Articolo metodologico

Utilizzo di organoidi intestinali umani per comprendere l'epitelio dell'intestino tenue a livello trascrizionale di una singola cellula

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DOI:

10.3791/66749

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28 giugno 2024

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1Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

In questo articolo

Sommario

Il protocollo combina la tecnologia degli organoidi intestinali umani con l'analisi trascrittomica a singola cellula per fornire informazioni significative sulla biologia intestinale precedentemente inesplorata.

Abstract

La trascrittomica a singola cellula ha rivoluzionato la nostra comprensione della biologia cellulare del corpo umano. Le colture di organoidi intestinali tenue umani all'avanguardia forniscono sistemi modello ex vivo che colmano il divario tra i modelli animali e gli studi clinici. L'applicazione della trascrittomica a singola cellula a modelli di organoidi intestinali umani (HIO) sta rivelando la biologia, la biochimica e la fisiologia cellulare del tratto gastrointestinale precedentemente non riconosciute. Le piattaforme avanzate di trascrittomica a singola cellula utilizzano il partizionamento microfluidico e la codifica a barre per generare librerie di cDNA. Questi cDNA con codice a barre possono essere facilmente sequenziati da piattaforme di sequenziamento di nuova generazione e utilizzati da vari strumenti di visualizzazione per generare mappe. Qui, descriviamo i metodi per coltivare e differenziare gli HIO dell'intestino tenue umano in diversi formati e procedure per isolare le cellule vitali da questi formati che sono adatti per l'uso in piattaforme di profilazione trascrizionale a singola cellula. Questi protocolli e procedure facilitano l'uso di HIO intestinali tenue per ottenere una maggiore comprensione della risposta cellulare dell'epitelio intestinale umano a livello trascrizionale nel contesto di una varietà di ambienti diversi.

Introduzione

L'epitelio dell'intestino tenue ha due zone distinte: la cripta che ospita la cellula staminale intestinale (ISC) e il villo, che è composto da cellule differenziate delle linee secretorie e assorbenti. A questa complessità si aggiunge la specificità regionale dell'epitelio che fornisce proprietà funzionali uniche tra le regioni dell'intestino tenue. Il lavoro pionieristico ha stabilito le condizioni di coltura in cui sia la cripta intestinale tenue umana che le zone dei villi possono essere generate ex vivo da tessuti chirurgici o biopsie tissutali1. Queste colture stanno colmando il divario tra gli studi sugli animali e gli studi clinici e stanno rivelando la biologia cellulare, la biochimica e la fisiologia del tratto gastrointestinale precedentemente non riconosciute. Le HIO vengono propagate come strutture sferiche 3D utilizzando un mezzo con fattori di crescita che promuovono la vitalità delle cellule staminali e matrici di supporto extracellulare. Queste condizioni si traducono in un modello HIO simile a una cripta che consiste principalmente di progenitori e cellule staminali. La rimozione dei fattori di crescita promuove la differenziazione delle ISC (modello simile ai villi) e la produzione di cellule epiteliali intestinali mature (calice, enteroendocrino, ciuffo, enterociti) in rapporti appropriati insieme alla proliferazione e differenziazione cellulare, alla polarizzazione, all'integrità della barriera, alle caratteristiche specifiche regionali e alle risposte fisiologiche appropriate2. Le colture HIO sono geneticamente stabili e possono essere propagate all'infinito nel loro stato simile a una cripta. Il facile accesso alla superficie apicale di queste colture è fornito dalle condizioni di coltura che consentono la crescita in un formato monostrato3. Gli HIO consentono inoltre di includere nelle analisi biologiche considerazioni sulla variabilità individuale dell'ospite, come la genetica, l'età, il sesso, l'etnia e lo stato della malattia. Gli strumenti di valutazione analitica e funzionale sono identici a quelli utilizzati negli approcci incentrati su linee cellulari trasformate e includono una varietà di tecniche molecolari come la citometria a flusso, la microscopia, la trascrittomica, la proteomica e la metabolomica.

La trascrittomica a singola cellula sta rivoluzionando la nostra comprensione della biologia e della fisiologia dell'intestino tenue, fornendo informazioni sui contributi individuali di ciascun tipo di cellula a un processo biologico. Il lavoro pionieristico che utilizza questa tecnologia ha fornito un panorama dei tipi di cellule presenti nell'intestino umano nativo 4,5,6. Le piattaforme di profilazione trascrizionale a singola cellula consentono l'esplorazione del panorama trascrizionale delle singole cellule, consentendo all'eterogeneità cellulare di essere in prima linea nell'esplorazione scientifica. In alcune piattaforme di profilazione trascrizionale di singole cellule, il partizionamento microfluidico e il barcoding vengono utilizzati per generare librerie di cDNA da mRNA poliadenilati cellulari ottenuti da un massimo di 10.000 cellule per campione. Su questa piattaforma, goccioline contenenti singole cellule, oligonucleotidi con codice a barre, reagenti di trascrizione inversa e olio formano una vescicola di reazione che si traduce in tutti i cDNA di una singola cellula con lo stesso codice a barre. I cDNA con codice a barre possono quindi essere sequenziati in modo efficiente utilizzando il sequenziamento di nuova generazione. I dati generati possono essere gestiti attraverso software e strumenti di visualizzazione, che convertono le sequenze con codice a barre in mappe di visualizzazione e profili trascrizionali a singola cellula. Le popolazioni cellulari possono essere identificate utilizzando database pubblicamente disponibili di epitelio umano dell'intestino tenue 4,5,6. Sebbene molti studi abbiano utilizzato questa piattaforma per interrogare organoidi intestinali murini a livello di singola cellula, l'analisi delle risposte trascrizionali di singole cellule di HIO è rimasta indietro rispetto a 7,8,9,10,11,12.

Qui, forniamo una guida passo passo per isolare cellule vitali da HIO intestinali tenue per l'elaborazione su piattaforme di profilazione trascrizionale a singola cellula (Figura 1). Forniamo linee guida per la coltura e la differenziazione insieme a componenti del terreno che sono stati ottimizzati per la differenziazione epiteliale. Delineiamo i metodi di recupero cellulare per tre diversi formati di coltura: colture tridimensionali (3D) e monostrato su inserti di coltura cellulare in plastica o a membrana. Forniamo dati di clustering dei campioni ottenuti utilizzando software open source per derivare geni espressi in modo differenziale in ciascun cluster.

Protocollo

Le linee di organoidi utilizzate qui sono state ottenute dal Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core. In breve, per stabilire inizialmente le linee di organoidi, i campioni di tessuto del donatore sono stati lavati e digeriti enzimaticamente per rilasciare le cripte intestinali. Le cripte sono state incorporate in una membrana basale e coltivate in un mezzo. L'Institutional Review Board del Baylor College of Medicine ha approvato il protocollo di studio per ottenere campioni di tessuto da cui sono state stabilite le linee di organoidi ed è stato ottenuto il consenso informato da tutti i donatori per stabilire linee di organoidi dal tessuto donato.

1. Passaggio di HIO 3D per espandersi per la differenziazione

  1. Rimuovere e scartare il terreno dai pozzetti degli organoidi coltivati in piastre a 24 pozzetti (attorno alla membrana solida del basamento) con una pipetta P1000. Aggiungere 300 μl di tripsina-EDTA allo 0,05% al pozzetto e rompere meccanicamente gli organoidi pipettandoli con una pipetta P1000 su e giù 5 volte.
  2. Incubare la piastra a 37 °C per 4 min. Aggiungere 500 μL di terreno completo senza fattori di crescita (CMGF- terreno) con il 10% di FBS in ciascun pozzetto (Tabella 1). Utilizzare una pipetta P1000 e pipettare il terreno CMGF e la miscela HIO, 10 volte avanti e indietro nel pozzetto. Trasferire l'intero volume in una provetta da 15 ml. Combinare il passaggio da più pozzetti nella stessa provetta da 15 mL. Non combinare più di 10 pozzetti per provetta.
  3. Centrifugare le celle a 4 °C utilizzando una centrifuga a rotore oscillante a 100 x g per 5 minuti. Rimuovere tutto il substrato, mantenendo il pellet sul fondo del tubo. Mantieni il tubo sul ghiaccio.
  4. Calcolare la quantità di membrana basale necessaria per il numero di HIO placcati e risospendere il pellet HIO in 30 μL/pozzetto di membrana basale utilizzando puntali per pipette P200 freddi. Pipettare la miscela di membrane basali HIO sotto forma di gocciolina al centro di una piastra a 24 pozzetti utilizzando puntali per pipette P200 freddi.
  5. Trasferire la piastra in un'incubatrice a 37 °C. Lasciare solidificare la membrana basale per 5-10 minuti, quindi aggiungere 500 μL di terreno completo a temperatura ambiente contenente WNT, R-spondina, noggina, EGF e inibitore ROCK (WRNE+Y; Tabella 1) per ogni pozzetto e coltura in un incubatore a 37 °C. Aggiorna la cultura con WRNE+Y a giorni alterni per 7 giorni.
    NOTA: Un HIO sano avrà una forma cistica con un epitelio lucido in germoglio (Figura 2). Le cellule al centro della cisti non possono essere visualizzate. Un HIO malsano sembrerà opaco e avrà un epitelio spesso con un centro solido. La caratteristica più importante è l'aspetto lucido.

2. Differenziazione HIO: formato 3D

  1. Utilizzare un pozzetto di HIO 3D per 3 pozzetti di HIO differenziati 3D 1 settimana dopo la coltura.
  2. Rimuovere i supporti dai pozzetti. Disperdere la membrana basale e gli HIO utilizzando una pipetta P1000 e aggiungere 500 μL freddi di CMGF- per pozzetto e pipettare su e giù almeno 5 volte. Far girare gli HIO a 4 °C utilizzando una centrifuga a rotore oscillante a 100 x g per 5 minuti. Rimuovere tutto il substrato mantenendo il pellet sul fondo del tubo.
  3. Aggiungere 30 μl di membrana basale per pozzetto di HIO da placcare. Pipettare la goccia da 30 μl di membrana basale con HIO in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Incubare a 37 °C per 10 min. Aggiungere 500 μl di terreno WRNE+Y/Diff (50/50).
  4. Passare dal mezzo al mezzo di differenziazione dopo 24 ore per altri 3 giorni, rinfrescando il mezzo a giorni alterni. Preparare 3 pozzetti per campione da raggruppare per ridurre la variabilità tecnica.

3. Differenziazione HIO: formato monostrato

  1. Rivestire gli inserti o i pozzetti di coltura cellulare a membrana di una piastra a 96 pozzetti con 100 μL/pozzetto di collagene placentare umano IV (1 mg/ml in acido acetico 100 mM) diluito in H2O freddo (1:30). Incubare a 37 °C per un minimo di 1,5 ore o massimo durante la notte. Per l'inserto per colture cellulari a membrana, aggiungere H2O sterile nello spazio della piastra per umidificare la piastra; per la piastra a 96 pozzetti, aggiungere H2O sterile nei pozzetti non utilizzati.
  2. Raccogliere HIO 3D coltivati in WRNE per 7 giorni rimuovendo il terreno e recuperando la membrana basale e le cellule aggiungendo 500 μL/pozzetto di EDTA 0,5 mM freddo (0,5 M EDTA diluito 1:1000 in PBS sterile). Utilizzare una pipetta P1000 per pipettare gli organoidi e la soluzione su e giù 5 volte e trasferirli in una provetta da microcentrifuga da 15 mL. Non raggruppare più di 10 pozzetti di organoidi per provetta. Centrifugare per 5 minuti a 300 x g in un rotore a secchiello oscillante a 4 °C.
    NOTA: Per preparare 3 pozzetti su una piastra da 96 pozzetti, utilizzare 1 pozzetto di HIO 3D. Per preparare 1 foglietto illustrativo per colture cellulari a membrana, utilizzare 1 pozzetto di HIO 3D (la densità di semina delle singole cellule è di circa 1-2 x 105 cellule/pozzetto per piastra a 96 pozzetti, 2,5-3 x 105 cellule/pozzetto per l'inserto per colture cellulari a membrana).
  3. Rimuovere 500 μl di fluido, lasciando il pellet sul fondo della provetta. Dissociare gli HIO aggiungendo 500 μl di tripsina allo 0,05%/0,5 mM EDTA e incubando per 4-5 minuti a 37 °C. Pipettare energicamente su e giù per ~50x utilizzando un P1000. Evitare di formare bolle pipettando contro il lato della provetta.
  4. Inattivare la tripsina aggiungendo 1 mL di CMGF- contenente il 10% di FBS. Filtrare grandi grumi di cellule non digerite bagnando un colino cellulare da 40 μm con 1 mL di CMGF- contenente il 10% di FBS e aggiungendo le cellule alla parte superiore del colino cellulare. Utilizzare la gravità per consentire alle cellule di passare attraverso il filtro e scartare il filtro cellulare contenente grumi di cellule.
  5. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione per 5 minuti a 400 x g in un rotore a secchiello oscillante a temperatura ambiente.
  6. Rimuovere il liquido dall'inserto di coltura cellulare a membrana rivestito di collagene o dalla piastra a 96 pozzetti. Risospendere il pellet HIO in 100 μL/pozzetto di WRNE contenente 10 μM di Y-27632, quindi pipettare nel compartimento superiore dell'inserto di coltura cellulare a membrana o nella piastra a 96 pozzetti. Per l'inserto di coltura cellulare a membrana, aggiungere 600 μL di WRNE contenente 10 μM di Y-27632 nel compartimento inferiore del pozzetto.
  7. Rimuovere il terreno dopo 24 ore sia dalla parte superiore che da quella inferiore dell'inserto di coltura cellulare a membrana o dalla piastra a 96 pozzetti e sostituirlo con un terreno di differenziazione per 5 giorni. Preparare 3 pozzetti per campione da raggruppare per ridurre la variabilità tecnica.

4. Preparazione di sospensioni di singole cellule da HIO 3D differenziate per trascrittomica a singola cellula

  1. Porre il reagente enzimatico per la digestione cellulare a 37 °C in un incubatore di CO2 per scongelare e riscaldare 30 minuti prima dell'inizio della digestione 3D HIO. Controlla gli HIO usando un microscopio a campo chiaro a 10x per garantire la salute delle cellule.
  2. Rimuovere il terreno dai pozzetti e aggiungere 500 μl di soluzione per il recupero delle celle fredde ai pozzetti. Pipettare su e giù alcune volte per liberare le cellule dalla membrana basale utilizzando una pipetta P1000 e puntali per pipette standard. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
    NOTA: L'uso di pozzetti replicati garantisce un numero adeguato di cellule e riduce la variazione da pozzetto a pozzetto. Non combinare i pozzetti prima del passaggio 4.7 di seguito.
  3. Incubare le provette di cellule su ghiaccio per 10 minuti, pipettando su e giù ogni 5 minuti. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione per 3 minuti a 400 x g a 4 °C.
  4. Rimuovere il liquido dal tubo, facendo attenzione a non disturbare il pellet della cella. Risospendere le cellule in 500 μl di reagente per la digestione enzimatica delle cellule preriscaldato. Pipettare su e giù con un P1000 almeno 10x.
  5. Incubare gli HIO per 30 minuti a 37 °C in un incubatore di CO2 . Ogni 10 minuti, pipettare l'intero volume 10 volte utilizzando una pipetta P1000 per aiutare a dissociare le cellule. Evitare di introdurre bolle d'aria nella sospensione cellulare.
  6. Pellettare le celle per 3 minuti a 400 x g a 4 °C. Rimuovere il surnatante, risospendere le cellule in 1 mL di terreno di differenziazione e conservarle in ghiaccio.
    NOTA: Da questo momento in poi, gli HIO devono essere sempre tenuti in ghiaccio.
  7. Pipettare le cellule su e giù 50 volte rapidamente utilizzando un P1000 per garantire che gli HIO siano dissociati in singole cellule. Fare attenzione a non introdurre bolle d'aria in questa fase, poiché causerà la perdita di cellule.
  8. Filtrare l'intero volume attraverso un filtro a punta da 70 μm utilizzando un puntale per pipetta P1000. Utilizzare una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml per raccogliere l'eluato.
    NOTA: La punta del filtro non si ostruisce se il tempo di digestione è sufficiente. Utilizzare più punte del filtro se il filtro si ostruisce; Non forzare il volume attraverso il filtro.
  9. Ripetere il passaggio 4.8 con un colino con punta da 40 μm. Conservare i campioni sul ghiaccio.
  10. Contare le singole cellule vitali su una camera di conteggio cellulare utilizzando l'esclusione del blu di tripano aggiungendo 5 μl di blu di tripano allo 0,4% a 5 μl di sospensione cellulare. Diluire il campione secondo necessità a 1000 cellule/μL. Se la densità cellulare è inferiore a 1000 cellule/μL, pellettare le celle per 2 minuti a 400 x g a 4 °C, rimuovere il terreno originale e risospendere in terreno di coltura cellulare. Questo protocollo produce in genere 5 x 105-1 x 106 cellule.
    NOTA: La preparazione di una sospensione di alta qualità (90% vitale e 90% cellule singole) è essenziale per dati di alta qualità su singole cellule. Tuttavia, l'esperienza indica che una vitalità fino al 75% può essere accettata nei casi in cui il trattamento, come l'infezione o l'applicazione di piccole molecole, influisce sulla vitalità.
  11. Preparare librerie di DNA per piattaforme di profilazione trascrizionale su singola cellula secondo i protocolli del produttore. Elaborare i dati secondo i protocolli di best practice per l'analisi dei dati scRNAseq13,14.

5. Preparazione di sospensioni di singole cellule da HIO differenziate su inserto di coltura cellulare a membrana

  1. Porre il reagente enzimatico per la digestione cellulare a 37 °C in un incubatore di CO2 per scongelare e riscaldare 30 minuti prima dell'inizio della digestione dell'inserto per colture cellulari con membrana HIO. Dividere il reagente per la digestione delle cellule enzimatiche preriscaldato in aliquote da 200 μL in provette per microcentrifuga da 1,5 mL, 1 provetta per inserto di coltura cellulare a membrana. Conservare le provette nell'incubatore a 37 °C fino al momento dell'uso.
  2. Preparare il PBS-EDTA aggiungendo 5 μL di EDTA 0,5 M a 5 mL di PBS. Aliquotare 500 μL di PBS-EDTA in una piastra da 24 pozzetti, 1 pozzetto per inserto di coltura cellulare a membrana.
  3. Lavare le cellule con PBS-EDTA: trasferire gli inserti di coltura cellulare a membrana dai pozzetti contenenti terreni di crescita ai pozzetti contenenti PBS-EDTA. Rimuovere il terreno di coltura cellulare dal lato apicale e sostituirlo con 100 μL di PBS-EDTA. Fare attenzione a non disturbare lo strato cellulare.
  4. Scartare immediatamente il PBS-EDTA aggiunto al lato apicale degli inserti di coltura cellulare a membrana. Rimuovere l'inserto di coltura cellulare a membrana dal pozzetto, tamponarlo toccando delicatamente il bordo di un tovagliolo di carta, quindi capovolgerlo sul piano di lavoro. Utilizzare una lama di bisturi affilata per rimuovere la membrana dall'inserto tagliando attorno alla circonferenza interna della membrana. Lavorare rapidamente per evitare che si secchi.
  5. Utilizzare una pinza per trasferire la membrana nella provetta da microcentrifuga preriscaldata da 1,5 mL riempita con reagente enzimatico per la digestione cellulare e assicurarsi che la membrana sia completamente sommersa. Ripetere l'operazione per tutti gli inserti aggiuntivi per colture cellulari a membrana.
    NOTA: L'aumento del volume del reagente enzimatico per la digestione cellulare a 500 μl può aiutare a dissociare i monostrati densi.
  6. Dissociare le cellule incubando provette con membrane a 37 °C in un incubatore di CO2 . Miscelare pipettando delicatamente l'intero volume 5 volte con una pipetta da 200 μl ogni 10 minuti per un totale di 30 minuti. Evitare bolle e aspirazione della membrana per preservarne la vitalità.
  7. Trasferire una piccola aliquota di cellule (1-2 μL) su un vetrino ogni 10 minuti per valutare la dissociazione valutando qualitativamente la percentuale di singole cellule. Possono essere necessari fino a 50 minuti con un pipettaggio aggiuntivo per ottenere l'80%-90% di singole cellule, a seconda del tipo di HIO. Raschiare delicatamente la membrana con la punta di una pipetta durante le fasi di miscelazione per favorire la dissociazione, in particolare per le cellule difficili da dissociare, tuttavia la raschiatura può influire sulla vitalità.
  8. Combinare 3 pozzetti di replica per condizione in una singola provetta per microcentrifuga da 1,5 mL (600 μL in totale). Aggiungere 400 μL di terreno di coltura cellulare (diff) + 10 μM ROCKi (1 mL di volume totale). Miscelare delicatamente pipettando.
    NOTA: L'uso di pozzetti replicati garantisce un numero adeguato di cellule e riduce la variazione da pozzetto a pozzetto. I pozzi dovrebbero essere raggruppati in questa fase.
  9. Filtrare l'intero volume attraverso un filtro con puntale da 70 μm utilizzando un puntale per pipetta da 1 ml. Raccogliere il flusso in una provetta da microcentrifuga fresca da 1,5 mL.
    NOTA: La punta del filtro non si ostruisce se il tempo di digestione è sufficiente. Utilizzare più punte del filtro se il filtro si ostruisce; Non forzare il volume.
  10. Ripetere il passaggio 5.9 con un colino con punta da 40 μm. Conservare i campioni sul ghiaccio.
  11. Contare le singole cellule vitali su una camera di conteggio cellulare utilizzando l'esclusione del blu di tripano aggiungendo 5 μl di blu di tripano allo 0,4% a 5 μl di sospensione cellulare. Diluire il campione secondo necessità a 1000 cellule/μL. Se la densità cellulare è inferiore a 1000 cellule/μL, centrifugare 2 min a 400 x g a 4 °C per pellettare le cellule, rimuovere il terreno originale e risospendere in WRNE+Y alla densità cellulare desiderata. Questo protocollo produce tipicamente 4 x 105 - 6 x 105 cellule.
    NOTA: La preparazione di sospensioni di alta qualità (90% vitali e 90% cellule singole) è essenziale per dati di alta qualità su singole cellule. Tuttavia, l'esperienza indica che una vitalità fino al 75% può essere accettata nei casi in cui il trattamento, come l'infezione o l'applicazione di piccole molecole, influisce sulla vitalità.
  12. Preparare librerie di DNA per le piattaforme di profilazione trascrizionale a singola cellula secondo i protocolli del produttore. Elaborare i dati secondo i protocolli di best practice per l'analisi dei dati scRNAseq13,14.

6. Preparazione di sospensioni a singola cellula da HIO differenziate come monostrati a 96 pozzetti

  1. Porre il reagente enzimatico per la digestione cellulare a 37 °C in un incubatore di CO2 per scongelare e riscaldare 30 minuti prima dell'inizio della digestione HIO monostrato.
  2. Preparare il PBS-EDTA aggiungendo 5 μL di EDTA 0,5 M a 5 mL di PBS. Eliminare il terreno di coltura cellulare dalla piastra a 96 pozzetti e sostituirlo con 100 μl di PBS-EDTA. Fare attenzione a non disturbare lo strato cellulare.
  3. Dissociare le cellule: scartare il PBS-EDTA e aggiungere 100 μL di reagente caldo per la digestione delle cellule enzimatiche in ciascun pozzetto. Posizionare la piastra a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 e mescolare pipettando delicatamente l'intero volume 5 volte con un puntale per pipetta da 200 μl ogni 10 minuti per 20-30 minuti. Evita le bolle per preservarne la vitalità.
    NOTA: L'aumento del volume del reagente per la digestione delle cellule enzimatiche a 500 μl può aiutare a dissociare i monostrati densi.
  4. Trasferire una piccola aliquota di cellule (1-2 μL) su un vetrino ogni 10 minuti per valutare la dissociazione. Potrebbero essere necessari fino a 50 minuti per raggiungere l'80%-90% di singole cellule, a seconda del tipo di HIO. Raschiare delicatamente la piastra con la punta di una pipetta durante le fasi di miscelazione per favorire la dissociazione, in particolare per le cellule difficili da dissociare; Tuttavia, lo scraping può influire sulla vitalità.
  5. Combina 3 pozzetti di replica per condizione in una singola provetta per microcentrifuga da 1,5 mL (300 μL in totale). Aggiungere 700 μL di terreno di coltura cellulare (diff) + 10 uM ROCKi (1 mL di volume totale). Miscelare delicatamente pipettando.
    NOTA: L'uso di pozzetti cresciuti replicati garantisce un numero adeguato di cellule e riduce la variazione da pozzetto a pozzetto.
  6. Filtrare l'intero volume attraverso un filtro con puntale da 70 μm utilizzando un puntale per pipetta da 1 ml. Raccogliere il flusso in una provetta da microcentrifuga fresca da 1,5 mL.
    NOTA: La punta del filtro non si ostruisce se il tempo di digestione del reagente per la digestione delle cellule enzimatiche è sufficiente. Utilizzare più punte del filtro se il filtro si ostruisce; Non forzare il volume.
  7. Ripetere il passaggio 6.6 con un colino con punta da 40 μm. Conservare i campioni sul ghiaccio.
  8. Contare le singole cellule vitali su una camera di conteggio cellulare utilizzando l'esclusione del blu di tripano aggiungendo 5 μl di blu di tripano allo 0,4% a 5 μl di sospensione cellulare. Diluire secondo necessità a 1000 cellule/μL. Se la densità cellulare è inferiore a 1000 cellule/μL, centrifugare 2 minuti a 400 x g 4 °C per pellettare le cellule, rimuovere il terreno originale e risospendere in terreno di coltura cellulare + ROCKi alla densità cellulare desiderata. Questo protocollo produce in genere 2 x 105 - 6 x 105 celle.
    NOTA: La preparazione di sospensioni di alta qualità (90% vitali e 90% cellule singole) è essenziale per dati di alta qualità su singole cellule. Tuttavia, l'esperienza indica che una vitalità fino al 75% può essere accettata nei casi in cui il trattamento, come l'infezione o l'applicazione di piccole molecole, influisce sulla vitalità.
  9. Preparare librerie di DNA secondo i protocolli del produttore della piattaforma di profilazione trascrizionale a singola cellula. Elaborare i dati secondo i protocolli di best practice per l'analisi dei dati scRNAseq13,14.

Risultati

Le sospensioni di singole cellule sono state raggruppate da 2-3 pozzetti di inserto per colture cellulari a membrana, monostrato e HIO 3D per garantire una resa cellulare sufficiente e ridurre la variazione da pozzetto a pozzetto. Le librerie di singole cellule sono state preparate utilizzando reagenti specifici per la piattaforma di profilazione trascrizionale a singola cellula. e sequenziato con letture finali accoppiate su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione, 30.000 letture/cella. Le letture sono state mappate, contate e analizzate utilizzando strumenti analitici per la genomica a singola cellula. Sono state escluse dall'analisi le cellule di bassa qualità con più del 20% di lettura mitocondriale o meno di 200 geni contati. Per valutare la qualità delle cellule, abbiamo tracciato il numero di geni, UMI e la percentuale di letture mitocondriali per cellula (Figura 3); le cellule di alta qualità contengono circa 3500 geni, 15.000 UMI e il 10% di letture mitocondriali. Dopo il filtraggio, abbiamo ottenuto da 4000 a 9500 cellule singole a seconda del formato di crescita HIO. Il clustering non supervisionato e la riduzione delle dimensioni UMAP hanno identificato cluster distinti che rappresentano i tipi cellulari attesi, inclusi enterociti assorbenti e cellule secretorie (Figura 4).

figure-results-1
Figura 1: Schema dei passaggi del protocollo. Schemi che delineano i passaggi principali della placcatura di HIO in diversi formati per il flusso di lavoro dei dati a cella singola. Questa immagine è stata creata utilizzando Biorender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Immagini in campo chiaro. Gli HIO pronti per l'elaborazione sono stati ripresi utilizzando un microscopio a campo chiaro con ingrandimento 5X. A sinistra, organoidi 3D; piastra centrale a 96 pozzetti; Esatto, Transwell. Barre di scala = 200 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Controllo di qualità dei dati. Esempi di metriche di singole cellule analizzate isolate da HIO digiunali cresciute come monostrati su piastre a 96 pozzetti. I grafici a violino mostrano il numero di geni (nFeature_RNA), UMI (nCount_RNA) e la percentuale di letture mitocondriali (percent.mt) per cellula. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: UMAP di singole cellule analizzate. (A) Un totale di 9952 singole cellule sono state isolate da HIO digiunali differenziate cresciute in piastre a 96 pozzetti. (B) Un totale di 5623 singole cellule sono state isolate da HIO digiunali differenziati cresciuti su inserti di coltura cellulare a membrana. (C) Un totale di 4402 singole cellule sono state isolate da HIO 3D ileali differenziate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

WRNE Terreno di crescitaMezzo di differenziazione
ComponenteVolumeConcentrazione finaleTerreno WRNE senza terreno condizionato L-WRN, nicotinamide e SB202190
*Y-27632 (5 mM) opzionale200 μl10 μM
A 83-01 (500 μM)100 μl500 nM
DMEM/F12 avanzato45 ml
B272 ml
EGF (50 μg/mL)100 μl50 ng/mL
gastrina (10 μM)100 μl10 nM
GlutaMax (100X)1 ml
HEPES 1 M1 ml
L-WRN Con- Media50 ml~50%
N21 ml
N-acetilcisteina (500 mM)100 μl500 μM
Nicotinamide 1 M1 ml10 mM
SB202190 (10 mM)100 μl10 μM
Volume totale100 ml
CMGF- Medio
DMEM/F12 avanzato500 ml
Glutamax5 ml100X
1 m di peso5 ml

Tabella 1: Composizione dei vari media utilizzati.

Discussione

Utilizzando piattaforme di genomica a singola cellula, sistemi biologici complessi, come le colture HIO derivate da tessuti che modellano l'epitelio intestinale, possono essere scomposti per produrre contributi cellulari individuali alla risposta biologica complessiva 4,5,6. È inoltre possibile identificare e interrogare l'eterogeneità cellulare e le popolazioni cellulari rare. L'input cellulare deve essere ottimizzato per massimizzare l'output utilizzando piattaforme basate sulla trascrittomica a singola cellula. Qui descriviamo i protocolli che produrranno sospensioni a singola cellula altamente vitali e di buona qualità che aumenteranno la probabilità di ottenere dati trascrittomici di alta qualità a valle. La familiarità con il protocollo è della massima importanza e si consiglia di eseguire diverse esecuzioni di esercitazione prima di procedere con la preparazione della libreria. Si consiglia di ottenere in modo riproducibile sospensioni di singole cellule vitali prima di utilizzare le cellule per la preparazione della libreria. La rapidità con cui il protocollo viene implementato è della massima importanza in quanto la velocità è direttamente proporzionale ai risultati di fattibilità. Sulla base di ciò, si consiglia di limitare il numero di campioni gestiti contemporaneamente. Si consiglia di interfacciarsi con l'entità che preparerà le librerie prima di avviare questi protocolli per assistenza nella risoluzione dei problemi.

La vitalità dell'HIO influenza direttamente la libreria di DNA inviata per il sequenziamento. La vitalità cellulare dell'HIO dipende da diverse fasi della preparazione della sospensione di una singola cellula, tra cui la dissociazione, la centrifugazione, i tamponi, il pipettaggio e l'accuratezza del conteggio. L'obiettivo della preparazione degli HIO per la piattaforma è quello di bilanciare il mantenimento della vitalità cellulare con la qualità del campione. Fondamentale per ottenere dati di alta qualità è la minimizzazione degli aggregati cellulari, delle cellule morte, degli acidi nucleici non cellulari e degli inibitori biochimici della trascrizione inversa. Le cellule morenti aumentano il rumore dell'acido nucleico e contribuiscono all'aggregazione cellulare, portando a guasti dei dati e della piattaforma 7,8,9,10,11,12. Il filtro con una dimensione del filtro appropriata può aiutare a rimuovere aggregazioni di grandi dimensioni e migliorare la qualità dei dati.

Diversi fattori devono essere considerati per ridurre al minimo la morte delle cellule HIO quando si preparano sospensioni di singole cellule. È necessario ottenere almeno l'80% di cellule vitali e l'>90% di vitalità è ancora più desiderabile. I campioni con un numero elevato di cellule non vitali possono essere migliorati utilizzando strategie per rimuovere le cellule morte, come le microsfere basate su colonna, sebbene queste richiedano più cellule iniziali e volumi di campione maggiori a causa della perdita durante la manipolazione. Gli HIO sono particolarmente sensibili ai tamponi e subiscono la morte cellulare se lasciati troppo a lungo a RT in determinati tamponi. I terreni organoidi determinano la minima perdita di cellule e la formazione di aggregati. Il pipettaggio può anche influire sulla vitalità dell'HIO durante la dissociazione. Le punte dei fori regolari possono tagliare gli organoidi, aiutandoli a dissociarsi in sospensioni a singola cellula; tuttavia, un pipettaggio troppo rapido con un puntale con foro normale può causare danni alle celle HIO a causa delle forze di taglio. Il pipettaggio lento con puntali a foro largo riduce al minimo lo stress sulle cellule HIO e migliora notevolmente il numero di cellule vitali a valle. La centrifugazione, il lavaggio e la risospensione sono altri fattori che possono influenzare la qualità delle sospensioni a singola cellula HIO. La centrifugazione a secchiello oscillante consente di pellettare più delicatamente le celle HIO, con conseguente riduzione del numero di cellule morte e riduzione al minimo della perdita di cellule. Infine, l'accuratezza del conteggio per determinare la concentrazione è essenziale per garantire che il numero massimo di cellule raggiunga la piattaforma per la sintesi della libreria. L'attenzione a questi dettagli si tradurrà nella riduzione al minimo dello stress sulle celle HIO durante il processo di isolamento e garantirà la massima probabilità di ritorno dei dati dopo l'elaborazione.

Sebbene la trascrittomica a singola cellula sia un potente strumento per sezionare i profili biologici e le risposte a livello di singola cellula 4,5,6, ci sono diverse limitazioni che devono essere considerate quando si applica la tecnologia per analizzare le colture di organoidi intestinali umani. In primo luogo, ci può essere una variazione trascrizionale significativa a causa della variabilità tecnica introdotta durante la preparazione e il sequenziamento della libreria o a causa degli effetti batch derivanti dalla preparazione del campione. Inoltre, il sequenziamento può causare un bias di copertura in presenza di una profondità di sequenziamento non uniforme tra geni o cellule. Ciò causa difficoltà nel rilevamento di geni poco espressi o nell'identificazione di popolazioni cellulari rare. In secondo luogo, l'identificazione dei tipi cellulari può essere difficile a causa dell'eterogeneità cellulare e trascrizionale delle colture di organoidi e di un profilo cellulare meno differenziato rispetto all'epitelio intestinale nativo. Anche l'accoppiamento delle risposte trascrizionali ai fenotipi funzionali è una sfida e richiede un'ulteriore convalida utilizzando altri approcci o saggi. In terzo luogo, questo approccio non include la considerazione del contesto spaziale o della dinamica temporale delle cellule. La procedura di dissociazione rimuove la capacità di dedurre le interazioni cellula-cellula dai dati trascrizionali. Fornisce solo una singola istantanea nel tempo dello stato cellulare piuttosto che un continuum biologico. Infine, gli approcci trascrizionali a singola cellula possono essere costosi e richiedere strumenti computazionali specializzati e competenze bioinformatiche. Tuttavia, questo approccio rimane ancora uno strumento all'avanguardia dominante per comprendere l'eterogeneità cellulare e identificare nuovi tipi di cellule.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono le sovvenzioni U19 AI157984, U01 DK103168, U19 AI144297, P30 DK56338, P01 AI057788, U19 AI116497 e NASA Cooperative Agreement Notice/TRISH NNX16AO69A.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
[Leu15]-gastrina ISigma-AldrichG914510 nM
0,05% tripsina-EDTAInvitrogen25300054
0,4% blu di tripanoMillipore-SigmaT8154
0,5 M EDTACorning46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-Corning21-040-CM
24 mm TranswellCostar3412
Piatto per coltura tissutale di superficie Nunclon delta a 24 pozzettiThermo Scientific142475
40 µ filtro per celle mFalcon352340
40 µ m Filtro a punta FlowmiSP Bel-Art LabwareH13680-0040
70 µ m Filtro a punta FlowmiSP Bel-Art LabwareH13680-0070
Piastra a 96 pozzettiCorning3595
A-83-01Tocris2939500 nM
AccutaseStemCell Technologies7920
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-028
B27 supplementoInvitrogen17504-0441X
Cromo Next GEM Cella Singola 3' GEM, Biblioteca & Kit di perline in gel v3.110x GenomicaPN-1000128
Collagene IVSigma-AldrichC5533-5MG33 &; g/mL
di soluzione per il recupero delle cellule Corning VWR354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)Invitrogen14190-1361X
GlutaMAX-IInvitrogen35050-0612 mM
HEPES 1MInvitrogen15630-08010 mM
L-WRN fluidi condizionatiATCCCRL-3276
Matrigel, GFR, senza fenoloCorning356231
mouse EGF ricombinanteInvitrogenPMG804350 ng/mL
integratore di N2Invitrogen17502-0481X
N-AcetilcisteinaSigma-AldrichA9165-5G500 &; M
NicotinamideSigma-AldrichN063610 mM
SB202190Sigma-AldrichS706710 µ M
TranswellCorning3413
Y27632Tecnologie delle cellule staminali7230810 µ M

Riferimenti

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  13. Luecken, M. D., Theis, F. J. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).
  14. Heumos, L., et al. Best practices for single-cell analysis across modalities. Nat Rev Genet. 24 (8), 550-572 (2023).

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Trascrittomica a singola cellulaColtura di organoidiDissociazione cellulareProfilazione trascrizionalePartizionamento microfluidicoSequenziamento di nuova generazioneIdentificazione del tipo cellulareMicroscopia in campo chiaro

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