del collo utilizzando un tosatrice per animali senza fili. Raccogli tutta la pelliccia rasata usando pezzi di nastro chirurgico. Inoltre, radere la regione con un rasoio per renderla completamente priva di pelo.
  11. Scegli un filamento MCAO in base al peso e/o all'età dell'animale misurato. Tiratelo fuori dal suo contenitore e mettetelo in una capsula di Petri in un luogo visibile. Metti una goccia di soluzione salina sulla parte in silicone del filamento per mantenerlo pulito e privo di polvere.
    NOTA: Lo spessore del rivestimento in silicone del filamento deve essere scelto in base alle raccomandazioni ufficiali del produttore nel caso di un topo di 12-16 settimane. Inoltre, la lunghezza del rivestimento in silicone deve essere attentamente pianificata in anticipo, a seconda delle dimensioni dell'area di irrigazione che deve essere occlusa (vedi Discussione).
  12. Posizionare un telo chirurgico pulito sul tavolo operatorio.
  13. Applicare una goccia di Betadine sulla pelle rasata dell'animale. Usa un batuffolo di cotone per strofinare il disinfettante sulla pelle in modo circolare dall'interno verso l'esterno. Successivamente, fai lo stesso con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo. Ripeti questo passaggio 3 volte con un paio di batuffoli di cotone sterili freschi per ogni ripetizione.
  14. Applicare una piccola quantità di gel di lidocaina sulla regione disinfettata del futuro sito di incisione per l'analgesia locale della ferita.

2. Chirurgia di induzione dell'ischemia

  1. Praticare una prima incisione sulla pelle disinfettata utilizzando un bisturi. Mantenere al minimo il numero di colpi di incisione cutanea per facilitare la guarigione della ferita chirurgica.
    NOTA: Tutti gli strumenti devono essere stati precedentemente sterilizzati. Il lettore dovrebbe fare riferimento alle loro linee guida istituzionali per l'uso di guanti sterili o chirurgici.
  2. Utilizzando una pinza di tipo 7 e 5, strappare la fascia superficiale e staccare le ghiandole salivari dal tessuto sottostante.
    NOTA: Avanzare sempre con la pinza chiusa ed estenderla mentre ci si allontana per spingere via il tessuto. In questo modo, gli spazi anatomici possono essere attraversati con un trauma tissutale minimo.
  3. Posizionare l'avvolgicavo nella sua posizione iniziale assicurandosi che le pressacavi salivari non interferiscano con i passaggi successivi.
  4. Rimuovere la fascia profonda del collo utilizzando una pinza di tipo 7 e staccare i muscoli sternocleidomastoideo dalla regione carotide per riposizionare il divaricatore.
  5. Riposizionare il divaricatore in modo che raggiunga i muscoli sternocleidomastoidei per consentire l'accesso alla regione carotidea.
  6. Resecare il muscolo omoioideo per consentire una visione chiara e un approccio più facile alla regione carotidea.
  7. Libera l'arteria carotide e i suoi rami dalla vena carotide e dal nervo vago, che sono tenuti insieme nella fascia carotidea.
    NOTA: Questa fascia deve essere rimossa con cura per evitare di ferire il nervo vago o causare sanguinamenti significativi.
    1. Pizzica la fascia carotidea sul lato laterale della triade carotidea e tirala delicatamente lateralmente per identificare visivamente l'arteria, il nervo, la vena e tutti i rami dei vasi sanguigni circostanti.
    2. Mentre si tira lateralmente la fascia, utilizzando una pinza di tipo 5, separare il CCA dal nervo e dalla vena adiacenti fino al punto di ramificazione e alla vena tiroidea superiore, che attraversa il CCA.
    3. Staccare completamente la parte inferiore del CCA dal tessuto sottostante e dalla fascia, utilizzando una pinza curva di tipo 7, assicurandosi che sia pronta per il serraggio nei passaggi successivi.
    4. Procedendo cranialmente nella regione al di sopra del punto di ramificazione CCA, strappare la fascia carotide usando due pinze.
    5. Allo stesso modo, tirare l'estremità libera della fascia carotidea medialmente e lateralmente per staccare con precisione l'ECA e l'arteria carotide interna (ICA) rispettivamente dalla fascia e dal tessuto circostante.
    6. Liberare l'ECA e l'ICA dal tessuto sottostante utilizzando una pinza curva di tipo 7.
  8. Con il CCA accuratamente preparato con i suoi due rispettivi rami, sollevare l'ECA utilizzando una pinza curva di tipo 7 e bloccarla con una pinza a chiusura automatica di tipo N0.
  9. Abbassare con cautela la pinza a chiusura automatica di tipo N0 sul tavolo operatorio.
    NOTA: Per riposizionare il punto di serraggio dell'ECA, a volte è necessario rilasciare leggermente l'impugnatura e spingere caudalmente il punto di diramazione dell'ECA. A questo punto, è importante assicurarsi che rimanga più di 1 mm di ECA tra il bloccaggio ECA e il punto di diramazione.
  10. Con l'ECA bloccato e tenuto saldamente con una pinzetta di tipo N0, introdurre due fili di seta intrecciati dietro l'ECA.
    NOTA: Il filo cranico costituirà il nodo di legatura e deve essere posizionato cranialmente dal sito di serraggio.
  11. Lega completamente il filo cranico, poiché è permanente, e taglia via il filo in eccesso usando le forbici.
  12. Legare il filo caudale in un nodo di sicurezza allentato.
    NOTA: Deve essere posizionato vicino al punto di diramazione ECA e tenuto libero per il passaggio del filamento MCAO.
  13. Utilizzando microclip vascolari, bloccare il CCA e l'ICA per evitare sanguinamenti dopo l'arteriotomia.
    NOTA: È fondamentale assicurarsi che la microclip applicata al CCA abbia una presa sufficientemente forte poiché il CCA è un'arteria pulsante ad alto rendimento e la mancata osservanza di questa precauzione può provocare un'abbondante emorragia e la morte dell'animale nelle fasi successive.
  14. Usando le forbici a micro-molla, esegui una piccola arteriotomia proprio sotto il sito di clampaggio dell'ECA.
    NOTA: L'arteriotomia deve essere abbastanza grande da consentire l'ingresso della parte in silicone del filamento, ma non più grande della metà della circonferenza ECA per non compromettere la tensione mantenuta dalla pinza di tipo N0.
  15. Con un angolo corrispondente a quello dell'ECA, inserire il filamento nel sito dell'arteriotomia in direzione prossimale al CCA, passando attraverso il nodo di sicurezza allentato nel sito di ramificazione dell'ECA e infilandosi nel lume del CCA con il filamento.
  16. Stringere il nodo di sicurezza attorno alla parte in silicone del filamento.
    NOTA: A questo punto è necessaria molta attenzione poiché il filamento tende a scivolare fuori dall'ECA a metà dell'ultima manovra e rimetterlo in quel punto è molto difficile.
  17. Aprire con cautela la micro clip ICA e rimuoverla.
  18. Con il filamento parzialmente inserito nell'ECA e fissato, eseguire un'arteriotomia completa liberando così il moncone ECA con il filamento MCAO all'interno. A questo punto sganciare la pinza a chiusura automatica di tipo N0 e rimuoverla.
  19. Con un set di pinzette di tipo 5, pizzicare con decisione il moncone ECA e sollevarlo leggermente. Tenendo il filamento parzialmente inserito con un'altra pinza, abbassare e tirare delicatamente il moncone ECA per orientare l'estremità interna del filamento verso l'ICA. Non pizzicare mai la parte in silicone del filamento.
  20. Con la pinza che tiene il filamento, fai avanzare lentamente il filamento attraverso l'ICA verso il cerchio di Wills.
    NOTA: Il primo punto di diramazione dell'ICA è anche l'unico in cui l'operatore può perdere il punto di diramazione MCA desiderato. Pertanto, è necessario un leggero angolo laterale di avanzamento per guidare il filamento verso il punto di ramificazione MCA. Con il leggero angolo laterale di avanzamento, il filamento si curva lontano dall'arteria pterigopalatina (PPA) e rende più probabile che l'estremità che avanza entri nel cerchio di Willis (Figura 1).

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Figura 1: Un'illustrazione dell'avanzamento del filamento di occlusione dell'arteria cerebrale media oltre il punto di ramificazione dell'arteria pterigopalatina. Il corretto avanzamento del filamento (a sinistra) si ottiene orientando il filamento MCAO in modo tale che si arretra contro la parete laterale dell'ICA e si curva lontano dal punto di ramificazione del PPA. In caso contrario (a destra) il filamento può entrare nel PPA e non causare ictus. In quest'ultimo caso, il filamento non sarà in grado di avanzare quanto dovrebbe e il chirurgo dovrebbe ritirare il filamento fino a quando la sua estremità non diventa visibile nel punto di ramificazione ICA e ricominciare ad avanzare il filamento. Le arterie di colore verde rappresentano le arterie comunicanti posteriori (PcomA), per lo più non pervie nei topi. Creato con BioRender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Far avanzare lentamente il filamento MCAO attraverso il cerchio di Willis fino a quando non si avverte un improvviso aumento della resistenza.
    NOTA: A questo punto, è importante osservare la lunghezza residua del filamento. Il filamento dovrebbe procedere senza sforzo ad almeno 7 mm dal punto di ramificazione ICA in un topo adulto.
  2. Stringere il nodo di sicurezza per assicurarsi che il filamento non venga spostato durante l'ischemia.
  3. Rimuovere la clip CCA e prendere nota dell'ora.
    NOTA: Questo segna l'inizio dell'insorgenza dell'ischemia.
  4. Impacchetta l'estremità libera del filamento MCAO nella scanalatura tra il triangolo carotideo e il muscolo sternocleidomastoideo omolaterale in modo che non sporga dalla ferita chirurgica.
  5. Rimuovere il divaricatore e avvicinare i bordi della ferita chirurgica l'uno all'altro. Lasciare che il sito chirurgico si stabilizzi per alcuni secondi affinché il tessuto torni nella sua posizione anatomica.
  6. Chiudere la ferita chirurgica utilizzando chiusure a nastro adesivo per facilitare una riapertura più rapida della ferita dopo il periodo di ischemia.
    NOTA: Se un ricercatore desidera lasciare che l'animale si svegli durante il periodo di ischemia, si consiglia di suturare la ferita per evitare la riapertura prematura della ferita.

3. Periodo di ischemia

  1. Convalidare il successo dell'intervento chirurgico utilizzando la risonanza magnetica o un altro metodo di misurazione quantitativa della perfusione.
    NOTA: In caso di esecuzione di una risonanza magnetica, l'imaging pesato in perfusione (PWI) dovrebbe mostrare un'ischemia critica nell'ampia regione MCA e l'imaging pesato in diffusione (DWI) dovrebbe delineare il sito di riduzione del coefficiente di diffusione apparente (ADC) a causa dell'edema cellulare.
  2. Metti l'animale in una gabbia pulita fino al termine del periodo di ischemia.

4. Intervento chirurgico di ritiro del filamento

  1. Circa 5 minuti prima della scadenza del tempo di ischemia assegnato, posizionare l'animale e fissarlo nuovamente sul tavolo operatorio.
  2. Rimuovere le chiusure della ferita del nastro e riaprire la ferita chirurgica con il divaricatore a filo.
  3. Liberare l'estremità libera del filamento MCAO dal tessuto circostante e dalle estremità del filo del nodo di fissaggio.
  4. Con la pinza di tipo N0, pizzicare e tirare ventralmente il bordo del moncone ECA per metterlo in tensione. Abbassare con cautela la pinza di pizzicamento verso il basso, in modo simile alla prima procedura chirurgica.
    NOTA: L'operatore deve evitare di pizzicare il nodo di sicurezza, in quanto ciò impedirebbe lo scioglimento del nodo.
  5. Clamp nuovamente il CCA con una clip microvascolare.
  6. Utilizzando una pinza di tipo 5, allentare il nodo di sicurezza per consentire il ritiro del filamento.
    NOTA: Il modo migliore per iniziare ad allentare il nodo è continuare a pizzicarlo fino a quando non si separa in singole parti e quindi spingere le estremità del filo verso il nodo.
  7. Ritirare lentamente il filamento MCAO fino a quando la parte in silicone inizia a sporgere dal moncone ECA. Stringere leggermente il nodo di sicurezza per prepararsi al completo ritiro del filamento.
  8. Quando si è vicini all'estremità in silicone del filamento, stringere il nodo di sicurezza in modo che spinga fuori il filamento MCAO e chiuda il moncone ECA con un'unica manovra. Stringere completamente il nodo dopo che il filamento è scivolato fuori.
  9. Aprire e rimuovere la pinza di pizzicamento insieme alla clip CCA.
    NOTA: Questo segna la fine del periodo di ischemia e l'inizio del processo di riperfusione.
  10. Rimuovere il divaricatore e riunire nuovamente i bordi della ferita chirurgica.
  11. Sutura la ferita chirurgica partendo dalla periferia, chiudendo completamente la ferita senza che sia visibile alcun tessuto sottostante.
    NOTA: Il numero di suture necessarie dipende dalle dimensioni della ferita chirurgica.
  12. Pulire e disinfettare il sito chirurgico utilizzando salviettine imbevute di alcol.

5. Cure post-chirurgiche

  1. Metti l'animale in una gabbia pulita e lascialo svegliare spontaneamente dall'anestesia.
  2. Posizionare il cibo pellettato sul fondo della gabbia per facilitarne l'accesso. Ammorbidire i pellet di cibo con acqua potabile. Riempi una piccola capsula di Petri con acqua potabile e portala anche sul pavimento della gabbia.
  3. Nelle successive 48 ore, iniettare 0,25 mL di soluzione fisiologica con buprenorfina (0,5 mg/kg) ogni 24 ore per via intraperitoneale.

Risultati

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Le scansioni MRI intraoperatorie o postoperatorie, in particolare le scansioni di imaging pesato in perfusione (PWI) e/o di imaging pesato in diffusione (DWI) (Figura 2) possono offrire la prova definitiva di una procedura di successo. La PWI intraoperatoria mostra un'ischemia critica nella regione omolaterale dell'MCA, confermando così che il posizionamento del filamento ha portato alla completa occlusione. La PWI postoperatoria di una procedura riuscita mostra iperperfusione al centro della lesione, nonché un certo grado di riperfusione ai bordi della regione MCA. Le lesioni DWI intraoperatorie corrispondono alle regioni ischemiche osservate sulla PWI intraoperatoria. Le lesioni DWI postoperatorie mostrano un restringimento verso il nucleo della lesione ischemica, accompagnato da una significativa diminuzione del coefficiente di diffusione apparente della lesione, rendendola più scura delle lesioni DWI intraoperatorie e del tessuto cerebrale riperfuso circostante. Le scansioni anatomiche T2 standard, sia intraoperatorie che postoperatorie, in genere non mostrano nulla di degno di nota a meno che non si verifichi un'emorragia indotta dai filamenti

(Figura 3). In questi casi, le scansioni PWI e DWI rivelano un'ischemia incompleta o assente.

Il processo di riperfusione segue nelle successive 48 ore ed è confermato che è avvenuto nelle scansioni MRI eseguite il secondo giorno dopo la procedura (Figura 2, CBF il giorno 2). Le scansioni PWI mostrano una riperfusione completa nel sito della lesione con una leggera iperperfusione nel nucleo della lesione. Le scansioni DWI mostrano più regioni di coefficienti di diffusione apparente ridotti a causa della formazione di edema cerebrale. Le scansioni anatomiche T2 indicano regioni iperintense di edema che avvolgono le regioni MCA, senza coinvolgimento di regioni non MCA come l'ippocampo.

Al risveglio, l'animale mostra chiari segni di ictus acuto. I sintomi comportamentali comuni includono un aumento del tono muscolare sul lato della lesione, che induce l'animale a flettere il busto in quella direzione. Anche il cerchio e la rotazione in direzione omolaterale sono chiari segni di un ictus acuto. L'atassia dell'andatura suggerisce spesso il coinvolgimento dell'ippocampo nel volume della lesione ischemica. Tuttavia, questo sintomo può mancare di specificità nella fase iperacuta a causa degli effetti collaterali dell'anestesia con isoflurano. Nei giorni successivi, l'animale dovrebbe sviluppare la flessione dell'arto anteriore in modo omolaterale e un peggioramento del suo stato posturale, accompagnato da un'assenza di riflesso dei baffi. Il tasso di mortalità raggiunge il picco a circa 3 giorni dopo la procedura a causa di edema cerebrale. La fase cronica inizia dopo che l'edema cerebrale inizia a risolversi. Durante questo periodo, l'animale può presentare ritenzione urinaria. Per questo motivo, è importante ispezionare l'animale per verificare la rigidità della vescica e un tappo fermo sull'uscita uretrale. La maggior parte delle volte, questo problema può essere risolto massaggiando delicatamente la vescica per facilitare la minzione. I segni di recupero del peso di solito compaiono entro i primi 7 giorni dopo l'insorgenza dell'ictus.

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Figura 2: Esempio rappresentativo di un MCAO riuscito con riperfusione completa confermata con scansioni MRI. CBF, ADC e T2w sono l'acronimo rispettivamente di mappe del flusso sanguigno cerebrale, mappe del coefficiente di diffusione apparente e scansioni anatomiche pesate in T2. IntraOP, postop e D02 indicano 3 diversi punti temporali di imaging dopo l'insorgenza dell'ischemia, dopo l'insorgenza della riperfusione e il secondo giorno dopo MCAO, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Scansioni MRI rappresentative di un'emorragia indotta da filamenti durante la procedura MCAO. CBF, ADC e T2w sono l'acronimo rispettivamente di mappe del flusso sanguigno cerebrale, mappe del coefficiente di diffusione apparente e scansioni anatomiche pesate in T2. IntraOP, postOP e D02 indicano 3 diversi punti temporali di imaging: rispettivamente dopo l'insorgenza dell'ischemia, dopo l'insorgenza della riperfusione e il secondo giorno dopo MCAO. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Un'illustrazione del corretto posizionamento del filamento nel ramo dell'arteria cerebrale media. Nella maggior parte dei casi, la parte di silicio del filamento (colorata in bianco) si deposita nella parte prossimale dell'arteria cerebrale anteriore (ACA) circa 2 mm più in là del punto di ramificazione MCA. Normalmente la regione cerebrale dell'ACA non viene colpita nei topi, poiché l'ACA si unisce a quella controlaterale in un unico ACA azygos. Le arterie interessate sono mostrate in grigio. A sinistra, il CCA viene lasciato pervio durante il periodo di ischemia, fornendo così sangue a tutti i rami dell'ICA fino all'MCA che è occluso con la parte siliconica del filamento. A destra, il filamento è posizionato in modo identico, tranne per il fatto che la legatura CCA viene mantenuta durante il periodo di ischemia. Poiché nella maggior parte dei casi il PcomA (colorato in verde) non è pervio, se la legatura CCA viene mantenuta, l'ictus avvolge in modo non selettivo la maggior parte dell'emisfero omolaterale tramite MCA, AchA, VTA, HTA e PCA. In questi casi, si possono osservare anche segni di infarto acuto dell'occhio (leucocoria e anisocoria) a causa del blocco della PPA. Creato con BioRender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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La MCAO è una procedura molto impegnativa per l'operatore e debilitante per l'animale. Per questo motivo, è della massima importanza per i ricercatori disporre di una procedura operativa standard che riduca al minimo la gravità dell'ictus, riduca il fallimento procedurale e migliori il benessere dell'animale dopo la procedura. Questo protocollo MCAO evidenzia alcuni degli aspetti chiave da considerare quando si esegue questa procedura su un mouse.

La scelta del filamento MCAO influenza le dimensioni e la posizione della lesione da ictus indotta e quindi è un passaggio critico in questa procedura11. I filamenti rivestiti di silicio, come quelli sperimentati da Doccol, hanno fatto un grande passo avanti nel ridurre l'incidenza delle emorragie indotte dai filamenti12. Tuttavia, i filamenti rivestiti di silicio sono disponibili in una grande varietà di dimensioni e lunghezze, ponendo una sfida per i nuovi ricercatori nel selezionare quelli appropriati per MCAO negli animali da esperimento. Mentre i produttori di filamenti di solito forniscono linee guida per la scelta del diametro del filamento giusto per un dato peso animale, la lunghezza del rivestimento in silicone è considerata una preferenza personale dell'operatore e dovrebbe essere scelta solo sulla base dell'abilità dell'operatore. In questo lavoro, sosteniamo la necessità di ridurre al minimo la lunghezza del silicio per garantire che la lesione indotta dall'ictus comprenda solo l'area di irrigazione MCA, migliorando così la riproducibilità. La Figura 4 illustra che l'arteria cerebrale posteriore (PCA), il primo ramo intracranico dell'ICA, fornisce le regioni posteriori del cervello, comprese parti dell'ippocampo. Recenti studi di micro-CT sui topi hanno identificato ulteriori tre rami più piccoli derivanti dall'ICA prima del punto di ramificazione dell'MCA13. L'arteria ipotalamica delicata e variabile (HTA), l'arteria tegmentale ventrale (VTA) e l'arteria coroide anteriore (AChA), nel loro ordine di ramificazione, contribuiscono in modo significativo alla variabilità intra-variante e intra-soggetto8. Inoltre, studi micro-CT hanno dimostrato che, nei topi, la distanza media dai punti di ramificazione MCA e PCA misura circa 1,7 mm, considerevolmente più corta della lunghezza del rivestimento di silicio della maggior parte dei filamenti prodotti14. Poiché l'unico feedback che un operatore riceve quando avanza il filamento è un improvviso aumento della resistenza quando il filamento raggiunge il punto di ramificazione MCA, la lunghezza finale del rivestimento di silicone del filamento è ciò che induce l'ischemia all'MCA e, a seconda della lunghezza del rivestimento di silicone, all'AChA, VTA, HTA e persino PCA, introducendo una variabilità contraria al modello MCAO previsto. Pertanto, per mantenere la riproducibilità e il benessere postoperatorio degli animali, l'obiettivo dovrebbe essere esclusivamente l'occlusione MCA. Doccol offre filamenti MCAO con rivestimenti in silicone che vanno da 1 a 2 mm, ma la nostra esperienza indica che l'utilizzo di rivestimenti da 1-2 mm spesso si traduce in un'operazione fittizia senza causare ictus. Le scansioni MRI intraoperatorie hanno rivelato che il filamento avanza fino a 2 mm oltre il punto di ramificazione MCA nell'arteria cerebrale anteriore (ACA) prima di fornire un feedback resistivo critico all'operatore. Per questo motivo, consigliamo vivamente l'uso di rivestimenti in silicone di lunghezza compresa tra 2 e 3 mm, che riducono il coinvolgimento dell'ippocampo nelle lesioni da ictus rispetto ai rivestimenti in silicone più lunghi sui filamenti MCAO.

Il secondo passo critico in questa procedura è il corretto posizionamento del filamento MCAO al fine di ottenere la completa occlusione dell'MCA. L'inserimento errato del primo ramo ICA, l'arteria pterigopalatina (PPA), è un problema comune per l'operatore poiché non c'è quasi nessun feedback che il filamento MCAO abbia preso una piega sbagliata durante il suo avanzamento. Per questo motivo, si consiglia un leggero angolo di avanzamento laterale in modo che la punta rivestita di silicone del filamento si incurvi lontano dal punto di ramificazione del PPA, rendendo più probabile l'ingresso nella porzione intracranica dell'ICA. (Figura 1) Come indicato nella sezione del protocollo, è importante osservare la lunghezza del filamento finale per concludere se il posizionamento del filamento è adeguato. Nel caso in cui il filamento non possa essere inserito per almeno 7 mm dal punto di ramificazione ICA, l'operatore deve ritrarre il filamento e ripetere. Qualsiasi forza non necessaria applicata durante l'inserimento del filamento può provocare un'emorragia e una procedura fallita. A questo proposito, è possibile utilizzare una misurazione continua della perfusione laser-doppler per confermare il corretto posizionamento del filamento.

Garantire un flusso sanguigno senza ostacoli dal CCA durante il periodo ischemico è un altro passo fondamentale di questo protocollo. Contrariamente alla maggior parte delle illustrazioni che raffigurano un cerchio di Willis completo in un topo, gli studi hanno dimostrato che l'arteria comunicante posteriore (PcomA) molto spesso non è bilateralmente pervia nei topi e non può fornire in modo affidabile il lato omolaterale del cerchio di Willis se il CCA rimane chiuso durante il periodo di ischemia15,16. In questi casi, anche se un ricercatore seleziona attentamente la lunghezza corretta del rivestimento di silicio del filamento, la corsa avvolgerà l'intero emisfero o solo la regione MCA, a seconda della pervietà del PcomA, dando origine alla varianza non considerata delle dimensioni della corsa. Per questo motivo, abbiamo modificato la procedura in modo che coinvolga la fase di istruzione in cui l'operatore rimuove la clip CCA subito dopo aver impostato il filamento MCAO occludente. Queste modifiche potrebbero aumentare la precisione e la riproducibilità dell'intervento chirurgico e ridurre allo stesso tempo l'eterogeneità dei risultati. La standardizzazione dei metodi migliorerebbe ulteriormente il tasso di successo e la comparabilità, nonché il potenziale di traduzione dei risultati17.

Il più grande limite della tecnica proposta è il fatto che l'ECA rimane legata dopo la procedura, il che può potenzialmente peggiorare lo stato dell'animale durante il recupero18. Finora, non abbiamo avuto successo negli sforzi per riparare l'ECA mantenendo il tasso di successo della procedura sufficientemente alto. Questo rimane un punto potenziale per futuri miglioramenti del metodo. Inoltre, ridurre al minimo il tempo in cui il CCA rimane bloccato è una sfida, ma è essenziale per prevenire il reclutamento di regioni non MCA nell'ictus. Poiché ciò potrebbe fornire una fonte di varianza inter- e intra-operatore, è consigliabile misurare la durata del clamping CCA, consentendo potenzialmente ai ricercatori di tenere conto statisticamente di almeno una frazione della varianza totale osservata nelle dimensioni della sigla. D'altra parte, l'abilità e l'esperienza dell'operatore giocano un ruolo cruciale nel ridurre il tempo di legatura CCA e la durata complessiva della procedura11.

Il metodo presentato è significativo perché consente ai ricercatori di occludere selettivamente l'MCA, rendendo così l'insorgenza della riperfusione improvvisa e altamente controllabile. Il metodo imita la trombectomia endovascolare e il suo successivo danno da riperfusione in modo più accurato rispetto ai metodi attualmente disponibili, fornendo dettagli per un modello di danno da ischemia/riperfusione animale riproducibile e clinicamente rilevante.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare. Gli autori non hanno alcuna affiliazione con i nomi commerciali e i marchi citati in questo lavoro.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato dal progetto BRADISCHEMIA della Croatian Science Foundation (UIP-2017-05-8082); GA KK01.1.1.01.0007 finanziato dall'Unione Europea attraverso il Fondo Europeo di Sviluppo Regionale e dall'Unione Europea attraverso il Fondo Europeo di Sviluppo Regionale nell'ambito della Convenzione di Sovvenzione n. KK.01.1.1.07.0071, progetto "SineMozak. Il lavoro dei dottorandi Rok Ister e Marta Pongrac è stato pienamente supportato dal "Progetto di sviluppo della carriera dei giovani ricercatori - formazione dei dottorandi" della Croatian Science Foundation, finanziato dall'Unione Europea dal Fondo Sociale Europeo. La procedura è stata filmata utilizzando uno smartphone Android montato su un microscopio operatorio utilizzando un supporto generico per fotocamera. I materiali video sono stati modificati e la voce fuori campo è stata registrata utilizzando l'editor video Wondershare Filmora.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Betadine soluzione cutanea 10g/100mlAlcaloide SkopjeN/A
Sutura di seta intrecciataFine Science Tools18020-60
Sutura Dafilon 5/0 DS16B. BraunC0936154
Dolokain 20 mg/g gelJadran-Galenski LaboratorijN/A
Dumont #5 pinzeFine Science Tools11251-202 pezzi
Pinza Dumont #7Fine Science Tools11271-30
Pinza Dumont N0 a chiusura automaticaFine Science Tools11480-11
Nastro chirurgico Durapore 1,25cm x 9,1mNastro chirurgico 3M7100057169
Durapore 2,5cm x 9,1m3M7100057168
Termostato esternoPetnap1012536
Portaaghi HalseyFine Science Tools12500-12
Sterilizzatore a perline caldeFine Science Tools18000-50
Forbici per irideFine Science Tools14060-10
Isoflurano USPPiramal terapia intensivaN/A
Laser Doppler MonitorMoorMOORVMS-LDF2
Cuscinetto termico per animali domestici in metalloPetnap
Micro Vannas forbici a mollaFine Science Tools15000-00
Divaricatore Mini-colibrìFine Science Tools17000-01
Unguento per gli occhi RecugelBausch& LombN/A
S& T B-1 vaso micro morsetto Strumenti di Fine Science00396-012 pezzi
S& Pinza per l'applicazione di micro pinze a TFine Science Tools00071-14
Micro serrefines SchwartzFine Science Tools18052-01
Stereomicroscopio spot Stemi DV4Zeiss000000-1018-453
Chiusure cutanee adesive rinforzate Steri-Strip 3 mm x 75 mm3M7100236545
Pinze per tessuti dritteFine Science Tools11023-10
SZX Stand ArmOlympusSZ2-STS
Tec III 300 serie calibrato vaporizzatoreVaporizzatore Vendite e assistenza inc.N/A
Supporto universale Tipo 2OlympusSZ2-STU2
VetFlo Supporto per anestesia a sei canaliKent ScientificVetFlo-1225Modificato per la miscelazione di O2/N2
1012525

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. regional, and national burden of stroke and its risk factors, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. Neurology. 20 (10), 1-26 (2021).">Feigin, V. L., et al. regional, and national burden of stroke and its risk factors, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. Neurology. 20 (10), 1-26 (2021).
  2. Revisiting cerebral postischemic reperfusion injury: New insights in understanding reperfusion failure, hemorrhage, and edema. Int J Stroke. 10 (2), 143-152 (2015).">Bai, J., Lyden, P. D. Revisiting cerebral postischemic reperfusion injury: New insights in understanding reperfusion failure, hemorrhage, and edema. Int J Stroke. 10 (2), 143-152 (2015).
  3. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 245-261 (2017).">Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 245-261 (2017).
  4. Transient middle cerebral artery occlusion with complete reperfusion in spontaneously hypertensive rats. MethodsX. 1, 283-291 (2014).">Hill, J. W., Nemoto, E. M. Transient middle cerebral artery occlusion with complete reperfusion in spontaneously hypertensive rats. MethodsX. 1, 283-291 (2014).
  5. Experimental studies of ischemic brain edema. Nosotchu. 8 (1), 1-8 (1986).">Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. Nosotchu. 8 (1), 1-8 (1986).
  6. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).">Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  7. Redefining the Koizumi model of mouse cerebral ischemia: A comparative longitudinal study of cerebral and retinal ischemia in the Koizumi and Longa middle cerebral artery occlusion models. J Cereb Blood Flow and Metab. 42 (11), 2080-2094 (2022).">Justić, H., et al. Redefining the Koizumi model of mouse cerebral ischemia: A comparative longitudinal study of cerebral and retinal ischemia in the Koizumi and Longa middle cerebral artery occlusion models. J Cereb Blood Flow and Metab. 42 (11), 2080-2094 (2022).
  8. Hypothalamic, thalamic and hippocampal lesions in the mouse MCAO model: Potential involvement of deep cerebral arteries. J of Neurosci Methods. 254, 80-85 (2015).">El Amki, M., et al. Hypothalamic, thalamic and hippocampal lesions in the mouse MCAO model: Potential involvement of deep cerebral arteries. J of Neurosci Methods. 254, 80-85 (2015).
  9. Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model. J Vis Exp. (47), e2423(2011).">Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model. J Vis Exp. (47), e2423(2011).
  10. Middle cerebral artery occlusion allowing reperfusion via common carotid artery repair in mice. J Vis Exp. (143), e58191(2019).">Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Gibson, C. L. Middle cerebral artery occlusion allowing reperfusion via common carotid artery repair in mice. J Vis Exp. (143), e58191(2019).
  11. A comparative study of variables influencing ischemic injury in the longa and koizumi methods of intraluminal filament middle cerebral artery occlusion in mice. PLoS One. 11 (2), e0148503(2016).">Morris, G. P., et al. A comparative study of variables influencing ischemic injury in the longa and koizumi methods of intraluminal filament middle cerebral artery occlusion in mice. PLoS One. 11 (2), e0148503(2016).
  12. Comparison of silicon-coated nylon suture to plain nylon suture in the rat middle cerebral artery occlusion model. J Neurosci Methods. 156 (1-2), 161-165 (2006).">Shimamura, N., Matchett, G., Tsubokawa, T., Ohkuma, H., Zhang, J. Comparison of silicon-coated nylon suture to plain nylon suture in the rat middle cerebral artery occlusion model. J Neurosci Methods. 156 (1-2), 161-165 (2006).
  13. Effect of suture properties on stability of middle cerebral artery occlusion evaluated by synchrotron radiation angiography. Stroke. 43 (3), 888-891 (2012).">Guan, Y., et al. Effect of suture properties on stability of middle cerebral artery occlusion evaluated by synchrotron radiation angiography. Stroke. 43 (3), 888-891 (2012).
  14. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).">Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
  15. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: Evaluation of the patency of the posterior communicating artery. J Cereb Blood Flow and Metab. 18 (5), 570-579 (1998).">Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: Evaluation of the patency of the posterior communicating artery. J Cereb Blood Flow and Metab. 18 (5), 570-579 (1998).
  16. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).">McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
  17. Distinctions between the Koizumi and Zea Longa methods for middle cerebral artery occlusion (MCAO) model: a systematic review and meta-analysis of rodent data. Sci Rep. 13 (1), 10247(2023).">Li, Y., et al. Distinctions between the Koizumi and Zea Longa methods for middle cerebral artery occlusion (MCAO) model: a systematic review and meta-analysis of rodent data. Sci Rep. 13 (1), 10247(2023).
  18. A critical re-examination of the intraluminal filament mcao model: impact of external carotid artery transection. Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).">Trueman, R. C., et al. A critical re-examination of the intraluminal filament mcao model: impact of external carotid artery transection. Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).

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