Articolo metodologico

Tecnica per l'isolamento e la coltura di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo della mascella di ratto

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DOI:

10.3791/66765

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31 maggio 2024

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1Medical School of Chinese PLA, 2Department of Stomatology, the First Medical Centre, Chinese PLA General Hospital, 3Department of Stomatology, Fujian People's Armed Police Corps Hospital

In questo articolo

Sommario

Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mascellare hanno funzioni significative nella differenziazione, nell'autorinnovamento e nella modulazione immunitaria. Sono emersi come un serbatoio cruciale di cellule precursori nella terapia genica, nell'ingegneria tissutale e nella medicina rigenerativa. Qui, presentiamo un metodo unico per isolare le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mascellare nei ratti.

Abstract

Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMMSC) sono un tipo di cellula staminale con potenziale di differenziazione multidirezionale. Rispetto alle BMMSC derivate dalle ossa appendicolari, le BMMSC derivate dalla mascella hanno una maggiore capacità di differenziazione proliferativa e osteogenica, diventando gradualmente importanti cellule seme per la riparazione dei difetti della mascella. Tuttavia, la mandibola ha una struttura ossea complessa e un contenuto spongioso inferiore rispetto alle ossa appendicolari. È difficile acquisire un gran numero di cellule staminali mesenchimali del midollo derivate dalla mascella di alta qualità utilizzando i metodi tradizionali. Questo studio presenta un "approccio di nicchia sulla staminalità" per isolare e coltivare cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mascellare di ratto (JBMMSC). Le JBMMSC primarie di ratto sono state isolate e coltivate utilizzando il metodo aderente all'intero midollo osseo combinato con il metodo di digestione della fetta ossea. Le cellule isolate sono state identificate come JBMMSC attraverso l'osservazione della morfologia cellulare, il rilevamento di marcatori di superficie cellulare e l'induzione della differenziazione multidirezionale. Le cellule estratte con questo metodo mostrano una forma a fuso "simile a un fibroblasto". Le cellule sono lunghe, a forma di fuso e simili a fibroblasti. L'analisi della citometria a flusso mostra che queste cellule sono positive per CD29, CD44 e CD90 ma negative per CD11b/c, CD34 e CD45, il che è congruente con le caratteristiche delle BMMSC. Le cellule mostrano una forte capacità di proliferazione e possono andare incontro a differenziazione osteogenica, adipogenica e condrogenica. Questo studio fornisce un metodo efficace e stabile per ottenere un numero sufficiente di JBMMSC di alta qualità con una forte capacità di differenziazione in breve tempo, il che potrebbe facilitare ulteriori studi sull'esplorazione della funzione biologica, della medicina rigenerativa e delle relative applicazioni cliniche.

Introduzione

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono state scoperte per la prima volta nel midollo osseo, che hanno mostrato la capacità di formare colonie adesive in coltura e un forte potenziale osteogenico1. Pittinger et al.2 hanno inoltre scoperto il loro potenziale di differenziazione multidirezionale verso ossa, grasso e cartilagine. Sebbene tutte le cellule staminali mesenchimali provenienti da fonti diverse abbiano il potenziale per la differenziazione multidirezionale, le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo hanno il più forte potenziale di differenziazione condrogenica rispetto alle cellule staminali mesenchimali derivate da altri tessuti, il che le rende considerate le migliori cellule candidate per l'ingegneria del tessuto osseo3. Tuttavia, molti studi hanno dimostrato che le BMMSC di diversa origine presentano caratteristiche e proprietà sito-specifiche come la capacità di differenziazione osteogenica e l'attività proliferativa cellulare 4,5. Ciò può essere dovuto a diversi strati germinali tra la mascella e le ossa appendicolari o la cresta iliaca6.

Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mascellare (JBMMSC) derivano dalle cellule della cresta neurale del neuroectoderma, mentre le BMMSC derivate dal femore originano dal mesoderma7. Rispetto alle BMMSC derivate dalle ossa lunghe e dalla cresta iliaca, le JBMMSC hanno un tasso di proliferazione, un'attività ALP eun potenziale osteogenico 8 più elevati. Inoltre, l'effetto applicativo delle BMMSC nei tessuti e negli organi può variare a seconda dei diversi tipi di cellule e ambienti9. La riparazione dei difetti della mascella dipende principalmente dal reclutamento di cellule staminali mesenchimali derivate dalla mascella. Pertanto, lo studio delle JBMMSC può fornire una base sperimentale per la sua applicazione clinica nell'ingegneria del tessuto osseo mascellare10. Tuttavia, la ricerca di base e le applicazioni cliniche si concentrano principalmente sulle BMMSC derivate dalle ossa appendicolari e assiali11. La ricerca sulle JBMMSC è limitata e ciò può essere dovuto al basso contenuto di osso spongioso nella mandibola e al fatto che le mascelle dei ratti hanno un contenuto di osso spongioso ancora inferiore12. Pertanto, è difficile separare le cellule staminali mesenchimali del midollo mascellare derivate dall'osso mascellare utilizzando il normale metodo di lavaggio del midollo osseo, comunemente utilizzato per isolare le BMMSC dalle ossa appendicolari o dalla cresta iliaca13. Sulla base dei metodi di Hong et al.14 e Cheng et al.15, abbiamo ipotizzato che la combinazione di digestione ossea densa e il metodo di lavaggio del midollo osseo potrebbe isolare in modo efficiente le JBMMSC di ratto.

Questo studio mira a stabilire un metodo efficiente per isolare le JBMMSC di ratto e fornire fonti di cellule seme sufficienti per l'ingegneria del tessuto osseo mascellare.

Protocollo

Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale per gli Animali dell'Ospedale Generale del PLA cinese. Per l'esperimento sono stati utilizzati ratti Wistar maschi di tredici settimane. I dettagli sugli animali, i reagenti e le attrezzature sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione sperimentale

  1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici, comprese le forbici oftalmiche, le pinzette e i rongeur ossei, ad alta temperatura e pressione.
  2. Preparare in anticipo i terreni di coltura.
    1. Preparare il terreno completo α-MEM contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina.
    2. Preparare collagenasi di tipo II allo 0,1% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
    3. Preparare 50 ml di PBS con l'1% di penicillina-streptomicina in una provetta da centrifuga sterile monouso da 50 ml.

2. Isolamento e allevamento di JBMMSC di ratto

  1. Isolare la mandibola del ratto seguendo i passaggi seguenti:
    NOTA: Per mantenere la sterilità del campione, tutti gli strumenti chirurgici in metallo devono essere disinfettati ad alta temperatura sulla fiamma di una lampada ad alcool per almeno tre secondi prima dell'uso.
    1. Anestetizzare il ratto con pentobarbital sodico al 2% (2 ml/kg) mediante iniezione intraperitoneale.
    2. Sacrificare il ratto anestetizzato mediante lussazione delle vertebre cervicali (seguendo protocolli istituzionalmente approvati) dopo che la sua frequenza respiratoria è diminuita e i muscoli si sono rilassati completamente.
    3. Immergere il ratto in etanolo al 75% per 30 minuti per disinfettarlo e poi trasferirlo sul tavolo ultra-pulito.
    4. Metti il ratto su un panno sterile usa e getta o in un contenitore sterile e tienilo in posizione supina.
    5. Tagliare e separare la pelle e il muscolo dall'angolo o dall'articolazione lungo il ramo, quindi separare il condilo dalla fossa glenoidea tagliando orizzontalmente il disco dell'articolazione temporo-mandibolare e i legamenti periferici bilaterali con le forbici oftalmiche.
      NOTA: Determinare la posizione dell'articolazione temporo-mandibolare muovendo la mandibola e osservando la posizione del condilo esternamente.
    6. Tagliare e separare i muscoli e i tessuti connettivi della mandibola laterale usando le forbici dal solco vestibolare sul lato vestibolare degli incisivi inferiori ai lati sinistro e destro.
    7. Incidere i muscoli linguali della mandibola dal frenulo linguale alla regione posteriore della mandibola.
    8. Rimuovere la mandibola dal cranio.
    9. Dividere la mandibola a metà tagliando la sinfisi tra gli incisivi inferiori con le forbici oftalmiche.
    10. Rimuovere con cura i restanti muscoli attaccati, la fascia e gli altri tessuti molli sulla mandibola utilizzando forbici e pinze oftalmiche.
  2. Isolare i JBMMSC.
    1. Posizionare il becco del rongeur all'incrocio degli incisivi e della parte mesiale del primo molare, tagliare il collegamento tra gli incisivi inferiori e la mandibola con il rongeur ed estrarre completamente gli incisivi inferiori.
    2. Rimuovere tutti i molari con un rongeur osseo.
    3. Rimuovere il ramo mandibolare con un rongeur osseo ed esporre la cavità midollare separando la parte centrale della mandibola lungo il bordo distale dell'ultimo molare16.
    4. Aspirare il terreno completo α-MEM con una siringa sterile monouso da 1 ml. Inserire l'ago nella cavità del midollo osseo e sciacquare ripetutamente il midollo osseo nella piastra di coltura con α-MEM completo fino a quando l'osso diventa bianco.
    5. Raccogliere la soluzione per il lavaggio del midollo osseo in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugarla a 800 x g per 3 minuti a temperatura ambiente.
    6. Scartare il surnatante con una pipetta, risospendere le cellule con 10 mL di terreno completo α-MEM e piastrle in un nuovo piatto di coltura da 10 cm.
    7. Dividere la mandibola arrossata in fette di osso di 1-3 mm³ con un rongeur e digerirle con 3 mL di collagenasi di tipo II allo 0,1% per 90 minuti in uno shaker a 200 giri/min a 37 °C.
    8. Centrifugare la mandibola digerita a 800 x g per 3 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.
    9. Coltura delle cellule prelevate e delle fette di osso digerite con terreno completo α-MEM a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 .
    10. Cambiare metà del terreno di coltura con terreno fresco dopo 72 ore e poi cambiarlo completamente ogni 2 giorni.
      NOTA: Non spostare il piatto di coltura per i primi tre giorni.
    11. Passaggio delle cellule aderenti con un rapporto di 1:2 quando raggiungono l'80%-90% di confluenza. Rimuovere le fette di osso durante la seconda sottocoltura. Usa le celle delle generazioni P2 o P3 per gli esperimenti.

3. Citometria a flusso per l'identificazione di marcatori di superficie cellulare

  1. Risospendere i JBMMSC della generazione P2 in tampone per citometria a flusso. Contare le cellule utilizzando un contatore automatico di cellule e regolare la concentrazione a 3 × 106 cellule/mL.
  2. Aggiungere 100 μl di sospensione cellulare e 2 μl di anticorpi monoclonali (CD11b/c, CD29, CD34, CD44, CD45 e CD90) a ciascuna provetta per microcentrifuga. Incubare per 30 minuti a 4 °C17,18.
  3. Lavare il campione due volte con 200 μL di tampone per citometria a flusso e centrifugarlo per 5 minuti a 250 x g a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante.
  4. Aggiungere 100 μl di tampone per citometria a flusso e 2 μl di anticorpo secondario fluorescente marcato con PE a ciascuna provetta. Incubare a 4 °C per 30 min.
  5. Ripetere il passaggio 3.3.
  6. Risospendere le JBMMSC in 300-500 μL di tampone per citometria a flusso per provetta.
  7. Condurre l'analisi citofluorimetrica utilizzando un citometro a flusso.
    NOTA: Utilizzare anticorpi omologhi come controlli negativi per eliminare la colorazione di fondo causata dalla combinazione non specifica di anticorpi.

4. Determinazione della proliferazione cellulare

  1. Seminare le JBMMSC della generazione P3 in una piastra da 96 pozzetti a una densità di 5 × 103 celle per pozzetto.
  2. Aggiungere 10 μL di soluzione CCK-8 a ciascun pozzetto.
  3. Posizionare la piastra a 96 pozzetti nell'incubatore per 2 ore e misurare l'assorbanza (valore OD a 450 nm) utilizzando un lettore di micropiastre.
    NOTA: Eseguire il test alla stessa ora ogni giorno per sette giorni consecutivi.

5. Capacità di formazione di colonie

  1. Seminare 1000 JBMMSC dal passaggio 3 in piastre di coltura da 10 cm e coltivare a 37 °C con il 5% di CO2.
  2. Cambiare il terreno di coltura ogni 3 giorni.
  3. Eseguire la colorazione con cristallovioletto dopo una coltivazione continua per 15 giorni.
  4. Quindi, fissare le cellule con metanolo per 5 minuti e colorare con il 2% di cristallovioletto per 5 minuti.

6. Differenziazione multilineage dei JBMMSC

NOTA: Utilizzare JBMMSC di generazione P3 per la differenziazione multilinea. Il gruppo di controllo è stato coltivato con α-MEM completo di terreno.

  1. Eseguire la differenziazione osteogenica.
    1. Inoculare 1 × 105 JBMMSC per pozzetto in una piastra a sei pozzetti.
    2. Quando la confluenza cellulare raggiunge il 70%, cambiare il mezzo in mezzo di induzione osteogenica.
      NOTA: Cambiare il mezzo di induzione osteogenica ogni 3 giorni.
    3. Eseguire la colorazione con fosfatasi alcalina (ALP) dopo 7 giorni di induzione osteogenica.
    4. Rimuovere il terreno dalla piastra a sei pozzetti, fissare le cellule con paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi lavarle con PBS tre volte.
    5. Colorare le cellule con la soluzione colorante ALP a temperatura ambiente per 30 minuti e proteggerle dalla luce.
    6. Sciacquare le cellule fino a quando non rimane più soluzione colorante e osservare i campioni al microscopio.
    7. Eseguire la colorazione con rosso di alizarina dopo 21 giorni di induzione osteogenica.
    8. Colorare le cellule con la soluzione colorante rossa di alizarina per 5 minuti dopo aver fissato le cellule con paraformaldeide al 4% per 30 minuti.
    9. Lavare le cellule con PBS fino a quando non rimane più una soluzione colorante rosso di alizarina.
    10. Osservare il numero di noduli di calcio al microscopio.
  2. Eseguire la differenziazione adipogenica.
    1. Inoculare 1 × 105 JBMMSC per pozzetto in una piastra a sei pozzetti.
    2. Quando la confluenza cellulare raggiunge il 70%, cambiare il mezzo in mezzo di induzione adipogenico.
      NOTA: Cambiare il mezzo di induzione adipogenica ogni tre giorni.
    3. Eseguire la colorazione con O rosso olio dopo 14 giorni di induzione adipogenica.
    4. Rimuovere il terreno dalla piastra a sei pozzetti, fissare le celle con la soluzione di fissaggio O rosso olio per 20-30 minuti, quindi lavarle con PBS tre volte.
    5. Rimuovere la soluzione fissante e lavare due volte le celle con acqua distillata.
    6. Immergere le cellule in isopropanolo al 60% per 20-30 s.
    7. Rimuovere l'isopropanolo al 60% e colorare le cellule con la colorazione O rosso olio per 20-30 minuti.
    8. Rimuovere la soluzione colorante, sciacquare le cellule con isopropanolo al 60% per 20-30 s, quindi lavarle con acqua distillata.
    9. Colorare il nucleo con una soluzione di ematossilina per 1-2 minuti.
    10. Rimuovere la soluzione di ematossilina e lavare le cellule 2-3 volte con acqua distillata. Aggiungere l'olio rosso O buffer per 1 minuto e rimuoverlo.
    11. Osservare il numero di goccioline lipidiche al microscopio.
  3. Eseguire la differenziazione condrogenica.
    1. Inoculare 1 × 105 JBMMSC per pozzetto in una piastra a sei pozzetti.
    2. Quando la confluenza cellulare raggiunge il 70%, cambiare il mezzo in mezzo di induzione condrogenica.
      NOTA: Cambiare il mezzo di induzione condrogenica ogni 3 giorni.
    3. Eseguire la colorazione blu di Alcian dopo 21 giorni di induzione condrogenica.
    4. Rimuovere il terreno dalla piastra a sei pozzetti, fissare le cellule con paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi lavarle con PBS tre volte.
    5. Colorare le celle con colorazione blu Alciano a 37 °C per 1 ora.
    6. Sciacquare le cellule fino a quando non rimane più soluzione colorante e osservarle al microscopio.

7. PCR in tempo reale

  1. Estrarre l'RNA totale utilizzando il kit di estrazione dell'RNA e misurare la concentrazione di RNA con un marcatore enzimatico (seguendo le istruzioni del produttore).
  2. Sintetizzare il cDNA utilizzando 500 ng di RNA19.
  3. Esecuzione di qRT-PCR su un sistema in tempo reale con 10 μL di miscela qRT-PCR contenente 1 μL di cDNA, 3,5 μL di acqua bidistillata, 5 μL di SYBR e 0,5 μL di miscela di primer (0,1 μM).
    NOTA: Le sequenze di primer sono elencate nella Tabella 1. Le condizioni dei cicli termici sono le seguenti: 50 °C per 2 min, 95 °C per 2 min, seguiti da 40 cicli di 95 °C per 15 s, 60 °C per 2 min, e poi incrementi di 0,5 °C per 5 s da 60 °C a 95 °C per la curva di fusione.
  4. Utilizzare GAPDH come controllo interno16.

Risultati

Dopo 72 ore di inoculazione cellulare, la maggior parte delle cellule era sospesa e di forma rotonda, con pochissime che aderivano alla parete (Figura 1B). Entro il quinto giorno, sono apparse colonie cellulari aderenti, che mostravano fusi o forme simili a fibroblasti (Figura 1C). Entro il settimo giorno, le cellule aderenti hanno raggiunto il 90% di confluenza, formando una forma a "banco di pesce" con un piccolo numero di celle sospese intermittenti (Figura 1D). Le cellule passate crescevano rapidamente e venivano fatte passare ogni 3 giorni. La morfologia cellulare era relativamente omogenea, prevalentemente a forma di fuso e disposta in uno schema a vortice dopo la confluenza (Figura 1E-G).

L'analisi della citometria a flusso ha rivelato alti livelli di espressione dei marcatori di superficie delle cellule staminali mesenchimali CD90, CD29 e CD44, con tassi di positività rispettivamente del 97,2%, 97,7% e 95,7%. Al contrario, i marcatori di superficie delle cellule staminali ematopoietiche CD45, CD34 e CD11b/c hanno mostrato una bassa espressione, con tassi positivi rispettivamente dell'1,37%, 0,66% e 1,49% (Figura 2A). Dopo 2 settimane di coltura, le JBMMSC hanno dimostrato la colonizzazione, come evidenziato dalla colorazione con cristallovioletto (Figura 2B). Hanno mostrato una capacità di espansione stabile in vitro, con la curva di crescita cellulare che segue un tipico modello "S-like" (Figura 2C). Il processo di proliferazione cellulare comprendeva un periodo latente, una fase di crescita logaritmica e una fase di plateau. La rapida crescita è iniziata dopo due giorni, seguita da un rallentamento dopo sei giorni. Le singole cellule mostravano caratteristiche di autoreplicazione e proliferazione.

Le cellule mostravano particelle di colorazione ALP blu-viola il 7° giorno e noduli mineralizzati rossi il 21° giorno. Inoltre, dopo 14 giorni di induzione adipogenica, le cellule mostravano goccioline lipidiche con perline rosse, mentre l'induzione della differenziazione condrogenica ha portato alla formazione di tessuto simile alla cartilagine blu (Figura 3A). Inoltre, dopo 7 giorni di induzione osteogenica, i livelli di espressione dell'mRNA di ALP, OCN e Runx2 nelle JBMMSC erano elevati15 (Figura 3B).

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Figura 1: Isolamento e coltura dei JBMMSC. (A) Una panoramica del protocollo. (B-D) Immagini di cellule coltivate per 3 giorni, 5 giorni e 7 giorni in coltura primaria, rispettivamente. (E-G) Immagini delle celle P1, P2 e P3, rispettivamente. Barre di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Identificazione delle JBMMSC. (A) Risultati dell'analisi della citometria a flusso delle JBMMSC di ratto. L'analisi della citometria a flusso ha rivelato che queste cellule erano positive per CD29, CD44 e CD90, in linea con le caratteristiche delle BMMSC. Al contrario, erano negativi per CD11b/c, CD34 e CD45. (B) Immagini rappresentative delle colonie di JBMMSC colorate con cristallovioletto (barre di scala: 100 μm). (C) La curva di crescita cellulare mostrava il tasso di proliferazione cellulare. I dati e le barre di errore denotano la media ± deviazione standard, n = 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Differenziazione multilineage (osteogenica, adipogenica e condrogenica) delle JBMMSC. (A) Dopo 7 giorni di induzione osteogenica, è stato osservato un aumento dell'attività dell'ALP. A 21 giorni dall'induzione osteogenica, numerosi noduli mineralizzati sono stati colorati di rosso con colorazione rossa di alizarina. La colorazione O rosso olio ha rivelato un numero significativo di goccioline lipidiche. La colorazione blu di Alcian ha evidenziato le cellule indotte nei condrociti dopo l'induzione condrogenica. (B) Espressione dell'mRNA dei geni osteogenici correlati ALP, OCN e Runx2 delle JBMMSC dopo induzione osteogenica per 7 giorni. (***P < 0,001, rispetto al gruppo di controllo). I dati e le barre di errore denotano la media ± deviazione standard, n = 3. Barre di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

GeneSequenze di primer (5'-3')
GADPHF: ACCCAGAAGACTGTGGATGG
R: CACATTGGGGGTAGGAACAC
ALPF: CACGTTGACTGTGGTTACTGCTGA
R: CCTTGTAACCAGGCCCGTTG
OCNF: GGTGGTGAATAGACTCCGGC
R: GCAACACATGCCCTAAACGG
Runx2F: GCACCCAGCCCATAATAGA
R: TTGGAGCAAGGAGAACCC

Tabella 1: Primer utilizzati nella PCR in tempo reale.

Discussione

Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMMSC) rappresentano un sottogruppo di cellule staminali non ematopoietiche che risiedono nel midollo osseo, caratterizzate dalle loro capacità di auto-rinnovamento, potenziale di differenziazione multidirezionale e funzioni di supporto per l'emopoiesi. Queste cellule svolgono un ruolo fondamentale in vari processi fisiologici come la rigenerazione dei tessuti, l'angiogenesi e la regolazione delle attività cellulari20. Di conseguenza, le BMMSC sono spesso utilizzate nella riparazione tissutale e nell'ingegneria rigenerativa come fonte ottimale di cellule seme21.

Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mascellare (JBMMSC), inizialmente isolate da aspirati di midollo osseo mascellare umano nel 2005 da Matsubara et al.22, mostrano caratteristiche distintive di differenziazione attribuibili alle origini uniche e ai percorsi di sviluppo della mascella rispetto ad altri siti scheletrici 4,23. Dati i distinti meccanismi di sviluppo e patologici che regolano l'osso craniofacciale, dare priorità alle JBMMSC nella riparazione dei difetti ossei craniofacciali sembra imperativo, a causa dei loro caratteri di sviluppo omologhi23. Inoltre, le JBMMSC mostrano un'elevata istocompatibilità con il microambiente orale a causa della loro comune origine del tessuto embrionale24,25. Nonostante questi vantaggi, un protocollo di isolamento standardizzato e sicuro per le JBMMSC rimane sfuggente e la ricerca sulle JBMMSC rimane relativamente limitata.

L'isolamento e la coltivazione delle BMMSC attualmente mancano di standardizzazione, con metodi comunemente impiegati tra cui la selezione di microsfere immunomagnetiche, la selezione con citometria a flusso, la centrifugazione con gradiente di densità e la coltura aderente dell'intero midollo osseo26. Tra questi, il metodo delle microsfere immunomagnetiche e il metodo di smistamento della citometria a flusso isolano le cellule riconoscendo antigeni specifici sulla superficie cellulare. Tuttavia, questi metodi comportano operazioni ingombranti, richiedono strumenti specializzati e possono influenzare l'attività cellulare nonostante la produzione di cellule di elevata purezza27. Il metodo di centrifugazione in gradiente di densità separa le cellule attraverso la centrifugazione e la stratificazione, che possono alterare il microambiente cellulare, portando a una crescita cellulare più lenta e a un aumento dell'invecchiamento cellulare28. Al contrario, il metodo di coltura aderente all'intero midollo osseo separa e purifica le BMMSC sostituendo in modo intermittente il terreno e passandole in base alle diverse capacità di adesione tra i diversi tipi di cellule nel midollo osseo. Questo metodo infligge danni minimi alle cellule ed è semplice da eseguire16.

Rispetto al femore, la mascella è di dimensioni più piccole e ha una cavità del midollo osseo più stretta, con interferenza da parte delle cellule del dente o del legamento parodontale. Il metodo di lavaggio e adesione del midollo osseo richiede una quantità relativamente maggiore di midollo osseo ed è adatto per animali di grossa taglia e per l'uomo29. Le JBMMSC nei ratti estratte applicando il tradizionale metodo di lavaggio del midollo osseo sono rare, lente a proliferare e di scarsa qualità30,31. Il contenuto di JBMMSC nel midollo osseo è molto basso e si trova principalmente nell'osso compatto e nell'endostio. Bu-Kyu Lee et al.32 hanno utilizzato gli aspirati mandibolari per isolare le JBMMSC, mentre il tempo totale di aspirazione per 10 ml di sangue midollare per la mandibola era cinque volte più lungo di quello per la cresta iliaca e la resa iniziale di MSC dalla mandibola era tre volte inferiore a quella della cresta iliaca. Il lavaggio del midollo osseo da solo non può isolare efficacemente le cellule nell'osso compatto e nell'endostio.

Negli ultimi anni, gli studi hanno scoperto che l'osso compatto è una fonte nuova e affidabile di BMMSC ed è stato derivato un metodo relativamente semplice di isolamento delle BMMSC, il metodo di coltura della digestione della fetta ossea33. Le BMMSC isolate con questo metodo hanno un'elevata purezza34. Guo et al.35hanno isolato con successo cellule staminali mesenchimali ossee da femori di topo utilizzando il metodo della coltura di digestione della fetta ossea. Yamazaet al.12 e Cheng et al.15 hanno applicato il metodo della coltura della digestione della fetta ossea all'isolamento di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mandibolare di topo e hanno verificato le proprietà delle MSC mediante proliferazione cellulare, immunofenotipo e differenziazione multilineare. Questo esperimento ha utilizzato una combinazione di adesione dell'intero midollo osseo e digestione di fette ossee per isolare e coltivare JBMMSC primarie di ratto. Il midollo osseo è stato accuratamente lavato via dalla cavità senza filtrazione per mantenere la composizione cellulare originale e i fattori di crescita nel midollo osseo. Quindi, le fette di osso sono state tagliate in piccoli pezzi e digerite usando collagenasi di tipo II per facilitare la risalita delle cellule dai frammenti ossei. Infine, le fette di osso sono state inoculate su un piatto di coltura e coltivate per consentire alle cellule di strisciare fuori dalle fette di osso. Il metodo di combinazione fa sì che il sistema di coltura della cellula primaria contenga contemporaneamente componenti di cellule staminali ematopoietiche, osso spongioso e osso corticale, che possono simulare meglio il microambiente delle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo nel corpo ed è più favorevole al mantenimento delle caratteristiche biologiche originali delle cellule. Questo metodo è quindi chiamato "un approccio di nicchia sulla staminalità"36. Luet al.37 ha anche sottolineato l'importanza delle nicchie di cellule staminali nell'isolamento delle BMMSC, ma coinvolgono solo il microambiente nel midollo osseo senza osso corticale. Questo metodo è stato applicato con successo nell'isolamento di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo dalla mascella di topo38.

Con questo approccio di nicchia abbiamo anche isolato e coltivato con successo JBMMSC di ratto. In primo luogo, le cellule isolate hanno mostrato una forma simile a quella dei fibroblasti e hanno aderito a piastre di coltura in plastica in vitro. In secondo luogo, le cellule esprimevano positivamente i marcatori di superficie CD90, CD29 e CD44 ed esprimevano negativamente CD45, CD34 e CD11b/c. In terzo luogo, le cellule potrebbero differenziarsi in osteociti, adipociti e condrociti. Le cellule ottenute avevano una buona morfologia, un rapido tasso di proliferazione e capacità di differenziazione, che soddisfaceva i criteri minimi per l'identificazione delle cellule staminali mesenchimali di derivazione umana proposti dalla Società Internazionale per la Terapia Cellulare17.

L'isolamento delle JBMMSC è stato sviluppato e utilizzato per isolare le cellule nell'uomo. Matsubara et al.22 sono stati i primi a isolare le JBMMSC da campioni di midollo osseo alveolare umano durante la chirurgia orale. Durante il processo di aspirazione della mandibola possono verificarsi possibili complicazioni, tra cui danni ai tessuti adiacenti, infezioni dovute a contaminazione batterica orale, ecc. Zong et al.39 hanno lavato la cavità del midollo osseo dei pezzi di campione osseo spongioso per ottenere JBMMSC umane. Park et al.40 hanno isolato JBMMSC umane da frammenti di osso alveolare ottenuti durante la perforazione dell'impianto utilizzando un metodo di digestione sequenziale. Mason et al.41 hanno isolato direttamente le JBMMSC umane dai nuclei del midollo osseo mascellare e dall'aspirato di pazienti sottoposti a posizionamento di impianti dentali di routine. C'è stato un alto tasso di successo nell'isolare le cellule dagli aspirati o dal nucleo e un tasso di successo più elevato della combinazione. Tuttavia, sebbene i metodi di cui sopra abbiano isolato con successo le JBMMSC dagli esseri umani, le differenze di efficacia tra i metodi devono essere confrontate. Attualmente, questo metodo presentato è stato utilizzato solo in topi e ratti e non ci sono ricerche sull'applicazione di questo metodo all'isolamento di JBMMSC umani. Ci sono dei limiti a questo metodo, soprattutto quando viene applicato agli esseri umani. Innanzitutto, questo metodo di combinare il lavaggio del midollo osseo e la digestione delle fette ossee è relativamente complicato e richiede più passaggi. In secondo luogo, i processi complessi impongono requisiti più elevati alla sterilità delle operazioni, che è fondamentale per il protocollo. In terzo luogo, è impossibile lavare l'intera cavità del midollo osseo dell'osso mascellare umano, quindi è necessario esplorare alcuni metodi equivalenti, come il lavaggio dei frammenti ossei spongiosi.

In sintesi, questo studio ha isolato e coltivato con successo JBMMSC di ratto utilizzando una combinazione di lavaggio del midollo osseo e digestione di fette ossee basata sul principio della "nicchia delle cellule staminali". I risultati dell'identificazione cellulare hanno confermato che questo metodo è in grado di isolare JBMMSC sufficienti e di elevata purezza, fornendo ampie fonti cellulari per l'ingegneria del tessuto osseo mascellare, in particolare nella riparazione dei difetti ossei, che è di grande importanza.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato supportato dai progetti di assistenza sanitaria del Dipartimento di logistica della Commissione militare (19BJZ22), dalla Beijing Natural Science Foundation (7232154) e dalla Fourth Mil Med Univ. progetti di ricerca clinica (2021XB025).

Materiali

Soluzione del midollo osseo di ratto
Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
di alizarina rossa S 0,2%SolarbioG1450
BCIP/NBT Kit di sviluppo del colore della fosfatasi alcalinaBeyotimeC3206
Bio-Rad CFX96 Sistema in tempo realeBio-Rad
CCK8 KitDujindoCK04
Piatto per coltura cellulare 10 cmCorning353003
CentrifugaEppendorf5810R
Provetta da centrifuga 15 mLCorning430790
Provetta da centrifuga 50 mLIncubatore Corning430828
CO2Thermo Fisher3111
Oscillatore a temperatura costanteShanghai Zhicheng Analysis Instrument Manufacturing Co., Ltd.ZWY-100H
Siero fetale bovinoBI04-001-1ACS
Citometroa flusso BDFACS C6 
Microscopio a contrasto di fase invertitoOlympusCKX41 
Kit di rilevamento dei marcatori di superficie delle cellule staminali mesenchimali (ratto) OricellRAXMX-09011
Lettore di micropiastre multifunzione BioTekSynergy LX Multi-Mode
Oil Red O Stain KitSolarbioG1262
Paraformaldeide 4%SolarbioP1110
PBSMACGENECC008
penicillina-streptomicina 0,25%MACGENECC004
PowerUp SYBR Green Master MixThermo FisherA25742
PrimeScript RT Master Mix TakaraRR036A
Kit di differenziazione monogenica delle cellule staminali mesenchimaliOricellRAXMX-90031
Kit di differenziazione condrogenica delle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo di rattoOricellRAXMX-90041
Kit di differenziazione osteogenica delle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo di rattoOricellRAXMD-90021
Kit di estrazione dell'RNATIANGENDP419
Banco super pulitoBeijing Yataikelong Instrument Technology Co., Ltd.KLCZ-1220A
Tripsina-EDTA  0,25%MACGENECC012
Tipo II collagenasiSolarbioC8150
Wistar ratBeijing Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd.
&alfa;-MEM terreno di coltura GibcoC12571500BT

Riferimenti

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