Articolo metodologico

Accesso alla differenziazione precoce della cellula T CD4+ helper follicolare virus-specifica nei topi acuti con infezione da LCMV

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DOI:

10.3791/66752

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26 aprile 2024

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1Department of Urology, South China Hospital, Medical School, Shenzhen University, 2Guangdong Key Laboratory for Biomedical Measurements and Ultrasound Imaging, National-Regional Key Technology Engineering Laboratory for Medical Ultrasound, School of Biomedical Engineering, Shenzhen University Medical School, 3Cancer Center, Daping Hospital & Army Medical Center of PLA, Third Military Medical University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 5Institute of Immunology, Third Military Medical University, 6Dermatology Hospital, Southern Medical University, 7Institute of Immunological Innovation and Translation, Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

L'attuale studio mostra protocolli per valutare l'impegno precoce del destino delle cellule TFH specifiche del virus e manipolare l'espressione genica in queste cellule.

Abstract

Le cellule T helper follicolari (TFH) sono percepite come una linea di cellule T CD4+ indipendente che aiuta le cellule B affini a produrre anticorpi ad alta affinità, stabilendo così un'immunità umorale a lungo termine. Durante l'infezione virale acuta, l'impegno del destino delle cellule TFH specifiche del virus è determinato nella fase iniziale dell'infezione e le indagini sulle cellule TFH differenziate precocemente sono cruciali per comprendere l'immunità umorale dipendente dalle cellule T e ottimizzare la progettazione del vaccino. Nello studio, utilizzando un modello murino di infezione da virus della coriomeningite linfocitica acuta (LCMV) e il topo TCR-transgenico SMARTA (SM) con cellule T CD4+ che riconoscono specificamente l'epitopo della glicoproteina LCMV I-AbGP66-77, abbiamo descritto le procedure per accedere all'impegno precoce del destino delle cellule TFH specifiche del virus sulla base di colorazioni con citometria a flusso. Inoltre, sfruttando la trasduzione retrovirale delle cellule T CD4+ SM, vengono forniti anche metodi per manipolare l'espressione genica nelle celluleT FH virus-specifiche differenziate precocemente. Pertanto, questi metodi aiuteranno negli studi che esplorano i meccanismi alla base dell'impegno precoce delle cellule TFH specifiche del virus.

Introduzione

Incontrando diversi agenti patogeni o minacce, le cellule T CD4+ naive adattano le loro risposte immunitarie differenziandosi in vari sottogruppi di cellule T helper (TH) con funzioni specializzate1. Nello scenario di infezione virale acuta, gran parte delle cellule T CD4+ naive si differenziano in cellule T helper follicolari (TFH) che forniscono aiuto alle cellule B 2,3. Distinte da altri sottogruppi di cellule TH CD4+ (ad esempio, cellule TH1, TH2, TH9 e TH17), le cellule TFH esprimono un livello sostanziale di CXCR5, che è il recettore delle chemochine per la chemochina CXCL13 che indirizza le cellule B, consentendo alle cellule TFH di migrare nei follicoli delle cellule B. Nei follicoli delle cellule B, le cellule TFH aiutano le cellule B affini nell'avvio e nel mantenimento delle reazioni del centro germinale, consentendo così una rapida produzione di anticorpi ad alta affinità e una memoria umorale a lungo termine 2,3.

In caso di infezione virale acuta, l'impegno precoce del destino delle cellule TFH virus-specifiche avviene entro 72 ore 4,5 ed è controllato dal repressore trascrizionale del linfoma-6 a cellule B (Bcl-6)5,6,7,8, che agisce come "regolatore principale" che governa le decisioni sul destino delle cellule T FH. Il deficit di Bcl-6 attenua gravemente la differenziazione delle cellule TFH, mentre l'espressione ectopica di Bcl-6 promuove sostanzialmente l'impegno del destino delle cellule TFH. Oltre a Bcl-6, diverse molecole sono coinvolte nell'istruire l'impegno precoce del destino delle cellule TFH. I fattori di trascrizione TCF-1 e LEF-1 avviano la differenziazione delle cellule TFH attraverso l'induzione di Bcl-6 9,10,11. L'inibizione di Blimp1, sia da parte di Bcl-6 che di TCF-1, è necessaria per l'impegno precoce del destino delle cellule TFH 11,12. STAT1 e STAT3 sono necessari anche per la differenziazione precoce delle cellule TFH 13. Inoltre, le modificazioni epigenetiche da parte dell'istone metiltransferasi EZH214,15 e della m6A metiltransferasi METTL316 aiutano a stabilizzare i programmi trascrizionali delle cellule TFH (in particolare Bcl6 e Tcf7) e quindi a innescare l'impegno precoce del destino delle cellule TFH. Mentre i progressi, comprese le molecole sopra menzionate e altre, riassunte altrove3, sono stati fatti nella comprensione delle regolazioni trascrizionali ed epigenetiche dell'impegno precoce del destino delle cellule TFH, molecole precedentemente sconosciute rimangono da imparare.

Nel modello murino di infezione da virus della coriomeningite linfocitica acuta (LCMV), le cellule T CD4+ TCR-transgeniche SMARTA (SM) CD4+ congeniche trasferite in modo adottivo, che riconoscono specificamente l'epitopo della glicoproteina LCMVI-A bGP66-77, subiscono la differenziazione delle cellule TFH o TH1 durante l'infezione virale. Questo modello di differenziazione della biforcazione TFH/TH1 supporta l'avanzamento del modello di infezione SM/LCMV acuta nello studio della biologia delle cellule TFH virus-specifiche. Infatti, il modello di infezione SM/LCMV acuta è stato ampiamente utilizzato nel campo della ricerca sulle cellule TFH e ha svolto un ruolo cruciale nelle scoperte fondamentali nella biologia delle cellule TFH. Ciò include l'identificazione del già citato Bcl-6 come fattore di trascrizione che definisce il lignaggio delle cellule TFH 5,6, nonché altri importanti fattori trascrizionali (ad esempio, Blimp-16, TCF-1/LEF 9,10,11, STAT1/STAT313, STAT517, KLF218 e Itch19) che guidano la differenziazione delle cellule T FH, le regolazioni post-trascrizionali ( ad esempio, METTL316 e miR-17~9220) della differenziazione delle cellule TFH, della memoria e della plasticità delle cellule TFH 21,22 e delle strategie di vaccinazione razionali mirate alle cellule TFH (ad esempio, il selenio23).

Il presente studio descrive metodi riproducibili per accedere all'impegno del destino precoce delle cellule TFH specifiche del virus, tra cui (1) la creazione di un modello murino di chimera SM acuta infettato da LCMV adatto per l'accesso alle cellule TFH differenziate precocemente, (2) l'esecuzione di colorazioni con citometria a flusso di molecole correlate alle celluleT FH differenziate precocemente e (3) l'esecuzione di manipolazioni geniche basate su vettori retrovirali in SM CD4+ Cellule T. Questi metodi saranno utili per gli studi che indagano l'impegno precoce del destino delle cellule TFH virus-specifiche.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti seguendo le procedure approvate dai Comitati Istituzionali per la Cura e l'Uso degli Animali della Terza Università Medica Militare. Nel presente studio sono stati utilizzati i seguenti ceppi di topo: topo C57BL/6J (B6) (entrambi i sessi), di età compresa tra 6 e 8 settimane, del peso di 25-30 g; Topo transgenico CD45.1+SM TCR (B6 CD45.1 × SM TCR transgenico), entrambi i sessi, di età compresa tra 6 e 8 settimane, del peso di 25-30 g; e topo transgenico CXCR5-GFP CD45.1+SM TCR (B6 CD45.1 × SM TCR transgenico × CXCR5-GFP knock-in), entrambi i sessi, di età compresa tra 6 e 8 settimane, del peso di 25-30 g. Le specie transgeniche sono state generate a seguito di un rapporto precedentemente pubblicato24. I dettagli dei reagenti, dei tamponi e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Raccolta di cellule T CD45.1+ SM CD4+ per il trasferimento adottivo

  1. Eutanasia (seguendo protocolli istituzionalmente approvati) il numero richiesto di topi SM transgenici CD45.1+ TCR-transgenici di età compresa tra 6 e 8 settimane24. Fai un'incisione di 1 pollice a sinistra della parete peritoneale dei topi soppressi con una forbice chirurgica, seziona la milza dal peritoneo e strappa il tessuto connettivo dietro la milza25,26.
  2. Posizionare ogni milza in un colino cellulare da 70 μm all'interno di una piastra di Petri (60 mm × 15 mm) e macinare la milza con 3 ml di tampone di lisi dei globuli rossi (RBC) utilizzando uno stantuffo della siringa da 1 ml.
    NOTA: Utilizzare il lato rotondo dello stantuffo della siringa per macinare la milza fino a quando rimane solo il tessuto connettivo.
  3. Aggiungere 6 mL di RPMI + 2% FBS (RPMI 2%) in ciascuna piastra per diluire 3 mL di tampone di lisi dei globuli rossi. Pipettare le sospensioni cellulari in una provetta conica da 15 mL dalla piastra. Sciacquare la piastra con altri 3 ml di RPMI al 2% e trasferirla nella stessa provetta conica.
  4. Centrifugare le sospensioni cellulari a 800 × g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante per decantazione. Risospendere le cellule con un tampone di isolamento e regolare la densità delle celle a ~1 × 108 cellule per mL. Metti il tubo sul ghiaccio.
  5. Preparare un cocktail di anticorpi biotinilati 1x contro CD8a, CD19, NK1.1, F4/80, CD11c e Ter119 in tampone di isolamento per l'arricchimento delle cellule T CD4+ .
    NOTA: Aggiungere gli anticorpi biotinilati nel tampone di isolamento alla diluizione indicata, come indicato nella Tabella dei materiali. Mantenere il volume del cocktail di anticorpi uguale a quello del tampone di isolamento al punto 1.4.
  6. Centrifugare le sospensioni cellulari a 800 × g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante per decantazione.
  7. Risospendere il pellet cellulare con l'indicato cocktail di anticorpi biotinilati 1x nel tubo conico.
  8. Stendere il tubo conico sul ghiaccio in uno shaker per 30 minuti a 45 giri/min.
  9. Durante l'incubazione con anticorpi biotinilati, preparare il volume richiesto di perle rivestite di streptavidina secondo le istruzioni del produttore.
    NOTA: Gli splenociti totali di un topo naïve necessitano di 200 μL di perle rivestite di streptavidina.
  10. Lavare le cellule centrifugando a 800 x g con 8-10 mL di tampone di isolamento per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Ripeti questo passaggio per altre due volte.
  11. Risospendere il pellet cellulare con perle rivestite di streptavidina preparate.
  12. Stendere il tubo sul ghiaccio in uno shaker per 40 minuti a 45 giri/min.
  13. Quindi, metti il tubo su un supporto magnetico per 3-4 minuti fino a quando tutte le perline sono assemblate sul lato magnetico.
  14. Raccogliere con cura il surnatante e trasferirlo in una nuova provetta conica da 15 mL.
  15. Centrifugare le sospensioni cellulari a 800 × g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante per decantazione.
    NOTA: Sono disponibili altri kit commerciali per l'arricchimento delle cellule T CD4+ , che possono essere utilizzati come sostituti della procedura di arricchimento delle cellule T CD4+ descritta nei passaggi 1.5-1.15.
  16. Risospendere il pellet cellulare con 2-3 mL di RPMI al 2%. Aspirare 50 μL di sospensione cellulare per l'analisi in citometria a flusso dell'efficienza dell'arricchimento delle cellule T CD4+ (CD4 e Vα2) e della vitalità cellulare.
  17. Centrifugare le sospensioni cellulari a 800 × g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante per decantazione. Risospendere il pellet cellulare con RPMI e regolare la densità cellulare a 1 ×10 7 cellule CD4+Vα2+ SM per mL. Metti la provetta sul ghiaccio e procedi con il trasferimento delle cellule adottive nella fase successiva.

2. Definizione del modello murino di chimera SM acuta infettato da LCMV per l'accesso alle cellule SM T FH differenziate precocemente

  1. Riscaldare i topi riceventi di C57BL/6 di età compresa tra 6 e 8 settimane con una lampada a infrarossi per dilatare la vena caudale per l'iniezione endovenosa.
  2. Aspirare 100 μl di sospensione cellulare contenente 1 × 106 cellule SM preparate al punto 1.17 con una siringa da insulina.
    NOTA: Il volume di iniezione deve essere modificato da ciascun ricercatore e non deve superare il volume massimo di iniezione consentito dalla legge istituzionale e locale.
  3. Tieni i topi in posizione con un fissatore per topi, raddrizza la coda e pulisci la coda con etanolo al 75% usando un batuffolo di cotone per rendere visibile la vena della coda.
  4. Inserire l'ago della siringa da insulina nella vena caudale e iniettare le sospensioni cellulari in modo fluido e lento. Quindi, lascia riposare i topi riceventi per una notte.
  5. Il giorno seguente, diluire lo stock di virus LCMV Armstrong con il terreno RPMI per ottenere una concentrazione finale di 1 × 107 unità formanti placche/mL.
  6. Iniettare 100 μl di soluzione diluita di LCMV Armstrong (contenente 1 × 106 unità formanti placche) nella vena caudale dei topi riceventi.
    NOTA: Ogni ricercatore deve essere cauto nel verificare se il titolo infettivo raccomandato è consentito dalla legge istituzionale e locale.

3. Colorazioni con citometria a flusso di cellule SM TFH differenziate precocemente

  1. Sacrificare i topi (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati) dal passaggio 2.6 al giorno 3 dopo l'infezione e processare i linfociti dalla milza come descritto nel passaggio 1. Regolare la densità cellulare a circa 2 × 107 cellule per ml.
  2. Caricare 50 μl di sospensioni cellulari (~1 × 10-6 celle) su una piastra a fondo rotondo da 96 pozzetti e rabboccare con 150 μl di tampone colorante per pozzetto. Tenete il piatto sul ghiaccio.
  3. Preparare il cocktail di anticorpi CXCR5 purificati di ratto (cioè l'anticorpo primario CXCR5) a una diluizione 1:50 in 50 μl di tampone di colorazione delle cellule TFH per ciascun campione in una provetta. Agitare accuratamente la provetta e centrifugarla a 15.000 × g per 3 minuti a 4 °C per aggregare le particelle. Mantieni il tubo sul ghiaccio.
  4. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 800 × g per 1 minuto a 4 °C, scartare il surnatante per decantazione, agitare brevemente la piastra e aggiungere 200 μl di tampone di colorazione per pozzetto.
  5. Ripetere il passaggio 3.4 e risospendere le cellule con 50 μL dell'anticorpo primario CXCR5 per pozzetto. Mescolare bene pipettando su e giù e incubare su ghiaccio per 1 ora.
  6. Preparare il cocktail di anticorpi anti-ratto di capra biotinilata (cioè l'anticorpo secondario CXCR5) con una diluizione 1:200 in 50 μl di tampone di colorazione delle cellule TFH per ciascun campione in una nuova provetta. Agitare la provetta e centrifugarla a 15.000 × g per 3 minuti a 4 °C per aggregare le particelle. Mantieni il tubo sul ghiaccio.
  7. Centrifugare la piastra a 800 × g per 1 minuto a 4 °C, scartare il surnatante per decantazione, agitare brevemente la piastra e aggiungere 200 μl di tampone colorante per pozzetto.
  8. Ripetere il passaggio 3.7 due volte e mantenere la piastra sul ghiaccio.
  9. Aggiungere alla piastra 50 μl di anticorpo secondario CXCR5 per pozzetto. Mescolare bene pipettando su e giù e incubare con ghiaccio per 30 minuti.
  10. Preparare la streptavidina coniugata a fluorescenza (cioè l'anticorpo terziario CXCR5) a una diluizione 1:200 in 50 μL di tampone di colorazione delle cellule TFH per ciascun campione. Nel frattempo, aggiungere altri anticorpi contro i marcatori di superficie (ad esempio, CD45.1, CD4, PD-1, CD25 e altre molecole interessate) e la colorazione delle cellule morte insieme all'anticorpo terziario CXCR5.
  11. Agitare la provetta e centrifugarla a 15.000 × g per 3 minuti a 4 °C per aggregare le particelle. Mantieni il tubo sul ghiaccio.
  12. Centrifugare la piastra a 800 × g per 1 minuto a 4 °C, scartare il surnatante per decantazione, agitare brevemente la piastra e aggiungere 200 μl di tampone colorante per pozzetto.
  13. Ripetere il passaggio 3.12 due volte e mantenere la piastra sul ghiaccio.
  14. Aggiungere alla piastra 50 μl di cocktail di anticorpi terziari CXCR5 per pozzetto. Mescolare bene pipettando su e giù e incubare su ghiaccio per 30 minuti al buio.
  15. Preparare 200 μl di tampone di fissazione/permeabilizzazione per ciascun pozzetto secondo le istruzioni del produttore.
  16. Centrifugare la piastra a 800 × g per 1 minuto a 4 °C, scartare il surnatante per decantazione, agitare brevemente la piastra e aggiungere 200 μl di tampone colorante per pozzetto.
  17. Ripetere il passaggio 3.16 due volte e mantenere il piatto sul ghiaccio al buio.
  18. Aggiungere 200 μl di tampone di fissazione/permeabilizzazione in ciascun pozzetto. Mescolare bene pipettando su e giù e incubando a temperatura ambiente per 30 minuti (al buio).
    NOTA: Preparare il tampone di permeabilizzazione (1x) secondo le istruzioni del produttore.
  19. Preparare il cocktail di anticorpi contro i fattori trascrizionali, tra cui Bcl-6, TCF-1, T-bet e altre molecole interessate, in 50 μL di tampone di permeabilizzazione (1x) per ogni pozzetto in una nuova provetta.
  20. Agitare la provetta e centrifugare a 15.000 x g per 3 minuti a 4 °C per aggregare le particelle.
  21. Centrifugare la piastra a 800 × g per 1 minuto a 4 °C, scartare il surnatante mediante decantazione, agitare brevemente la piastra e aggiungere 50 μl di cocktail di anticorpi del fattore trascrizionale per pozzetto. Mescolare bene e incubare con ghiaccio per 30 minuti al buio.
  22. Centrifugare la piastra a 800 × g per 1 minuto a 4 °C, scartare il surnatante, agitare brevemente la piastra per decantazione e aggiungere 200 μl di tampone di permeabilizzazione (1x) per pozzetto.
  23. Ripetere il passaggio 3.22.
  24. Aggiungere 200 μl di tampone di colorazione in ciascun pozzetto, centrifugare la piastra a 800 × g per 1 minuto a 4 °C, scartare il surnatante per decantazione e agitare brevemente la piastra.
  25. Risospendere il pellet cellulare in ciascun pozzetto con 200 μl di tampone di colorazione e trasferire le cellule in provette per citometria a flusso per l'analisi immediata del citometro a flusso.
    NOTA: In alternativa, i campioni possono essere rilevati entro 3 giorni aggiungendo 200 μl di PFA al 2% in ciascuna provetta e conservandoli a 4 °C al buio.

4. Produzione di retrovirus

  1. Coltivare le cellule 293T (con meno di dieci passaggi) con terreno DMEM 10% in una piastra di coltura da 10 cm per una durata di 2-3 passaggi.
  2. Quando le cellule hanno raggiunto il 90% di confluenza, scartare il vecchio terreno e lavare delicatamente le cellule con PBS due volte, seguite da una breve tripsinizzazione delle cellule 293T utilizzando 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% a temperatura ambiente per 1 minuto.
  3. Arrestare il processo di digestione risospendendo le cellule in 2 mL di terreno DMEM al 10% preriscaldato, trasferendole in una provetta conica da 15 mL e centrifugando a 200 × g per 5 minuti a 4 °C.
  4. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare pipettando su e giù i terreni di coltura con 2 mL di terreno DMEM al 10% preriscaldato.
  5. Quantificare il numero di cellule e la piastra 5 × 105 cellule in 2,5 mL di terreno DMEM al 10% per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti.
    NOTA: Agitare delicatamente la piastra per consentire alle cellule 293T di diffondersi uniformemente su tutta la piastra.
  6. Quando la confluenza delle cellule 293T supera l'80%, preparare i reagenti di trasfezione come descritto nei passaggi da 4.7 a 4.9.
  7. Per ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, aggiungere 250 μl di terreno Opti-MEM preriscaldato in una provetta sterile da 1,5 mL. Quindi, aggiungere 3 μg di DNA plasmidico (contenente 2 μg di vettore retrovirale e 1 μg di pCL-Eco) al terreno Opti-MEM, seguito da un pipettaggio delicato su e giù per garantire una miscelazione completa.
    NOTA: I vettori retrovirali utilizzati come esempi in questo studio sono il vettore MigR1 e il vettore MigR1 modificato con regione CDS Bcl6 a monte di IRES-GFP (MigR1-Bcl6).
  8. Quindi, aggiungere 7,5 μl di reagente di trasfezione preriscaldato (ottenuto commercialmente) alla miscela e pipettare delicatamente su e giù per garantire una miscelazione accurata.
  9. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 20 minuti.
  10. Erogare la miscela goccia a goccia in regioni distinte del pozzetto di coltura cellulare 293T, quindi far oscillare delicatamente il recipiente di coltura con un movimento avanti e indietro e da un lato all'altro per garantire una distribuzione uniforme della miscela.
  11. Incubare le cellule 293T per 72 ore in un incubatore a 37 °C contenente il 5% di CO2.
  12. Rilevare l'etichetta del vettore retrovirale come proxy per l'efficacia della trasfezione nelle cellule 293T trasfettate utilizzando un microscopio a fluorescenza o una citometria a flusso.
    NOTA: Ad esempio, abbiamo confermato il segnale di fluorescenza GFP in una percentuale significativa di cellule 293T trasfettate con vettore MigR1, suggerendo una trasfezione di alta qualità.
  13. Raccogliere il terreno di coltura cellulare e centrifugare a 2.500 × g per 10 minuti a 4 °C per eliminare i detriti cellulari. Il surnatante risultante deve essere raccolto con cura e conservato per la conservazione a lungo termine a -80 °C o temporaneamente a 4 °C.

5. Attivazione in vivo, trasduzione del retrovirus e trasferimento adottivo di cellule T SM CD4+

  1. Iniettare un topo CD45.1+ SM (di età compresa tra 6 e 8 settimane) per via endovenosa con 200 μg di peptide11,14 LCMV GP61-77 in un volume di 100 μL di terreno RPMI.
    NOTA: Il volume di iniezione deve essere modificato da ciascun ricercatore e non superare il volume di iniezione massimo consentito dall'istituzione e dalla legge locale.
  2. Eutanasia del topo SM a 16-18 ore dopo l'iniezione del peptide (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Acquisire gli splenociti seguendo le procedure sopra menzionate nel passaggio 1.
    NOTA: In alternativa, il metodo di stimolazione anti-CD3/anti-CD28 in vitro 27,28 può essere utilizzato per attivare le cellule T SM CD4+ al posto della stimolazione peptidica in vivo descritta nei passaggi 5.1 e 5.2.
  3. Sospendi gli splenociti con il 2% di RPMI e regola la densità cellulare a circa 1 × 108 cellule per mL in una provetta conica da 15 mL. Mantieni il tubo sul ghiaccio.
  4. Erogare 50 μl di sospensione cellulare in una piastra a fondo rotondo da 96 pozzetti e integrare con 150 μl di tampone di colorazione per pozzetto.
  5. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 800 × g per 1 minuto a 4 °C per pellettare le cellule, rimuovere con cura il surnatante per decantazione, agitare brevemente la piastra e aggiungere 200 μl di tampone colorante per pozzetto.
  6. Ripetere il passaggio 5.5 e risospendere le cellule con 50 μL di cocktail di anticorpi di superficie, inclusi CD4, CD25 e CD69, per rilevare lo stato di attivazione delle cellule T SM CD4+ . Mescolare accuratamente pipettando su e giù e incubare su ghiaccio per 30 minuti al buio.
  7. Rabboccare ogni pozzetto con tampone di colorazione a 200 μl, seguito dalla centrifugazione della piastra a 800 × g per 1 minuto a 4 °C. Scartare il surnatante per decantazione e agitare brevemente la piastra.
  8. Ripetere il passaggio 5.7 per due volte.
  9. Risospendere le cellule in 200 μL di tampone di colorazione e trasferirle in una provetta per citometria a flusso.
  10. Analizzare le cellule colorate con anticorpi coniugati a fluorescenza con una citometria a flusso per valutare lo stato di attivazione delle cellule T SM CD4+ .
    NOTA: Le cellule T CD4+ SM attivate hanno mostrato abbondanti espressioni di CD25 e CD69 rispetto alle cellule naive, consentendo così successive procedure di trasduzione.
  11. Aggiungere 1 × 10 celluleT CD4+ SM (dal passaggio 5.3) per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Centrifugare le celle a 800 × g per 3 minuti a 4 °C, quindi rimuovere con cura il terreno mediante decantazione.
  12. Aggiungere 1 mL di terreno retrovirale come descritto al punto 4.13 e 8 μg di polibrene in ciascun pozzetto.
  13. Spin-trasdurre le cellule a 800 × g per 2 ore a 37 °C.
  14. Eliminare con cautela il terreno del retrovirus mediante pipettaggio e aggiungere 1 mL di RPMI preriscaldato al 10% integrato con 10 ng/mL di IL-2 murino ricombinante a ciascun pozzetto.
  15. Incubare le cellule per 48 ore in un incubatore a 37 °C contenente il 5% di CO2.
  16. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL e centrifugare le cellule a 800 × g per 6 minuti a 4 °C.
  17. Rimuovere il surnatante per decantazione e risospendere le cellule con un volume appropriato del 2% di RPMI per ottenere una densità cellulare di 1 × 108 cellule per mL in una provetta conica da 15 mL. Mantieni il tubo sul ghiaccio.
  18. Erogare 50 μl di sospensione cellulare in una piastra a fondo rotondo da 96 pozzetti e integrare con 150 μl di tampone di colorazione per pozzetto.
  19. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 800 × g per 1 minuto a 4 °C per pellettare le cellule, rimuovere con cura il surnatante per decantazione, agitare brevemente la piastra e aggiungere 200 μl di tampone colorante per pozzetto.
  20. Ripetere il passaggio 5.19 e risospendere le cellule con 50 μL di cocktail di anticorpi di superficie, inclusi CD4, Vα2 e anticorpi associati al tag vettore. Mescolare accuratamente pipettando su e giù e incubare su ghiaccio per 30 minuti al buio.
  21. Rabboccare ogni pozzetto con tampone di colorazione a 200 μl, seguito dalla centrifugazione della piastra a 800 × g per 1 minuto. Scartare il surnatante per decantazione e agitare brevemente la piastra.
  22. Ripetere il passaggio 5.21 per due volte.
  23. Risospendere le cellule in 200 μL di tampone di colorazione e trasferirle in una provetta per citometria a flusso.
  24. Analizzare le cellule colorate con anticorpi coniugati a fluorescenza con citometria a flusso per valutare l'efficienza di trasduzione nelle cellule T SM CD4+ .
    NOTA: Nello studio, le cellule T CD4+ SM trasdotte in modo efficiente hanno mostrato un'elevata espressione del tag di retrovirus, come la GFP.
  25. Centrifugare le sospensioni cellulari del passaggio 5.17 a 800 × g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante per decantazione. Risospendere il pellet cellulare con RPMI e regolare la densità cellulare a 1 ×10 7 cellule SM CD4+Vα2+ /mL.
  26. Trasferire adottivamente un numero totale di 1 × 106 cellule T CD45.1+ SM CD4+ a ciascun topo ricevente C57BL/6 (di età compresa tra 6 e 8 settimane) mediante iniezione endovenosa di 100 μL di sospensione cellulare nella fase 5.25.
  27. Il giorno successivo, infettare i topi riceventi C57BL/6 con 1 × 106 unità LCMV Armstrong che formano la placca attraverso l'iniezione endovenosa.

6. Analisi in citometria a flusso di cellule SM TFH trasdotte da retrovirus allo stadio precoce di infezione acuta da LCMV

  1. Acquisire gli splenociti dai topi C57BL/6 dal passaggio 5.25 del giorno 3-post infezione.
  2. Eseguire la colorazione con citometria a flusso dei marcatori di superficie, inclusi CD4, CD45.1, CXCR5, CD25 e altre molecole interessate, negli splenociti come descritto nella fase 3.
  3. Per la rilevazione dei fattori trascrizionali nelle cellule T SM CD4+ trasdotte con retrovirus marcate da proteine fluorescenti, aggiungere 200 μL di PFA al 2% a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti al buio.
  4. Eseguire la fissazione/permeabilizzazione, la colorazione con citometria a flusso dei fattori trascrizionali interessati ed eseguire l'analisi della citometria a flusso come descritto nel passaggio 3.

Risultati

Caratteristiche delle cellule TFH virus-specifiche differenziate precocemente durante l'infezione acuta da LCMV
Per sondare l'impegno precoce del destino delle cellule TFH virus-specifiche, le cellule T CD4+ SM congeniche naive che riconoscono specificamente l'epitopo LCMV GP I-AbGP66-77 sono state trasferite adottivamente in riceventi CD45.2+ C57BL/6. Il giorno successivo, questi riceventi sono stati infettati per via endovenosa con un dosaggio elevato di LCMV Armstrong a risoluzione acuta (Figura 1A). Il giorno 3 dopo l'infezione, gli splenociti dei riceventi C57BL/6 sono stati analizzati mediante citometria a flusso e i risultati hanno indicato una grande quantità di cellule T CD45.1+ SM CD4+ trasferite (~10% del totale delle cellule T CD4+) (Figura 1B), che ha fornito un numero sufficiente di cellule T CD4+ specifiche per ulteriori indagini. Ulteriori analisi delle cellule T CD4+ SM trasferite hanno mostrato la co-espressione di CXCR5 e Bcl-6/TCF-1 e l'espressione reciproca di CXCR5 e CD25/T-bet, definendo così le linee TFH (CXCR5+Bcl-6+ o CXCR5+TCF-1+) e TH1 (CXCR5-CD25+ o CXCR5-T-bet+) (Figura 1C). Per valutare la specificità e la sensibilità della colorazione degli anticorpi CXCR5 presentata nello studio, abbiamo ulteriormente incrociato la suddetta linea di topi SM CD45.1+ con la linea di topi knock-in CXCR5-GFP, che è stata generata dall'inserimento di un costrutto IRES-GFP dopo il frame di lettura aperto di Cxcr529. Quindi, le cellule SM reporter CD45.1+ CXCR5-GFP sono state trasferite nei riceventi C57BL/6. Questi riceventi sono stati infettati con LCMV Armstrong e i loro splenociti sono stati analizzati il giorno 3 dopo l'infezione. Infatti, il segnale di fluorescenza del metodo di colorazione degli anticorpi CXCR5 nello studio si sovrapponeva finemente al segnale GFP nelle cellule T CD4+ SM CD4+ del reporter CXCR5-GFP trasferite al giorno 3 dopo l'infezione (Figura 1D), indicando l'elevata specificità del metodo di colorazione degli anticorpi CXCR5 in tre fasi.

Sovraespressione di Bcl-6 basata su retrovirus nelle cellule T CD4+ SM
Bcl-6 è una delle molecole più importanti nel favorire il differenziamento delle cellule TFH 6,7,8. Per accertare l'affidabilità dell'attuale protocollo nell'accesso alle cellule TFH differenziate precocemente, le cellule T CD45.1+ SM CD4+ sono state attivate in vivo e trasdotte con surnatante retrovirale da plasmidi MigR1 o cellule 293T trasfettate con plasmidi di sovraespressione MigR1-Bcl6 (Figura 2 e Figura 3A). Le cellule T SM CD4+ trasdotte da retrovirus sono state successivamente trasferite in modo adottivo nei riceventi di C57BL/6, che sono stati poi infettati con LCMV Armstrong (Figura 3B). Il giorno 3 dopo l'infezione, abbiamo riscontrato una biforcazione bilanciata delle cellule TFH e TH1 nelle cellule T CD4+ MigR1-SM, mentre una differenziazione predominante diretta dalle cellule TFH T nelle cellule T CD4+ MigR1-Bcl6-SM (Figura 3C). Coerentemente, il livello di espressione di Bcl-6 è stato migliorato nelle cellule T CD4+ MigR1-Bcl6-SM rispetto a quello nelle cellule T CD4+ MigR1-SM (Figura 3D). Pertanto, il fenotipo che la differenziazione ectopica delle cellule TFH 6 guidata dall'espressione di Bcl-6 è stato finemente riprodotto seguendo l'attuale protocollo.

figure-results-1
Figura 1: Analisi in citometria a flusso dell'impegno precoce delle cellule SM TFH durante l'infezione da LCMV di Armstrong. (A) Disegno sperimentale. Le cellule T spleniche CD4+ sono state raccolte da topi SM CD45.1+ e poi trasferite in modo adottivo in riceventi C57BL/6 (CD45.2+). Il giorno successivo, questi destinatari sono stati infettati con LCMV Armstrong. Il giorno 3 dopo l'infezione, le cellule SM CD45.1+ trasferite dalla milza dei riceventi sono state analizzate mediante citometria a flusso. (B) Dati rappresentativi della citometria a flusso che mostrano la strategia di gating delle cellule T CD45.1+ SM CD4+ trasferite dalla milza dei riceventi al giorno 3 dopo l'infezione da LCMV Armstrong. (C) Dati rappresentativi della citometria a flusso che mostrano co-colorazioni di CXCR5 e di altre molecole associate alle cellule TFH (Bcl-6, TCF-1, CD25 e T-bet) nelle cellule SM CD45.1+ trasferite dalla milza dei riceventi al giorno 3 dopo l'infezione da LCMV Armstrong. (D) Dati rappresentativi di citometria a flusso che mostrano co-colorazioni di anticorpi coniugati a fluorescenza contro CXCR5 e segnale GFP in cellule SM reporter CD45.1+ CXCR5-GFP trasferite dalla milza dei riceventi al giorno 3 dopo l'infezione da LCMV Armstrong. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Trasduzione retrovirale nelle cellule T CD4+ SM. (A) Diagramma schematico della produzione di retrovirus e della trasduzione retrovirale nelle cellule T SM CD4+ . Per la produzione di retrovirus, le cellule 293T seminate in una piastra a 6 pozzetti sono state trasfettate con plasmidi di DNA bersaglio quando la densità cellulare raggiunge la confluenza dell'≥80%. Quindi, il surnatante di coltura cellulare contenente retrovirus è stato raccolto 72 ore dopo la trasfezione e immediatamente utilizzato o conservato a -80 °C. Per la trasduzione retrovirale nelle cellule T SM CD4+ , a un topo SM CD45.1+ sono stati iniettati per via endovenosa 200 μg di peptide LCMV GP61-77 . Quindi, la milza è stata sezionata da un topo SM 16-18 ore dopo l'iniezione di peptidi ed è stato rilevato lo stato di attivazione delle cellule T CD4+ spleniche. Le cellule T CD4+ SM attivate sono state trasdotte con surnatante di coltura contenente retrovirus e coltivate in vitro per 48 ore prima di accedere all'efficienza di trasduzione. (B) Imaging al microscopio a fluorescenza di GFP in cellule 293T trasfettate con DNA plasmidico. Barra della scala: 400 μm. (C) Analisi in citometria a flusso dei livelli di espressione di CD25 e CD69 in cellule T CD4+ naïve spleniche da topo naïve (naive, a sinistra) o cellule T SM CD4+ spleniche da topo SM iniettato con peptidi LCMV GP61-77 (attivato, a destra). (D) Analisi in citometria a flusso dell'espressione di GFP in cellule T SM CD4+ trasdotte da retrovirus (trasdotte, a sinistra) o in cellule T SM CD4+ non trasdotte da retrovirus (non trasdotte, a sinistra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Effetti della sovraespressione di Bcl-6 nell'impegno del destino cellulare SM TFH . (A) Mappe lineari delle dorsali retrovirali di MigR1 (pannello superiore) e del vettore MigR1 modificato con la regione CDS di Bcl6 a monte di IRES-GFP (MigR1-Bcl6) (pannello inferiore). (B) Disegno sperimentale. Le cellule T SM CD4+ trasdotte con MigR1 o MigR1-Bcl6 sono state trasferite adottivamente in riceventi C57BL/6 (CD45.2+) un giorno prima di LCMV Armstrong. Il giorno 3 dopo l'infezione, le cellule T CD45.1+ SM CD4+ trasferite dalla milza dei riceventi sono state analizzate mediante citometria a flusso. (C) Analisi in citometria a flusso di CXCR5 e CD25 in cellule T GFP+ trasdotte in MigR1 o MigR1-Bcl6 SM CD4+ . I numeri adiacenti al gate indicano le frequenze delle cellule TFH nelle cellule T SM CD4+ . (D) Analisi in citometria a flusso del livello di espressione di Bcl-6 in cellule T SM CD4+ trasdotte con MigR1 o MigR1-Bcl6. MFI, intensità media di fluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

La ricerca nel campo delle cellule TFH è stata evidenziata sin dalla scoperta della funzione specializzata delle cellule TFH nell'aiutare le cellule B. Studi accumulati hanno indicato che la differenziazione delle cellule TFH è un processo multistadio e multifattoriale30, in cui l'impegno del destino delle cellule TFH è determinato nella fase iniziale5. Pertanto, una migliore comprensione dei meccanismi alla base delle cellule TFH differenziate precocemente è fondamentale per la biologia delle cellule TFH e per la progettazione razionale dei vaccini. In questo articolo, abbiamo fornito metodi per accedere all'impegno precoce del destino delle cellule TFH virus-specifiche e per manipolare l'espressione genica nelle cellule TFH differenziate precocemente sfruttando il modello di infezione virale LCMV Armstrong, il topo SM transgenico TCR e la trasduzione mediata da retrovirus.

Il recettore delle chemochine CXCR5 è un importante marcatore di superficie che distingue le cellule TFH da altri sottogruppi di cellule TH CD4+ 6,7,8,31, rendendo così necessario il metodo di colorazione CXCR5 di elevata specificità e sensibilità nella ricerca sulle cellule TFH. Nello studio, è stato dimostrato un metodo di colorazione CXCR5 streptavidina-biotina in tre fasi per identificare il sottogruppo di cellule TFH (Figura 1C). Sebbene la perdita di specificità sia un problema appiccicoso per gli approcci di colorazione con anticorpi a due o tre streptococco di alta sensibilità, è stato riscontrato che il segnale di fluorescenza mediante colorazione con anticorpi CXCR5 in tre fasi si sovrapponeva quasi completamente al segnale GFP nelle cellule T SM CD4+ reporter CXCR5-GFP29 al giorno 3 dopo l'infezione (Figura 1D), suggerendo il raggiungimento sia della specificità che della sensibilità mediante il metodo di colorazione degli anticorpi CXCR5 in tre fasi. In effetti, questa strategia di colorazione CXCR5 a tre streptococco è collaudata e ha aiutato i ricercatori a studiare meglio la biologia delle cellule TFH 11,14,15,21 e altri tipi di cellule T che esprimono CXCR529,32.

Dopo l'infezione e l'immunizzazione, il destino-impegno delle cellule TFH è generalmente modellato da una differenziazione biforcata di cellule T CD4+ naive in cellule TFH o cellule T H effettrici non-TFH 2,3,30. Questo studio ha mostrato la biforcazione bilanciata delle cellule TFH e TH1 nelle cellule T CD4+ SM trasferite. Inoltre, queste cellule T SM CD4+ trasferite hanno una quantità cellulare adeguata nella fase iniziale dell'infezione, fungendo così da modello adatto per lo studio della differenziazione delle cellule TFH. Certamente, l'espressione ectopica di Bcl-6 mediata da retrovirus nelle cellule T CD4+ SM trasferite era fortemente distorta verso la differenziazione delle cellule TFH rispetto a quella delle cellule T CD4+ SM di controllo (86,6% vs. 53,8%) (Figura 3C), che è allineata con il precedente rapporto6 e dimostra ulteriormente l'accuratezza dei protocolli descritti nello studio. In alternativa, i suddetti protocolli possono essere applicati anche al knock-down mediato da retrovirus di geni interessati (ad esempio, bcl6, Tcf7) in cellule T SM CD4+ 11 attivate precocemente (dati non mostrati).

Una limitazione del protocollo è il problema della tempistica (più di 2 ore in totale) e il processo in più fasi del metodo di colorazione CXCR5 in tre fasi. In alternativa, nella ricerca sulle cellule TFH sono stati applicati anche metodi di colorazione18,33 o 4,9,34 CXCR5 in due fasi. È giustificato un confronto tra la specificità/sensibilità di questi metodi di colorazione CXCR5.

In sintesi, l'attuale studio ha fornito protocolli per accedere alle cellule TFH specifiche del virus differenziate precocemente e per studiare i geni interessati che potenzialmente regolano la differenziazione delle cellule TFH . Questi protocolli alimenteranno le indagini sull'impegno precoce del destino delle cellule TFH .

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (dal n. 32300785 al X.C.), del China National Postdoctoral Program for Innovative Talents (n. BX20230449 a X.C.) e il National Science and Technology Major Project (n. 2021YFC2300602 a L.Y.).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,25% tripsina-EDTACorning25-052-CI
4% soluzione di correzione della paraformaldeide, 4% PFABeyotimeP0099-500mL
70 μ filtro cellularem MerckCLS431751
Alexa Fluor 647 anti-topo TCR Vα 2 (clone B20.1)Biolegend127812diluizione 1:200
Alexa Fluor 700 anti-topo CD45.1 (clone A20)Biolegend110724diluizione 1:200
APC anti-topo CD25 (clone PC61)Biolegend101910diluizione 1:200
B6 CD45.1 (B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) topoThe Jackson Laboratory002014
BeaverBeads StreptavidinBeaver22321-10
Biotina anti-topo F4/80 Anticorpo (clone BM8)Biolegend123106diluizione 1:200
Biotina Rat anti-mouse CD11c (clone N418)Biolegend117304diluizione 1:200
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)Biolegend115504diluizione 1:200
Biotina di ratto anti-topo CD8a (clone 53-6.7)Biolegend100704diluizione 1:200 Biotina
di ratto anti-topo NK-1.1 (clone PK136)Biolegend108704diluizione 1:200 Biotina
di ratto anti-topo TER-119/Cellule eritroidi (clone TER-119)Biolegend116204diluizione 1:200
albumina sierica bovina, BSASigmaA7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)Biolegend644816diluizione 1:100
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)Biolegend135220diluizione 1:200
C57BL/6J (B6) mouseThe Jackson Laboratory000664
CXCR5-GFP knock-in reporter mouseIn casa; la linea di topo knock-in CXCR5-GFP è stata generata dall'inserimento di un costrutto IRES-GFP dopo il frame di lettura aperto di Cxcr5.
DMEM 10% medioDMEM medio contenente il 10% di FBS
DMEM medioGibco11885092
EDTASigmaE9884
FACSFortesaBD Biosciences
Siero fetale bovino, FBSSigmaF8318
FlowJo (versione 10.4.0)BD Biosciences
Foxp3/Set di tamponi per colorazione con fattore di trascrizioneInvitrogen00-5523-00Il kit contiene tre reagenti: a. Concentrato di fissaggio/permeabilizzazione (4X); b. Diluente di fissaggio/permeabilizzazione; c. Tampone di permeabilizzazione.
Anticorpo IgG anti-ratto di capra (H+L),laboratori a vettoreBA-9400-1.5Diluizione 1:200
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging SystemThermoFisher Scientific
TamponeFACS contenente lo 0,5% di BSA e 2mM EDTA
Kit di colorazione per cellule morte nel vicino infrarosso fissabile LIVE/DEAD, per eccitazione a 633 o 635 nm LifeTechnologiesL10199Diluizione 1:200
MigR1addgene#27490
NaN3SigmaS2002
Opti-MEM mediumGibco31985070
pCL-Ecoaddgene#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)Biolegend104508diluizione 1:200
PE Topo anti-Bcl-6 (clone K112-91)BD Biosciences561522diluizione 1:50
Soluzione salina tamponata con fosfato, PBSGibco10010072
PolybreneSolarbioH8761
Ratto purificato Anti-Topo CXCR5 (clone 2G8)BD Biosciences551961diluizione 1:50
PerCP anti-topo CD4 (clone RM4-5)Biolegend100538diluizione 1:200
ricombinante murina IL-2Gibco212-12-1MG
tampone per lisi dei globuli rossiBeyotimeC3702-500mL
RPMI 1640 medioSigmaR8758
RPMI 2%RPMI 1640 medio contenente il 2% di FBS
SMARTA (SM) TCR topo transgenicoLa linea transgenica SM TCR nel nostro laboratorio è un dono del Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Inoltre, questa linea di topi può essere ottenuta anche da The Jackson Laboratory (colorazione#: 030450).
TamponePBS contenente il 2% di FBS e lo 0,01% di NaN3
Streptavidina PE-Cianine7eBioscience25-4317-82Diluizione 1:200
TCF1/TCF7 (C63D9) Corpo monoclonale di coniglio (Alexa Fluor 488 Conjugate) Tecnologia di segnalazione cellulare6444SDiluizione 1:400
TFH tamponeTampone FACS contenente l'1% di BSA e il 2% di siero di topo
Reagente TransIT-293Mirus BioMIRUMIR2700
biotinilato Tampone di isolamento ThermoFisher Scientific LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV)Azienda cinese di peptidi di colorazione di colorazione cellulare

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