Imaging al microscopio a foglio leggero e strategie di montaggio per embrioni precoci di zebrafish

Sommario

Viene descritta una strategia di preparazione del campione per l'imaging di embrioni precoci di zebrafish all'interno di un corion intatto utilizzando un microscopio a foglio luminoso. Analizza i diversi orientamenti che gli embrioni acquisiscono all'interno del corion al 70% degli stadi di epibolia e gemma e descrive in dettaglio le strategie di imaging per ottenere una risoluzione su scala cellulare in tutto l'embrione utilizzando il sistema light-sheet.

Abstract

La microscopia a foglio ottico è diventata la metodologia di scelta per l'imaging dal vivo di embrioni di zebrafish su lunghe scale temporali con fototossicità minima. In particolare, un sistema multiview, che consente la rotazione del campione, consente l'imaging di interi embrioni da diverse angolazioni. Tuttavia, nella maggior parte delle sessioni di imaging con un sistema multiview, il montaggio dei campioni è un processo problematico poiché i campioni vengono solitamente preparati in una provetta polimerica. Per aiutare in questo processo, questo protocollo descrive le strategie di montaggio di base per l'imaging dello sviluppo precoce del pesce zebra tra il 70% degli stadi epibolici e quelli iniziali del somite. In particolare, lo studio fornisce statistiche sulle varie posizioni in cui gli embrioni si trovano di default al 70% degli stadi di epibolia e gemma all'interno del corion. Inoltre, discute il numero ottimale di angoli e l'intervallo tra gli angoli necessari per l'imaging di embrioni interi di zebrafish nelle prime fasi di sviluppo, in modo che le informazioni su scala cellulare possano essere estratte fondendo le diverse visualizzazioni. Infine, poiché l'embrione copre l'intero campo visivo della telecamera, necessario per ottenere una risoluzione su scala cellulare, questo protocollo descrive in dettaglio il processo di utilizzo delle informazioni della perlina dall'alto o dal basso dell'embrione per la registrazione delle diverse visualizzazioni.

Introduzione

Garantire una fototossicità minima è un requisito importante per l'imaging di embrioni vivi con un'elevata risoluzione spazio-temporale per lunghi periodi. Nell'ultimo decennio, la microscopia a foglio ottico è diventata la metodologia preferita per soddisfare questo requisito 1,2,3,4,5,6,7. In breve, in questa tecnica che è stata utilizzata per la prima volta nel 2004 per catturare i processi di sviluppo⁸, due sottili fogli di laser allineati passano attraverso l'embrione da estremità opposte, illuminando solo il piano di interesse. Un obiettivo di rilevamento viene posizionato ortogonalmente, quindi la luce fluorescente emessa da tutti i punti illuminati del campione viene raccolta simultaneamente. Un'immagine 3D viene quindi ottenuta spostando in sequenza l'embrione attraverso il foglio di luce statica.

Inoltre, in una forma specifica di questa metodologia, chiamata microscopia a foglio di luce multiview, i campioni possono essere sospesi in un tubo polimerico che può essere ruotato utilizzando un rotore, consentendo l'imaging dello stesso embrione da più angolazioni ^9,10,11. Dopo l'imaging, le immagini da più angolazioni vengono fuse in base ai marcatori di registrazione, che sono tipicamente marcatori fluorescenti globulari all'interno dell'embrione (ad esempio, nuclei) o nel tubo (ad esempio, perle fluorescenti). L'imaging multiview e la fusione migliorano significativamente la risoluzione assiale, fornendo una risoluzione isotropa in tutte e tre le dimensioni¹². Sebbene questo sia un grande vantaggio, una delle principali sfide della metodologia multiview è il montaggio del campione, in cui gli embrioni devono essere montati e mantenuti in posizione nelle provette durante l'intero corso dell'imaging.

Per eseguire l'imaging multiview, per mantenere gli embrioni in posizione e prevenire il movimento durante l'imaging, gli embrioni possono essere incorporati nell'agarosio. Tuttavia, questo spesso porta a una crescita e uno sviluppo dannosi, in particolare per gli embrioni di zebrafish in fase iniziale¹³, il sistema modello che viene discusso qui. Una seconda strategia di montaggio consiste nell'utilizzare un tubo sottile che è solo leggermente più grande del diametro dell'embrione, dove l'embrione può essere tirato nel tubo insieme al mezzo embrionale, seguito dalla chiusura del fondo del tubo con un tappo di agarosio¹⁴. In questo metodo, poiché la provetta è riempita con mezzo embrionale, i marcatori di registrazione come le perle fluorescenti non possono essere utilizzati per la fusione delle diverse viste e la registrazione si basa quindi sui marcatori all'interno dell'embrione. In generale, le perle fungono da migliori marcatori di registrazione poiché il segnale dei marcatori all'interno dell'embrione si degrada quando ci si sposta più in profondità nel campione a causa delle limitazioni di illuminazione e rilevamento di qualsiasi microscopio.

Così, un terzo approccio, che sarà dettagliato qui e utilizzato in precedenza 5,13,14,15,16, consiste nell'imaging di embrioni precoci di zebrafish con un corion intatto e nel riempire la provetta con una percentuale minima di agarosio, che contiene perline come marcatori di registrazione. In questo scenario, poiché l'intervento manuale per il posizionamento degli embrioni all'interno di un corion non è possibile, questo studio fornisce statistiche sull'orientamento predefinito in cui cadono i primi embrioni di zebrafish, concentrandosi in particolare sul 70% degli stadi epibolici e delle gemme. Discute quindi il numero ottimale di visualizzazioni necessarie per l'imaging di embrioni in fase iniziale con risoluzione su scala cellulare e descrive in dettaglio il processo di fusione utilizzando BigStitcher, un plug-in basato su FIJI 10,17,18. Insieme, questo protocollo, che utilizza un obiettivo NA 20x/1, mira a facilitare gli embriologi di zebrafish nell'utilizzo di sistemi di fogli luminosi multiview per l'imaging di embrioni con nuclei e marcatori di membrana dalla gastrulazione agli stadi iniziali di somite.

Protocollo

Le procedure di mantenimento e sperimentazione del pesce zebra utilizzate in questo studio sono state approvate dal comitato istituzionale per l'etica degli animali, vedi riferimento TIFR/IAEC/2023-1 e TIFR/IAEC/2023-5. Gli embrioni ottenuti incrociando pesci eterozigoti che esprimono Tg(actb2:GFP-Hsa.UTRN)¹⁹ sono stati iniettati con l'mRNA di H2A-mCherry (30 pg) allo stadio di una cellula. L'mRNA di H2A-mCherry è stato sintetizzato utilizzando il plasmide pCS2+ H2A-mCherry (un dono del laboratorio Oates, EPFL) mediante trascrizione in vitro . Gli embrioni che esprimono entrambi i marcatori, denominati rispettivamente Utr-GFP e H2A-mCherry, nel resto del protocollo, sono stati sottoposti a imaging al 70% degli stadi di epibolibea e gemma. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione del campione per l'imaging multiview

1. Preparazione di tubi in FEP/PTFE
   1. Pulire i tubi FEP/PTFE seguendo le procedure descritte in precedenza¹⁴.
   2. Dopo la pulizia, tagliare le provette in lunghezze di 2-2,5 cm secondo le esigenze e conservarle in provette da microcentrifuga da 2 ml contenenti acqua distillata doppia. I tubi possono essere conservati in questo modo per circa un mese.
   3. Prima della preparazione del campione, riscaldare le provette a 70-75 °C per circa 25 minuti per raddrizzare le provette. Evitare il sovraffollamento in ogni provetta per microcentrifuga per evitare la formazione di grumi, garantendo spazio sufficiente per un efficace raddrizzamento delle provette.
      NOTA: Indossare i guanti durante l'intera procedura di manipolazione delle provette, poiché eventuali impronte digitali/particelle di polvere rimaste sulle provette possono interferire con l'imaging.
2. Preparazione dell'agarosio
   1. Preparare le soluzioni stock E3 buffer 50x come segue:
      1. Brodo 1 - 3.252 g di Na₂HPO₄, 0.285 g di KH₂PO₄, 11.933 g di NaCl, 0.477 g di KCl in 1 L di acqua deionizzata
      2. Brodo 2 - 2.426 g di CaCl₂, 4.067 g di MgSO₄ in 1 L di acqua deionizzata.
   2. Per preparare 1 tampone E3, aggiungere 20 mL di soluzioni stock 1 e 2 in 960 mL di acqua deionizzata.
      NOTA: Non aggiungere blu di metilene nel tampone E3 utilizzato per l'imaging in quanto provoca la dispersione della luce.
   3. Sciogliere l'agarosio a basso punto di fusione in 1x E3 riscaldando a 70-75 °C su un blocco termico agitando fino a quando la soluzione diventa limpida senza grumi o cristalli.
   4. Per l'imaging multiview, aggiungere alla soluzione di agarosio le microsfere fluorescenti disponibili in commercio (vedere la Tabella dei materiali), che consente la registrazione dell'immagine durante l'analisi. Sonicare le perle a temperatura ambiente con frequenza di 40 kHz per 20-30 minuti in un ultrasuonatore a bagno d'acqua per disaggregare le perle.
   5. Dopo la sonicazione, aggiungere 1 μL di perle a 10 mL di soluzione di agarosio in una provetta da 15 mL e agitare bene la provetta per garantire una dispersione uniforme delle microsfere.
      NOTA: Il volume della soluzione di perline da aggiungere all'agarosio dipende dalla soluzione madre e dal produttore. Prova una gamma di volumi e scegli una concentrazione in cui le perle appaiano ben disperse quando vengono riprodotte nel sistema a foglio luminoso. Troppe perle possono aggregarsi nonostante la sonicazione e il vortice, mentre troppo poche perle possono influire sulla registrazione dell'immagine.
   6. Conservare la provetta di agarosio con l'aggiunta di perle in un bagno d'acqua chiuso mantenuto a 37 °C per almeno 30 minuti prima della preparazione del campione. In questo modo si garantisce che la temperatura dell'agarosio scenda da 70 °C a 37 °C.
3. Preparazione del campione
   1. Sistemare i pesci in coppia con i divisori la sera prima del giorno dell'imaging. Rimuovere i divisori per circa 15 minuti e raccogliere gli embrioni utilizzando la procedura standard²⁰.
   2. Una volta che gli embrioni raggiungono lo stadio di interesse per la preparazione del campione, versare tutti i 10 mL di agarosio (con perline) che viene mantenuto a 37 °C su una piastra di Petri da 6 cm.
   3. Attendere circa 2-3 minuti per portare la temperatura al di sotto di 33 °C prima di trasferire da 10 a 15 embrioni nella soluzione di agarosio.
      NOTA: Questo è un passo importante per prevenire ogni possibile shock termico agli embrioni trasferiti nell'agarosio.
   4. Assicurarsi che venga aggiunto il minor quantità possibile di tampone E3 alla soluzione di agarosio durante il trasferimento degli embrioni. Agitare la capsula di Petri in modo che il piccolo buffer che sarebbe stato trasferito si disperda bene.
   5. Indossare i guanti per il resto della procedura di preparazione del campione.
   6. Prelevare una micropipetta da 200 μl con un puntale appropriato e inserire una provetta diritta pulita estratta dalla provetta della microcentrifuga nel puntale della pipetta, come mostrato nella Figura 1A, B.
   7. Aspirare un po' di agarosio nella provetta, seguito da 2-3 embrioni utilizzando la micropipetta (Figura 1C,D). Assicurarsi che gli embrioni siano vicini al fondo della provetta (Figura 1E), il che diventerà importante durante l'impostazione dell'imaging. Inoltre, assicurarsi che ci sia un po' di agarosio tra i diversi embrioni (Figura 1E) in modo che le perle in questa regione possano essere utilizzate come marcatori di registrazione.
   8. Senza rilasciare la pressione dalla pipetta, staccare la provetta dalla punta della pipetta e posizionarla sul coperchio della capsula di Petri riempita con E3 per la solidificazione dell'agarosio (Figura 1F).
   9. Ripetere i passaggi da 1.3.6 a 1.3.8 fino a quando tutti gli embrioni nella piastra di Petri non vengono trasferiti nelle provette.
   10. Una volta che l'agarosio si è solidificato (operazione che può richiedere 5-10 minuti e può essere confermata controllando l'agarosio nella piastra di Petri), trasferire le provette in una provetta da microcentrifuga da 2 mL riempita con E3 (Figura 1G).
   11. Conservare le provette con gli embrioni in un'incubatrice a 28 °C o 33 °C, a seconda delle necessità, prima di procedere all'imaging multiview.

2. Imaging multiview

NOTA: Questo passaggio presenta una procedura generale per l'imaging multiview di embrioni di zebrafish nelle loro prime fasi di sviluppo. Il metodo descritto di seguito può essere facilmente adattato a qualsiasi sistema di microscopia a foglio di luce multiview.

1. Localizzazione dell'embrione
   NOTA: Riempire la camera del campione del microscopio con il terreno embrionale²⁰ e impostare la temperatura della camera del campione sulla temperatura di interesse almeno 10 minuti prima dell'imaging.
   1. Montare il portacampioni come descritto in precedenza²¹, tuttavia, con una modifica. Poiché l'imaging verrà eseguito attraverso la provetta, inserire la provetta con gli embrioni direttamente in un capillare del diametro giusto, in modo che sia tenuta in posizione senza spingere fuori l'agarosio e disturbare gli embrioni sul fondo (Figura 1H).
      NOTA: Poiché la camera del campione ha un'altezza definita, assicurarsi che gli embrioni si trovino verso il fondo della provetta durante la preparazione del campione (come indicato nel passaggio 1.3.7) consentirebbe di posizionare l'embrione nel campo visivo senza colpire il pavimento della camera.
   2. Inserire il portacampione nel sistema multiview e utilizzare i controlli x e y per portare l'embrione al centro del campo visivo.
   3. Usa il controllo z del navigatore dei campioni per mettere a fuoco l'embrione.
   4. A questo punto, l'orientamento dell'embrione all'interno del corion sarà ben visibile e, se non è soddisfacente, inserire una nuova tuba e scegliere l'embrione con un orientamento di interesse.
2. Allineamento dei fogli luminosi
   1. Una volta che l'embrione è in posizione, imposta tutte le impostazioni sperimentali: laser, percorso della luce, filtro, divisore di fascio e fotocamera.
   2. Durante l'impostazione dei parametri di acquisizione, se il software fornisce un'opzione per la scansione pivot, selezionarla. Una scansione pivot ridurrà l'effetto di ombreggiatura che emerge dal foglio di luce quando incontra strutture o regioni opache nel campione.
   3. Avviare l'analisi in tempo reale del campione. Imposta la dimensione in bit, la potenza del laser e lo zoom desiderato, che determineranno lo spessore del foglio luminoso e, quindi, la risoluzione assiale.
   4. Per allineare i fogli luminosi, passare prima all'illuminazione su un lato e modificare le impostazioni dei due fogli luminosi (sinistro e destro) in sequenza. Ingrandisci digitalmente una regione del campione in cui sono visibili chiare strutture di interesse.
      NOTA: In questo studio, per allineare i fogli è stato utilizzato un marcatore nucleare (H2A-mCherry) o di membrana (Utr-GFP). Si consiglia di modificare le impostazioni del foglio luminoso nel software in modo da ottenere il contrasto più nitido del segnale nella regione di interesse.
   5. Una volta che i due fogli luminosi sono stati ottimizzati individualmente per ottenere il miglior segnale, accendere entrambi i fogli luminosi. Eseguire un secondo giro di allineamento e assicurarsi che lo sfarfallio sia minimo, il che indica un allineamento abbastanza buono dei due fogli.
   6. Una volta effettuato l'allineamento, attivare l'opzione di fusione automatica delle immagini generate dai due fogli, se consentito dal software. In alternativa, si possono prima allineare grossolanamente i fogli leggeri concentrandosi sulle perline attorno al campione e poi regolare con precisione l'allineamento utilizzando le informazioni del campione.
      NOTA: Durante l'imaging con due fluorofori (come marcatori nucleari e di membrana), l'allineamento ottimale è solitamente marginalmente diverso per le due strutture. In questo scenario, scegliere un'impostazione basata sui vincoli sull'elaborazione a valle. Ad esempio, se i confini delle celle devono essere segmentati, il che richiede un'elaborazione relativamente più intensiva, allineare i fogli di luce in base al marcatore a membrana.
3. Configurazione dell'imaging multiview
   1. Dopo aver allineato i fogli luminosi, attivare le opzioni per l'esecuzione di uno z-stack e dell'imaging multiview.
   2. Avviare la scansione in tempo reale e navigare utilizzando il navigatore dei campioni per selezionare la prima vista. In questa visualizzazione, impostare l'intervallo di sezione, seguito dalla prima e dall'ultima sezione dello stack z. Aggiungere questa posizione nella finestra di dialogo multivista, che prende nota della posizione e delle informazioni sullo stack z per questa visualizzazione.
   3. Passare alla vista successiva modificando l'angolo nel navigatore campioni. Impostate lo z-stack per la seconda vista e aggiungete le informazioni nella finestra di dialogo multivista.
   4. Ripetere la stessa operazione per altre visualizzazioni.
      NOTA: assicurarsi che in ciascuna vista sia presente un certo numero minimo di sezioni in modo che vi sia una sovrapposizione sufficiente tra le diverse visualizzazioni, il che consentirà di registrare le visualizzazioni durante l'elaborazione. Il numero minimo di sezioni dipenderà dal fattore di zoom e dal numero di angoli scelti per l'imaging.
   5. Dopo aver impostato tutte le visualizzazioni, salva queste informazioni in un file di testo (chiamato "posizioni embrionali", ad esempio), che conterrà le informazioni z-stack, le coordinate (x, y, z) del tubo e le specifiche dell'angolo per ciascuna vista. Dopo il salvataggio, deselezionare tutte le posizioni dalla finestra di dialogo multivista.
   6. Poiché l'imaging viene eseguito con un corion intatto, che è relativamente grande, non è possibile visualizzare le perle nel tubo con le stesse impostazioni. Pertanto, le informazioni sul cordone devono essere acquisite da una posizione diversa nel tubo. Per fare ciò, traduci in una diversa coordinata "y" lontano dall'embrione dove sono visibili le perline. Aggiungi questa posizione alla finestra di dialogo multivista e salva questa posizione in un file di testo (chiamato 'beads-y', per esempio).
      NOTA: Visualizzare le perle il più vicino possibile al campione di embrione per ridurre al minimo gli effetti di possibili differenze nella curvatura del tubo nelle due posizioni. Pertanto, se nella provetta sono montati più embrioni, è importante lasciare un po' di agarosio tra le provette per visualizzare le perle (come menzionato nel passaggio 1.3.7).
   7. Vai alla cartella in cui sono salvati i file di testo e duplica il file 'embryo-positions' in un nuovo file chiamato 'beads-positions'. Sostituire la coordinata y per tutte le viste nel file 'beads-positions' con la coordinata y del file 'beads-y'. Ciò garantirà che le perline vengano visualizzate con lo stesso numero di visualizzazioni, pile z e coordinate x, ma in una diversa posizione y nel tubo.
   8. Tornare al software di imaging e caricare il file "Bead-positions" nel software. Se l'opzione serie temporale è attivata, selezionare un ciclo e avviare l'esperimento. Salva le immagini delle perline come "perline", che verranno utilizzate per registrare le diverse viste durante l'elaborazione delle immagini.
   9. Dopo aver scattato le immagini delle perline, cancellare le posizioni e caricare il file iniziale "posizioni embrionali" nel software. Impostare il numero di cicli desiderato con un intervallo di tempo adeguato e avviare l'esperimento.

3. Analisi delle immagini multiview

NOTA: Per fondere le immagini multiview, viene utilizzato un plug-in FIJI, BigStitcher, che è l'ultima versione del plug-in Multiview Ricostruzione, 10,17,18. Il plugin può essere installato aggiungendo il plugin BigStitcher nella funzione 'Gestisci siti di aggiornamento', a cui si può accedere nell'opzione 'Aggiorna' nel menu 'Aiuto'. Una volta installato, il plugin apparirà nel menu "Plugin". I passaggi generali coinvolti nella fusione sono i seguenti: (1) Definire coppie di file .xml/.h5 sia per le perle che per gli embrioni; (2) Registra tutte le viste con il file delle perline; (3) Funzione di estrazione del punto di diffusione (PSF) per le perline, che può essere utilizzata per la deconvoluzione (Figura 2A); (4) Trasferire le informazioni di registrazione e PSF dal file delle perline al file dell'embrione e iniziare la deconvoluzione multivista. La maggior parte di questi passaggi è stata precedentemente descritta in dettaglio²¹ e qui vengono descritti i passaggi che vengono elaborati in modo diverso.

1. Definizione di un set di dati .xml
   1. Definire un nuovo set di dati sia per le perle che per l'embrione rispettivamente come "beads.xml" e "embryo.xml", come descritto in precedenza²¹.
2. Rilevamento e registrazione tramite punti di interesse
   1. Dopo aver esportato correttamente il file beads.xml, selezionare le viste necessarie per la registrazione nella finestra di dialogo "Esplora multivista" (Figura 2B). Fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere Rileva punti di interesse. Procedere con i passaggi come descritto²¹.
   2. Dopo aver rilevato i punti di interesse, selezionare tutte le visualizzazioni, fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere Registrati utilizzando i punti di interesse. Seguire il protocollo come descritto²¹.
   3. Controllare attentamente se la registrazione del cordone ha funzionato correttamente. Una volta completata la registrazione, le perline sovrapposte provenienti da diverse viste vengono sovrapposte (Figura 2C). Per verificare la precisione con cui è avvenuta la registrazione, selezionare due viste consecutive, andare alla regione di sovrapposizione e passare da una vista all'altra per osservare se le perline riprodotte da diverse angolazioni sono sovrapposte. Ripetere l'operazione per ogni visualizzazione consecutiva.
   4. Se la sovrapposizione non è precisa, riprovare la registrazione allentando il significato richiesto per la registrazione e/o l'errore accettabile di sovrapposizione (definito "errore RANSAC" nella finestra di dialogo "Registrazione").
   5. Dopo aver effettuato correttamente la registrazione, fare clic su Salva nella finestra "Multiview Explorer" per salvare il file .xml aggiornato.
      NOTA: Salvare anche il file di registro, in quanto contiene ulteriori informazioni dettagliate sull'efficienza della registrazione. Per tradurre le informazioni di registrazione dalle perline all'embrione, seguire i passaggi descritti di seguito.
   6. Apri il file bead.xml in un editor di testo a tua scelta e copia l'intero blocco in "ViewRegistrations".
   7. Aprire il embryo.xml e sostituire il blocco "ViewRegistrations" con il blocco copiato dal file delle perline. Se sono presenti più canali, sostituire le informazioni di registrazione per ciascun canale come sopra. Le informazioni di registrazione possono essere trasferite manualmente o utilizzando il codice MATLAB personalizzato che può essere scaricato qui: https://github.com/sundar07/Multiview_analysis
   8. Apri il file embryo.xml in "BigStitcher" e controlla attentamente se la registrazione ha funzionato con successo per l'embrione. Ripetere lo stesso processo fatto per le perline, controllando la sovrapposizione delle strutture di interesse ogni due viste consecutive.
      NOTA: A volte, la registrazione dell'embrione potrebbe non essere così desiderabile nonostante le perle vengano registrate perfettamente. Ciò è possibile se ci sono lievi cambiamenti nella curvatura del tubo dalla posizione in cui vengono visualizzate le perle alla posizione dell'embrione. Inoltre, potrebbero esserci sottili movimenti dell'embrione tra le viste poiché fluttua liberamente all'interno del corion. In questo caso, eseguire un secondo ciclo di registrazione utilizzando un marcatore nucleare nell'embrione.
   9. Per fare ciò, apri il file embryo.xml in "BigStitcher", fai clic con il pulsante destro del mouse su tutte le viste che hanno il marcatore nucleare e scegli Rileva punti di interesse.
   10. Rinomina i punti di interesse come "nuclei" e procedi con i passaggi eseguiti per le perline.
   11. Durante l'impostazione dei parametri "Differenza di gaussiana", assicurarsi che la maggior parte, se non tutti, i nuclei vengano rilevati e che non vi sia alcuna rilevazione nucleare ectopica. Quindi, fai clic su Fine.
   12. Successivamente, registra queste visualizzazioni scegliendo Registra utilizzando i punti di interesse e opta per l'opzione Basato su descrittore preciso (invariante alla traduzione ). Assicurati che l'opzione "confronta tutte le visualizzazioni e i punti di interesse" sia selezionata e utilizza "nuclei" come punti di interesse. Utilizzare l'opzione per fissare la prima vista e non eseguire la mappatura.
   13. Per la registrazione, utilizzare un modello affine con regolarizzazione rigida e i parametri predefiniti nel plug-in.
   14. Ricontrolla il successo della registrazione confrontando ogni due visualizzazioni consecutive.
   15. Dopo aver effettuato correttamente la registrazione, fare clic su Salva nella finestra "Multiview Explorer" per salvare il file .xml aggiornato.
   16. Apri il file embryo.xml in un editor di testo a tua scelta e copia le informazioni di registrazione dai marcatori nucleari agli altri canali.
3. Estrazione e assegnazione della funzione di diffusione dei punti
   1. Per eseguire la deconvoluzione multiview, estrarre la PSF del sistema di imaging dal set di dati delle perline registrate e applicarla al file dell'embrione.
   2. Per ottenere queste informazioni, selezionare tutte le viste nel file di perline, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere le opzioni Funzioni di diffusione dei punti e Estrai .
   3. Nella finestra di dialogo che appare, assicurati che le opzioni Usa punti di interesse corrispondenti e Rimuovi proiezioni di intensità minima da PSF siano selezionate, procedi con le dimensioni PSF predefinite e fai clic su OK.
      NOTA: Se l'estrazione PSF ha esito positivo per tutte le visualizzazioni, il file di registro visualizzerà "Estratto n/n PSF"
   4. Successivamente, salva nuovamente il file .xml. Apparirà una casella di controllo selezionata nella colonna PSF della finestra di dialogo "Multiview Explorer" e verrà generata una cartella "psf" nella rispettiva cartella con tutte le PSF estratte.
   5. Aprite il file embryo.xml e assegnate separatamente il file PSF per ciascuna visualizzazione. Fare clic con il pulsante destro del mouse su "una vista" → fare clic su Funzioni di diffusione dei punti → scegliere Assegna → selezionare Avanzate, quindi Assegna nuova PSF a tutte le viste selezionate. Fare clic su Sfoglia, andare al percorso del file .xml e aprire la cartella psf .
   6. Scegli il PSF corrispondente con l'ID corrispondente nella vista selezionata e fai clic su OK, dopodiché la casella di controllo PSF apparirà spuntata nella finestra "Multiview Explorer".
   7. Ripetere la procedura per tutte le altre visualizzazioni.
4. Fusione e deconvoluzione multiview
   1. Dopo aver assegnato la funzione di diffusione dei punti per tutte le viste, fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere Deconvoluzione multivista.
   2. Selezionare il riquadro di delimitazione come viste attualmente selezionate. Per questo lavoro, l'accelerazione OSEM predefinita e il numero di iterazioni funzionano bene.
   3. Eseguire il downsampling delle immagini in base alle esigenze, se si desidera un calcolo più veloce o se la memoria della CPU è limitante.
      NOTA: Se la RAM richiesta supera la memoria esistente, nella parte inferiore della finestra verrà visualizzato un messaggio di errore di avviso in colore rosso. Non avviare la deconvoluzione se viene visualizzato questo avviso, poiché il plug-in si bloccherà e smetterà di rispondere ad un certo punto durante l'elaborazione.
   4. Per valutare l'andamento della deconvoluzione, controllare il file di registro, che visualizzerà i risultati ogni 5 iterazioni.
   5. Per aumentare la velocità di calcolo, eseguire la deconvoluzione multiview nella GPU se precedentemente installata.
      NOTA: Al termine di questo processo, verrà visualizzata una finestra di immagine fusa, che può essere salvata come file tiff.

Risultati

L'orientamento preciso del campione è una parte vitale dell'utilizzo efficiente di una configurazione di microscopia. Tuttavia, l'orientamento manuale dei campioni spesso non è possibile quando si utilizza un sistema di fogli leggeri multiview, data la necessità di preparare i campioni in un tubo. Pertanto, per verificare se ci sono posizioni stereotipate che gli embrioni assumono all'interno del corion, gli embrioni di zebrafish sono stati sottoposti a imaging al 70% di epibolia (circa 7 ore dopo la fecondazione (hpf)), poiché l'imaging time-lapse dalla gastrulazione alle prime fasi di somite era il fulcro di questo studio. Quando i campioni sono stati preparati immediatamente prima dell'imaging al 70% di epibolia, gli embrioni non hanno mostrato alcun orientamento specifico che si osserva frequentemente tra i campioni. Poiché spesso ciò non è desiderabile, i campioni sono stati preparati molto prima della gastrulazione e conservati in provette da microcentrifuga alla temperatura appropriata fino all'inizio dell'imaging. In queste condizioni, al 70% di epibolia (N = 3; n = 87 embrioni), gli orientamenti dell'embrione potrebbero essere classificati in (1) Orizzontale, quando l'asse animale-vegetale (AV) dell'embrione era ortogonale all'asse lungo del tubo polimerico, (2) Verticale, quando l'asse AV era parallelo all'asse lungo del tubo polimerico, e, (3) Obliquo, quando l'asse AV era ad angolo acuto (Figura 3A). La posizione orizzontale è risultata la meno rappresentata, mentre le posizioni verticale e obliqua sono state osservate in egual misura (Figura 4).

Quando gli embrioni sono stati lasciati nelle tube, gli embrioni sono rimasti stabili in queste rispettive posizioni fino al 90% di epibolia, dopodiché la maggior parte degli embrioni ha cambiato il proprio orientamento. Pertanto, è stato necessario un secondo ciclo di documentazione degli orientamenti allo stadio di gemma dell'embriogenesi (circa 10 hpf) per tenere conto dei cambiamenti di orientamento. Questo è stato eseguito per campioni preparati in modo indipendente. Per l'imaging degli stadi iniziali del somite, è stato precedentemente riportato che un embrione con la sua notocorda ortogonale all'asse lungo del tubo polimerico era l'orientamento ideale in quanto consente la visualizzazione di più somiti bilaterali che si formano lungo l'asse¹⁵. Quando i campioni sono stati preparati prima della gastrulazione (N = 3, n = 93 embrioni), circa il 25% degli embrioni ha mostrato questo orientamento (Figura 4) e questi embrioni sono rimasti stabili in questo orientamento almeno fino allo stadio 8-somite, in linea con i rapporti precedenti¹⁵. Il resto degli embrioni mostrava vari altri orientamenti allo stadio di gemma (classificati nella Figura 3B e nella Figura 4); Tuttavia, molti di loro si sono riorientati in posizione orizzontale durante la prima formazione di Somite. È interessante notare che una percentuale simile di embrioni presentava un orientamento orizzontale allo stadio di gemma, indipendentemente dal fatto che il campione fosse stato preparato prima della gastrulazione, al 70% di epibolia o immediatamente prima dello stadio di gemma. Pertanto, i tempi di preparazione del campione sembrano meno critici per l'orientamento orizzontale di interesse per l'imaging degli stadi di somite, a differenza di quanto osservato per l'imaging al 70% dell'epibolia.

Il vantaggio di un sistema multiview è la possibilità di visualizzare lo stesso campione da più angolazioni. Tuttavia, per gli embrioni di zebrafish nelle fasi menzionate, il numero di visualizzazioni necessarie per ottenere la risoluzione cellulare nell'intero embrione non è chiaro. Per caratterizzare questo, gli embrioni di zebrafish sono stati ripresi utilizzando un obiettivo NA 20x/1 nel braccio di rilevamento con un fattore di zoom di 1, che corrispondeva a uno spessore del foglio leggero di 4,57 μm. In base a queste impostazioni, l'embrione copriva l'intero campo visivo di una fotocamera sCMOS con una dimensione dei pixel di 6,5 μm e un'area di 1920 x 1920 pixel. La microiniezione di mRNA per un fluoroforo marcato con istone (H2A-mCherry) in embrioni in stadio di 1 cellula ottenuti da una linea transgenica che marcava i filamenti di actina (Utr-GFP) ha permesso la visualizzazione sia dei nuclei che delle membrane cellulari nell'embrione. Per eseguire la fusione multiview di embrioni con diversi intervalli angolari, è stata eseguita l'acquisizione a 360° degli embrioni transgenici doppi e delle perle nella provetta ogni intervalli di 30° (n = 3 embrioni al 70% di epibolia; n = 3 embrioni allo stadio di gemma) o 45° (n = 3 embrioni al 70% di epibolia; n = 3 embrioni allo stadio di gemma) con circa 100 fette in ogni angolo e un intervallo di fette di 2 μm. Saltando gli angoli alternati durante l'elaborazione delle immagini, le acquisizioni a 30° e 45° hanno fornito in aggiunta i set di dati a 60° e 90°.

Le immagini acquisite sono state quindi registrate utilizzando le informazioni sulla perlina e i dettagli di registrazione sono stati trasferiti al set di dati dell'embrione come descritto nella sezione del protocollo. La registrazione con successo utilizzando il plug-in BigStitcher è stata ottenuta per le diverse acquisizioni, ad eccezione del set di dati a 90°, probabilmente a causa della minore copertura del campione da ogni angolazione. Per ovviare a questo problema, gli embrioni sono stati sottoposti a imaging ogni 90° con circa 400 fette in ogni angolo e un intervallo di fetta di 2 μm, sia allo stadio epibolibico che a quello di gemma al 70%, che sono stati registrati con successo (n = 3 embrioni per ogni stadio).

Il passo successivo è stato quello di eseguire la fusione multiview e la deconvoluzione dei set di dati registrati. Questo è stato fatto con un downsampling 4x per velocizzare il calcolo. Come si vede nella rappresentazione dei nuclei da viste individuali e di un embrione ricostruito a più viste (Figura 5), le viste individuali coprono un campo visivo più piccolo, che, dopo la fusione, ha prodotto un'immagine dell'intero embrione. Per la rappresentazione, i nuclei sono stati rilevati utilizzando Mastodon (https://github.com/mastodon-sc/mastodon), un plug-in basato su FIJI, che può essere aggiunto nella sezione "Gestisci siti di aggiornamento" del menu "Aiuto" in FIJI e accessibile dal menu dei plug-in una volta aggiunto. Per il rilevamento, le rispettive immagini sono state prima convertite in formato XML/hdf5, quindi il rilevamento nucleare è stato eseguito utilizzando il plug-in "Detection" di Mastodon con un rivelatore DoG (diametro 6 μm e soglia di qualità 80).

Tra le diverse immagini fuse, il set di dati a 90° mostrava uno sfondo molto alto più profondo nel campione, rendendolo inadatto per eseguire qualsiasi quantificazione. Pertanto, a differenza dei campioni più piccoli come gli embrioni di Drosophila, che sono stati spesso visualizzati con un intervallo di 90° in altri studi ^9,22, lo stesso non è raccomandato per l'imaging precoce di embrioni di zebrafish utilizzando un obiettivo NA 20x/1. Tra i set di dati fusi a 30°, 45° e 60°, qualitativamente, non c'era alcuna differenza sostanziale nelle informazioni sui nuclei (Figura 6B, riga superiore); tuttavia, le strutture più fini come i confini delle celle sembravano risolte molto meglio con il set di dati fusi a 30° rispetto al resto (Figura 6C, riga superiore).

Per confermare questa osservazione, Mastodon è stato utilizzato per rilevare i nuclei nelle immagini fuse ottenute dall'imaging ogni 30°, 45° e 60°. Per l'analisi sono state scelte tre regioni nelle immagini fuse, una ciascuna a una profondità di 20 μm (Figura 6A), 50 μm e 100 μm dalla superficie dell'embrione. Per confrontare l'efficienza del rilevamento dei nuclei tra le immagini, il rilevamento è stato eseguito come descritto sopra, con parametri identici tra le immagini fuse da diversi intervalli angolari. In tutte le regioni analizzate, ogni nucleo è stato rilevato indipendentemente dalle immagini fuse ottenute dall'imaging ogni 30°, 45° o 60° (Figura 6B, riga inferiore). Pertanto, le strutture globulari come i nuclei possono essere visualizzate a uno qualsiasi degli intervalli angolari di cui sopra senza perdita di informazioni.

Per l'analisi dei confini cellulari, è stato utilizzato Tissue Analyzer²³, un plug-in FIJI utilizzato abitualmente per segmentare le cellule 24,25,26. Simile a Mastodon, il plug-in Tissue Analyzer può essere aggiunto nella sezione "Gestisci siti di aggiornamento" del menu "Aiuto" in FIJI e accessibile dal menu dei plug-in una volta aggiunto. I confini cellulari sono stati segmentati utilizzando l'algoritmo del bacino idrografico con parametri predefiniti e una forte sfocatura che va da 1,5 a 2 a seconda della profondità del tessuto e una debole sfocatura di 1. Questi parametri sono stati mantenuti costanti in tutte le analisi, facilitando un confronto semplice. Quando le immagini segmentate sono state confrontate manualmente con le immagini di input originali, sono stati osservati errori, in cui il software non è riuscito a rilevare un confine di cella o ha disegnato confini di celle inesistenti (Figura 6C, riga inferiore). Il numero di errori commessi dal plug-in dell'analizzatore tissutale è stato normalizzato al numero totale di legami rilevati nella regione e calcolato come "Errore di segmentazione del contorno". Sebbene questi errori fossero presenti in tutte le regioni analizzate, il numero di errori è aumentato drasticamente nelle immagini fuse ottenute dall'imaging a intervalli angolari di 45° e 60°, rispetto ai 30° (Figura 6D). Ciò indicava che la risoluzione nelle immagini fuse era sempre peggiore all'aumentare dell'intervallo angolare. Pertanto, per segmentare strutture più fini come i confini cellulari, un intervallo angolare più stretto consente un'elaborazione più semplice a valle.

Figura 1: Preparazione del campione utilizzando provette polimeriche. (A) Una provetta polimerica dalle provette per microcentrifuga conservate viene prelevata utilizzando una pinza. (B) Collegare la provetta alla punta di una micropipetta da 200 μl. (C) Aspirare gli embrioni con l'aiuto di una pipetta nella provetta. (D,E) Un tubo polimerico con embrioni allo stadio di gemma visibili verso il fondo del tubo. (F) I tubi polimerici vengono posizionati su una piastra di Petri con E3 per solidificare l'agarosio. (G) Conservare le provette polimeriche in una provetta da microcentrifuga riempita con E3. (H) Portacampioni assemblato con il tubo polimerico montato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Flusso di lavoro di analisi delle immagini multiview e registrazione tramite perline. (A) La pipeline di analisi delle immagini multivista. (B) L'immagine mostra la finestra "Multiview Explorer" in BigStitcher, un plugin FIJI, dove ogni vista appare come una singola riga e contiene informazioni sull'angolo, il canale, la registrazione, i punti di interesse e il PSF. Tutti i comandi descritti nel protocollo vengono visualizzati quando viene selezionata una vista e seguiti da un clic con il pulsante destro del mouse, come illustrato nel menu a comparsa. Le viste selezionate possono essere visualizzate nella finestra di BigDataViewer, come illustrato. (C) Un'immagine rappresentativa del cordone prima (a sinistra) e dopo la registrazione (a destra) ottenuta dall'imaging a intervalli angolari di 30°. Tutte le viste angolari sono state selezionate e visualizzate. Barre della scala: 75 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Panoramica degli orientamenti embrionali predefiniti. Immagini rappresentative degli orientamenti in cui cadono gli embrioni all'interno del corion al 70% degli stadi di epibolia (A) e gemma (B). La riga superiore di ogni pannello raffigura immagini in campo chiaro ottenute dal sistema di fogli luminosi, mentre la riga inferiore raffigura cartoni animati rappresentativi. Le frecce in (B) indicano la posizione della notocorda, che è stata utilizzata per identificare l'orientamento. Ap, palo animale; Vp, palo vegetale; A, anteriore; P, posteriore. Barre di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Statistiche dei diversi orientamenti embrionali. (A) La colonna impilata indica le percentuali di embrioni che rientrano negli orientamenti indicati al 70% di epibolia quando i campioni vengono preparati prima della gastrulazione. (B) Le colonne impilate indicano le percentuali di embrioni che rientrano negli orientamenti indicati negli stadi di gemma quando i campioni vengono preparati prima della gastrulazione (a sinistra), al 70% di epibolia (al centro) e agli stadi di gemma (a destra). N, il numero di covate indipendenti da cui sono stati ottenuti gli embrioni; n, il numero totale di embrioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Rappresentazione dei nuclei di un embrione ricostruito multiview. (A)Il grafico a dispersione 3D rappresenta i nuclei rilevati in un embrione ricostruito in multivista ripreso con un intervallo angolare di 30°. Ogni cerchio rappresenta un nucleo e viene tracciato il baricentro delle posizioni dei nuclei. Le coordinate nucleari sono state ottenute utilizzando Mastodon, un plug-in FIJI. (B) Grafici a dispersione 3D di nuclei da tre viste rappresentative dello stesso embrione - le rappresentazioni sono a 60° di distanza. I colori per ogni nucleo sono stati assegnati in modo casuale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Confronto delle informazioni su scala cellulare in immagini fuse. (A) L'immagine a sinistra mostra un'istantanea di un embrione ricostruito in multivista a una profondità di 20 μm dalla superficie. Il cerchio giallo rappresenta la regione utilizzata per ulteriori analisi. Barre di scala: 50 μm (in tutti i pannelli). (B) Immagini grezze rappresentative di nuclei a 20 μm di profondità dalla superficie dell'embrione da tre set di dati ripresi rispettivamente ogni 30°, 45° e 60° (in alto). Nuclei rilevati (in verde) nelle stesse immagini da Mastodon, un plugin FIJI (in basso). (C) Immagini grezze rappresentative a 20 μm di profondità dalla superficie dell'embrione da tre set di dati ripresi rispettivamente ogni 30°, 45° e 60°, utilizzando il marcatore di actina, Utr-GFP (in alto). I confini segmentati da Tissue Analyzer, un plug-in FIJI, vengono visualizzati per le stesse immagini (in basso). Le frecce indicano gli errori commessi dall'analizzatore di tessuti nella segmentazione dei confini, con la freccia gialla che rappresenta un confine mancante e la freccia bianca che rappresenta i confini rilevati erroneamente quando visivamente non sembrano esistere confini. (D) Il box plot mostra la percentuale di errori commessi dall'analizzatore tissutale tra embrioni ricostruiti multiview sottoposti a imaging ogni 30°, 45° e 60° a diverse profondità. Le barre di errore indicano 1,5 volte l'intervallo interquartile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Posizionare un embrione con il giusto orientamento per visualizzare la regione di interesse è uno dei passaggi limitanti che spesso si traduce in una sessione di microscopia fallita per un utente. Questo è ancora più vero in un microscopio a foglio ottico multivista, dove la manipolazione manuale dell'orientamento è difficile poiché i campioni sono incorporati all'interno di un tubo. Per aiutare in questo processo, questo studio riporta le statistiche di varie posizioni in cui un embrione di pesce zebra occupa tra il 70% degli stadi epibolici e quelli iniziali di somite all'interno di un corion quando la provetta polimerica con gli embrioni viene tenuta in posizione verticale in una provetta da microcentrifuga.

Con il 70% di epibolia, gli embrioni orientati verticalmente o orizzontalmente forniscono informazioni complementari sugli eventi in tutto l'embrione. Mentre l'orientamento orizzontale consente la visualizzazione delle dinamiche cellulari nel polo animale e della dinamica delle cellule sottoposte a epibolia viste dal polo vegetale, l'orientamento verticale consente la visualizzazione dei lati dorsali e ventrali dell'embrione, comprese le dinamiche cellulari nell'organizzatore dorsale, l'internalizzazione delle cellule durante la gastrulazione e i flussi di convergenza-estensione. Questo studio dimostra che esiste un'alta probabilità di ottenere un embrione con orientamento verticale per puro caso se i campioni vengono preparati alcune ore prima dell'imaging; Tuttavia, l'orientamento orizzontale sembra essere molto meno diffuso in queste fasi. Per gli stadi precedenti al 70% di epibolia, si raccomanda agli utenti di documentare statistiche simili sull'orientamento dell'embrione all'interno del corion prima di procedere con l'imaging time-lapse, poiché avere queste informazioni in anticipo consente di risparmiare tempo a lungo termine.

Dalla fase di gemma, l'orientamento migliore per l'imaging è un embrione posizionato orizzontalmente, in quanto ciò consente di seguire le dinamiche cellulari lungo l'intero asse del corpo anteroposteriore degli embrioni¹⁵. Ottenere un embrione in questo orientamento è relativamente semplice, poiché circa il 25% degli embrioni cade in questa posizione stabile indipendentemente da quando il campione viene preparato. In generale, per l'imaging di qualsiasi fase di interesse, si consiglia di preparare circa 15 provette con due o tre embrioni in ciascuna provetta, che garantiranno un'alta probabilità di ottenere embrioni nell'orientamento desiderato e, quindi, una sessione di microscopia di successo in un dato giorno. Inoltre, si consiglia di ordinare le tube circa un'ora prima della fase di interesse per scegliere un embrione con il giusto orientamento per l'imaging time-lapse.

Dopo aver ottenuto un embrione con il giusto orientamento, è importante tenere conto del numero di viste e dell'intervallo di angolo tra le viste per l'imaging. Ciò dipende dalla risoluzione spaziale e temporale minima richiesta. Più angolazioni vengono visualizzate da una particolare struttura o regione dell'embrione, migliore è la risoluzione spaziale (come mostrato nella Figura 6), ma questo porta a un compromesso sulla risoluzione temporale. In questo protocollo, con un sistema che ha due bracci di illuminazione e uno di rilevamento, l'imaging di due canali su un intero 360° con un intervallo angolare di 30° e circa 100 z-slice in ciascun angolo con una spaziatura delle fette di 2 μm, ha richiesto circa 3 minuti per un punto una tantum. Sebbene ciò sia sufficiente per tracciare le cellule nelle prime fasi embrionali, se si vogliono catturare eventi con dinamiche più veloci, è necessario acquisire un numero minore di angoli, garantendo una migliore risoluzione temporale ma con un compromesso sulla risoluzione spaziale, soprattutto se le strutture più fini come i confini cellulari devono essere segmentate. Una seconda opzione da considerare per migliorare la risoluzione temporale è quella di utilizzare un sistema multiview con due bracci di rilevamento, che aumenterà sostanzialmente la velocità di acquisizione utilizzata di recente per tracciare i movimenti cellulari durante la gastrulazione negli embrioni di zebrafish¹⁶. Inoltre, sebbene in questo protocollo sia stato testato solo l'obiettivo NA 20x/1, a seconda del campione da riprendere, della risoluzione spaziale richiesta e del campo visivo, è necessario considerare l'obiettivo giusto. Nel complesso, in base all'elaborazione e alla quantificazione a valle necessarie per un particolare campione e campo visivo, il numero di viste e l'intervallo angolare devono essere scelti con attenzione. Per l'imaging di interi embrioni precoci di zebrafish, in particolare con risoluzione su scala cellulare da più angolazioni, tuttavia, un obiettivo NA 20x/1 sembra essere ottimale, poiché un obiettivo con un ingrandimento inferiore e NA (ad esempio, un obiettivo NA 10x/0,5) avrà una risoluzione molto più bassa, portando probabilmente a più errori di segmentazione, mentre un obiettivo con ingrandimento e NA più elevati non sarà fattibile per coprire l'intero embrione nel campo visivo della fotocamera.

In questo studio, per discutere le strategie di montaggio e di imaging, sono stati utilizzati un marcatore di actina, che può essere utilizzato come proxy per tracciare i confini cellulari, e un marcatore istonico, per rilevare e tracciare i nuclei. In effetti, la maggior parte degli studi pubblicati in precedenza che hanno utilizzato un sistema di fogli luminosi multiview hanno utilizzato preferenzialmente marcatori simili 5,7,15,16,27. Il motivo principale per la scelta di questi marcatori è che la microscopia a foglio di luce multiview viene utilizzata principalmente per seguire le dinamiche su scala cellulare (ad esempio, forma e riarrangiamento cellulare) sia su scala tissutale che su tutto l'embrione per lunghi periodi di tempo che vanno da diverse ore a giorni. D'altra parte, se c'è la necessità di ottenere una risoluzione subcellulare, potrebbe essere utilizzata una linea transgenica diversa che segna la regione di interesse, ma in questo scenario, un microscopio a foglio di luce multiview potrebbe non essere la scelta migliore di strumento, e piuttosto un confocale, un sistema di super-risoluzione o anche un microscopio a foglio di luce reticolare^{28, 29} potrebbe adattarsi meglio al problema oggetto di indagine.

Il protocollo discusso funziona bene dalla gastrulazione agli embrioni di zebrafish allo stadio 15-somite³⁰ (circa 17 hpf) senza alcuna modifica e, sebbene non testato qui, è probabile che funzioni anche per embrioni precedenti prima della fase di gastrulazione. Oltre lo stadio 15-somite, iniziano le contrazioni muscolari spontanee^30,31, che possono essere soppresse aggiungendo tricaina, un anestetico, nella provetta e nella camera del campione. Inoltre, a circa 18 hpf, l'eversione della coda lontano dal tuorlo inizia^{a 30}, il che allontana l'embrione dal campo visivo. Per risolvere questo problema, è necessario utilizzare un algoritmo di tracciamento che tenga traccia dell'estremità allungata per mantenere l'embrione a fuoco³². Inoltre, per l'imaging di embrioni in fase avanzata quando sono privi di un corion, ad esempio per seguire lo sviluppo neurale, è necessario impiegare una strategia di montaggio alternativa come recentemente eseguita³³.

Per l'imaging di embrioni di zebrafish con un corion intatto, non è possibile catturare sia le perline, che fungono da marcatori di registrazione, sia l'embrione nello stesso campo visivo utilizzando un obiettivo NA 20x/1. Questo studio fornisce una semplice alternativa registrando le diverse visualizzazioni con le informazioni provenienti dalle perle presenti sopra o sotto il campione, seguite dallo spostamento della registrazione dalle perle all'embrione durante la lavorazione. Una volta che il campione di embrione è stato registrato in questo modo, può essere eseguito un secondo ciclo di registrazione utilizzando i nuclei come marcatori di registrazione, che sono presenti all'interno del campione, per un'ulteriore messa a punto della registrazione iniziale. Quando si esegue l'imaging time-lapse, le informazioni sui nuclei, a loro volta, possono essere utilizzate per la registrazione di punti temporali consecutivi come è stato riportato in precedenza²¹. Un'alternativa a questo protocollo è quella di rinunciare alle perline e utilizzare invece le informazioni sui nuclei per la registrazione iniziale. Ma la registrazione spesso falliva (non mostrata qui) nel plugin BigStitcher, probabilmente a causa di una combinazione di molti nuclei che non venivano rilevati più in profondità nell'embrione durante l'elaborazione e anche a causa di un numero relativamente più piccolo di nuclei che sono presenti nell'embrione se visti da certe angolazioni (ad esempio quando visti ventralmente in fasi epiboliche tardive).

In questo protocollo, poiché le informazioni sulle microsfere dall'alto o dal basso del campione vengono utilizzate per la registrazione e non è necessario che le microsfere vengano visualizzate nella stessa vista del campione, è possibile utilizzare questo protocollo per l'imaging solo di specifiche regioni di interesse, ma ad alto ingrandimento da diverse angolazioni anziché dall'intero embrione. Inoltre, è facile adattare questo protocollo per l'imaging di più campioni impilati verticalmente nella provetta utilizzando le informazioni sulle perline tra i campioni per la registrazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agarosio, bassa temperatura di gelificazione	Sigma-Aldrich	A9414
Cloruro di calcio diidrato	Sigma-Aldrich	12022
Versione FIJI			: ImageJ 1.54f
Perle di lattice, polistirene modificato con carbossilato, rosso fluorescente, 0.5 μ m dimensione media delle particelle, sospensione acquosa	Sigma-Aldrich	L3280
Solfato di magnesio eptaidrato	Sigma-Aldrich	M2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit di trascrizione	ThermoFischer Scientific	AM1340	Per la trascrizione in vitro del plasmide H2A-mCherry
Cloride di potassio	Sigma-Aldrich	P9541
Fosfato di potassio monobasico	Sigma-Aldrich	P0662
Guaina in PTFE AWG 15L - 1,58 mm ID x 0,15 mm Parete +/-0,05	Innovazioni Adtech in Fluoroplastiche	STW15	Provette in PTFE
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S3014
Fosfato di sodio bibasico	Sigma-Aldrich	71640
Pulitore ad ultrasuoni	Labman	LMUC3
Ultrasuoni Zeiss LightSheet 7 Sistema	Zeiss