Questo protocollo descrive l'assemblaggio di un sistema pneumatico per l'erogazione di aria pressurizzata a un ago durante il processo di smussatura dell'ago. Il protocollo descrive ulteriormente il processo di smussatura per la creazione di aghi per microiniezione affilati e come misurare la dimensione relativa dell'apertura dell'ago.
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Articolo metodologico
Smussatura a umido degli aghi per microiniezione che utilizza una pressione dell'aria costante per un feedback sull'apertura dell'ago
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli aghi per microiniezione sono uno strumento fondamentale per la somministrazione di reagenti per la modificazione del genoma, componenti CRISPR (RNA guida, proteina Cas9 e modello del donatore) e componenti del sistema di trasposoni (plasmidi e mRNA della trasposasi) in embrioni di insetti in via di sviluppo. Gli aghi affilati per microiniezione sono particolarmente importanti durante la somministrazione di questi agenti modificanti poiché aiutano a ridurre al minimo i danni all'embrione che viene iniettato, aumentando così la sopravvivenza di questi embrioni rispetto all'iniezione con aghi non smussati. Inoltre, la smussatura degli aghi produce aghi che sono più coerenti da ago ad ago rispetto agli aghi aperti rompendo casualmente la punta dell'ago sfiorando la punta contro un oggetto (lato di un vetrino coprioggetti, la superficie dell'embrione da iniettare, ecc.). Il processo di smussatura a umido degli aghi per microiniezione con aria a pressione costante erogata all'ago consente alla persona che smussa l'ago di sapere quando l'ago è aperto (presenza di bolle) e fornisce anche un'indicazione relativa di quanto grande è stata creata un'apertura dell'ago. La dimensione relativa dell'apertura nell'ago può essere determinata regolando la pressione dell'aria erogata all'ago fino a raggiungere un equilibrio e le bolle smettono di fluire dalla punta dell'ago. Più bassa è la pressione alla quale viene raggiunto l'equilibrio, maggiore è la dimensione dell'ago; E viceversa, maggiore è la pressione, minore è la dimensione dell'ago.
Introduzione
La modificazione genetica degli insetti è un processo originariamente sviluppato in Drosophila da Rubin e Spradling e, nel corso degli anni, questo processo è stato modificato per creare modificazioni genetiche inaltre specie. Il processo si basa sulla consegna precisa di componenti di modifica microiniettati negli embrioni in una specifica finestra di tempo e luogo all'interno dell'embrione in via di sviluppo 2,3,4. Gli aghi affilati per microiniezione sono uno strumento fondamentale nel processo di modificazione genetica di alcuni insetti, come le zanzare 4,5,6,7,8,9 e i flebotomi10, mentre non sono così critici per altri insetti, come i bachi da seta 11. Gli aghi affilati sono spesso un fattore chiave tra il successo e il fallimento quando si cerca di creare un insetto geneticamente modificato 2,4. Tipicamente, gli aghi di vetro microcapillari vengono tirati riscaldando il vetro fino al punto in cui il vetro diventa elastico, consentendo al capillare di essere tirato in un ago a punta chiusa affusolata. Prima di poter essere utilizzato, l'ago deve essere aperto in modo da creare una punta affilata per l'iniezione. Tradizionalmente, gli aghi vengono aperti sfiorando delicatamente la punta dell'ago contro qualcosa (il bordo di un vetrino/vetrino coprioggetti, o l'embrione, ecc.) che provoca la rottura di una piccola quantità di vetro dalla punta, creando casualmente una punta affilata 2,3. Un processo leggermente meno casuale è la smussatura a secco, in cui l'ago viene rapidamente abbassato su una piastra abrasiva rotante otticamente piatta per un breve periodo di tempo, provocando l'abrasione di una piccola quantità di vetro dalla punta dell'ago, creando una punta affilata. La smussatura a secco è un po' meno casuale rispetto allo sfioramento della punta dell'ago contro qualcosa. Il protocollo descritto di seguito fa un ulteriore passo avanti nel processo di smussatura fornendo aria compressa all'ago da smussare e smussandolo sotto uno strato di liquido in modo che le bolle siano visibili non appena l'ago è stato aperto. Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo per produrre aghi per microiniezione affilati in modo affidabile. La smussatura sotto uno strato di liquido è un miglioramento rispetto alla rottura casuale dell'ago come descritto sopra e alla smussatura a secco perché l'utente riceve un feedback sul processo di smussatura, consentendo alla persona che smussa di sapere quando l'ago è aperto e relativamente quanto è grande l'apertura dell'ago. Conoscere la dimensione relativa dell'apertura della punta dell'ago può consentire alla persona che smussa di creare aghi con diverse dimensioni di apertura. Varie dimensioni di apertura dell'ago hanno vantaggi diversi; Ad esempio, le dimensioni dell'apertura dell'ago più grandi possono ospitare miscele di iniezione ad alta viscosità, mentre gli aghi di apertura più piccoli causano meno danni all'embrione che viene iniettato.
L'aria viene fornita all'ago utilizzando un regolatore e un sistema di tubi in uretano basati su un sistema di iniezione modificato regolato dalla pressione dell'aria2. Mentre l'aria viene fornita all'ago a una pressione costante, l'ago viene smussato sotto uno strato di liquido. Il processo di smussatura è composto da un processo ripetuto in cinque fasi: 1) abbassamento dell'ago sulla superficie abrasiva, 2) lasciando che l'ago smussi per un breve periodo di tempo, 3) sollevando l'ago dalla piastra abrasiva mantenendolo sotto la superficie dello strato liquido, 4) arrestando la rotazione della piastra abrasiva per verificare la comparsa di bolle. Se non sono presenti bolle, i passaggi da 1 a 4 vengono ripetuti fino a quando non compaiono le bolle; 5) Una volta presenti le bolle, la pressione dell'aria può essere regolata per determinare la dimensione relativa dell'apertura dell'ago. Minore è la pressione necessaria per fermare la formazione di bolle, maggiore è l'apertura sulla punta dell'ago.
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Protocollo
NOTA: Il protocollo descritto di seguito utilizza il Sutter BV-10 microcapillare smussato. Tuttavia, questo protocollo può essere modificato per l'uso con qualsiasi modello di microcapillare smussato.
1. Assemblaggio del regolatore, del manometro e del tubo di alimentazione dell'aria
- Tagliare una sezione di tubo in uretano per il collegamento dall'alimentazione dell'aria alla base del regolatore (R; Sezione 1, Figura 1). La lunghezza di questa sezione dipenderà dalla distanza dall'alimentazione dell'aria al regolatore, che si troverà accanto alla smussatrice .
- Far scorrere un tubo clamp sul tubo di uretano, quindi spingere un connettore del tubo flessibile all'estremità del tubo. Assicurarsi che il connettore del tubo sia completamente inserito posizionandolo contro una superficie dura. Tenendo il tubo vicino al connettore del tubo, premere saldamente il tubo nel tubo fino a quando il connettore del tubo non è completamente inserito. Insieme, il tubo clamp e il connettore del tubo flessibile formano il collegamento HC (Figura 1).
- Far scorrere il tubo clamp fino all'estremità del tubo dove è inserito il connettore del tubo. Ruotare la fascetta stringitubo sull'estremità della punta inserita in modo che formi un collegamento ermetico.
- Avvitare manualmente il connettore del tubo flessibile nella base del regolatore (R), quindi terminare il serraggio del collegamento con una piccola chiave. Assicurati che la connessione sia ermetica ma non eccessiva.
- Nella porta laterale del regolatore, avvitare a mano un connettore a T (T), quindi utilizzare una piccola chiave per terminare il serraggio.
- Tagliare un piccolo pezzo di tubo di uretano (Figura 1, Sezione 2), lungo circa 3-5 cm. Posizionare due fascette stringitubo sul pezzo di tubo, quindi inserire un connettore per tubo flessibile in ciascuna estremità del tubo e terminare i collegamenti (HC) come descritto nei passaggi 1.2-1.4 per ciascuna estremità del tubo.
- Avvitare un'estremità del tubo corto nella base del manometro, quindi terminare il serraggio con una chiave come al punto 1.5.
- Avvitare l'altra estremità del tubo corto in una delle porte del connettore a T (T) collegato al regolatore al punto 1.5.
- Tagliare una sezione del tubo in uretano (Figura 1, Sezione 3) per il collegamento tra il regolatore e il supporto dell'ago (NH). La dimensione di questa sezione dipenderà dalla distanza dalla smussatrice alla posizione del regolatore.
- Posizionare un tubo clamp sulla sezione del tubo, quindi inserire un connettore del tubo come descritto nei passaggi 1.2-1.4.
- Sull'altro lato di questa sezione di tubo, posizionare il connettore luer femmina (LC) fornito con il supporto dell'ago (NH).
- Rimuovere il morsetto di fissaggio e la rondella di nylon (Figura 2, f) dal manipolatore. Il morsetto di fissaggio e la rondella sono progettati per contenere solo un microcapillare di vetro, non sono progettati per sostenere il peso aggiuntivo di un supporto microcapillare, un'asta filettata e un tubo di alimentazione dell'aria.
- Taglia un pezzo rettangolare di foglio di gomma da imballaggio di 1,5 cm x 2 cm per avvolgere l'asta filettata nel morsetto del parafango della bicicletta. Ciò contribuirà a tenere più saldamente l'asta filettata e il supporto dell'ago nel morsetto del parafango della bicicletta. Utilizzando due pinze ad ago, aprire la clip del parafango della bicicletta, piegare il pezzo rettangolare di foglio di gomma sopra l'asta filettata a 3,5 cm da un'estremità dell'asta in modo che formi una U sopra l'asta. Inserire l'asta filettata rivestita in un foglio di gomma nel morsetto del parafango della bicicletta aperto e utilizzare le pinze per chiudere il morsetto attorno all'asta e al foglio di gomma. Installare la bicicletta clamp e il gruppo dell'asta filettata sul bullone del manipolatore, sostituire il fissaggio clamp senza la rondella di nylon e serrare il fissaggio clamp finché non tiene saldamente il gruppo dell'asta filettata.
- Infilare il portaago sull'asta filettata. Assicurarsi che il connettore luer termini in una posizione che non leghi il tubo di uretano quando è collegato (Figura 2, g).
- Collegare il connettore luer femmina al connettore luer maschio (Figura 2, g) del portaago (Figura 2, d).
- Collegare l'estremità libera della Figura 1, Sezione 1 del tubo all'alimentazione dell'aria (questa connessione varierà in base all'alimentazione dell'aria utilizzata). L'alimentazione dell'aria deve essere pulita, asciutta e priva di residui di olio. L'alimentazione dell'aria può provenire da una fonte d'aria domestica o da una bombola di gas, aria compressa o azoto.
2. Smussatura degli aghi in borosilicato
- Estrarre gli aghi per microiniezione utilizzando micro capillari in vetro borosilicato con le seguenti impostazioni sullo strumento: Calore: 305, Fil: 4, Vel: 70, Del: 235, Pul: 160, con tempo di loop di 12.24.
- Assemblare il gruppo di macinazione secondo le istruzioni del produttore, costituito dalla piastra abrasiva e dall'anello di ritegno con magneti12.
NOTA: Potrebbe essere necessario avvolgere la piastra abrasiva con una sottile striscia di pellicola trasparente per evitare la fuoriuscita prematura di Photo-Flo (agente bagnante) dalla piastra abrasiva. Ciò è necessario solo se la soluzione di agente umettante fuoriesce prematuramente nell'olio del piedistallo, provocando l'arresto della rotazione della piastra di macinazione. L'agente umettante riduce il rischio di segni di essiccazione sugli aghi di vetro dopo la smussatura. L'uso di un agente umettante non è fondamentale per il processo di smussatura e l'acqua può essere sostituita. - Posizionare 10 gocce di olio per piedistallo sulla superficie otticamente piana del piedistallo e posizionare sopra il gruppo di macinazione. Avviare il gruppo di macinazione.
- Accendere la fonte di luce per illuminare la superficie. Assicurarsi che la sorgente luminosa sia posizionata dietro lo smussato e brilli con un angolo di 45° rispetto alla piastra abrasiva e all'ago. L'angolo di illuminazione è necessario in modo che l'ombra dell'ago sia facilmente visibile. Con un ingrandimento di 90x, ruotare la testa del microscopio in posizione. Arrestare brevemente la rotazione della piastra abrasiva e mettere a fuoco il microscopio sulla superficie della piastra abrasiva.
- Aggiungere l'1% di agente umettante allo stoppino fino a quando lo stoppino non è completamente bagnato. Aggiungere l'1% di agente umettante sulla superficie della piastra abrasiva. Assicurarsi che l'agente umettante copra la superficie abrasiva ma non fuoriesca dall'anello di sicurezza nero.
- Posizionare lo stoppino pre-bagnato sulla superficie della piastra abrasiva mentre gira. Assicurati che lo stoppino si trovi sul lato sinistro della piastra abrasiva (mentre guardi in basso dall'alto) e si estenda dalle 11 alle 6 (con la piastra come quadrante dell'orologio). Assicurarsi che lo stoppino non scorra sulla parte nera dell'anello di sicurezza.
- Inserire un ago nel portaago (Figura 2, d) e serrare l'anello di ritegno per tenere l'ago in posizione. Aprire il regolatore (Figura 1, R) e aumentare la pressione a 24 psi.
- Sollevare il portaago ruotando la manopola di regolazione del percorso (Figura 2, a) Assicurarsi che l'ago sia sollevato abbastanza in alto da essere più alto della superficie della piastra abrasiva rotante, quindi ruotare l'intero manipolatore in modo che l'ago oscilli in posizione sopra la piastra abrasiva rotante. L'ago da smussare deve essere posizionato sulla piastra abrasiva rotante orientata in modo tale che la rotazione della piastra si allontani dalla punta dell'ago (Figura 3A)
- Guardando di lato, utilizzare la manopola di regolazione grossolana (Figura 2, a) per abbassare l'ago verso la superficie della piastra abrasiva. Fermati quando l'ago tocca quasi la superficie del liquido.
- Utilizzare lo zoom per abbassare l'ingrandimento del microscopio, quindi spostare il microscopio in modo che l'ago si trovi al centro del campo visivo. Una volta al centro della visuale, aumentare l'ingrandimento, regolando la posizione del manipolatore in modo che la punta dell'ago rimanga al centro della visuale. Una volta raggiunto l'ingrandimento massimo, arrestare la piastra di macinazione e mettere a fuoco il microscopio sulla superficie della piastra abrasiva, quindi riavviare immediatamente la rotazione della piastra una volta che la superficie è a fuoco. A questo punto l'ago potrebbe non essere in vista.
- Utilizzando la manopola di regolazione grossolana del manipolatore, abbassare l'ago verso la piastra abrasiva. Nel campo visivo, saranno visibili un'immagine dell'ago e una o più ombre dell'ago. Quando l'ago e l'ombra dell'ago sono vicini al contatto, passare alla manopola di regolazione fine del manipolatore e continuare ad abbassare l'ago fino a quando l'ago e le sue ombre sembrano toccarsi. A questo punto, leggere il calibro (Figura 2, c) e annotare la lettura. La superficie della piastra abrasiva è pari o inferiore a questa lettura del calibro.
NOTA: È difficile vedere quando l'ago tocca la superficie della piastra abrasiva rotante, quindi l'ago potrebbe non toccare effettivamente la piastra abrasiva a questo punto. - Lasciare che l'ago rimanga a questo livello di lettura del calibro per 5-10 s.
- Utilizzando la manopola di regolazione fine del manipolatore, sollevare l'ago, assicurandosi che rimanga sotto la superficie dell'agente bagnante. Interrompere la rotazione della piastra abrasiva per alcuni secondi e osservare se fuoriescono bolle dalla punta dell'ago. Se sono presenti bolle, procedere al passaggio 2.15. Se non sono presenti bolle, procedere al passaggio 2.14.
- Riportare l'ago alla lettura del calibro utilizzando la manopola di regolazione fine del manipolatore, quindi spostarlo un po' più in basso ed eseguire una nuova lettura del calibro, quindi ripetere i passaggi 2.12-2.13.
- Avviare nuovamente la piastra abrasiva per vedere se la formazione di bolle è osservabile mentre la piastra è in rotazione. Se l'evidenza della formazione di bolle è visibile durante la rotazione della piastra, l'apertura della punta dell'ago è probabilmente troppo grande per microiniezioni di embrioni sensibili, come le iniezioni di embrioni di zanzara. Se la formazione di bolle non è visibile durante la rotazione del piatto abrasivo, l'apertura dell'ago è ideale per l'uso in procedure che richiedono un ago di apertura affilato e piccolo.
- Utilizzare la manopola di regolazione del percorso del manipolatore per sollevare l'ago sopra la piastra abrasiva in una posizione sufficientemente alta sopra la piastra in modo che l'ago non colpisca nulla mentre l'intero manipolatore viene ruotato per allontanare l'ago dalla piastra abrasiva e dal microscopio.
- Una volta che l'ago è in una posizione in cui può essere rimosso senza colpire nulla, abbassare la pressione dell'aria a zero, rimuovere l'ago e metterlo in una scatola per la conservazione degli aghi (una capsula di Petri con nastro biadesivo o argilla da modellare per tenere gli aghi smussati) fino all'uso.
3. Determinazione della dimensione relativa dell'apertura dell'ago smussato
NOTA: La determinazione delle dimensioni relative dell'apertura dell'ago smussato viene effettuata al punto 2.13. I passaggi seguenti descrivono ulteriormente questo processo.
- Una volta osservate le bolle al punto 2.13, con la piastra abrasiva non in rotazione, diminuire lentamente la pressione dell'aria ruotando la manopola di regolazione del regolatore (Figura 1, R) fino a quando le bolle smettono di fluire dalla punta dell'ago. Notare la pressione alla quale le bolle smettono di fluire dalla punta.
- Aumentare la pressione dell'aria fino a quando le bolle non fluiscono di nuovo dalla punta dell'ago. Maggiore è la pressione, minore è l'apertura dell'ago.
- Procedere spostando l'ago in una posizione in cui possa essere rimosso in sicurezza, passaggi 2.16-2.17.
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Risultati
La procedura sopra descritta produce aghi per microiniezione costantemente affilati. Gli aghi affilati sono caratterizzati dalla capacità di inserirsi in embrioni di insetti morbidi corion, come gli embrioni di zanzara, con poca o nessuna resistenza da parte della membrana embrionale. Quando gli embrioni di zanzara vengono microiniettati per la modificazione genetica, la membrana embrionale è relativamente elastica. Spingere un ago smussato contro la membrana dell'embrione ne causerà l'indentazione (...
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Discussione
La modificazione genetica delle zanzare si basa su una microiniezione precisa dei materiali di modificazione (plasmidi, RNA guida o proteine) negli embrioni pre-blastoderma 3,4,5,6,7,8. Fondamentali per questo processo sono gli aghi affilati che perforano facilmente l'embrione
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Dichiarazioni
L'autore non ha nulla da rivelare.
Ringraziamenti
L'autore desidera ringraziare le seguenti persone. Il personale dell'Università del Maryland Insect Transformation Facility: Channa Aluvihare, Robert Alford e Daniel Gay. Senza il loro lavoro dedicato, l'Insect Transformation Facility non esisterebbe. Vanessa Meldener-Harrell per la correzione di bozze di questo manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microcapillari con diametro esterno di 1,0 mm | World Precision Instruments | ||
| Olio per piedistallo smussato | Sutter Instruments | 008 | |
| Clip per parafango per bicicletta | VeloOrange | R-clip Confezione da 4 | https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack |
| Boom Stand Microscopio | AmScope | AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscopio o equivalente | |
| BV-10 Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| Piastra abrasiva diamantata | Sutter Instruments | 104F | Piastra abrasiva diamantata - extra fine (da 0,2 µ a 1,0 µ dimensioni della punta) |
| Guarnizione, Buna-N | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 11761-2-pkg | Utilizzato per sigillare il collegamento su connettori a T o a L, se non già incluso con questi pezzi |
| Tubo Clamp | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 5000-2-pkg | |
| Connettore per tubo flessibile | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | CT4-pkg | Necessita di 5 connettori per tubi flessibili |
| Supporto per ago per microiniezione | World Precision Instruments | MPH3-10 | Supporto per aghi per microcapillari con diametro esterno di 1 mm |
| P-2000 | Sutter Instruments | Qualsiasi estrattore per aghi | |
| Photo-Flo 200 Solution | B& H Foto, Video e Audio | BH #KOPF200P MFR #1464510 | agente bagnante |
| Manometro | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | PG-100 | Calibro 0-100 psi |
| Stoppino di riferimento | Sutter Instruments | X050300 | |
| Porta stoppino di riferimento | Sutter Instruments | M100019 | |
| Regolatore | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 01-Mar | Bisogno di porte #10-32 per i collegamenti |
| Foglio di imballaggio in gomma 6 inx 6 in | Danco | Modello # 59849 | |
| Raccordo a T | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 15002-2-pkg | |
| filettata | Barra filettata o barra con estremità filettata. I fili devono essere 10-32. | ||
| Tubo in uretano | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | URH1-0804-BLT-050 |
Riferimenti
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable Element Vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
- O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W. Transformation systems in insects. Methods Mol Biol. 260, 227-254 (2004).
- Handler, A. M., James, A. A. Insect Transgenesis: Methods and Applications. , CRC Press. Boca Rato. (2000).
- Harrell, R. A. Mosquito embryo microinjection. Cold Spring Harbor Protocols. , 10.1101/pdb.prot107686 (2023).
- Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex Quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38 (5), 701-710 (2001).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Mol Biol. 10 (6), 597-604 (2001).
- Adelman, Z. N., Jasinskiene, N., James, A. A. Development and applications of transgenesis in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Mol Biochem Parasitol. 121 (1), 1-10 (2002).
- Perera, O. P., Harrell, R. A., Handler, A. M. Germ-line transformation of the South American malaria vector, Anopheles albimanus, with a piggyBac/EGFP transposon vector is routine and highly efficient. Insect Mol Biol. 11 (4), 291-297 (2002).
- Harrell, R. A. Mosquito embryo microinjection under halocarbon oil or in aqueous solution. Cold Spring Harb Protoc. , 10.1101/pdb.prot108203 (2023).
- Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. CRISPR/Cas9 mutagenesis in Phlebotomus papatasi: The immune deficiency pathway impacts vector competence for Leishmania major. mBio. 10 (4), e01941(2019).
- Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol. 18 (1), 81-84 (2000).
- BV-10 Micropipette Beveler Operation Manual Rev. 3.00. , Available from: https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html (2018).
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Ristampe e permessi
