Smussatura a umido degli aghi per microiniezione che utilizza una pressione dell'aria costante per un feedback sull'apertura dell'ago

Sommario

Questo protocollo descrive l'assemblaggio di un sistema pneumatico per l'erogazione di aria pressurizzata a un ago durante il processo di smussatura dell'ago. Il protocollo descrive ulteriormente il processo di smussatura per la creazione di aghi per microiniezione affilati e come misurare la dimensione relativa dell'apertura dell'ago.

Abstract

Gli aghi per microiniezione sono uno strumento fondamentale per la somministrazione di reagenti per la modificazione del genoma, componenti CRISPR (RNA guida, proteina Cas9 e modello del donatore) e componenti del sistema di trasposoni (plasmidi e mRNA della trasposasi) in embrioni di insetti in via di sviluppo. Gli aghi affilati per microiniezione sono particolarmente importanti durante la somministrazione di questi agenti modificanti poiché aiutano a ridurre al minimo i danni all'embrione che viene iniettato, aumentando così la sopravvivenza di questi embrioni rispetto all'iniezione con aghi non smussati. Inoltre, la smussatura degli aghi produce aghi che sono più coerenti da ago ad ago rispetto agli aghi aperti rompendo casualmente la punta dell'ago sfiorando la punta contro un oggetto (lato di un vetrino coprioggetti, la superficie dell'embrione da iniettare, ecc.). Il processo di smussatura a umido degli aghi per microiniezione con aria a pressione costante erogata all'ago consente alla persona che smussa l'ago di sapere quando l'ago è aperto (presenza di bolle) e fornisce anche un'indicazione relativa di quanto grande è stata creata un'apertura dell'ago. La dimensione relativa dell'apertura nell'ago può essere determinata regolando la pressione dell'aria erogata all'ago fino a raggiungere un equilibrio e le bolle smettono di fluire dalla punta dell'ago. Più bassa è la pressione alla quale viene raggiunto l'equilibrio, maggiore è la dimensione dell'ago; E viceversa, maggiore è la pressione, minore è la dimensione dell'ago.

Introduzione

La modificazione genetica degli insetti è un processo originariamente sviluppato in Drosophila da Rubin e Spradling e, nel corso degli anni, questo processo è stato modificato per creare modificazioni genetiche in^{altre specie.} Il processo si basa sulla consegna precisa di componenti di modifica microiniettati negli embrioni in una specifica finestra di tempo e luogo all'interno dell'embrione in via di sviluppo ^2,3,4. Gli aghi affilati per microiniezione sono uno strumento fondamentale nel processo di modificazione genetica di alcuni insetti, come le zanzare 4,5,6,7,8,9 e i flebotomi¹⁰, mentre non sono così critici per altri insetti, come i bachi da seta ¹¹. Gli aghi affilati sono spesso un fattore chiave tra il successo e il fallimento quando si cerca di creare un insetto geneticamente modificato ^2,4. Tipicamente, gli aghi di vetro microcapillari vengono tirati riscaldando il vetro fino al punto in cui il vetro diventa elastico, consentendo al capillare di essere tirato in un ago a punta chiusa affusolata. Prima di poter essere utilizzato, l'ago deve essere aperto in modo da creare una punta affilata per l'iniezione. Tradizionalmente, gli aghi vengono aperti sfiorando delicatamente la punta dell'ago contro qualcosa (il bordo di un vetrino/vetrino coprioggetti, o l'embrione, ecc.) che provoca la rottura di una piccola quantità di vetro dalla punta, creando casualmente una punta affilata ^2,3. Un processo leggermente meno casuale è la smussatura a secco, in cui l'ago viene rapidamente abbassato su una piastra abrasiva rotante otticamente piatta per un breve periodo di tempo, provocando l'abrasione di una piccola quantità di vetro dalla punta dell'ago, creando una punta affilata. La smussatura a secco è un po' meno casuale rispetto allo sfioramento della punta dell'ago contro qualcosa. Il protocollo descritto di seguito fa un ulteriore passo avanti nel processo di smussatura fornendo aria compressa all'ago da smussare e smussandolo sotto uno strato di liquido in modo che le bolle siano visibili non appena l'ago è stato aperto. Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo per produrre aghi per microiniezione affilati in modo affidabile. La smussatura sotto uno strato di liquido è un miglioramento rispetto alla rottura casuale dell'ago come descritto sopra e alla smussatura a secco perché l'utente riceve un feedback sul processo di smussatura, consentendo alla persona che smussa di sapere quando l'ago è aperto e relativamente quanto è grande l'apertura dell'ago. Conoscere la dimensione relativa dell'apertura della punta dell'ago può consentire alla persona che smussa di creare aghi con diverse dimensioni di apertura. Varie dimensioni di apertura dell'ago hanno vantaggi diversi; Ad esempio, le dimensioni dell'apertura dell'ago più grandi possono ospitare miscele di iniezione ad alta viscosità, mentre gli aghi di apertura più piccoli causano meno danni all'embrione che viene iniettato.

L'aria viene fornita all'ago utilizzando un regolatore e un sistema di tubi in uretano basati su un sistema di iniezione modificato regolato dalla pressione dell'aria². Mentre l'aria viene fornita all'ago a una pressione costante, l'ago viene smussato sotto uno strato di liquido. Il processo di smussatura è composto da un processo ripetuto in cinque fasi: 1) abbassamento dell'ago sulla superficie abrasiva, 2) lasciando che l'ago smussi per un breve periodo di tempo, 3) sollevando l'ago dalla piastra abrasiva mantenendolo sotto la superficie dello strato liquido, 4) arrestando la rotazione della piastra abrasiva per verificare la comparsa di bolle. Se non sono presenti bolle, i passaggi da 1 a 4 vengono ripetuti fino a quando non compaiono le bolle; 5) Una volta presenti le bolle, la pressione dell'aria può essere regolata per determinare la dimensione relativa dell'apertura dell'ago. Minore è la pressione necessaria per fermare la formazione di bolle, maggiore è l'apertura sulla punta dell'ago.

Protocollo

NOTA: Il protocollo descritto di seguito utilizza il Sutter BV-10 microcapillare smussato. Tuttavia, questo protocollo può essere modificato per l'uso con qualsiasi modello di microcapillare smussato.

1. Assemblaggio del regolatore, del manometro e del tubo di alimentazione dell'aria

1. Tagliare una sezione di tubo in uretano per il collegamento dall'alimentazione dell'aria alla base del regolatore (R; Sezione 1, Figura 1). La lunghezza di questa sezione dipenderà dalla distanza dall'alimentazione dell'aria al regolatore, che si troverà accanto alla smussatrice .
2. Far scorrere un tubo clamp sul tubo di uretano, quindi spingere un connettore del tubo flessibile all'estremità del tubo. Assicurarsi che il connettore del tubo sia completamente inserito posizionandolo contro una superficie dura. Tenendo il tubo vicino al connettore del tubo, premere saldamente il tubo nel tubo fino a quando il connettore del tubo non è completamente inserito. Insieme, il tubo clamp e il connettore del tubo flessibile formano il collegamento HC (Figura 1).
3. Far scorrere il tubo clamp fino all'estremità del tubo dove è inserito il connettore del tubo. Ruotare la fascetta stringitubo sull'estremità della punta inserita in modo che formi un collegamento ermetico.
4. Avvitare manualmente il connettore del tubo flessibile nella base del regolatore (R), quindi terminare il serraggio del collegamento con una piccola chiave. Assicurati che la connessione sia ermetica ma non eccessiva.
5. Nella porta laterale del regolatore, avvitare a mano un connettore a T (T), quindi utilizzare una piccola chiave per terminare il serraggio.
6. Tagliare un piccolo pezzo di tubo di uretano (Figura 1, Sezione 2), lungo circa 3-5 cm. Posizionare due fascette stringitubo sul pezzo di tubo, quindi inserire un connettore per tubo flessibile in ciascuna estremità del tubo e terminare i collegamenti (HC) come descritto nei passaggi 1.2-1.4 per ciascuna estremità del tubo.
7. Avvitare un'estremità del tubo corto nella base del manometro, quindi terminare il serraggio con una chiave come al punto 1.5.
8. Avvitare l'altra estremità del tubo corto in una delle porte del connettore a T (T) collegato al regolatore al punto 1.5.
9. Tagliare una sezione del tubo in uretano (Figura 1, Sezione 3) per il collegamento tra il regolatore e il supporto dell'ago (NH). La dimensione di questa sezione dipenderà dalla distanza dalla smussatrice alla posizione del regolatore.
10. Posizionare un tubo clamp sulla sezione del tubo, quindi inserire un connettore del tubo come descritto nei passaggi 1.2-1.4.
11. Sull'altro lato di questa sezione di tubo, posizionare il connettore luer femmina (LC) fornito con il supporto dell'ago (NH).
12. Rimuovere il morsetto di fissaggio e la rondella di nylon (Figura 2, f) dal manipolatore. Il morsetto di fissaggio e la rondella sono progettati per contenere solo un microcapillare di vetro, non sono progettati per sostenere il peso aggiuntivo di un supporto microcapillare, un'asta filettata e un tubo di alimentazione dell'aria.
13. Taglia un pezzo rettangolare di foglio di gomma da imballaggio di 1,5 cm x 2 cm per avvolgere l'asta filettata nel morsetto del parafango della bicicletta. Ciò contribuirà a tenere più saldamente l'asta filettata e il supporto dell'ago nel morsetto del parafango della bicicletta. Utilizzando due pinze ad ago, aprire la clip del parafango della bicicletta, piegare il pezzo rettangolare di foglio di gomma sopra l'asta filettata a 3,5 cm da un'estremità dell'asta in modo che formi una U sopra l'asta. Inserire l'asta filettata rivestita in un foglio di gomma nel morsetto del parafango della bicicletta aperto e utilizzare le pinze per chiudere il morsetto attorno all'asta e al foglio di gomma. Installare la bicicletta clamp e il gruppo dell'asta filettata sul bullone del manipolatore, sostituire il fissaggio clamp senza la rondella di nylon e serrare il fissaggio clamp finché non tiene saldamente il gruppo dell'asta filettata.
14. Infilare il portaago sull'asta filettata. Assicurarsi che il connettore luer termini in una posizione che non leghi il tubo di uretano quando è collegato (Figura 2, g).
15. Collegare il connettore luer femmina al connettore luer maschio (Figura 2, g) del portaago (Figura 2, d).
16. Collegare l'estremità libera della Figura 1, Sezione 1 del tubo all'alimentazione dell'aria (questa connessione varierà in base all'alimentazione dell'aria utilizzata). L'alimentazione dell'aria deve essere pulita, asciutta e priva di residui di olio. L'alimentazione dell'aria può provenire da una fonte d'aria domestica o da una bombola di gas, aria compressa o azoto.

2. Smussatura degli aghi in borosilicato

1. Estrarre gli aghi per microiniezione utilizzando micro capillari in vetro borosilicato con le seguenti impostazioni sullo strumento: Calore: 305, Fil: 4, Vel: 70, Del: 235, Pul: 160, con tempo di loop di 12.24.
2. Assemblare il gruppo di macinazione secondo le istruzioni del produttore, costituito dalla piastra abrasiva e dall'anello di ritegno con magneti¹².
   NOTA: Potrebbe essere necessario avvolgere la piastra abrasiva con una sottile striscia di pellicola trasparente per evitare la fuoriuscita prematura di Photo-Flo (agente bagnante) dalla piastra abrasiva. Ciò è necessario solo se la soluzione di agente umettante fuoriesce prematuramente nell'olio del piedistallo, provocando l'arresto della rotazione della piastra di macinazione. L'agente umettante riduce il rischio di segni di essiccazione sugli aghi di vetro dopo la smussatura. L'uso di un agente umettante non è fondamentale per il processo di smussatura e l'acqua può essere sostituita.
3. Posizionare 10 gocce di olio per piedistallo sulla superficie otticamente piana del piedistallo e posizionare sopra il gruppo di macinazione. Avviare il gruppo di macinazione.
4. Accendere la fonte di luce per illuminare la superficie. Assicurarsi che la sorgente luminosa sia posizionata dietro lo smussato e brilli con un angolo di 45° rispetto alla piastra abrasiva e all'ago. L'angolo di illuminazione è necessario in modo che l'ombra dell'ago sia facilmente visibile. Con un ingrandimento di 90x, ruotare la testa del microscopio in posizione. Arrestare brevemente la rotazione della piastra abrasiva e mettere a fuoco il microscopio sulla superficie della piastra abrasiva.
5. Aggiungere l'1% di agente umettante allo stoppino fino a quando lo stoppino non è completamente bagnato. Aggiungere l'1% di agente umettante sulla superficie della piastra abrasiva. Assicurarsi che l'agente umettante copra la superficie abrasiva ma non fuoriesca dall'anello di sicurezza nero.
6. Posizionare lo stoppino pre-bagnato sulla superficie della piastra abrasiva mentre gira. Assicurati che lo stoppino si trovi sul lato sinistro della piastra abrasiva (mentre guardi in basso dall'alto) e si estenda dalle 11 alle 6 (con la piastra come quadrante dell'orologio). Assicurarsi che lo stoppino non scorra sulla parte nera dell'anello di sicurezza.
7. Inserire un ago nel portaago (Figura 2, d) e serrare l'anello di ritegno per tenere l'ago in posizione. Aprire il regolatore (Figura 1, R) e aumentare la pressione a 24 psi.
8. Sollevare il portaago ruotando la manopola di regolazione del percorso (Figura 2, a) Assicurarsi che l'ago sia sollevato abbastanza in alto da essere più alto della superficie della piastra abrasiva rotante, quindi ruotare l'intero manipolatore in modo che l'ago oscilli in posizione sopra la piastra abrasiva rotante. L'ago da smussare deve essere posizionato sulla piastra abrasiva rotante orientata in modo tale che la rotazione della piastra si allontani dalla punta dell'ago (Figura 3A)
9. Guardando di lato, utilizzare la manopola di regolazione grossolana (Figura 2, a) per abbassare l'ago verso la superficie della piastra abrasiva. Fermati quando l'ago tocca quasi la superficie del liquido.
10. Utilizzare lo zoom per abbassare l'ingrandimento del microscopio, quindi spostare il microscopio in modo che l'ago si trovi al centro del campo visivo. Una volta al centro della visuale, aumentare l'ingrandimento, regolando la posizione del manipolatore in modo che la punta dell'ago rimanga al centro della visuale. Una volta raggiunto l'ingrandimento massimo, arrestare la piastra di macinazione e mettere a fuoco il microscopio sulla superficie della piastra abrasiva, quindi riavviare immediatamente la rotazione della piastra una volta che la superficie è a fuoco. A questo punto l'ago potrebbe non essere in vista.
11. Utilizzando la manopola di regolazione grossolana del manipolatore, abbassare l'ago verso la piastra abrasiva. Nel campo visivo, saranno visibili un'immagine dell'ago e una o più ombre dell'ago. Quando l'ago e l'ombra dell'ago sono vicini al contatto, passare alla manopola di regolazione fine del manipolatore e continuare ad abbassare l'ago fino a quando l'ago e le sue ombre sembrano toccarsi. A questo punto, leggere il calibro (Figura 2, c) e annotare la lettura. La superficie della piastra abrasiva è pari o inferiore a questa lettura del calibro.
    NOTA: È difficile vedere quando l'ago tocca la superficie della piastra abrasiva rotante, quindi l'ago potrebbe non toccare effettivamente la piastra abrasiva a questo punto.
12. Lasciare che l'ago rimanga a questo livello di lettura del calibro per 5-10 s.
13. Utilizzando la manopola di regolazione fine del manipolatore, sollevare l'ago, assicurandosi che rimanga sotto la superficie dell'agente bagnante. Interrompere la rotazione della piastra abrasiva per alcuni secondi e osservare se fuoriescono bolle dalla punta dell'ago. Se sono presenti bolle, procedere al passaggio 2.15. Se non sono presenti bolle, procedere al passaggio 2.14.
14. Riportare l'ago alla lettura del calibro utilizzando la manopola di regolazione fine del manipolatore, quindi spostarlo un po' più in basso ed eseguire una nuova lettura del calibro, quindi ripetere i passaggi 2.12-2.13.
15. Avviare nuovamente la piastra abrasiva per vedere se la formazione di bolle è osservabile mentre la piastra è in rotazione. Se l'evidenza della formazione di bolle è visibile durante la rotazione della piastra, l'apertura della punta dell'ago è probabilmente troppo grande per microiniezioni di embrioni sensibili, come le iniezioni di embrioni di zanzara. Se la formazione di bolle non è visibile durante la rotazione del piatto abrasivo, l'apertura dell'ago è ideale per l'uso in procedure che richiedono un ago di apertura affilato e piccolo.
16. Utilizzare la manopola di regolazione del percorso del manipolatore per sollevare l'ago sopra la piastra abrasiva in una posizione sufficientemente alta sopra la piastra in modo che l'ago non colpisca nulla mentre l'intero manipolatore viene ruotato per allontanare l'ago dalla piastra abrasiva e dal microscopio.
17. Una volta che l'ago è in una posizione in cui può essere rimosso senza colpire nulla, abbassare la pressione dell'aria a zero, rimuovere l'ago e metterlo in una scatola per la conservazione degli aghi (una capsula di Petri con nastro biadesivo o argilla da modellare per tenere gli aghi smussati) fino all'uso.

3. Determinazione della dimensione relativa dell'apertura dell'ago smussato

NOTA: La determinazione delle dimensioni relative dell'apertura dell'ago smussato viene effettuata al punto 2.13. I passaggi seguenti descrivono ulteriormente questo processo.

1. Una volta osservate le bolle al punto 2.13, con la piastra abrasiva non in rotazione, diminuire lentamente la pressione dell'aria ruotando la manopola di regolazione del regolatore (Figura 1, R) fino a quando le bolle smettono di fluire dalla punta dell'ago. Notare la pressione alla quale le bolle smettono di fluire dalla punta.
2. Aumentare la pressione dell'aria fino a quando le bolle non fluiscono di nuovo dalla punta dell'ago. Maggiore è la pressione, minore è l'apertura dell'ago.
3. Procedere spostando l'ago in una posizione in cui possa essere rimosso in sicurezza, passaggi 2.16-2.17.

Risultati

La procedura sopra descritta produce aghi per microiniezione costantemente affilati. Gli aghi affilati sono caratterizzati dalla capacità di inserirsi in embrioni di insetti morbidi corion, come gli embrioni di zanzara, con poca o nessuna resistenza da parte della membrana embrionale. Quando gli embrioni di zanzara vengono microiniettati per la modificazione genetica, la membrana embrionale è relativamente elastica. Spingere un ago smussato contro la membrana dell'embrione ne causerà l'indentazione (Figura 4B). Quando l'ago viene tirato indietro, la membrana riacquista la sua forma. Con una pressione sufficiente, l'ago smussato alla fine strapperà la membrana e l'embrioplasma probabilmente fuoriuscirà. Più affilato è l'ago, minore è la rientranza quando l'ago viene premuto contro la membrana dell'embrione (Figura 4E). Invece di strappare la membrana, un ago affilato scivolerà attraverso la membrana, causando danni minimi o nulli all'embrione. Con un ago ideale, non ci sarà quasi nessuna rientranza della membrana embrionale poiché l'ago scivola nell'embrione.

L'Università del Maryland Insect Transformation Facility (UM-ITF) è una struttura di servizi che crea insetti geneticamente modificati per clienti nel mondo accademico e nell'industria. La struttura utilizza aghi smussati per la microiniezione di embrioni di zanzara. Nel periodo compreso tra gennaio 2023 e dicembre 2023, l'UM-ITF ha iniettato 12.795 embrioni di Aedes in 56 progetti clienti (Tabella 1). L'uso di aghi smussati ha aiutato l'UM-ITF a mantenere un portello medio post-iniezione del 31% in tutti i progetti (Tabella 2). Inoltre, l'UM-ITF è stato in grado di mantenere un tasso di successo dell'iniezione del 96%, come determinato dal follow-up post-progetto con i clienti (Tabella 2). Il successo dell'iniezione è una misura del fatto che i materiali di iniezione (guide CRISPR, proteina Cas9, plasmidi vettori di trasposoni, ecc.) iniettati siano stati consegnati negli embrioni del progetto in un modo in cui questi materiali sono stati in grado di creare una modificazione genetica, in pratica, c'erano prove della creazione di CRISPR Indel, dell'inserimento del vettore basato sul trasposone del cliente o dell'inserimento di un vettore di controllo della qualità dell'iniezione (il trasposone termina con un promotore più un marcatore). In altre parole, le iniezioni erano abbastanza buone da produrre modificazioni genetiche, se i componenti iniettati funzionavano correttamente. Ci sono molti fattori che contribuiscono al successo di un progetto di modificazione genetica e le microiniezioni di qualità con aghi affilati sono un fattore chiave di successo. La smussatura degli aghi utilizzando la procedura descritta nel protocollo di cui sopra consente all'UM-ITF di produrre costantemente aghi per microiniezione affilati di qualità, consentendo quindi all'UM-ITF di eseguire iniezioni costantemente efficaci.

Figura 1: Diagramma schematico dei componenti del sistema dell'aria e collegamento al microcapillare. L'aria viene erogata all'ago capillare attraverso un sistema di tubi di uretano da un'alimentazione d'aria (aria domestica o bombola d'aria). I tubi in uretano sono collegati al regolatore (R) e al manometro tramite raccordi per tubi flessibili (HC), che sono costituiti da un connettore per tubo flessibile e da una fascetta stringitubo. Il raccordo del tubo si avvita in un raccordo femmina filettato 10-32 sulla base del regolatore (R) e del manometro. Un connettore a T (T) è collegato al regolatore (R) per far fuoriuscire l'aria tra il manometro e il portaspillo (NH). Il tubo in uretano è collegato al portaago tramite un connettore luer (LC) fornito con il portaago (NH). Il collegamento all'alimentazione dell'aria varia a seconda dell'alimentazione dell'aria utilizzata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Parti del manipolatore e configurazione dell'aria. Parti del manipolatore: a. manopola di regolazione grossolana, b. manopola di regolazione fine, c. calibro, d. portaago WPI, e. calibro angolare, f. morsetto di fissaggio e clip per parafango della bicicletta, g. adattatore luer e connettore per tubo luer e h. tubo in uretano. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Posizionamento dell'ago in relazione alla rotazione del piatto abrasivo. (A) Posizionamento corretto dell'ago durante la smussatura. L'ago da smussare deve essere posizionato sulla piastra abrasiva rotante orientata da qualche parte tra la perpendicolare alla rotazione e in linea con la rotazione, dove la rotazione si allontana dalla punta dell'ago. (B) Posizionamento errato dell'ago. La rotazione della piastra abrasiva in questo orientamento fa sì che la superficie della piastra abrasiva spinga sulla punta dell'ago piuttosto che sotto e oltre la punta. In questo orientamento, la smussatura potrebbe non avvenire in modo uniforme. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Confronto tra l'inserimento dell'ago con aghi non affilati e affilati. (A-C) ago non affilato e (D-F) ago affilato. (A) e (D) sono stati catturati prima che l'ago entrasse in contatto con l'embrione; (B) ed (E) si trovano nel punto immediatamente precedente alla perforazione della membrana embrionale da parte dell'ago, mentre (C) e (F) si trovano subito dopo la perforazione dell'ago. La freccia bianca in (B) indica l'indentazione della membrana embrionale perché è necessario applicare una pressione maggiore affinché un ago non affilato possa perforare. La freccia nera in (E) indica la mancanza di rientranza dovuta al piercing dell'ago che si fa facilmente grazie a un ago affilato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Progetti UM-ITF Aedes da gennaio 2023 a dicembre 2023. Elenco dei progetti di microiniezione UM-ITF Aedes con il numero di embrioni iniettati per ciascun progetto, il numero di larve nate da questi embrioni iniettati e la percentuale di larve che si sono schiuse per embrione iniettato totale. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: I risultati del progetto Aedes UM-ITF. L'UM-ITF è una struttura di servizi che fornisce servizi di microiniezione per la modificazione genetica degli insetti. La tabella elenca il numero di progetti Aedes iniettati da ITF da gennaio 2023 a dicembre 2023. Il numero di clienti che hanno risposto alle richieste di follow-up del progetto in cui la risposta indicava il successo o il fallimento del progetto di iniezione. Il numero di progetti di successo, in cui un progetto di successo è stato quello in cui i materiali di iniezione sono stati microiniettati in un momento e in un luogo tali da consentire alle iniezioni di produrre una modificazione genetica, e il numero di progetti che sono stati considerati non riusciti a causa della mancanza di modificazione genetica. Il tasso medio di schiusa per i progetti di microiniezione Aedes nel periodo da gennaio 2023 a dicembre 2023. Il tasso di successo del progetto e il tasso di risposta del cliente. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

La modificazione genetica delle zanzare si basa su una microiniezione precisa dei materiali di modificazione (plasmidi, RNA guida o proteine) negli embrioni pre-blastoderma 3,4,5,6,7,8. Fondamentali per questo processo sono gli aghi affilati che perforano facilmente l'embrione durante l'iniezione ^2,4. Un ago affilato è in grado di scivolare attraverso la membrana, rilasciare i materiali di modifica ed essere prelevato dall'embrione senza che la parte dell'embrio-plasma fuoriesca nel sito di iniezione dopo la microiniezione (osservazione personale).

Gli aghi per microiniezione vengono chiusi quando vengono estratti per la prima volta e devono essere aperti prima dell'iniezione². Tradizionalmente, gli aghi per microiniezione sono stati aperti sfiorando delicatamente l'ago contro qualcosa come il bordo del vetrino coprioggetti o il vetrino che trattiene gli embrioni, contro l'embrione stesso o qualche altro materiale². Tuttavia, l'apertura dell'ago sfiorandolo contro un oggetto fornisce un risultato incoerente (osservazione personale). A volte, l'ago si rompe in modo da renderlo affilato, mentre altre volte l'ago diventa molto opaco, il che, come accennato in precedenza, può danneggiare gli embrioni che vengono iniettati, impedendone la modifica o, nel peggiore dei casi, uccidendo l'embrione. In alternativa, gli aghi possono anche essere aperti inserendo l'ago in un embrione. Questo processo può aprire l'ago, rendendolo pronto per l'iniezione. Tuttavia, produce anche risultati casuali che occasionalmente creano un ago molto affilato, ma più spesso intasano l'ago con materiale embrionale prima che possa essere utilizzato per l'iniezione. Sebbene gli aghi smussati richiedano tempo e fatica extra, il processo produce aghi affilati in modo più coerente.

La modificazione genetica delle zanzare è anche un processo dipendente dal tempo che richiede che gli embrioni vengano microiniettati prima che l'embrione in via di sviluppo cellularizzi 4,5,6,7,8. Quando si aprono gli aghi sfiorando l'ago contro qualcosa o inserendo l'ago in un embrione, il tempo necessario per aprire e trovare un ago affilato viene preso quando gli embrioni sono già pronti per l'iniezione e continuano a svilupparsi. Nel migliore dei casi, il processo di apertura di un ago e la produzione di un ago affilato richiede solo un minuto o due, ma altre volte potrebbe volerci abbastanza tempo da far sì che le uova preparate per quel ciclo di iniezione siano troppo vecchie nel momento in cui viene prodotto un buon ago. Il vantaggio della smussatura è che viene eseguita in anticipo e gli aghi sono pronti per l'uso non appena gli embrioni vengono impostati per l'iniezione, assicurando che gli embrioni siano allo stadio di sviluppo perfetto per l'iniezione.

Sebbene il protocollo di cui sopra sia stato sviluppato e utilizzi la smussatrice Sutter BV-10, il protocollo può essere modificato per l'uso con qualsiasi smussatrice . Il fattore principale è che la superficie di smussatura deve essere in grado di contenere un piccolo volume di liquido sotto il quale è smussato l'ago.

Smussare gli aghi per microiniezione mentre una fonte d'aria fornisce aria compressa alla parte posteriore dell'ago ha due vantaggi. Innanzitutto, la pressione dell'aria aiuta a produrre aghi coerenti. Quando il processo di smussatura viene avviato alla stessa pressione dell'aria fornita, vengono prodotti aghi costantemente affilati e la smussatura viene interrotta quando compaiono le bolle per la prima volta. È fondamentale che per osservare la formazione iniziale di bolle, la piastra abrasiva debba essere fermata momentaneamente in modo che la rotazione della piastra abrasiva non mascheri la formazione iniziale di bolle. Se la presenza di bolle è visibile solo quando la piastra abrasiva è in movimento, l'apertura dell'ago potrebbe essere troppo grande. È fondamentale che la pressione dell'aria fornita sia la stessa ogni volta che viene avviata la smussatura, che la smussatura venga interrotta non appena le bolle iniziano a fuoriuscire (visualizzata quando la piastra non è in movimento) e che le bolle non siano visibili quando la piastra è in movimento Il secondo vantaggio è che una volta aperto l'ago, La dimensione dell'apertura può essere misurata relativamente diminuendo la pressione dell'aria fornita fino a quando le bolle smettono di fuoriuscire dalla punta dell'ago. Notando la pressione alla quale le bolle smettono di fluire dalla punta, è possibile dedurre una dimensione relativa dell'apertura. Più bassa è la pressione alla quale le bolle smettono di scorrere, maggiore è l'apertura nella punta dell'ago e maggiore è la pressione, minore è la dimensione dell'apertura della punta. Conoscere la dimensione relativa dell'apertura può essere utile quando si utilizza una miscela per iniezione più viscosa e, quindi, più probabile che ostruisca l'ago per iniezione. L'utilizzo di questa misura della dimensione relativa dell'apertura consente la creazione di aghi in grado di erogare miscele per iniezione a viscosità più elevata. Naturalmente, ci sono alcuni compromessi quando si utilizzano aghi con dimensioni di apertura maggiori. In particolare, gli embrioni iniettati possono avere maggiori probabilità di fuoriuscire dopo l'iniezione e i tassi di sopravvivenza per gli embrioni iniettati possono essere inferiori.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microcapillari con diametro esterno di 1,0 mm	World Precision Instruments
Olio per piedistallo smussato	Sutter Instruments	008
Clip per parafango per bicicletta	VeloOrange	R-clip Confezione da 4	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand Microscopio	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscopio o equivalente
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Piastra abrasiva diamantata	Sutter Instruments	104F	Piastra abrasiva diamantata - extra fine (da 0,2 µ a 1,0 µ dimensioni della punta)
Guarnizione, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Utilizzato per sigillare il collegamento su connettori a T o a L, se non già incluso con questi pezzi
Tubo Clamp	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
Connettore per tubo flessibile	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Necessita di 5 connettori per tubi flessibili
Supporto per ago per microiniezione	World Precision Instruments	MPH3-10	Supporto per aghi per microcapillari con diametro esterno di 1 mm
P-2000	Sutter Instruments		Qualsiasi estrattore per aghi
Photo-Flo 200 Solution	B& H Foto, Video e Audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	agente bagnante
Manometro	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	Calibro 0-100 psi
Stoppino di riferimento	Sutter Instruments	X050300
Porta stoppino di riferimento	Sutter Instruments	M100019
Regolatore	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Bisogno di porte #10-32 per i collegamenti
Foglio di imballaggio in gomma 6 inx 6 in	Danco	Modello # 59849
Raccordo a T	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
		filettata	Barra filettata o barra con estremità filettata. I fili devono essere 10-32.
Tubo in uretano	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050